Aus der
Klinik und Poliklinik für Neurologie
der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Die Rolle der den Morbus Charcot-Marie-Tooth verursachenden R94Q Mutation im MFN2 Gen
in der Resistenz gegen oxidativen Stress
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Vorgelegt von
Rahel Zimmermann aus Heidelberg
Mainz, 2020
Wissenschaftlicher Vorstand:
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Tag der Promotion: 06.07.2021
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... III
TABELLENVERZEICHNIS ... IV
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURDISKUSSION ... 3
2.1 Morbus Charcot-Marie Tooth ... 3
2.1.1 Epidemiologie ... 3
2.1.2 Klinik und Verlauf ... 4
2.2 Mitochondriale Spaltung und Fusion ... 5
2.3 Mitofusin ... 7
2.4 Mitochondriale Calciumhomöostase ... 10
2.5 Mitophagie... 11
2.6 Oxidativer Stress ... 13
2.7 Glutathion ... 13
3 MATERIAL... 16
3.1 Zelllinien ... 16
3.2 Verbrauchsmaterialien ... 16
3.3 Medium ... 17
3.4 Puffer, Chemikalien ... 17
3.5 Antikörper, Farbstoffe, Marker ... 18
3.6 Plasmide ... 19
3.7 Kits ... 19
3.8 Geräte ... 19
3.9 Programme ... 21
4 METHODEN ... 22
4.1 Zellbiologie ... 22
4.1.1 Kultur und Passagieren von MEF- Zellen ... 22
4.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerkammer ... 22
4.1.3 Automatisierte Zellzahlbestimmung... 23
4.1.4 Zellviabilitätsbestimmung ... 23
4.1.5 Zellproliferationsbestimmung ... 23
4.1.6 Zelluläre ROS Messung mit CellROX® Green Reagenz ... 24
4.1.7 Mitochondriale Membranpotentialmessung mit TMRE ... 24
4.1.8 Glukoseaufnahme ... 25
4.2 Molekularbiologie ... 25
4.2.1 Transiente Transfektion ... 25
4.2.2 RNA Isolation ... 27
4.2.3 Polymerase-chain-reaction (PCR) und Sequenzierung ... 28
4.2.4 cDNA Synthese ... 29
4.2.5 Glutathionassay ... 29
4.2.6 Mitochondriale Calciumbestimmung... 30
4.3 Proteinbiochemie... 30
4.3.1 Probengewinnung ... 30
4.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration ... 31
4.3.3 SDS Page ... 31
4.3.4 Westernblot ... 32
5 ERGEBNISSE ... 33
5.1 Validierung der R94Q und Rescue Zelllinien ... 33
5.2 Proliferation von Wildtyp und R94Q MFN2 nimmt bei oxidativem Stress gleichermaßen ab... 34
5.3 Oxidativer Stress führt gleichermaßen zum Abfall des mitochondrialen Membranpotentials ... 36
5.4 Erhöhter mitochondrialer Calciumgehalt bei R94Q-Zellen ... 37
5.5 Verringerte ROS und erhöhtes GSH sowie erhöhter Glukoseumsatz in R94Q-Zellen bei oxidativem Stress ... 38
5.6 Verringerte Mitophagie in R94Q-Zellen ... 43
6 DISKUSSION ... 48
6.1 KO+WT und KO+R94Q exprimieren gleiche Mengen an MFN2, die jedoch über dem MFN2 des WT liegen ... 48
6.2 Kein Unterschied zwischen Wachstumsraten von R94Q und WT Zellen und gleichermaßen Wachstumsminderung durch oxidativen Stress ... 48
6.3 R94Q beeinflusst die Calciumhomöostase über MAM ... 50
6.4 Verringerte ROS bei R94Q-Zellen ... 51
6.5 Erhöhtes Glutathion und gesteigerte Glukoseaufnahme bei R94Q-Zellen ... 53
6.6 Verringerte Mitophagie bei R94Q-Zellen ... 54
6.7 Diskussion der gewählten Methoden ... 55
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 56
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 57
9 DANKSAGUNG ... 65
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
BCA-Test Bicinchoninsäure-Test
Bzw. Beziehungsweise
Ca. Zirka
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
cm Zentimeter
CTB Celltiterblue-Assay
CO2 Kohlenstoffdioxid
cDNA komplementäre DNA CMT Charcot Marie Tooth
°C Grad Celsius
Da Dalton
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate DTT Dithiothreitol
D-MEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMF Dimethylfumarat
DNA Desoxyribonukleinsäure DMSO Dimethylsulfoxid
FCS fetales Kälberserum
G Zentrifugalbeschleunigung
g Gramm
GSH Glutathion
GSS Glutathion-Synthase GSR Glutathion-Reduktase GPx Glutathion-Peroxidase GSSG Glutathion-Disulfid
GSTs Glutathion-S-Transferasen H2O2 Wasserstoffperoxid
h Stunde
in vitro im Reagenzglas in vivo in der lebenden Zelle
kDa Kilodalton
mRNA BotenRNA
M Molar
m Milli-
MFN Mitofusin
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
NaOH Natriumhydroxid
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NO Stickstoffmonoxid
n Nano-
ng Nanogramm
OH Hydroxyl-Radikale
O2 Sauerstoff
O2ˉ Superoxid-Radikale
PCR Polymerase-Kettenreaktion PBS phosphatgepufferte Salzlösung
qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion RIPA-Puffer Radioimmunoprecipitation Assay-Puffer
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribunuklease
ROS reaktive Sauerstoff-Spezies Rpm Umdrehungen pro Minute
SDS-Page Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
s Sekunde
siRNA small interferring RNA
U Units
µ Mikro-
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromolar
ZNS Zentrales Nervensystem
z.B. Zum Beispiel
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Patienten mit distal betonten Muskelatrophien ... 4
Abbildung 2: Mitochondriale Fusion und Fission ... 6
Abbildung 3: Struktur von MFN2 ... 8
Abbildung 4: Initialisierung der Mitophagie ... 12
Abbildung 5: GSH/GSSG Zyklus ... 14
Abbildung 6: Rescue und R94Q exprimieren vergleichbare MFN2 Mengen ... 33
Abbildung 7: Behandlung mit 100 µM H2O2 beeinträchtigt das Wachstum von R94Q und Rescue-Zellen gleichermaßen ... 35
Abbildung 8: Oxidativer Stress führt bei beiden Zelllinien zum Abfall des mitochondrialen Membranpotentials ... 36
Abbildung 9: Erhöhter mitochondrialer Calciumgehalt bei R94Q-Zellen ... 38
Abbildung 10: Erhöhter Glukoseumsatz bei R94Q-Zellen unter oxidativem Stress ... 42
Abbildung 11: Verringerte Mitophagie in R94Q-Zellen sowie erhöhte Mitophagie durch H2O2 Behandlung bei beiden Zellininen ... 44
Abbildung 12: Verringerte Mitophagie bei R94Q-Zellen ... 47
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Verbrauchsmaterialien ... 17
Tabelle 2: Medium ... 17
Tabelle 3: Puffer, Chemikalien ... 18
Tabelle 4: Antikörper, Farbstoffe, Marker... 18
Tabelle 5: Plasmide ... 19
Tabelle 6: Kits 19 ... 19
Tabelle 7: Geräte ... 20
Tabelle 8: Programme ... 21
1 EINLEITUNG
Der Morbus Charcot-Marie-Tooth (CMT) ist eine erblich bedingte neuronale Muskelatrophie und betrifft motorische und sensible Neurone des peripheren Nervensystems. Er ist die häufigste neurogenetische Krankheit und betrifft 1 von 2500 Menschen (Bucci et al., 2012). Die Symptome der CMT Krankheit setzen normalerweise in der frühen Kindheit bis zum jungen Erwachsenenalter ein und sind charakterisiert durch progressive distale Muskelatrophie und Polyneuropathie, die zu peripherer Schwäche, typischen Fuß- und Handdeformationen und dem Verlust der distalen Sensibilität führen. Es gibt über 80 Subtypen des CMT (Jerath & Shy, 2015), die nach elektrophysiologischen Charakteristika, Vererbungsmuster oder genetischer Mutation weiter klassifiziert werden können. CMT kann durch verschiedene Mutationen in Proteinen, die unter anderem für den zellulären Transport, die Formation von Myelin oder die mitochondriale Spaltung und Fusion wichtig sind, verursacht werden (Niemann et al., 2006). Eines davon ist das Mitofusin 2 Gen (MFN2), dessen Mutation die autosomal dominante axonale CMT2A Form auslöst (McCorquodale et al., 2011).
Mitochondrien sind hochdynamische Zellorganellen, die eine wichtige Rolle für Zellfunktionen wie Zellatmung, ATP-Produktion, Calciumregulation und Apoptose spielen (Youle & van der Bliek, 2012). Mitochondrien sind der Hauptentstehungsort von reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS), daher sind antioxidativ wirkende Stoffe wie Glutathion essentiell für die Homöostase des Redoxstatus und eine gute mitochondriale Funktion (Benard & Rossignol, 2008). Mitochondrien unterliegen ständiger Fusion und Fission, sodass ihre Gestalt von klein und fragmentiert bis zu groß und tubulär variieren kann. Dieser Prozess ist wichtig für die mitochondriale Bioenergetik und das Überleben der Zelle (Westermann, 2010). Fusion und Spaltung werden durch verschiedene Umwelteinflüsse ausgelöst, wie zellulärer Stress, Schädigung der DNA und Induktion der Apoptose (Youle & van der Bliek, 2012).
Mitofusine gehören zu der Gruppe von Proteinen, die für ein funktionierendes mitochondriales Netzwerk essentiell sind (Dorn, 2013; Huang et al., 2011). Neben dem Einfluss auf die mitochondriale Form, spielt MFN2 eine Rolle in vielen zellulären Prozessen, wie der mitochondrialen Bioenergetik. Deshalb kann angenommen
werden, dass Fehlfunktion oder Abwesenheit von MFN2 starke Auswirkungen auf zelluläre Energiemetabolismus, Calciumhomöostase und andere zelluläre Funktionen hat. (Pich et al., 2005).
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der R94Q Mutation im MFN2 Gen auf verschiedene zelluläre Prozesse zu untersuchen. Insbesondere wurde der Einfluss unter oxidativem Stress in Form von H2O2 Behandlung untersucht.
2 LITERATURDISKUSSION
2.1 Morbus Charcot-Marie Tooth 2.1.1 Epidemiologie
Der Morbus Charcot-Marie-Tooth (CMT) ist eine erblich bedingte neuronale Muskelatrophie und wurde im Jahre 1886 zum ersten Mal von Jean-Martin Charcot, Pierre Marie und Howard Henry Tooth beschrieben (Kazamel & Boes, 2015). Die Krankheit wird auch als hereditäre motorisch-sensible Neuropathie Typ I (HMSN I) bezeichnet und betrifft motorische und sensible Neurone des peripheren Nervensystems. Es ist die häufigste neurogenetische Krankheit und betrifft 1 von 2500 Menschen (Bucci et al., 2012).
Es gibt über 80 Subtypen des CMT (Jerath & Shy, 2015), die nach elektrophysiologischen Charakteristika, Vererbungsmuster oder genetischer Mutation weiter klassifiziert werden können. Nach elektrophysiologischen Charakteristika lässt sich CMT in demyelinisierende und axonale Neuropathien unterteilen (Vallat, 2003).
Die demyelinisierende Form (Typ 1) betrifft die Myelinscheiden der Axone und führt durch eine Abnahme der Isolation zu einer verminderten Nervenleitgeschwindigkeit.
Bei der axonalen Form (Typ 2) kommt es dagegen zu einer Schädigung der Fasern im Axon selbst. Dadurch stehen weniger Fasern zur Verfügung stehen, welche aber noch gleich schnell leiten, da die Myelinschicht nicht beeinträchtigt ist. Folglich kommt es zu einer Abnahme der Amplitude, während die Nervenleitgeschwindigkeit nicht oder nur leicht verringert ist (Banchs et al., 2009). In Bezug auf das Vererbungsmuster kann man autosomal dominante (CMT1), autosomal rezessive (CMT4) und x- chromosomale Formen (CMT1X) unterscheiden. Der axonale Typ CMT2 kann sowohl autosomal dominant als auch x-chromosomal vererbt werden (Berger et al., 2002).
CMT kann durch verschiedene Mutationen in Proteinen, die unter anderem für den zellulären Transport, die Formation von Myelin oder die mitochondriale Spaltung und Fusion wichtig sind, verursacht werden (Niemann et al., 2006). Insbesondere Mutationen in Proteinen, die an der mitochondrialen Dynamik beteiligt sind, führen zu den autosomal-rezessiven CMT4A und der autosomal dominanten CMT2A Form (R.
V. Baxter et al., 2002).
Die axonale Form Typ 2A ist mit bis zu 40% der Fälle die häufigste (Szigeti & Lupski, 2009). Mutationen im CMT2A Gen Lokus stehen in Verbindung mit dem Mitofusin 2 Gen. (Neusch et al., 2007).
2.1.2 Klinik und Verlauf
Die Symptome der CMT Krankheit setzen normalerweise in der frühen Kindheit bis zum jungen Erwachsenenalter ein. Diese sind charakterisiert durch eine progressive Polyneuropathie, die zu distaler Muskelatrophie und damit verbundener peripheren Schwäche und den typischen Fuß- und Handdeformationen (Abb.1) führt. Im weiteren Verlauf breitet sich die Schwäche und Atrophie dann auch auf proximale Muskelgruppen aus. Dies führt zu ausgeprägten funktionellen Beeinträchtigungen, die oft mit einer Rollstuhlpflichtigkeit verbunden sind. Abhängig von verschiedenen Untergruppen der CMT Krankheit können auch verschiedene Symptome wie kognitive Einschränkungen, Lernschwierigkeiten, Hör- und Sehschwächen sowie Probleme bei der Sprachproduktion auftreten (Jerath & Shy, 2015).
Abbildung 1: Patienten mit distal betonten Muskelatrophien
Interossäre Atrophie der Mittelhand (A) und pes cavus Deformation (B - D) (Neurogenetikambulanz, Universitätsmedizin Göttingen)
Es sind bisher keine kausalen Therapieoptionen bekannt, jedoch können unterstützende Maßnahmen wie Physio- und Ergotherapie den Patienten helfen besser mit den Symptomen zurecht zu kommen. Zusätzlich können orthopädietechnische und chirurgische Behandlungen zum Funktionserhalt, insbesondere der unteren Extremitäten, beitragen. Rehabilitationsaufenthalte in spezialisierten Kliniken können ebenfalls helfen die Funktionalität möglichst lange zu erhalten. Symptomatisch können Analgetika zur Linderung des neuropathischen und mechanischen Schmerzes eingesetzt werden. Die CMT Krankheit ist keine tödliche Erkrankung und die Lebenserwartung ist nicht eingeschränkt (Jerath & Shy, 2015).
CMT kann durch verschiedene Mutationen in Proteinen, die unter anderem für den zellulären Transport, die Formation von Myelin oder die mitochondriale Spaltung und Fusion wichtig sind, verursacht werden. Die in dieser Arbeit untersuchte R94Q- Mutation des MFN2 Proteins ist essenziell für die mitochondriale Spaltung und Fusion, weshalb im Folgenden genauer auf diesen Vorgang eingegangen wird.
2.2 Mitochondriale Spaltung und Fusion
Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für Zellfunktionen wie Zellatmung, ATP Produktion, Calciumregulation und Apoptose. Sie verfügen über eine Lipiddoppelmembran, ihre eigene extranukleäre zirkuläre DNA und teilen sich unabhängig vom Zellzyklus (Youle & van der Bliek, 2012). Aufgrund dessen wird die Endosymbiontentheorie angenommen, welche besagt, dass die Mitochondrien aus einer Symbiose von Prokaryoten mit Vorläufern heutiger Eukaryoten entstanden sind, indem sie ihre Genomgröße reduziert und die meisten ihrer Gene in das Wirtsgenom integriert haben (Benard & Rossignol, 2008). Die innere Mitochondrienmembran ist eingefaltet und bildet die Cristae, und somit eine massive Vergrößerung der Reaktionsoberfläche. Die am häufigsten erwähnte Funktion der Mitochondrien ist die Produktion von Energie in Form von Adenosin-5’-triphosphat (ATP) während der oxidativen Phosphorylierung. Aufgrund dessen werden Mitochondrien auch als Kraftwerke der Zelle bezeichnet. Mitochondrien sind der Hauptentstehungsort von reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS) und haben eine 5-10fach höhere Konzentration von Superoxiden als das Zytosol. Daher sind Antioxidantien wie Glutathion essentiell
für die Homöostase des Redoxstatus und eine gute mitochondriale Funktion (Benard
& Rossignol, 2008).
Mitochondrien sind dynamische Organellen, die sich ständig spalten und fusionieren, sodass ihre Gestalt von klein und fragmentierte bis zu groß und tubuläre variieren kann. Dieser Prozess ist wichtig für die mitochondriale Bioenergetik und das Überleben der Zelle (Westermann, 2010). Fusion und Spaltung werden durch verschiedene Umwelteinflüsse ausgelöst, wie zellulärer Stress, Schädigung der DNA und Induktion der Apoptose. (Youle & van der Bliek, 2012).
Bei der mitochondrialen Fusion verbinden sich die äußere und innere Mitochondrienmembran und ermöglicht so den Austausch von mitochondrialer DNA, Proteinen und Lipiden. Dies hat eine protektive Wirkung, denn die Fusion eines geschädigten Mitochondriums mit einem gesunden kann das geschädigte wieder funktional werden lassen kann (H. Chen et al., 2003). Die hauptverantwortlichen Proteine für die Fusion sind die GTPasen Mitofusin 1 und 2 (Mfn1/Mfn2) in der äußeren Mitochondrienmembran sowie Optical Atrophy1 (OPA1) in der inneren Mitochondrienmembran (Olichon et al., 2002; Santel & Fuller, 2001).
Abbildung 2: Mitochondriale Fusion und Fission (Saotome et al., 2014)
Wichtige Vermittler für die mitochondriale Spaltung sind DRP1, Fis1 und Mff, sowie das Ganglioside-induced differentiation-associated protein (GDAP1) (Saotome et al., 2014)
Es wurde gezeigt, dass fragmentierte Mitochondrien die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die entsprechende Zelle apoptotisch wird (Suen et al., 2008). Daher könnte angenommen werden, dass die mitochondriale Spaltung ein proapoptotischer Mechanismus ist. Sie kann jedoch auch unabhängig von dieser auftreten.
Interessanterweise führen sowohl eine Mutation von MFN2 als auch von GDAP1 zu klinisch nicht unterscheidbarem CMT, obwohl sie einen entgegengesetzten Effekt auf die mitochondriale Form haben.
2.3 Mitofusin
Mitofusin (MFN1 and MFN2) Proteine sind in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert und ragen in das Zytosol (Koshiba et al., 2004). Am N-Terminalen Ende befindet sich die GTPase Domäne. Das Gen für MFN2 ist auf Chromosom 1 lokalisiert und codiert für ein Protein bestehend aus 757 Aminosäuren und 85 kDa (H. Chen et al., 2003; Filadi et al., 2018). Bisher wurde angenommen, dass MFN2 zwei Transmembrandomänen besitzt, sodass beide Termini dem Zytosol zugewandt sind.
Mattie et al. haben dagegen gezeigt, dass das C-Terminale Ende im mitochondrialen Intermembranraum liegt (Mattie et al., 2018). Zusammen mit Opa1, einem Protein in der inneren Mitochondrienmembran, regulieren MFN1 und MFN2 die Fusion der äußeren und inneren Mitochondrienmembran.
Abbildung 3: Struktur von MFN2
(A) Schema zeigt die lineare Struktur von MFN2, N-terminal liegt die GTPase Domäne, gefolgt von der HR1 Domäne, der PR Domäne und der C-Terminalen HR2 Domäne. (B) MFN2 Topologie mit zwei Transmembrandomänen, nach neusten Ergebnissen könnte das C-terminale Ende auch im Intermembranraum liegen (C) Schema der OMM Fusionsaktivität. Die Fusion wird durch Interaktion der beiden HR2 Domänen, sowie Dimerisierung der GTPase Domäne vermittelt (Filadi et al., 2018).
Sowohl der Knockout von MFN1 als auch der Knockout von MFN2 führt zu frühem Tod im Embryonalstadium (H. Chen et al., 2003), während die Mutation von MFN2 die Charcot-Marie-Tooth Krankheit zur Folge hat (Koshiba et al., 2004). MFN2 Mutationen sind häufig bei der axonalen CMT Krankheit zu finden, weshalb empfohlen wird bei diesem Subtyp auf Mutationen im MFN2 Gen zu testen (Calvo et al., 2009). Die Überexpression von MFN2 führt zu perinukleärer Häufung über Konservierung der C- terminalen Doppelwende Coiled-coil Domäne und mitochondrialer Fusion über die GTPase Domäne (Santel & Fuller, 2001).
Neben dem Einfluss auf die mitochondriale Form, spielt MFN2 eine Rolle in vielen zellulären Prozessen, wie der mitochondrialen Bioenergetik. Seine Runterregulierung reduzierte das mitochondriale Membranpotential und die Zellatmung und das mitochondrialen Protonenleck (Bach et al., 2003). MFN2 wird für die Produktion von mitochondrialem Coenzym Q, einem wichtigen Baustein der mitochondrialen Atmungskette, benötigt. Das Hinzufügen von Coenzym Q zu Zellen mit MFN2 Mangel führt zu einem Anstieg der Zellatmung sowie der mitochondrialen Fusion (Mourier et al., 2015). Die Überexpression von MFN2 dagegen führt zu einer Aktivierung der
Atmungskette (Pich et al., 2005). Kawalec et al. hat dagegen gezeigt, dass murine Fibroblasten mit einem MFN2 Knockout eine höhere Zellatmung haben als Wildtypzellen. Dies lässt vermuten, dass der zelluläre Energiemetabolismus durch Adaptation der mitochondrialen Atmung kompensiert werden kann (Kawalec et al., 2015).
De Brito et al. haben außerdem gezeigt, dass ein Teil des MFN2 im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, insbesondere an spezialisierten Kontaktstellen mit den Mitochondrien, auch mitochondria-associated membranes (MAM) genannt (de Brito & Scorrano, 2008). Die MAM kontrollieren verschiedenste zelluläre Prozesse wie Calciumhomöostase, mitochondriale Dynamik und Mitophagie (Krols et al., 2016; Rowland & Voeltz, 2012). Mitofusin 2 spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der MAM. Der Knockout von MFN2 in MEF Zellen führt zu einer gestörten ER Morphologie, zu verminderter ER-Mitochondrien Interaktion und damit zu einer ineffizienteren Calciumaufnahme in Reaktion auf Inositoltriphosphat (IP3) Stimuli (de Brito & Scorrano, 2008). Ebenfalls wurde gezeigt, dass die R94Q Mutation von MFN2 zu einer Reduktion der MAM, ER Stress, Probleme der intrazellulären Calciumhomöostase sowie gestörter mitochondrialer Dynamik führen (Bernard- Marissal et al., 2019b).
Züchner et al. waren die ersten, die die heterozygote 281G-A Transition im MFN2 Gen bei einer russischen Familie mit CMT2A2A beschrieben haben. Die Mutation entsteht durch eine Substitution von Arginin 94 zu Glutamin (R94Q), die in einer Helixschleife der GTPase-Domäne vorgeschaltet ist. Transgene Mäuse, die diese Mutation exprimieren entwickeln motorische Beeinträchtigungen und Gangstörungen.
Zusätzlich lassen sich distale Akkumulationen von Mitochondrien im Ischiasnerv nachweisen (Cartoni et al., 2010), sowie Defekte der Komplexe II und V der Atmungskette, die mit einem massiven Abfall der ATP Synthese assoziiert sind (Guillet et al., 2011).
El Fissi et al. konnten in einem Drosophila Modell zeigen, dass die R94Q Mutation zu einer Hemmung der Fusion und der Aggregation von fragmentierten Mitochondrien führt (El Fissi et al., 2018).
Van Hameren et al. haben in ruhenden oder stimulierten peripheren, myelinisierten Nervenaxonen in vivo gezeigt, dass die R94Q-Mitochondrien die ATP-Produktion nach axonaler Aktivität nicht hochregulieren, während die H2O2-Produktion weitgehend unbeeinflusst bleibt. Sie schlussfolgerten, dass neuropathische Bedingungen die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und ATP entkoppeln und dadurch möglicherweise die axonale Funktion und Integrität beeinträchtigen (van Hameren et al., 2019).
Bernard-Marissal et al. haben gezeigt, dass die R94Q Mutation die Degeneration der distalen Axone induziert. Zudem führt die Mutation zu einer Reduktion der ER- Mitochondrien Kontaktstellen in Fibroblasten, die von CMT2A Patienten stammen (Bernard-Marissal et al., 2019a).
Picci et al. haben bestätigt, dass R94Q-Mäuse progressive motorische und sensorische Dysfunktionen entwickeln, sowie eine Abnahme in der Acetylierung von α-tubulin in den distalen Segmenten der langen peripheren Nerven. Zusätzlich konnten sie zeigen, dass die Behandlung mit einem neuen selektiven Inhibitor der Histone deacetylase 6 (HDAC6) die Abnahme dieser Acetylierung rückgängig machen konnte und die motorische Funktion der Mäuse wiederhergestellt werden konnte. Somit könnte HDAC6 in der Zukunft auch ein therapeutischer Angriffspunkt für CTM2A Patienten sein (Picci et al., 2020).
2.4 Mitochondriale Calciumhomöostase
Calcium (Ca2+) ist eines der wichtigsten intrazellulären Signalmoleküle. Kontraktion, Sekretion und Proliferation und auch Lernen und Gedächtnisfunktionen werden calciumvermittelt reguliert, um nur einige zu nennen. Seine Konzentration ist extrazellulär 20.000-100.000-mal höher als intrazellulär. Um diesen Gradienten aufrecht erhalten zu können, muss Calcium aktiv nach extrazellulär sowie in das endoplasmatische Retikulum befördert werden. Zu hohe Calciumkonzentrationen wirken toxisch auf die Zelle und können zum Zelltod führen (Berridge et al., 2000). In den Mitochondrien kann Calcium Schlüsselenzyme der Atmungskette aktivieren und so die ATP Produktion steigern (Szabadkai & Duchen, 2008). Durch den Protonengradienten der Atmungskette entsteht ein negatives Membranpotential,
welches die treibende Kraft für den Einstrom von Calcium in die Mitochondrien ist (Rottenberg & Scarpa, 1974). Der wichtigste Kanal für den Calciumeinstrom über die innere Mitochondrienmembran ist der mitochondrial Calcium Uniporter (MCU), ein 40 kDa großer Kanal mit zwei Transmembrandomänen. Seine Überexpression führt über Stimulierung der IP3 Synthese und Freisetzung von Calcium aus dem ER zu einem massiven Anstieg der mitochondrialen Calciumkonzentration (Baughman et al., 2011).
MCU wird durch Mitochondrial calcium uptake 1 & 2 (MICU 1 & 2) reguliert. Sowohl das Fehlen von MCU als auch das von MICU1 oder 2 führt zu schweren Störungen in der Calciumhomöostase (Shamseldin et al., 2017).
Wie bereits in 2.3 beschrieben haben spezialisierte Kontaktstellen zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien, auch MAM genannt, einen wichtigen Einfluss auf die mitochondriale Calciumhomöostase. Der Calciumfluss zwischen den beiden Organellen wird durch einen Komplex aus dem IP3, einem Kanal zur Calciumfreisetzung aus dem ER, dem Chaperon Grp75 und dem OMM voltage dependent anion channel (VDAC) vermittelt (De Mario et al., 2017).
2.5 Mitophagie
Autophagie ist ein Mechanismus der Zelle, um intrazelluläre Komponenten wiederzuverwerten, die Organellenzahl zu regulieren und ebenfalls eine Form der Qualitätskontrolle. Autophagie der Mitochondrien wird als Mitophagie bezeichnet (Youle & Narendra, 2011). Die Mitophagie wird für die Elimination von dysfunktionalen und geschädigten Mitochondrien benötigt und ist essentiell für eine gesunde Mitochondrienpopulation (El-Hattab et al., 2018). Die Mitophagie wurde erstmals in Hefezellen untersucht, wo sie von autophagy-related 32 (Atg32) vermittelt wird. In Säugetieren wird die Mitophagie während der Blutzelldifferenzierung von NIP3-like protein X (NIX; auch als BNIP3L bekannt) reguliert. Zusätzlich wird die Mitophagie in vielen Vielzellern von Parkin und PTEN-induced putative kinase protein 1 (PINK1) reguliert. Mutationen in diesen Proteinen führen zu dysfunktionaler Mitophagie und sind unter anderem mit dem M. Parkinson assoziiert (Youle & Narendra, 2011).
In gesunden Mitochondrien wird das Protein PINK1 kontinuierlich importiert und abgebaut (Narendra et al., 2008). Gerät dieser Import bei geschädigten Mitochondrien
ins Stocken reichert sich PINK1 auf der Oberfläche von geschädigten Mitochondrien an und aktiviert dort Parkin durch Phosphorylierung und allosterisch durch das Generieren von Phosphoubiquitin (pUb) (Kazlauskaite et al., 2014). Parkin ist eine E3 Ubiquitinligase, katalysiert die Ubiquitinierung von Proteinen der äußeren Mitochondrien Membran (OMM) und rekrutiert damit durch Vorwärtskopplung die Ub- bindende Autophagiemaschinerie. Letztendlich werden die Mitochondrien in Lysosomen abgebaut (Heo et al., 2015; Lazarou et al., 2015).
Abbildung 4: Initialisierung der Mitophagie
Mitochondirale Schädigung führt zu Akkumulierung von PINK1 (a), welches daraufhin Parkin aktiviert (b). Ubiquitilierung der OMM (c) was wiederum zur Bildung von Autophagierezeptoren führt (d) (Heo et al., 2015).
McLelland et al. haben beschrieben, dass MFN2 die Autophagie der Mitochondrien durch PINK1 und Parkin reguliert (McLelland et al., 2018). ER Mitochondrien Kontaktstellen werden während der Mitophagie zerstört. Parkin/PINK1 katalysieren massive Phosphoubiquitierungen von MFN2, die wiederum zum p97-abhängige Abbau von Mfn2 Komplexen in der äußeren Mitochondrienmembran führen (McLelland et al., 2018). Dies hat wiederum das Distanzieren der Mitochondrien vom ER zur Folge.
Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Verbindung von Mitochondrien und ER zu einer Suppression der Mitophagie führen (McLelland et al., 2018) .
2.6 Oxidativer Stress
Oxidativer Stress ist definiert als das Ungleichgewicht zwischen der Produktion und der Entfernung von ROS (Halliwell & Whiteman, 2004). Diese enthalten ein oder mehrere ungepaarte Elektronen und werden auch als freie Radikale bezeichnet. Sie können als Elektronenakzeptor agieren und Elektronen von anderen Molekülen aufnehmen. Das andere Molekül wird damit oxidiert, weshalb man freie Radikale auch als Oxidationsmittel bezeichnet. Freie Radikale sind ubiquitär in unserer Umwelt vorhanden, wobei am häufigsten Hydroxyl-Radikale (OH), Superoxid-Radikale (O2ˉ) und Stickstoffmonoxid (NO) vorkommen (Rahman, 2007). Moleküle, wie z.B.
Wasserstoffperoxid (H2O2) und Peroxynitrit (ONOOˉ) sind selbst keine freien Radikale, aber können zur Bildung von diesen führen.
Der Hauptentstehungsort von ROS ist in den Mitochondrien entlang der Elektronen- Transportkette am Komplex I (NADPH-Dehydrogenase) und am Komplex III (Cytochrom-c-Reduktase) (Finkel & Holbrook, 2000). Zusätzlich produzieren Peroxisomen und Enzyme wie die NADPH-Oxidase, Monoaminooxidase, Cyclooxygenase und Lipoxygenase ROS und erhöhen damit den oxidativen Stress.
Die Zelle hat verschiedene Mechanismen zum Abbau von ROS. Zu diesen gehören die Superoxiddismutase, die Katalase und die Glutathonperoxidase. Die Superoxiddismutase katalysiert den Zerfall von Superoxiden in Sauerstoff und Hydrogenperoxid. Die Katalase und die Gluthathionperoxidase reduzieren dann H2O2
zu Wasser.
2.7 Glutathion
Eines der wichtigsten antioxidativen Moleküle ist Glutathion (GSH). GSH ist ein Tripeptid aus den Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin, wobei der Einbau von Cystein der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Glutathionsynthese von Neuronen ist, da diese Cystein nicht selbst herstellen und daher aufnehmen müssen (Tan et al., 2001). Glutathion hat viele verschiedene Funktionen, die drei wichtigsten sind Biotransformation, Cysteinreserve und Redoxpuffer. In der Phase II der
Biotransformation werden schädliche Stoffe an Glutathion gebunden, sind damit besser wasserlöslich und können über die Niere ausgeschieden werden. Die Reaktion wird von Glutathion-S-Transferasen katalysiert. Cystein ist als Aminosäure essenziell für eine funktionierende Proteinbiosynthese. Dieses ist jedoch reaktionsfreudig und geht in einer aeroben Umgebung durch Oxidation zu Cysteinsulfin- und -sulfonsäure ständig irreversibel verloren. Glutathion stellt damit die Notreserve für Cystein dar. Um als Redoxpuffer zu fungieren, wird Glutathion oxidiert, und geht damit von seiner monomeren Form (GSH) in das Dimer Glutathion-Disulfid (GSSG) über. Diese Reaktion wird von der Glutathion Peroxidase katalysiert.
Abbildung 5: GSH/GSSG Zyklus
GSH reduziert katalysiert durch die GSH Reduktase ROS und andere oxidierte Proteine und wird dabei zu GSSG. Dieses wird NADPH abhängig von der GSH Peroxidase zu GSH recycelt.
GSSG kann dann durch die Glutathion-Reduktase (GSR) wieder zu Glutathion reduziert werden. Für diese Reaktion wird das Koenzym NADPH als Reduktionsmittel benötigt. So wird bei gesteigertem GSH-Level und erhöhter Glutathion-Reduktase Aktivität auch vermehrt NADPH benötigt. Dieses kann die Zelle durch eine Steigerung des Pentose- Phosphat Pathways (PPP) produzieren. Im oxidativen Teil des PPP wird Glukose unter NADPH Gewinnung in Ribulose-5-Phosphat umgewandelt, welches dann wiederum im nicht-oxidativen Teil zu Metaboliten der Glykolyse umgewandelt werden kann. GSH liegt normalerweise 100-fach höher vor als GSSG. Dieses Verhältnis spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Redoxsystems der Zelle (Maher, 2005).
Eine weitere Möglichkeit ROS zu reduzieren sind sogenannte uncoupling proteins (UCPs). UCP 1-3 sind mitochondriale Anionencarrierproteine und spielen eine wichtige Rolle darin die ROS-Emission der Elektronentransportkette zu reduzieren. Die Funktion von UCP1 ist noch nicht gänzlich geklärt. UCP 2 und UCP 3 werden von ROS
oder ROS By-Produkten aktiviert und induzieren dann einen Protonenleak und damit eine negative Feedbackschleife für mitochondriale ROS-Produktion. Zusätzlich wurde gezeigt, dass UCP2 und UCP3 von kovalenten Modifikationen durch Glutathion kontrolliert werden. Die reversible Glutathionylation ist folglich notwendig, um UCP2 und UCP3 aber nicht UCP1 zu aktivieren bzw. zu inhibieren. (Mailloux & Harper, 2011).
Zusammenfassend lassen die obigen Ergebnisse die Vermutung zu, dass die R94Q Mutation Auswirkungen auf mitochondriale Dynamik und Calciumhomöostase hat. Ziel dieser Arbeit war es diesen Einfluss in einem Zellkulturmodell insbesondere unter oxidativem Stress genauer zu untersuchen und so die Entstehung der CMT- Krankheit besser zu verstehen.
3 MATERIAL
3.1 Zelllinien
Für diese Arbeit wurden Murine embryonale Fibroblasten (MEF) Zellen von MFN2-/- Mäusen verwendet, die freundlicherweise von Timothy Shutt (University of Calgary) zur Verfügung gestellt wurden. Stabile Zelllinien wurden von Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe mittels Piggybac System generiert (Wolf et al., 2019).
Zusammengefasst wurde ein Piggybac backbone, welcher HA-MFN2-IRES-mCherry- NLS exprimiert, mit einer Transposase kotransfiziert. Nach 1 Woche wurden mCherry positive Zellen mit wiederholter fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung konzentriert, bis
>95% der Zellen mCherry exprimierten. In dieser Arbeit wurde insbesondere mit den Zelllinien Knockout+WT (Rescue) und Knockout+R94Q (R94Q) gearbeitet. Diese Zellen wurden in DMEM high Glucose Medium mit 10% fetal calf serum (FCS) und 1%
Penicillin und Streptomycin in einem Inkubator mit 5% CO2 und 95% Luft bei 37°C kultiviert.
3.2 Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterial Firma
Zell- und Gewebekulturschale (100×20mm) Sarstedt
Napfschale 6, 12, 24, 96 Loch, F-Böden Greiner Bio-One Cellstar® Reagiergefäß 15 ml Greiner Bio-One
Röhre 50ml, 114×28mm, PP Sarstedt
Reagiergefäß 1,5 ml, 2 ml Sarstedt Certified 0,2ml 8 Twin Strip StarPCR Tu Starlab
Kyro-Röhrchen 20, 2ml TPP
Kyrobox JG Labor Center e.k.
Cellstar® Zellkulturflaschen 250ml Greiner Bio-One Pipette 2,5;10;100;1000 μl Eppendorf
Multipipette® Eppendorf
accu-jet® pro Brand
Serologische Pipette Cellstar®
5 ml;10 ml; 25 ml; 50 ml
Greiner Bio-One
Combitips advanced® 0,5; 2,5; 5ml Eppendorf Biopur Pipettenspitzen 10 μl; 200 μl; 1000 μl Star Lab
TipOne®, Filter Tip Starlab
Filter Tip Greiner Bio-One
Zellschaber Greiner Bio-One
Wägeschalen A Hartenstein
Steriler Spritzen Filter VWR internationale
Spritze, 5ml BD Discardit
Luna™ Zell-Zählkammern Logos Biosystems
Neubauerkammer Precicolor HBG
Menzel-Gläser, Deckgläser Thermo Scientific Mini-PROTEAN® TGX™ Stain Free Precast
Gels 4-20%
Bio-Rad Trans-Blot® Turbo™ Mini PVDV Transfer
Pack
Bio-Rad
Tabelle 1: Verbrauchsmaterialien
3.3 Medium
Medium Firma
Dulbecco's modified eagle's medium High Glucose mit Glukose, Sodium Pyruvat, L-Glutamin
Sigma Aldrich
Opti-Mem® Gibco Life
Technologies
Tabelle 2: Medium
3.4 Puffer, Chemikalien
Puffer Firma
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma Aldrich 0,05 % Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies HyClone™ Fetal Bovine Serum (FCS) Thermo Scientific 10 000 Units/ml Penicillin und 10 mg/ml
Streptomycin
Sigma Aldrich Complete Mini Protease Inhibitor Roche Diagnostics
RIPA Lysis and Extraction Buffer Perbio Science
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma Aldrich
Dimethyl fumarate 97% Sigma Aldrich
Lipofectamine® RNAiMAX™ Reagent Invitrogen by Life Technologies Ethanol Rotipuran 99,8%, p.a. Roth
Milchpulver Roth
Tween® 20 Roth
Ambion,Nuclease-Free Water Nalgene
1,4-Dihiothretiol (DTT) Roth
Glycerin Roth
TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) MP Biomedicals
Natriumchlorid (NaCl) Roth
Tabelle 3: Puffer, Chemikalien
3.5 Antikörper, Farbstoffe, Marker
Antikörper, Farbstoff, Marker Firma
Trypanblau, 0,4% Invitrogen
MagicMark™ XP Western Protein Standard Invitrogen CellTiter-Blue® Cell Viability Assay Promega
Bromphenolblau Sigma-Aldrich
Midori Green Nippon Genetics Europe
1 kb plus DNA ladder Invitrogen
Anti-Aktin (mouse) Millipore
Anti-MFN2 (rabbit) Millipore
TMRE (Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate) 10 μM
Sigma-Aldrich, 87917 CellROX Green Reagent 5 μM Molecular Probes, C10444
Tabelle 4: Antikörper, Farbstoffe, Marker
3.6 Plasmide
Plasmid Referenz
pIND(SP1) mt-Keima Prof. Atsushi Miyawaki,
RIKEN Brain Science Institute, Japan
pDsRed2- Mito-Timer Addgene, 52659
pCMV CEPIA 3mt Addgene, 58219
pTurbo635N-Mito (MitoFarRed) Prof. Axel Methner lab pENTR6c mito-GFP (GFP Parkin) Prof. Axel Methner lab
Tabelle 5: Plasmide
3.7 Kits
Bezeichnung Firma
Quick-gDNA™ MiniPrep Zymo Research Corporation,
D3025
BC Assay Protein Quantification Kit Interchim, Wörgl, Austria
ZR RNA MiniPrep Kit Zymo Research Corporation,
R1064
High Capacity cDNA Reverse Transkription Kit Applied Biosysems
Tabelle 6: Kits
3.8 Geräte
Gerät Firma
Luna™ Automatischer Zellzähler Logos Biosystems
Vortexe-2-Genie Scientific Industries
Vortexer Biozym
Heraeus Multifuge 3L-R Zentrifuge Thermo Scientific Heraus Multifuge X1 Zentrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 21 Zentrifuge Thermo Scientific
Aqualine AL 12 Warmwasserbad LAUDA
JB Aqua 5 Plus Wasserbad Grant
Motic AE20 Serien Mikroskop Motic
Olympus IX 51 Mikroskop Olympus
Vacusafe Absaugpumpe Integra
MSC-Advantage Sterilbank Thermo Scientific
Abzugshaube Infralab
CO₂-Inkubator MCO-20AIC Sanyo
Kühlraum 4° Viessman
Kühlschrank Liebherr Comfort
Gefrierschrank -80°C Sanyo
Gefrierschrank -20° Liebherr Comfort
Schüttelplatte GFL 3011 GFL
Reax 2 Schüttelplatte Heidolph
Grobwaage ALC-810.2 Acculab-Sartorius Group
MR Hei-Standard Magnet-Rührer Heidolph
pH-Meter CG 810 Schott Geräte
Thermomixer comfort Eppendorf
Stoppuhr VWR
Milli-Q Plus Anlage Millipore
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad
Trans Blot Turbo Bio-Rad
Power Pac Basic Bio-Rad
Mini Protean Tetra Cell Bio-Rad
Infinite M200Pro, Tecan Reader Tecan
peQSTAR 96 universal peQlab
The Odyssee Sa Infrared Imaging System Li-Cor
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Tabelle 7: Geräte
3.9 Programme
Programm Firma
Adobe Illustrator CS6 Adobe
Adobe Photoshop CS6 Adobe
Image Studio Lite Version 3.1 LI-CO
Graph Pad Prism 6 Graph Pad Prism
ODYSSEY Sa Li-Cor
Microsoft PowerPoint 2010 Microsoft Corporation
Microsoft Exel 2010 Microsoft Corporation
Image J National Institutes of Health
Tabelle 8: Programme
4 METHODEN
4.1 Zellbiologie
4.1.1 Kultur und Passagieren von MEF- Zellen
Die MEF-Zellen wurden bei 37°C und einem Kohlenstoffdioxidgehalt von 5% in Zellkulturmedium inkubiert. Als Zellkulturmedium wurde Dulbesso’s Modified Eagle’s Medium with high Glucose, L-glutamine and Sodium Pyruvate verwendet, dem 10%
FCS (fetal calf serum) sowie 1% Penicillin und Streptomycin zugesetzt wurden. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage bei einer Konfluenz von 95% passagiert. Hierzu wurde das Medium abgesaugt und die Platte mit 6 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS;
phosphate buffered saline) gewaschen, um Reste des FCS zu entfernen. Dies ist notwendig, damit das FCS nicht das im nächsten Schritt zugegebene Trypsin hemmt.
Die 1 ml 0.05%-Trypsin-EDTA lösen die adhärenten Zellen von der Schale, wobei dieser Prozess durch Auf- und Abpipettieren verstärkt wurde. Anschließend wurden 9ml Medium hinzugegeben, um den Prozess zu stoppen. Zuletzt wurden die Zellen in 1:40er Verdünnung in eine neue Petrischale mit vorgelegtem Medium überführt.
4.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerkammer
Die Neubauerkammer besteht aus neun gleich großen Quadraten, wobei zum Zählen der Zellen die äußeren vier Quadranten verwendet werden. Zunächst muss beachtet werden, dass die Konzentration der zu bestimmenden Probe zwischen 2,5x105- 2,5x106 Zellen/ml liegen sollte. Ist dies nicht der Fall muss die Probe weiter verdünnt werden. Anschließend wurden 10 µl der Zellsuspension mit 10 µl Tryptanblau verdünnt. Dieses ist ein Diazofarbstoff und wird von lebenden Zellen nicht aufgenommen, kann jedoch durch die zerstörte Zellmembran toter Zellen dringen und diese anfärben. In die Neubauerkammer wurden 10 µl der Tryptanblau-MEF- Zellsuspension pipettiert und mindestens zwei diagonal voneinander liegende Quadranten ausgezählt. Daraufhin kann die Konzentration der Ausgangsprobe wie folgt berechnet werden:
𝑍𝑒𝑙𝑙𝑧𝑎ℎ𝑙/𝑚𝑙 =Zellzahl×Verdünnung×Kammerfaktor (104) Anzahl gezählter Quadrate
4.1.3 Automatisierte Zellzahlbestimmung
Zur automatisierten Zellzahlbestimmung wurde die Probe zunächst ebenfalls mit Tryptanblau 1:2 verdünnt. Anschließend wurden 10 μl der Mischung in eine Zählkammer überführt und mit dem Luna automated cell counter gezählt.
4.1.4 Zellviabilitätsbestimmung
Um die Viabilität der Zellen zu bestimmen, wurde der CellTiter-Blue® Cell Viability Assay der Firma Promega verwendet. Dieser beruht auf der Fähigkeit lebender Zellen den Redoxindikator Resazurin in das fluoreszierende Endprodukt Resorufin zu überführen. Je 3000 MEF Zellen/Loch wurden als Triplets in 100 µmol Zellkulturmedium auf einer 96 Lochnapfschale ausplattiert und 24 h bei 37°C und 5%
CO₂ inkubiert. Anschließend wurde das Zellkulturmedium entfernt und 0 µM, 0.01 µM, 0.1 µM, 1 µM, 10 µM und 100 µM H2O2 zugegeben und für weitere 24 h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Daraufhin wurde das Medium abgesaugt und CellTiterBlue Reagenz hinzugegeben und für 4h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Danach erfolgte die Fluoreszenzintensitätsbestimmung photometrisch mit dem Infinite® 200 PRO (Tecan) Reader bei einer Wellenlänge von 590 nm.
4.1.5 Zellproliferationsbestimmung
Um die Proliferation der Zellen zu messen, wurde der RealTime Glo MT Cell Viability Assay verwendet. Die NanoLuc Luciferase sowie das MT Cell Viability Substrat werden dem Zellkulturmedium zugefügt. Anschließend wird das MT Cell Viability Substrat von den lebenden Zellen reduziert und steht daraufhin der NanoLuc Luciferase zu Verfügung, die ein lumineszierendes Endprodukt herstellt. Die Fluoreszenzintensität ist damit proportional zu den lebenden Zellen. Das Besondere an diesem Assay ist, dass die Lumineszenz kontinuierlich für bis zu 72 h gemessen und somit auf die Zellproliferation rückgeschlossen werden kann.
Es wurden je 750 Zellen pro Loch in eine weiße 96er-Lochnapfschale ausplattiert. MT Cell Viability Substrat und NanoLuc Luciferase wurden 1:1000 in Zellkulturmedium verdünnt. Nach 30 min wurde die erste Lumineszenzmessung im 37°C vorgewärmten Tecan Reader durchgeführt. Nach 24 h, wurde zunächst eine 2. Messung
durchgeführt. Anschließend wurde bei der Hälfte der Zellen 10 µl einer 1 mM H2O2
Lösung den 100 µl Zellkulturmedium hinzugefügt, sodass eine H2O2 Konzentration von 100 µM entstand. Nach 48 h und 72 h wurden zwei weitere Messungen durchgeführt.
4.1.6 Zelluläre ROS Messung mit CellROX® Green Reagenz
CellROX® Green Reagenz ist eine fluorogene Sonde zur Messung des oxidativen Stresses in lebenden Zellen. Der membrangängige Farbstoff ist in reduziertem Zustand schwach fluoreszierend und zeigt bei Oxidation durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine hellgrüne photostabile Fluoreszenz. Es wurden 4000 Rescue sowie 4000 R94Q MEF Zellen in 250 µl Zellkulturmedium in einem ibidi Slide ausplattiert und nach 24 h die eine Hälfte über 24 h mit 100 µM H2O2 behandelt. Nach weiteren 24 h wurde zunächst aus der 2,5 mM Stammlösung eine 5 µM Färbelösung hergestellt, indem das CellROX Reagenz 1:5000 in DMEM ohne FCS verdünnt wurde.
Die Ibidi-Slides wurden mit DMEM ohne FCS einmal gewaschen und dann 250 µl Färbelösung pro Kammer hinzugefügt. Anschließend wurde bei 37°C für 30 min inkubiert und daraufhin 3x mit PBS gewaschen. Danach wurde angewärmtes DMEM Medium ohne Phenolrot hinzugefügt und die Flurenzenzintensität bei 485/520 (ex/em) am konfokalen Mikroskop (Leica TCS SP5) gemessen.
4.1.7 Mitochondriale Membranpotentialmessung mit TMRE
Tetramethylrhodamin-Ethylester (TMRE) ist ein membrangängiger, nicht zytotoxischer Fluoreszenzfarbstoff und kann aufgrund dessen im life Cell Imaging verwendet werden. Der Farbstoff verfügt über eine positive Ladung und akkumuliert deswegen in den negativ geladenen Mitochondrien. Bei einer Depolarisation der Mitochondrien, wie zum Beispiel zu Beginn der Apoptose werden die dort gespeicherten Anionen freigesetzt und demnach sinkt auch die TMRE-Konzentration.
Tetramethylrhodamin-Ethylester (TMRE) Pulver wurde in 486 µl Dimethylsulfoxide (DMSO) verdünnt, um eine 100mM Stammlösung zu erhalten. Für den Versuch wurde durch Verdünnen in Zellkulturmedium ohne FCS eine 25 nM Lösung hergestellt. Es wurden je 3500 Zellen der Rescue und R94Q Zelllinine in 250 µl Zellkulturmedium in einem ibidi Slide ausplattiert. Nach 24 h wurden die Zellen hälftig mit 100 µM H2O2
behandelt. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen mit 25 nM TMRE Färbelösung bei
37°C für 30 min gefärbt und anschließend zweimal mit warmem PBS gewaschen.
TMRE besitzt zwei Absorptionsmaxima bei λmax = 515 nm und 555 nm sowie ein Emissionsmaximum bei λmax = 575 nm. Daher wurden Bilder mit dem SP5 Konfokalen Mikroskop (Leica) bei 561 nm gemacht. Die Fluoreszenzintensität wurde anschließend mit Image J bestimmt. Als Positivkontrolle wurde FCCP verwendet.
4.1.8 Glukoseaufnahme
Um die Glukoseaufnahme der Zellen zu messen, wurde der Farbstoff 2-NBDG (2-(N- (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) verwendet. Bei diesem handelt es sich um ein Glukoseanalogon, welches zum Life Imaging der Glukoseaufnahme und damit als Indikator der Zellviabilität verwendet werden kann.
Es wurden je 3500 Zellen der Rescue und R94Q Zelllinie in 250 µl in einem ibidi Slide ausplattiert. Nach 24 h wurden die Zellen hälftig mit 100 µM H2O2 behandelt. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen mit 100 µM 2-NBDG Färbelösung für 60 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde zweimal mit PBS gewaschen und daraufhin in phenolrotfreiem Medium Bilder am konfokalen Laser Mikroskop aufgenommen. Da das Absorptionsmaxima bei λmax = 485 nm liegt, wurde der 488 nm Argon Laser verwendet. Zuletzt wurde die Fluoreszenzintensität mithilfe von Image J analysiert.
4.2 Molekularbiologie
4.2.1 Transiente Transfektion
Als Transfektion wird das Einbringen von DNA, meist in Form von Plasmiden, in eukaryotische Zellen bezeichnet. Hierbei wird zwischen transienter Transfektion und der Herstellung von stabiler Zelllinien unterschieden. Bei der transienten Transfektion wird die DNA für das Protein nicht in das Genom der Zelle integriert, daher wirft die Zelle das Plasmid nach einigen Zellteilungen wieder ab. Das Protein wird also nur für eine kurze Dauer (transient) exprimiert. Bei der Herstellung von stabilen Zelllinien wird neben der DNA zusätzlich ein Plasmid für eine piggyBac Transposase transfiziert (Nickel et al., 2016). Diese integriert den DNA-Abschnitt mit dem zu transfizierenden Protein in das Genom der Zelle, sodass das Protein dauerhaft exprimiert wird.
Ein Plasmid besteht mindestens aus folgenden Teilsequenzen: einem Origin of Replication (kurz ORI), an dem die RNA-Polymerase ansetzt und mit der Transkription beginnt und eine Sequenz für ein Protein, bzw. eine „Leersequenz“ als Kontrolle. Die meisten Plasmide enthalten zudem eine Sequenz für ein fluoreszierendes Protein oder eine Antibiotikaresistenz, welches als Kontrolle der Transfektion dienen kann. Zellen, bei denen die Transfektion erfolgreich war, leuchten unter einem Fluoreszenzmikroskop oder verfügen über eine neue Antibiotikaresistenz. Der Anteil der transfizierten Zellen an der Gesamtzahl der Zellen wird als Transfektionseffizienz bezeichnet.
Je nach Zellart gibt es hierzu verschiedene Methoden, in dieser Arbeit wurde die Lipofektion verwendet. Bei dieser werden die Nukleinsäuren in Liposomen eingeschlossen beziehungsweise an diese gebunden. Diese Liposomen fusionieren nach Endozytose mit der Endosomenmembran, wodurch die DNA freigesetzt wird.
4.2.1.1 Transfektion mit den Plasmiden CEPIA3mt und Mito-TurboFarRed
Zunächst wurden 4000 MEF Zellen jeder Zelllinie in 250 µl Medium auf ein Ibidi Slide, zur anschließenden Auswertung am konfokalen Mikroskop (Leica TCS SP5), ausplattiert. Diese Zellzahl wurde so gewählt, dass die Zellen zum Transfektionszeitpunkt 60-80% konfluent waren. Nach einer Inkubationszeit von 24 h, um das Anheften der Zellen an dem Slide zu gewährleisten, wurde die eigentliche Transfektion vorgenommen. Hierzu wurden zunächst in einem Mikroreaktionsgefäß 100 µl Opti-MEM® Medium mit 8 µl Lipofectamine vermischt. Zusätzlich wurde in einem anderen Mikroreaktionsgefäß je 2,5 µl der Plasmide CEPIA3mt und Mito- TurboFarRed, was einer DNA-Konzentration von 2,5 µg entspricht, mit 125 µl Opti- MEM® Medium gemischt. Anschließend wurden je 90 µl beider Ansätze in ein drittes Mikroreaktionsgefäß überführt. Dieses wurde homogenisiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt wurden 10 µl dieser Lösung auf jedes Loch gegeben, was einer Plasmidkonzentration von 100 µg Plasmid pro Loch entspricht.
4.2.1.2 Transfektion mit den Plasmiden MtKeima, Mitotimer, GFP-Parkin und Mito- TurboFarRed
Bei den Transfektionen wurde wie in 1.2.1.1 beschrieben vorgegangen. Es wurde lediglich anstelle der oben genannten Plasmide 3 µg des Plasmides MtKeima, bzw. je 2,5 µg der Plasmide GFP-Parkin und Mito-TurboFarRed bzw. 4 µg des Plasmides Mitotimer verwendet.
4.2.2 RNA Isolation
Um die RNA aus den MEF-Zellen zu isolieren, wurde das ZR RNA MiniPrep Kit der Firma Zymo Research verwendet. Das Prinzip beruht auf der single step Methode (Chomzynski & Sacchi, 1987)bei der im ersten Schritt die Proteine denaturiert werden.
Im zweiten Schritt werden die Proteine durch Phenol entfernt und die DNA Fragmente sammeln sich nach Zentrifugation in der Interphase. Die RNA bleibt in dem wässrigen Überstand zurück. Es wurde nach dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Dafür wurde von konfluenten MEF-Zellen das Zellkulturmedium entfernt, mit PBS gespült und dann die Zellen durch Trypsin von der Lochnapfschale gelöst. Anschließend wurde wieder Medium hinzugefügt und 3 min bei 1300 rpm zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 400 µl RNA Lyse Puffer suspendiert und für 1 min bei 12000 G zentrifugiert.
Anschließend wurde das Lysat in eine Zymo-Spin III C Säule im Auffangröhrchen überführt und für 30 S bei 8000 G zentrifugiert. Der Durchfluss wurde im Auffangröhrchen aufbewahrt und mit 0,8 Volumen Ethanol (95-100 %) vermischt.
Diese Mischung wurde in eine Zymo-Spin II C Säule mit Auffangröhrchen überführt und für 1 Min. bei 12000 G zentrifugiert.
Dann wurden 400 µl RNA Waschpuffer in die Zymo-Spin II C Säule gefüllt und abermals für 30 s bei 12000 G zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Im nächsten Schritt wurde ein DNase Cocktail für jede Probe vorbereitet, dafür wurden 10 µl RNase-Free DNase 1, 10 µl 10x Reaction Buffer und 80 µl DNase/ RNase-Free Water zusammen pipettiert.
Die Zymo-Spin II C Säule wurde in ein RNase freies Röhrchen überführt und dann wurden 100 µl des zuvor hergestellten DNase 1 Cocktails auf die Matrix der Säule pipettiert. Das Ganze wurde für 30 s bei 500 zentrifugiert. Die Säule und der Durchfluss
wurden im RNase freien Röhrchen aufbewahrt und bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert und dann bei 12000 G für 30 Sek zentrifugiert. Anschließend wurde die Zymo- Spin II C Säule in ein neues Auffangröhrchen überführt. Zu dem vorher gewonnenen Durchfluss (100 µl) wurden 300 µl RNA Lyse-Puffer im RNase freien Röhrchen hinzugefügt und gut gemischt. Daraufhin wurden 400 µl Ethanol dazu pipettiert und die ganze Mischung auf eine Zymo-Spin II C Säule in einem Auffangröhrchen übertragen und für 30 s bei 12000 G zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Im nächsten Schritt wurden 400 µl RNA Prep-Puffer der Säule hinzugefügt und für 1min bei 12000 G zentrifugiert. Daraufhin folgten einige Waschschritte. Zuletzt wurden 25 µl DNase/RNase freies Wasser direkt auf die Säule aufgetragen und nach 1 min Inkubationszeit bei RT für 30 s bei 10000 G zentrifugiert, um die RNA aus der Säule zu extrahieren. Die RNA konnte nun direkt weiterverwendet oder bei -70 °C gelagert werden.
4.2.3 Polymerase-chain-reaction (PCR) und Sequenzierung
Die Polymerasekettenreaktion dient der in vitro Amplifikation von einem bereits bekannten DNA Stück und findet im Theromocycler statt. Die PCR wurde zur Seqenzierung des MFN2 Gens verwendet, um die Zelllinien Rescue und R94Q zweifelsfrei zu identifizieren. Es werden zwei Primer benötigt, die den zu sequenzierenden DNA-Abschnitt am 5‘ und in 3‘ Ende einrahmen, Desoxynucleosidtriphosphate zur Strangverlängerung sowie eine DNA-Polymerase. In diesem Fall wurde die Herculase II verwendet. Die PCR besteht aus verschiedenen Schritten: der Denaturierung, der Hybridisierung und der Polymerisierung. Zur Denaturierung erhitzt sich der Thermocycler auf 95°C, um sicherzustellen, dass die DNA Doppelstränge sich trennen. Anschließend findet bei 68°C die Hybridisierung der Primer statt. Zuletzt wird das Gerät wieder auf 72°C erwärmt, da bei dieser Temperatur die Polymerase ihr Temperaturoptimum hat. Diese Schritte werden zwischen 20 und 30mal wiederholt bis die gewünschte DNA Konzentration erreicht ist. Anschließend wird die DNA durch Agarosegelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Je höher die Konzentration der Agarose in dem Gel bilden sich mehr Quervernetzungen und somit auch ein feinerer Filter. Durch eine angelegte Spannung wandert die negativ geladenen DNA zum positiven Pol. Kürzere DNA-Stücke können das Gel besser
passieren und wandern daher weiter zum Positiven Pol, sodass eine Auftrennung nach Größe geschieht. Anschließend wurde das Gel mittels UV-Licht detektiert.
Um die Basenabfolge eines DNA-Abschnittes zu bestimmen wurde diese mit Nuklease-freiem Wasser auf die Konzentration c = 50 ng/µl verdünnt und bei GATC- Biotech per Sanger-Sequenzing sequenziert.
4.2.4 cDNA Synthese
Um aus der RNA die komplementäre DNA, auch cDNA genannt, zu generieren, wird eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die reverse Transkriptase verwendet. Hierzu wurde das High Capacity cDNA Reverse Transkription Kit von Applied Biosysems verwendet. Es wurden 20 µl der zuvor isolierten RNA mit 2ul Reverse Transkriptase Puffer, 1,6 µl eines 25x Desoxyribunukleosidtriphosphate(dNTP) Mix; 4 µl eines 10x Random Primers; 2 µl der Reversen Transkriptase und 8,2 µl Nuklease freies Wasser miteinander vermischt. Im Cycler wurde dann in temperaturabhängigen Schritten die cDNA synthetisiert: 10min bei 25°C, 120min bei 37°C, 5min bei 85°C und zuletzt 8min bei 4°C.
4.2.5 Glutathionassay
Der Glutathionassay dient zur Bestimmung des GSH- und des GSSH-Gehaltes. Das Prinzip liegt darin, dass GSSG mit Hilfe der Glutathionreduktase und NADPH zu GSH reduziert wird. Dieses wird wiederum durch DTNB in einer nichtenzymatischen Reaktion unter Entstehung von gelb gefärbtem 2-Nitro-5-thiobenzoat (TNB-) zu GSSG oxidiert.
Zunächst wurden 150000 Zellen pro Loch in einer 6-Lochnapfplatte ausplattiert und nach 24 h die Hälfte der Zellen mit 100 µM H2O2 behandelt. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen auf Eis mit kaltem PBS gewaschen und mit Hilfe von 200 µl PBS mit einem Zellkratzer von der Platte gelöst. Anschließend wurden die Zellen in ein Mikroreaktionsgefäß mit 100 µl 10% SSA pipettiert, um die Proteine zu präzipitieren.
Nach einer Inkubationszeit von 10 min wurde weitere 10 min bei 4°C und 14000 rpm zentrifugiert. Daraufhin wurden 280 µl des Überstandes in ein Mikroreaktionsgefäß mit
24 µl TEA/H2O-Mischung gegeben. Das Zellpellet wurde über Nacht bei 37°C in NaOH gelöst und anschließend zur Proteinbestimmung mittels BCA-Assay verwendet.
Für den GSH-Assay wurden zunächst in Duplikaten je 20 µl einer GSH-Standardreihe (0-20uM) aufgetragen und Triplets der 4 Proben. Nach Zugabe von je 100 µl des Assay Mix bestehend aus DTNB, NADPH und der Glutathionreduktase wurde über 30 min die Absorption bei 412 nm im Infinite® 200 PRO (Tecan) Reader gemessen.
4.2.6 Mitochondriale Calciumbestimmung
Um die mitochondriale Calciumkonzentration messen zu können, wurden die Zellen wie unter 1.2.1 beschrieben mit den Plasmiden CEPIA3mt und Mito-TurboFarRed transfiziert. CEPIA3mt zeigt das mitochondriale Calcium an, während Mito- TurboFarRed ein mitochondrialer Expressionsmarker ist.
4000 Rescue sowie R94Q-Zellen wurden in 250 µl Zellkulturmedium in einem ibidi- Slide ausplattiert. Anschließend wurden die Zellen mit den Plasmiden Cepia und MtFarRed transfiziert (siehe 7.2.1) und nach 24 h für 24 h mit 100 µM H2O2 behandelt.
Die Fluoreszenzintensitätsbestimmung erfolgte am SP5 konfokalen Laser Scanning Mikroskop bei 488/530 (ex/em) für CEPIA3mt und bei 633/640 (ex/em) für Mito- TurboFarRed. Zuletzt wurde die CEPIA3mt Fluorenzenzintensität auf die Mito- TurboFarRed Fluorenzenzintensität normalisiert.
4.3 Proteinbiochemie 4.3.1 Probengewinnung
Um eine Probe aus einer Zellkultur zu gewinnen, wurden die Zellen im Medium zunächst zentrifugiert. Anschließend wurde das Medium entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und das PBS ebenfalls entfernt. Dann wurde der Probe 100 µl Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA)-Puffer mit Proteinase- und Phosphatase- Inhibitor zugegeben, diese auf Eis 10 min inkubiert und dann bei maximaler Geschwindigkeit und 4°C 30 min zentrifugiert. Daraufhin befanden sich die Proteine im Überstand.
4.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur Konzentrationsbestimmung der Proteine wurde der Bicinchoninsäure (BCA-) Test der Firma Interchim (BC Assay Protein Quantification Kit) verwendet. Dieses Verfahren beruht auf einer Reduktion von Cu2+ Ionen zu Cu-Ionen, welche einen Farbkomplex mit BCA bilden. Diese Farbkomplexe können dann photometrisch bei einer Wellenlänge (λ) von 562 nm analysiert) werden. Als erstes wurden die Proteinproben 1:100 mit Nukleinsäure freiem Wasser verdünnt und anschließend als Triplet auf eine 96 Lochplatte aufgetragen. Als Vergleichswerte wurde eine Rinderserumalbumin (BSA)-Standardreihe mit verschiedenen Konzentrationen (0;6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 µg/ml) hergestellt und als Triplett mit je 15 µl pipettiert. Anschließend wurden den vorgelegten Lösungen je 100 µl des BC Assay Mix (Reagenz A+B 1:50) hinzugefügt und bei 37°C für 30 min inkubiert. Zuletzt erfolgte die photometrische Analyse bei einer Wellenlänge von 562 nm am Infinite® 200 PRO (Tecan) Reader. Zur Auswertung und Berechnung der Proteinkonzentrationen wurde Excel verwendet.
4.3.3 SDS Page
Zur Auftrennung der Proteine nach ihrer molekularen Größe wurde die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet. Hierbei wird das Probenmaterial zunächst 3 min bei 100°C denaturiert mit Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt, welches sich an diese lagert und ihnen somit eine stark negative Ladung gibt.
Zusätzlich wird Dithiothreitol (DTT) der Probe zugefügt, um die Disulfidbrücken zu brechen, sowie das schwere Glycerol, um die Proben besser in die Taschen sinken zu lassen. Außerdem ist dem Puffer der Farbstoff Bromphenolblau zugesetzt. Dieser wandert aufgrund seiner geringen Größe schneller als die Proben, sodass man eine optische Kontrolle hat, wann die Elektrophorese zu beenden ist.
Durch das Anlegen einer Spannung wandern die negativ geladenen Proteine zur positiv geladenen Anode. Die Geschwindigkeit wird durch die Größe der Proteine sowie die Beschaffenheit des Gels bestimmt. Meist bestehen Gele aus einem 5%
Polyacrylamid-Gel (Sammelgel) und einem höher konzentrierten Polyacrylamid-Gel (Trenngel). Das Sammelgel dient dazu alle Proben möglichst gleichzeitig in das Trenngel eintreten zu lassen, in dem die endgültige Aufteilung nach Molekulargewicht erfolgt. In diesem Fall wurde ein 10% Mini PROTEAN Membrane Stain Free Gel von
Bio-Rad verwendet, welches vertikal in eine Gelelektrophoresekammer mit 1fachem SDS Puffer gehängt wurde. Als Marker wurden 5 µl MagicMark XP Western Protein Standard in die erste Tasche pipettiert, gefolgt von den Proben. Anschließend wurde 15 min eine Spannung von 300 V angelegt.
4.3.4 Westernblot
Nach dem SDS Page wurden die Proteine von dem Gel auf eine Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran überführt. Hierzu wurde TransBlot Turbo von Bio-Rad verwendet.
Indem ein elektrisches Feld angelegt wurde, binden die Proteine über hydrophobe Interaktionen an die Membran. Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wurde die Membran für eine Stunde mit 3% in PBST gelöstes Milchpulver bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der primäre Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten mit PBST, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Der sekundäre Antikörper, welcher an die Spezies-spezifische Fc-Region des primären Antikörpers bindet, ist mit einem fluorochrome konjugiert, der am Ende mit dem infrarot Bildsystem (ODYSSEY) detektiert werden kann. Der sekundäre Antikörper wurde für 1h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, um das Ausbleichen des Fluoreszenzmarkers zu verhindern. Anschließend wurde drei Mal mit PBST gewaschen, dann der Blot in PBS gegeben und die Fluoreszenz mit dem ODYSSEY infrarot Bildsystem detektiert.
5 ERGEBNISSE
5.1 Validierung der R94Q und Rescue Zelllinien
Um die Auswirkungen der R94Q Mutation zu untersuchen, wurden von anderen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe stabile Rescue (KO+WT) und R94Q (KO+R94Q) Zelllinien hergestellt. Hierzu wurden embryonalen Mäusefibroblasten (MEF-Zellen) von MFN2 knockout Mäusen verwendet, welche freundlicherweise von Timothy Shutt (Universität von Calgary) zur Verfügung gestellt wurden. Um mögliche toxische Effekte von Antibiotika, die oft zum Generieren von stabilen Zelllinien genutzt werden, zu vermeiden wurden wie folgt vorgegangen: Die MEF Zellen wurden, mittels Piggybac System mit einem HA-markierten MFN2 (WT oder R94Q) transfiziert und anschließend mittels fluorenzenzaktivierter Zellsortierung die mCherry positiven Zellen konzentriert.
Alle stabil transfizierten Zellen exprimieren ein rot fluoreszierenden mCherry-Protein hinter der internal ribosomal entry site (IRES), während Zellen mit einem zusätzlichen mCherry vor dem IRES-mCherry als Negativkontrolle dienen (Wolf et al., 2019).
Zu Beginn meiner Arbeit habe ich zunächst bestätigt, dass beide Zelllinien gleichermaßen MFN2 exprimieren. Abbildung 1A zeigt den Westernblot der verschiedenen Zelllinien. Bei 86 kDa ist die Bande von MFN2 zu erkennen, bei 40 kDa die der Ladekontrolle β-Aktin. Das überexprimierte MFN2 läuft aufgrund des N- terminalen HA-Tags langsamer. Wie zu erwarten gibt es bei WT, KO+WT und KO+R94Q jeweils eine MFN2 Proteinbande, während bei KO und KO+EV keine Bande zu sehen ist. In Abbildung 1B ist die Auswertung des Blots dargestellt. Es ist zu erkennen, dass KO+WT (Rescue) Zellen und KO+R94Q-Zellen (R94Q) vergleichbare Mengen an MFN2 exprimieren, wobei dies mehr ist als bei den Wildtyp-Zellen.
Abbildung 6: Rescue und R94Q exprimieren vergleichbare MFN2 Mengen
