3. Ergebnisse
3.3. Einfluss von Mutationen auf die UTP-induzierte Potenzierung der
wirkender Inhibitor von verschiedenen Proteinkinasen, und ein (nominell) Mg2+-freies Medium, welches typischerweise Proteinkinase-abhängige Reaktionen inhibiert (Christie et al., 1992), den Potenzierungseffekt durch UTP unterdrückt (Abb. 18.). Der selektive, membranpermeable PKC-Inhibitor Gö 6976, der nichtselektive Ekto-PKC-Inhibitor K252b (0.2 µM) (Kase et al., 1987) und das membranundurchlässige PKC-Inhibitorpeptid (10 µM) inhibierten alle die UTP-induzierte Potenzierung der α,ß-meATP-Ströme (Abb. 18).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass UTP durch ekto-PKC-vermittelte Übertragung der terminalen Phosphatgruppen von Nukleotiden die extrazellulären Phosphorylierungstellen des P2X3-Rezeptors zu beeinflussen scheint.
Abb. 18. Effekt von verschiedenen PKC-Inhibitoren auf die α,ß-meATP-induzierten Ströme in HEK293-hP2X3 Zellen.
Das Applikationsschema entspricht dem in Abb. 11. dargestellten. Mittelwerte ± SEM für jede Versuchsreihe von mindesten 6 bis 9 Zellen werden zusammengefasst. *p<0,05;
statistisch signifikante Differenz zur zweiten Kontrollantwort (100 %).
3.3. Einfluss von Mutationen auf die UTP-induzierte Potenzierung der
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seiner Mutanten transient transfiziert. Um die funktionell relevanten PKC-Phosphorylierungsstellen am P2X3-Rezeptor zu indentifizieren, wurden die Ser- und Thr-Reste innerhalb von fünf der sieben Konsensus-Phosphorylierungsstellen nacheinander durch die neutrale Aminosäure Ala ersetzt. Eine intrazelluläre PKC Stelle, die in allen P2X-Rezeptoren hochkonserviert ist, befindet sich N-terminal (PKC1, 12-14), während die zusätzlichen Stellen extrazellulär lokalisiert sind (PKC2, 134-136; PKC3, 178-180; PKC4, 196-198; PKC6, 269-271) (Mager et al., 2004). Die PKC5-Stelle wurde in unseren Experimenten nicht verändert. Zusätzlich wurden noch zwei Ser-Reste (S110, S267), die im humanen P2X3-Rezeptor, aber nicht in dem der Ratte vorhanden sind, zu Ala mutiert.
Keine der Mutationen verhinderte die Membranexpression des P2X3-Rezeptors oder seine Empfindlichkeit gegenüber extrazellulären Nukleotiden in den HEK 293-Zellen. In allen Fällen verursachten α,ß-meATP-Applikationen reproduzierbare Stromamplituden (für die zweite Stromantwort im üblichen Applikationsschema, siehe Abb. 19).
Abb. 19. Einfluss der Mutationen von Ser- und Thr-Resten zu Ala in den PKC Konsensus-Phosphorylierungsstellen des Wildtyp-P2X3-Rezeptors auf seine elektrophysiologischen Eigenschaften.
Die intrazelluläre Lösung enthielt GDP-ß-S 300 µM. Das Applikationsschema entspricht dem in Abb. 11 beschriebenen. A, Es ist keine potenzierende Wirkung von UTP auf den α,β-meATP-Strom an der Mutante T134A zu beobachten (Inaktivierung der PKC2-Stelle;
s. Abb. 16). B. Die Potenzierung an der Mutante S267A bleibt erhalten (keine Mutationen in einer der Konsensus-PKC-Stellen).
Trotz der T13A- (PKC1-Stelle), S267A- und S269A-Mutationen (PKC4-Stelle und ihre unmittelbare Nachbarschaft) beobachteten wir eine unveränderte Potenzierung der
α,ß-meATP-induzierten Ströme durch UTP, während die Mutationen T134A (PKC2-Stelle), S178A und N177V (PKC3-Stelle) die Steigerung derselben Ströme durch UTP verhinderten (Abb. 20). Bereits aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Leitfähigkeit der Mutante T134A nach der Applikation von 3 μM α,β-meATP bedeutend geringer war als die der Mutante S267A (s. die unterschiedliche Stromeichung in Abb. 19A und B; Abb.
20). Diese Änderungen sollten jedoch nicht überinterpretiert werden, da infolge der unterschiedlichen Expression des Rezeptorproteins nach transienter Transfektion sehr variable Stromgrößen beobachtet werden können. Es fällt auf, dass nach der Substitution von Thr in Position-12 mit Ala, nach α,ß-meATP-Applikation kein messbarer Strom hervorgerufen werden konnte. Dieses Ergebnis publizierten bereits Paukert et al. (2001).
Die Autoren vermuteten eine mutationsverursachte Störung der P2X3-Kanalexpression in der Zellmembran. Deswegen veränderten wir Thr nur in Position-13 auf Ala; diese Mutation hemmte nicht die Stromamplitude, sondern schien sie sogar zu vergrößern (Abb.
20).
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Abb. 20. Einfluss der Mutationen von Ser- und Thr-Resten zu Ala in den PKC Konsensus-Phosphorylierungsstellen des P2X3 Rezeptors auf dessen elektrophysiologische Eigenschaften.
Der Wildtyp-Rezeptor und seine Mutanten wurden in HEK 293-Zellen transient transfiziert.
Die intrazelluläre Lösung enthielt GDP-ß-S (300 µM). Das Applikationsschema entspricht dem in Abb. 11 beschriebenen. Es kann kein eindeutiger Zusammenhang zwischen erhaltener oder fehlender UTP-induzierter Potenzierung und Veränderungen in den Amplituden der α,β-meATP-Ströme beobachtet werden. Mutationen in den Phosphorylierungsstellen PKC2 und -3 (T134A, S178A, N177V) oder in der entsprechenden Doppelmutante (T134A+S178A) verhinderten den potenzierenden Effekt von UTP. Im positiven Bereich der Y-Achse wurde die prozentuale Steigerung der α
,ß-meATP-induzierten Ströme durch UTP dargestellt. Mittelwert ± SEM von mindestens 7 Zellen; *p<0,05; statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zur zweiten Stromamplitude, die auf 100% gesetzt wurde. Im negativen Bereich der Y-Achse wurden Mittelwerte ± SEM der Stromamplituden aufgetragen. #p>0,05; statistisch signifikanter Unterschied des Mittelwerts der Stromamplitude im Vergleich zu dem des Wildtyp-Rezeptors. Das Applikationsschema entspricht dem in Abb. 20 beschriebenen. Die intrazelluläre Lösung enthielt GDP-ß-S 300 µM in allen Versuchen.
Wenn α,β-meATP (3 µM) sechsmal im Abstand von 5 min und für jeweils 1 s mit dem üblichen Applikationsschema auf transient mit dem Wildtyp P2X3-Rezeptor oder seinen Mutanten transfizierte HEK 293-Zellen appliziert wurde, induzierte UTP nach einer Applikationszeit von 5 min eine kleinere Potenzierung der α,ß-meATP-induzierten Ströme (43.6 ± 21.1%; n=7) (Abb. 20) als in stabil transfizierten HEK 293-hP2X3-Zellen (66.4 ± 17.1%; n=7) (Abb. 20). Dies führen wir auf die geringere Expressionsdichte des P2X3 -Rezeptors in der HEK293-Zellmembran bei transienter als bei permamenter Transfektion zurück.
Die Steigerung der α,ß-meATP-Ströme durch UTP blieb in den Mutanten S110A, T196A, S267A und S269A erhalten (Abb. 20). Daraus kann gefolgert werden, dass Mutationen in den Ser-Resten, die beim P2X3-Rezeptor des Menschen nicht aber bei dem der Ratte (S110, S267) vorkommen, die potenzierende Wirkung von UTP nicht beeinflussen, ebenso wie Mutationen in den Thr und Ser-Resten, welche innerhalb der extrazellulären PKC-Phosphorylierungsstellen PKC4 und PKC6 (T196A, S269A) lokalisiert sind. Im Gegensatz dazu, gelang es uns mit Mutationen in den Thr- und Ser-Resten, die in den extrazellulären PKC-Phosphorylierungsstellen PKC2 und PKC3 (T134A, S178A) lokalisiert waren, den UTP-Effekt zu unterbinden.
Sowohl die gleichzeitige Substitution von Thr-134 und Ser-178durch Ala (T134A+S178A) als auch die Substitution von Asn-177 neben dem Ser-178 durch Val (N177V) führten zu UTP-resistenten Mutanten (Abb. 20).
Überraschenderweise verhinderte die Mutation von Thr zu Ala im intrazellulären N-Terminus die potenzierende Wirkung von UTP ebenfalls, obwohl UTP als stark polare Verbindung die Zellmembran nicht durchdringen dürfte und deshalb keine Phosphorylierung an der PKC1-Stelle durch UTP zu erwarten ist (Abb. 20). Gründe hierfür
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könnten eine fehlende basale intrazelluläre Phosphorylierung des Rezeptorproteins sein oder eine Änderung der räumlichen Rezeptorstruktur, die zu einer Abnahme der UTP-Bindung an den PKC2- und PKC-3-Stellen führen könnte.
3.4. Hemmung der maximalen Stromantwort von α,ß-meATP durch Inhibitoren der Proteinkinase C oder durch Mutationen im P2X3-Rezeptor
Obwohl alle mutierten P2X3-Rezeptoren auf die Applikation des Agonisten α,β-meATP mit einer gut messbaren Stromantwort reagierten, variierten die Amplituden bei den einzelnen Mutanten beträchtlich; eine Korrelation zwischen den Stromamplituden und ihrer UTP-induzierten Potenzierung konnte ebenfalls nicht festgestellt werden. Allerdings löste die verwendete α,β-meATP-Konzentration (3 μM) nur submaximale Stromamplituden aus.
Um der Frage nachzugehen, ob sich die Maximalwirkung von α,β-meATP in Abhängigkeit von der basalen Phosphorylierung des P2X3-Rezeptors durch endogen freigesetztes ATP/UTP sich ändern könnte, erstellten wir Konzentrations-Wirkungskurven für α,ß-meATP (0.03-300µM) in An- und Abwesenheit des ekto-PKC-Inhibitors K252b (0,2 µM) an HEK293-hP2X3-Zellen (Abb. 21A).
Abb. 21. Hemmung des α,β-meATP-Effektes am Wildtyp P2X3-Rezeptor nach pharmakologischer Hemmung oder Mutation von Konsensus-Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen.
Das Applikationsschema entspricht dem in Abb. 11 gezeigten. A, Konzentrations-Wirkungskurve von α,β-meATP an HEK293-hP2X3 Zellen unter Kontrollbedingungen (schwarz) und in Anwesenheit des Ekto-PKC-Inhibitors K252b (2 µM) in der extrazellulären Lösung (violett). Mittelwerte ± SEM von mindestens 7 Zellen.
*p<0,05;statistisch signifikanter Unterschied zum Effekt der höchsten α,β -meATP-Konzentration unter Kontrollbedingungen. B, -meATP-Konzentrations-Wirkungskurven von α,β -meATP an HEK293 Zellen, die mit dem Wildtyp P2X3-Rezeptor (schwarz) seinen Mutanten T134A (blau), S178A (grün) und T134A + S178A (rot) transient transfiziert wurden.
Mittelwerte ± SEM von mindestens 6 Zellen. *p<0,05; statistisch signifikanter Unterschied zum Effekt der höchsten α,β-meATP-Konzentration am Wildtyp P2X3-Rezeptor (schwarz).
Der membranunpermeable PKC-Inhibitor K252b verringerte die maximale Stromantwort auf α,ß-meATP, beeinflusste aber den EC50-Wert nicht. Daher scheint, trotz vergleichbarer Wirkpotenz des Agonisten, die Entwicklung der vollen intrinsischen Aktivität eine basale Ekto-Phosphorylierung des P2X3-Rezeptors vorauszusetzen.
Diese Annahme wird durch weitere Experimente gestützt, in denen Konzentrations-Wirkungskurven von α,ß-meATP an mit dem Wildtyp P2X3-Rezeptor transient transfizierten HEK 293-Zellen erstellt wurden; zusätzlich wurden auch die Mutanten T134A, S178A und T134A+S178A in diese Untersuchungen mit einbezogen (Abb. 21 B).
Aminosäure-Substitutionen in den relevanten Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen des Rezeptors führten ähnlich wie die pharmakologische Ausschaltung der Ekto-PKC durch K252b, zu einer Abnahme der maximalen Stromantworten auf α,β-meATP. Die EC50
Werte blieben auch in dieser experimentellen Serie unverändert.
Es wurde nicht untersucht, ob der Austausch der Ser- oder Thr-Reste durch Ala in den relevanten Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen PKC2 und -3 die Synthese des Rezeptors oder seinen Einbau in die Zellmembran beeinflussen können. Da jedoch die verwendete submaximale Konzentration von α,β-meATP (3 μM) an jeder einzelnen Mutanten gut messbare Stromantworten auslöste, können gravierende Modifikationen der Rezeptorsynthese oder des Rezeptortraffickings ausgeschlossen werden. Die potenzierende Wirkung von UTP wäre durch solche modulatorischen Effekte sowieso nicht beeinträchtigt gewesen.
3.5. Effekt von Mutationen des P2X3-Rezeptors auf die Kinetik der