6.1 KO+WT und KO+R94Q exprimieren gleiche Mengen an MFN2, die jedoch über dem MFN2 des WT liegen
Ziel der Arbeit war es, die Auswirkungen der R94Q Mutation des MFN2 Gens, insbesondere bei oxidativem Stress, besser zu verstehen. Grundvoraussetzung dafür ist es, zwei vergleichbare Zelllinien zu haben, die sich möglichst nur im Vorhandensein von Wildtyp Gen und Mutation unterscheiden. Um dies zu erreichen, wurden mit dem gleichen Verfahren (vgl. 3.1) die Zelllinien KO+WT und KO+R94Q hergestellt.
Anschließend wurde kontrolliert, dass beide Zelllinien in gleiche Mengen von MFN2 exprimieren, da ansonsten die beobachteten Effekte auch durch Über- oder Unterexpression von MFN2 bedingt sein können. Zusätzlich wäre es wünschenswert, wenn das MFN2 von KO+WT dem des WT entspräche, um ein möglichst realistisches Abbild der Originalzelle zu haben. Ich konnte bestätigen, dass die MFN2 Menge von KO+WT und KO+R94Q nahezu identisch sind. Jedoch liegt diese deutlich über der MFN2 Menge der WT Zellen. Damit kann man zwar KO+WT und KO+R94Q-Zellen gut miteinander vergleichen, jedoch diese nicht wirklich mit dem WT, da bei beiden Zelllinien MFN2 im Vergleich zum WT MFN2 überexprimiert wird. Somit dienen die Ergebnisse zwar dem besseren Verständnis der R94Q Mutation, es muss jedoch beim Übertragen der Ergebnisse auf Patienten diese Überexpression des Zellmodels als möglicher Bias beachtet werden.
6.2 Kein Unterschied zwischen Wachstumsraten von R94Q und WT Zellen und gleichermaßen Wachstumsminderung durch oxidativen Stress Um oxidativen Stress auszulösen wurde H2O2 verwendet. Dieses ist ein physiologischer Sauerstoffmetabolit und gleichzeitig ein wichtiges Signalmolekül in der Zelle. Unter physiologischen Bedingungen liegt die intrazelluläre H2O2 Konzentration zwischen 1-10nM. Höhere Konzentrationen lösen eine adaptive Stressantwort (oxidativen Eustress) über Schlüsselenzyme wie Nrf2/Keap1 oder NF-κB aus.
Überphysiologische Konzentration von über 100 nM führen zur Schädigung von Biomolekülen und werden als oxidativen Distress bezeichnet (Sies, 2017).
Ich habe die Viabilität der Zellen bei verschiedenen H2O2 -Konzentrationen untersucht, wobei erst die Konzentration von 100 µM H2O2 bei beiden Zelllinien gleichermaßen zu einer Reduktion der Viabilität führte. Nach Sies entspricht diese Konzentration einer intrazellulären Konzentration von 1µM und ist als milder oxidativer Stress einzuordnen (Sies, 2017). Ein Problem des gewählten Versuchsaufbaus ist, dass die Messung lediglich einmal durchgeführt werden kann, da das verwendete Regent toxisch für die Zellen ist. Demnach kann nur die Viabilität 52h nach dem Ausplattieren bestimmt werden. Folglich könnte die verminderte Viabilität nach Behandlung mit 100 µM sowohl durch den Tod von einigen Zellen als auch durch eine verminderte Proliferation der Zellen unter oxidativem Stress verursacht sein. Ebenso ist es nicht möglich die Zellzahl nach 52h auf die Zellzahl nach dem Ausplattieren zu normalisieren, da diese nicht gemessen werden kann. Es wurden zwar die Zellen gezählt und versucht die gleiche Zellzahl auszuplattieren, jedoch gab es hier immer leichte Schwankungen und ein dichterer Zellverband reagierte deutlich weniger sensibel auf oxidativen Stress. Dieses Problem wurde mit einem zweiten Proliferationsversuch umgangen, welches eine mehrfache Viabilitätsmessung zuließ. Somit konnte die Zell Viabilität nach dem Ausplattieren sowie alle 24 h gemessen werden. Auch hier bestätigte sich das Ergebnis des ersten Versuchs.
Somit ist ein Ergebnis meiner Arbeit, dass die R94Q Mutation keinen Einfluss auf die Viabilität der Zellen hat. Ebenso verändert die R94Q Mutation nicht die Proliferation der Zellen unter oxidativem Stress. Geringer oxidativer Stress hat keinen Einfluss auf Viabilität und Proliferation und eine H2O2 Konzentration von 100 µM verringert die Proliferation in 24 h um ca. 25%.
Es ist durchaus möglich, dass noch höhere H2O2 Konzentrationen einen Unterschied zwischen den Zelllinien zeigen, jedoch ist die gewählte Konzentration von 100 µM (1µM intrazellulär) schon 10fach über der von Sies als überphysiologisch bezeichneten Konzentration. Daher wäre ein solcher Effekt unter physiologischen Bedingungen vermutlich nicht relevant.
Ebenfalls könnte sein, dass der Zeitraum von 24 h nach H2O2 Messung zu lang gewählt ist, um mögliche Effekte bei niedrigeren H2O2 Konzentrationen zu sehen. Eventuelle Effekte hätten durch kürzere Messabstände im Proliferationsversuch gezeigt werden
können. Jedoch stellt auch jede weitere Messung zusätzlichen Stress für die Zellen dar. Der Tecan Reader wurde zwar vor jeder Messung vorgewärmt aber trotzdem stellte der Weg vom Inkubator zum Reader eine Kälteeinwirkung dar, die wiederum Auswirkungen auf die Proliferation der Zellen haben könnte. Zusätzlich wären Effekte, die bereits nach 24 h nicht mehr zu sehen sind, vermutlich so gering, dass sie für die Ätiologie des CMT nicht relevant sind.
Außerdem ist es möglich, dass es andere, bisher nicht getestete Noxen gibt, bei denen die R94Q Mutation einen Einfluss auf das Zellüberleben hat.
Kawalek et al. berichtet 2015, dass die relative Proliferationsrate bei MEF MFN2 -/- Zellen und Wildtyp Zellen von der Serum-Supplementation im Zellkulturmedium abhängt. So lag die Wachstumsrate bei den Knockout Zellen bei Zusatz von fetal bovine serum (FBS) deutlich unter dem der Wildtyp Zellen während bei Zugabe von bovine calf serum (BCS) die Wachstumsrate der Knockout-Zellen die der Wildtyp-Zellen überstieg (Kawalec et al., 2015). Ich habe in meiner Arbeit nur die Proliferationsrate bei Zellkulturmedium mit FCS untersucht und konnte hier keinen Unterschied zwischen R94Q-Zellen und Rescue-Zellen feststellen. In Bezug auf die Ergebnisse von Kawalek et al. wäre es eventuell interessant zu untersuchen in wie weit die Zugabe von BCS die Wachstumsrate verändert.
6.3 R94Q beeinflusst die Calciumhomöostase über MAM
Für eine regelrechte Funktion der Mitochondrien spielt der Ca2+-Stoffwechsel eine entscheidende Rolle. So können Ca2+ Schlüsselenzyme der Atmungskette aktivieren und so die ATP-Produktion steigern (Szabadkai & Duchen, 2008). Die Calciumhomöostase wird unter anderem von MAM kontrolliert (Krols et al., 2016;
Rowland & Voeltz, 2012), für deren Regulation wiederum MFN2 eine wichtige Rolle spielt (de Brito & Scorrano, 2008).
Dies wurde auch von Bernard-Marissal et al. bestätigt, die gezeigt haben, dass die R94Q Mutation von MFN2 zu einer Reduktion der MAM, ER Stress, Probleme der intrazellulären Calciumhomöostase sowie gestörter mitochondrialen Dynamik führen.
Im Speziellen wurde bei Motoneuronen kein Unterschied der basalen
Calciumkonzentration gefunden, während bei sensorischen Neuronen der basale Calciumspiegel der R94Q-Zellen über dem der Kontrollgruppe lag (Bernard-Marissal et al., 2019b). Misko et al. haben Lentivirus-transduzierten Kulturen von sensorischen Neuronen verwendet, um die Auswirkungen des R94Q Mutation im Vergleich zum Wildtyp zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass die Überexpression von MFN2 mit axonaler Degeneration und axonalen Calciumanstieg einhergeht (Misko et al., 2012). Die Stimulation des MAM Proteins Sigma Non-Opioid Intracellular Receptor 1 (SIGMAR1) mit dem pre-084 Agonist führt zu einem Schutz vor axonalen Degeneration in Motoneuronen die R94Q exprimieren. SIGMAR1 ist ein ER Chaperon Protein, das in der Stabilisierung des IP3 Rezeptor involviert ist und damit den Calcium Ausstrom kontrolliert (Watanabe et al., 2016). Die Hemmung von SIGMAR1 ist mit MAM Defekten und axonaler Degeneration in Motoneuronen assoziiert (Hayashi et al., 2009).
In meiner Arbeit konnte ich ebenfalls einen erhöhten mitochondrialen Calciumgehalt in R94Q-Zellen im Vergleich zu den Rescue-Zellen feststellen. Oxidativer Stress führte zu einem weiteren Anstieg des mitochondrialen Calciumgehaltes bei beiden Zelllinien, wobei auch hier der Wert der R94Q+H2O2 Zellen signifikant über dem der Rescue+H2O2 Zellen lag. Dies bestätigt damit die Ergebnisse von Bernard-Marissal et al. und Misko et al..
Abschließend kann festgehalten werden, dass MFN2 die MAM beeinflusst, und diese wiederum essenziell für eine funktionierende Calciumhomöosthase sowohl des ER als auch der Mitochondrien sind. Daher wäre es weiterführend interessant die MAM nach H2O2 Behandlung zu untersuchen, um festzustellen, inwieweit auch hier der Calciumanstieg mit einer Reduktion von MAM einhergeht, beziehungsweise wie die MAM sich bei den Rescue-Zellen unter oxidativem Stress verändern.
6.4 Verringerte ROS bei R94Q-Zellen
Wie in 2.2 und 2.5 beschrieben haben Mitochondrien einen zellspezifischen Turnover, die Lebensdauer der Mitochondrien variiert also in verschiedenen Zellen und Geweben. Selektive Mitophagie entfernt dysfunktionale und geschädigte Mitochondrien und ist mit der mitochondrialen Biogenese verbunden (Kim &
Lemasters, 2011). Mitochondrien sind heterogen in ihrer ATP Produktion, manche produzieren große Mengen an ATP während andere ineffizient sind und größere Mengen an ROS produzieren (Twig et al., 2008). Durch eine starke ROS Erhöhung erleiden Mitochondrien oxidative Schäden, die dann von der Proteinqualitätskontrolle erfasst werden (Bender et al., 2011). Mitophagie wird also durch die ROS Produktion gesteigert (Kim & Lemasters, 2011).
In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass eine höhere ROS Produktion mit einer gesteigerten Mitophagie korreliert. So hat bei beiden Zelllinien die Behandlung mit 100 µM H2O2 eine Steigerung der ROS und einen Anstieg der Mitophagie zur Folge. Pich et al. gezeigt, dass MFN2 loss-of-function Pyruvate, Glukose und Fettsäureoxidation inhibiert und damit das mitochondriale Membranpotential reduziert (Pich et al., 2005).
Bach et al. hat ebenfalls gezeigt, dass die Herunterregulierung von MFN2 zu einem reduzierten Membranpotential, reduzierter zellulärer Atmung und zu einer Reduktion des mitochondrialen Protonenleaks führt (Bach et al., 2003). Folglich wäre zu erwarten gewesen, dass die R94Q Mutation (ohne H2O2 Behandlung) ebenfalls mit einer Steigerung der ROS, Reduktion des Membranpotentials und daraus folgend eine Steigerung der Mitophagie einhergeht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch eine niedrigere ROS Produktion und verringerte Mitophagie der R94Q-Zellen im Vergleich zu den Rescue-Zellen bei vergleichbaren Membranpotentialen der beiden Zelllinien ohne H2O2 Behandlung. Die Behandlung mit H2O2 hatte bei beiden Zelllinien gleichermaßen den Abfall des Membranpotentials zur Folge und passt damit zu den oben beschriebenen Ergebnissen. Die verringerte ROS Produktion könnte durch Kompensationsmechanismen der R94Q-Zellen erklärt werden. Diese Theorie wird auch von Kawalec et al. vertreten, die gezeigt haben, dass murine Fibroblasten mit einem MFN2 knockout eine höhere Zellatmung haben als Wildtypzellen, was sich ebenfalls nicht mit den Ergebnissen von Bach et al. und Pich et al. deckt. Kawalec et al. schlossen folglich, dass der zelluläre Energiemetabolismus durch Adaptation der mitochondrialen Atmung kompensiert werden kann (Kawalec et al., 2015).
6.5 Erhöhtes Glutathion und gesteigerte Glukoseaufnahme bei R94Q-Zellen Es ist bekannt, dass ein erhöhter Level des totalen GSH die Zelle gegen oxidativen Stress schützt. So hat Noack et al. gezeigt, dass eine Erhöhung des total GSH Levels Zellen, die GDAP1 überexprimieren, gegen oxidativen Stress schützt (Noack et al., 2012). Auch Del Amo und Secco haben bestätigt, dass Hoch- oder Runterregulation von GDAP1 eine Erhöhung des totalen Glutathions in Drosophilafliegen zur Folge hat (López Del Amo et al., 2015). Der Mechanismus über den GDAP1 zu einer Erhöhung des Glutathions führt ist bisher nicht genau verstanden. Shutt et al. haben jedoch die These aufgestellt, dass das GSH/GSSG Verhältnis ein wichtiger Regulationsmechanismus der mitochondrialen Fusion ist (Shutt et al., 2012). Da beide Mutationen in GDAP1 und MFN2 mit CMT assoziiert sind, könnte vermutet werden, dass die R94Q-Zellen ähnliche Kompensationsmechanismen haben und auch hier der totale GSH Level bei oxidativem Stress erhöht wird.
Diese Theorie wird durch die in 8.4. dargestellten Ergebnisse gestützt. Oxidativer Stress führt bei beiden Zelllinien zu einem signifikanten Anstieg des totalen GSH Level, wobei der Anstieg im Vergleich zur unbehandelten Gruppe bei den R94Q-Zellen deutlich größer ist (Anstieg um ca. 100%) als bei den Rescue-Zellen (Anstieg um ca.
30%). Dies könnte daran liegen, dass die R94Q-Zellen insgesamt eine schlechtere Stoffwechsellage und daher mehr zu kompensieren haben. Ohne H2O2 Behandlung liegt der GSH Level der R94Q-Zellen jedoch unter dem der Rescue-Zellen. Dies könnte damit erklärt werden, dass die R94Q-Zellen neben der erhöhten GSH Produktion noch andere Mechanismen der Kompensation ihres Defekts haben, wie beispielsweise das mitochondriale uncoupling. Dieses wird durch sogenannte uncoupling Proteins (UCPs) vermittelt. UCP 1-3 sind mitochondriale Anionencarrier, die eine wichtige Rolle in der Minimierung der ROS Emission der Elektronentransportkette spielen (Mailloux & Harper, 2011). Mitglieder unserer Forschungsgruppe konnten zeigen, dass bei R94Q-Zellen nach H2O2 Behandlung der Sauerstoffverbrauch signifikant höher ist als bei Rescue-Zellen nach H2O2
Behandlung. Gleichzeitig bleibt die ATP gleich (Wolf et al., 2019). Dies lässt darauf schließen, dass die Zelle sich durch uncoupling vor erhöhter ROS Produktion schützt.
Die Tatsache, dass ROS bei R94Q-Zellen nach H2O2 Behandlung im Vergleich zu Rescue nach H2O2 Behandlung nicht deutlich erhöht sind, könnte dadurch erklärt werden, dass die Messungen nach 24 h durchgeführt wurden und daher durch die
oben genannten Kompensationsmechanismen das initial stärker erhöhte ROS schon wieder abgefallen ist.
Der signifikante Anstieg der Glukoseaufnahme in der R94Q+ H2O2 Gruppe passt ebenfalls zu der stark gesteigerten GSH Produktion: Für die vermehrte Reduktion von GSSG zu GSH wird mehr NADPH benötigt. Dieses wird wiederum durch eine Steigerung des Pentosephosphatwegs bereitgestellt, für die die Zelle vermehrt Glukose aufnehmen muss.
6.6 Verringerte Mitophagie bei R94Q-Zellen
In unseren R94Q-Zellen ging das Entkoppeln von ATP Produktion und Zellatmung, ausgelöst durch milden oxidativen Stress, mit einer Reduktion der Mitophagie einher.
Chen et al. haben gezeigt, dass PINK1 MFN2 phosphoryliert und so die Parkin-vermittelte Ubiquitinierung und den folgenden Abbau der Mitochondrien initiiert. Wie auch bei uns führt die Akkumulation von morphologisch und funktional abnormalen Mitochondrien in MFN2 Knockout MEF zu respiratorischer Insuffizienz (Y. Chen &
Dorn, 2013). Interessanterweise hemmt der Verlust von Beclin-1, einem Autophagie Protein, welches in der Formation und Reifung des Autophagosoms eine wichtige Rolle spielt, die CCCP induzierte Translokation von Parkin zu den Mitochondrien sowie MFN2 Ubiquitinierung und Abbau. Ebenso hebt die Depletion von Beclin-1 die Suppression der mitochondrialen Fusion in MFN2 Knockout Zellen auf (Choubey et al., 2014), was vermuten lässt, dass die MFN2 Mutation irgendwie diesen Stoffwechselweg beeinflusst. Anderenfalls könnte die Mutation die Phosphorylierung von MFN2 durch PINK1, die für die Bindung von Parkin sowie die Parkin Translokation essenziell ist, beeinflussen, was wiederum die Mitophagie hemmt.
Kontrovers zu unseren Ergebnissen stehen die von Rizzo et al.: Diese haben einen Anstieg der Mitophagie in Motoneuronen aus induzierten Stammzellen von CMT2A Patienten festgestellt. Diese Beobachtung ging mit einer Reduktion des Mitochondrienvolumens sowie Veränderung in der Anordnung der Mitochondrien einher, während Überleben und Axonverlängerung unverändert blieben (Rizzo et al., 2016). Ebenso zeigten die Neurone eine erhöhte Expression von PINK1, PARK2 und BNIP3, einer Spleißvariante von BECN1, die als Auslöser der Mitophagie vermutet
wird. Es wäre möglich, dass diese Spleißvariante nur bei menschlichen Motoneuronen exprimiert wird, was diese entgegengesetzten Ergebnisse erklären würde. Diese Theorie wird durch die Ergebnisse von Sebastian et al. gestützt, die in MFN2 Knockout Mausmuskelfasern eine Reduktion der Mitophagie sowie geschädigte Mitochondrien zeigen konnten, die zu mitochondrialer Dysfunktion geführt haben (Sebastián et al., 2016). Sie konnten ebenfalls zeigen, dass ein altersinduziertes MFN2-Defizit einen ROS abhängigen adaptiven Signalweg durch Induktion des Transkriptionsfaktors HIF1α und BNIP3 initiiert, was für den Verlust der Mitophagie kompensiert und damit die Mitochondrien schützt (Sebastián et al., 2016). Zhou et al. vermuten dagegen, dass verschiedene Level von MFN1 den Effekt des R94Q MFN2 auf die Parkin-vermittelte mitochondriale Autophagie beeinflussen. Dies wiederum könnte bedeuten, dass eine Anreicherung von MFN1 im Nervensystem eine mögliche Therapieoption für CMT darstellt (Zhou et al., 2019).
6.7 Diskussion der gewählten Methoden
Für viele Versuche wurden die Zellen transfiziert bzw. gefärbt und anschließend Bilder von 30-50 Zellen pro Kondition am konfokalen Mikroskop (SP5 Leica) aufgenommen und die Fluoreszenz ausgewertet. Obwohl ich mich bemüht habe möglichst objektiv Zellen aus den mehreren Tausend Zellen auszuwählen unterliegt das menschliche Auge immer einem gewissen Bias. So wurden beispielsweise nur Zellen ausgewählt, die entweder einzeln oder einschichtig im Zellverband vorlagen, da überlappende Zellen nicht gut auswertbar waren. Um dieses zu minimieren habe ich pro Kondition je zwei Kammern ausgewertet mit insgesamt mindestens 30 Zellen pro Kondition.
Außerdem wurde jeder Versuch dreimal wiederholt, sodass insgesamt 90-150 Zellen pro Kondition zur Verfügung standen.
Eine objektivere Methode wäre sicherlich die Auswertung der Fluoreszenz mit einem Mikroskop, mit dem die (automatische) Aufnahme und Auswertung von einer deutlich größeren Zellzahl möglich ist. Alternativ käme auch die Auswertung mittels FACS in Frage. Jedoch setzt dies das Vorliegen der Zellen in einer Suspension voraus. Das Ablösen der adhärenten MEF Zellen würde wiederum mit Stress der Zellen einhergehen, sodass eventuell sensible live Messungen verfälscht wären.