Regulation des humanen rekombinanten P2X 3 -Rezeptors durch

Verletzungszustand (Xu und Huang, 2004) oder zu einer Zunahme der synaptischen Aktivität führen (Khakh, 2001; Bobanovicet al., 2002).

In den vorliegenden Experimenten wurden UTP und GTP auf HEK293-P2X3 Zellen appliziert, weil diese Nukleotide erst in viel höheren Konzentrationen als ATP (Fischer et al., 2003) den P2X3-Rezeptor aktivieren und weil sie in ihrer Mg²⁺-assoziierten Form Substrate für die Ektoproteinkinase sind. Der Potenzierungseffekt von UTP wurde nur für den Fall beobachtet, bei dem die negative Interaktion zwischen dem UTP-empfindlichen P2Y4-Rezeptor (Fischer et al., 2003) und dem transfizierten P2X3-Rezeptor durch die intrazelluläre Applikation von GDP-ß-S (Sternweis und Pang, 1990) gehemmt wurde.

Unter diesen Bedingungen verursachten niedrigere UTP-Konzentrationen, die den Rezeptor nicht aktivieren, eine Steigerung der Rezeptorantwort auf α,β-meATP.

Die UTP-induzierte Potenzierung zeigte eine Konzentrations- und Zeitabhängigkeit.

Konzentrationen über einem Grenzwert von 3 µM aktivierten und desensibilisierten den Rezeptor. Dadurch wurde es unmöglich weitere α,β-meATP-induzierte Ströme zu beobachten. Für die Potenzierung der α,β-meATP-induzierten Ströme spielt die Nukleotidstruktur der Stoffe eine essentielle Rolle; die entsprechenden Nukleoside bzw.

ihre Mono- oder Diphosphate sind unwirksam. Die durch UTP induzierte Potenzierung ist dosisabhängig. Interessant ist, dass ATP in viel niedrigerer Konzentration (10 nM) die gleiche Potenzierung wie UTP induziert. Die Ursache für die Potenzierung bei einer niedrigen ATP-Konzentration ist, dass ATP vermutlich die optimale Struktur als Substrat für die PKC besitzt. Der Fakt, dass ATP selber diese Potenzierung verursacht, ist ein Nachweis, dass dieser Prozess unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt.

Logischerweise sollte die UTP-induzierte Potenzierung auch bei einem Haltepotential von +40 mV und bei der Outside-out Konfiguration auftreten. Leider konnten wir durch den starken Rundown-Effekt die von uns gewünschte Potenzierung nicht sehen (nicht präsentiert).

Ausgangspunkt unserer Überlegungen war, dass die Ekto-PKC für die potenzierende Wirkung von UTP auf die α,β-meATP-induzierten Ströme verantwortlich ist. Deshalb verwendeten wir eine Reihe von PKC-Aktivatoren (PMA, DAG-Lakton), die einen ähnlichen Effekt wie UTP verursachten. Die Potenzierung unterschied sich von der UTP-induzierten Potenzierung insofern, dass sie nicht mehr auswaschbar war, was gut mit der hohen Lipidlöslichkeit der verwendeten Substanzen übereinstimmt. Außerdem war der

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Effekt dosisabhängig. Die fehlende Potenzierung der α,β-meATP-induzierten Ströme sowohl durch UTP als auch durch PMA oder DAG-Lakton in Anwesenheit von Pharmaka (Staurosporin, K252b, PKC-Inhibitor-Peptid und Gö 6976) (Kase et al., 1987; Way et al., 2000) oder nach Manipulationen (Mg²⁺-freies extrazelluläres Medium) (Christie et al., 1992), für die bekannt ist, dass sie die PKC-Aktivität inhibieren, belegt den gemeinsamen Wirkmechanismus. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass entweder ein Oberflächenprotein auf der Zellmembran oder Phosphorylierungsstellen auf der extrazellulären Schleife des P2X3-Rezeptors Ziele der Ekto-PKC sind.

Punktmutationen in Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen des P2X3-Rezeptors bestätigen, dass UTP ein Substrat für die Ekto-PKC ist. Durch das Ersetzen der entscheidenden Ser- und Thr-Reste durch Ala wurde die Beteiligung der Phosphorylierungsstellen PKC2 und PKC3 (T134A, S178A) deutlich. Die Substitution dieser wichtigen Ser- und Thr-Reste durch Asp unterstreicht die Bedeutung der zwei anderen Phosphorylierungsstellen PKC4 und PKC6 (Thr-196, Ser-269) ebenfalls.

Offensichtlich wird durch die negativ geladene Aminosäure Asp die PKC-induzierte Phosphorylierung durch UTP, welches ein Substrat von Ekto-PKC ist, nachgeahmt. Die Asp-Mutationen interagieren mit dem Effekt von UTP, reduzieren darüber hinaus die Amplituden der α,β-meATP-induzierten Ströme und verlangsamen deren Desensibiliserungskinetik. Wir nehmen an, dass dies durch die übermäßige Aktivierung der Ekto-PKC Stelle mittels der in den Rezeptor eingefügten Asp-Reste bedingt ist. Eine konstitutive Desensibilisierung des Rezeptors führt zwangsläufig zu verminderten und verlangsamten Stromamplituden. Im Gegensatz zu den Asp-Mutationen, veränderten die Ala-Mutationen in PKC2 und -3 nur die potenzierende Wirkung von UTP, nicht aber die Amplitude oder Kinetik der α,β-meATP-Ströme

Alle P2X-Rezeptoren enthalten positiv geladene Aminosäuren (Lys, Arg) in der extrazellulären Schleife, die ATP durch Anziehen der negativ geladenen Phosphatgruppe binden können, außerdem koordiniert Phe die Bindung des Adeninringes von ATP (Jiang et al., 2000; North, 2002; Roberts und Evans, 2004). An P2X1- oder P2X2-Rezeptoren wurden diese Agonisten-Bindungsstellen vorwiegend im Übergang zwischen der extrazellulären Schleife und dem transmembranen Bereich identifiziert. Eine Substitution dieser basischen Aminosäurereste durch das neutrale Ala verhinderte die Bindung von ATP, ohne mit dem Einbau der P2X-Rezeptoren in die Zellmembran zu interferieren. Diese

Agonisten-Bindungsstellen sind jedoch mit den von uns untersuchten Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen nicht identisch. Im letzteren Fall wurden die für die PKC-Stellen typischen Ser- und Thr-Reste durch Ala oder Asp ersetzt. Durch diese Änderungen erfolgte keine Modifikation der Agonisten-Bindung, sehr wohl aber die der basalen Aktivierung des P2X3-Rezeptors durch eine Phosphorylierungsreaktion. Die molekulare Simulation des Rezeptors zeigte, dass die Agonisten-Bindung- und Ektoproteinkinase C-Stellen in der extrazellulären Schleife räumlich unterschiedlich untergebracht sind. Letzten Endes wurden in Mutationsanalysen von konservierten Cysteinresten, welche Disulfidbrücken im extrazellulären Bereich des P2X3-Rezeptors bilden, festgestellt, dass beim Ersatz von Cys durch Ala die Agonistenempfindlichkeit reduziert wird (Clyne et al., 2002; Ennion und Evans, 2002; Nakazawa et al., 2004). Die Ekto-PKC-Stellen wiesen jedoch keine Überlappung mit den für die Bildung der Disulfidbrückenbildung notwendigen Cys-Resten auf.

Obwohl die Phosphorylierung des P2X1-Rezeptorkanals durch PMA Markierung mit [³²P]Orthophosphat und folgender Immunpräzipitation demonstriert wurde (Vial et al., 2004), konnten wir in unseren Experimenten wegen des zu niedrigen Expressionsniveaus der P2X3-Rezeptoren in HEK 293-Zelllinien den Grad der Kanalphosphorylierung nicht messen (C. Vial und R. J. Evans, nichtpublizierte Beobachtung). Allerdings deuten unsere Experimente stark darauf hin, dass niedrige UTP-Konzentrationen PKC-Stellen im extrazellulären Bereich des P2X3-Rezeptors phosphorylieren können.

Zum Schluss wurden noch native P2X3-Rezeptoren von DRG-Neuronen, die an der Schmerzübertragung beteiligt sind (Robertson et al., 1996; Dunn etal., 2001), darauf hin untersucht, ob sie durch extrazelluläre Nukleotide moduliert werden. Gemäß vorherigen Ergebnissen induziert UTP in Konzentrationen >0,3 µM schnell inaktivierende Einwärtsströme (Robertson et al., 1996). Allerdings potenzierte UTP in niedrigeren Konzentrationen von 3-30 nM ausnahmslos die α,β-meATP-induzierten Ströme infolge eines Mechanismus, der von der PKC-Aktivität abhängig ist, da der PKC-Inhibitor Gö 6976 die UTP-induzierte Potenzierung verhinderte. Die nativen P2X3-Rezeptoren von DRG-Neuronen der Ratte und die in HEK 293-Zellen exprimierten rekombinanten humanen P2X3-Rezeptoren reagierten sehr ähnlich auf UTP.

Schließlich wurde vorgeschlagen, dass unter physiologischen Bedingungen niedrige extrazelluläre Konzentrationen von endogenem ATP (Lazarowski et al., 2000) die

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Empfindlichkeit des P2X3-Rezeptors gegenüber diesem Agonisten erhöhen können. Solch eine Aktivierung könnte eine Voraussetzung für die volle Funktionalität der schmerzübermittelnden P2X3-Rezeptoren in peripheren sowie zentralen Prozessen der Hinterwurzelganglienzellen sein. Allerdings sei hier erwähnt, dass höhere Konzentrationen von endogenem ATP den Rezeptor desensibilisieren können, wie dies durch Inhibitoren der ATP-abbauenden Phosphohydrolase gezeigt werden konnte.

Die agonistische Funktion von ATP oder seiner Strukturanaloga könnte somit durch das Zusammenspiel mehrerer teilweise gegenläufiger Prozesse bestimmt werden: 1) Phosphorylierung der Ekto-PKC-Stellen und somit eine Funktionssteigerung; 2) Desensibiliserung der Agonisten-Bindungsstelle des Rezeptors und somit eine Funktionsabnahme; 3) Aktivierung des Rezeptors durch Besetzung der Agonisten-Bindungsstellen durch ATP und somit Induktion der nicht-selektiven kationischen Leitfähigkeit; und 4) schließlich eine Hemmung der P2X3-Rezeptoraktivierung durch eine gleichzeitige Stimulation von inhibitorischen P2Y-Rezeptoren.

4.2. Sauerstoff- und Glukose-Mangel erhöhen die Expressionsrate des P2X₇