Quantitative Analysen der HMG-Expression in
ausgewählten malignen Neoplasien
Dissertation
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat -
Dem
Promotionsausschuss Dr. rer. nat.
im
Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen
vorgelegt von
Britta Meyer
Bremen, 29.09.2006
1. Gutachter: Prof. Dr. J. Bullerdiek
2. Gutachter: Prof. Dr. L. Rensing
Hiermit erkläre ich, Britta Meyer, geboren am 08.08.1974, dass zum Verfassen der vorliegenden Dissertation „Quantitative Analysen der HMG-Expression in
ausgewählten malignen Neoplasien” folgende drei Aussagen zutreffen:
1. Ich habe die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt.
2. Ich habe keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt.
3. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht.
Bremen, 29.09.2006
1 Einleitung... 1
2 Material und Methoden ... 9
2.1 Gewebeproben ... 9
2.2 Blutproben ... 9
2.3 Zelllinien ... 9
2.4 DNA-Isolierung ... 10
2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur ... 10
2.4.2 Plasmid DNA-Isolierung... 10
2.4.3 BAC DNA-Isolierung ... 10
2.4.4 Quantifizierung von DNA im Photometer ... 10
2.5 RNA-Isolierung ... 10
2.5.1 RNA-Isolierung aus Frischgewebe und Zellen... 10
2.5.2 RNA-Isolierung aus Blut (PAXgene) ... 11
2.5.3 RNA-Isolierung aus Blut (ROCHE) ... 11
2.5.4 mRNA-Anreicherung... 12
2.5.5 Quantifizierung von RNA im Photometer ... 12
2.6 Northern Blot ... 12
2.7 cDNA-Erststrangsynthese ... 13
2.8 PCR... 13
2.9 Gelelektrophorese ... 13
2.10 Klonierung und Sequenzierung von DNA-Fragmenten... 14
2.11 Herstellung von cDNA/DNA-Sonden ... 14
2.12 BAC-Screening und Verifizierung ... 15
2.13 Semi-quantitative RT-PCR ... 15
2.14 Quantitative Real-time PCR ... 16
2.14.1 Absolute Quantifizierung bei humanen Templates ... 16
2.14.2 Absolute Quantifizierung bei caninen Templates... 18
2.14.3 Relative Quantifizierung... 18
2.15 Herstellung rekombinanter HMGB1-Proteine in Bakterien ... 19
2.16 SDS-PAGE... 20
2.17 Statistische Auswertung ... 20
3 Ergebnisse... 21
3.1 Mapping und Charakterisierung ausgewählter HMG-Gene beim Modelltier Hund... 21
3.1.1 Mapping und Charakterisierung des caninen HMGA1-Gens ... 21
3.2.1 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Tumor und
korrespondierenden tumorfreien Lungengewebe von NSCLC-Patienten 24 3.2.2 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens in Prostatageweben
des Hundes... 25
3.2.3 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Mammakarzinompatientinnen... 26
3.2.4 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen ... 27
3.2.5 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Patienten mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems im Vergleich zu gesunden Probanden ... 28
3.2.6 Semi-quantitative Expressionsanalyse des HMGB1-Gens in Sarkomen des Hundes... 30
3.3 Untersuchung zur Funktion des HMGB1-Proteins... 32
3.3.1 Untersuchung zur angiogenen Wirkung des HMGB1-Proteins ... 32
4 Diskussion... 33 5 Zusammenfassung ... 47 6 Summary... 49 7 Literatur ... 51 8 Danksagung ... 67 9 Publikationsübersicht... 68 10 Anhang...154 10.1 Tabellen...154 10.2 Abbildungen ...161
°C Grad Celsius
A Adenin
AC Adenocarcinoma
AGE Advanced glycation end products
AK Antikörper
ALL Akute lymphatische Leukämie AML Akute myeloische Leukämie APL Akute Promyelozyten Leukämie
AS Aminosäure
BAC Bacterial artificial chromosome
BCR Breakpoint cluster region
bFGF Basic fibroblast growth factor
Bp Basenpaare
C Cytosin
c-ABL v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog
CCND1 Cyclin D1
CD Cluster of differentiation
CDK Cyclin-abhängige Kinasen
cDNA Copy DNA
CDS Codierende Sequenz
CFA Canis familiaris
CLL Chronische lymphatische Leukämie CML Chronische myeloische Leukämie
Da Dalton dCTP Desoxycytidintriphosphat DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ER Östrogenrezeptorstatus EtOH Ethanol
FAB French American British, Klassifizierung der AML
FACS Fluorescence activated cell sorting
FAM 6-Carboxyfluorescein-aminohexyl Amidit FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung
FFPE Formalin-fixiert in Paraffin eingebettet g Gravitationsbeschleunigung
h Stunde
HCl Salzsäure
HFPE HOPE-fixiert in Paraffin eingebettet HMG High Mobility Group
HMGA High Mobility Group Protein A
HMGA1a High Mobility Group Protein A Isoform a
HMGA1b High Mobility Group Protein A Isoform b
HMGB High Mobility Group Protein B HMGN High Mobility Group Protein N
HOPE Hepes-glutamic acid buffer mediated organic solvent protection effect
HSA Homo sapiens
Hz Hertz
IL-1β Interleukin-1β
IHC Immunhistochemie
IPTG Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid J Joule
JNK c-Jun N-terminale Kinase
Kb Kilobasenpaare
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
KRAS Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
l Liter
LB Luria Bertani
LPS Lipopolysaccharid
M Molar
MAP Mitogen-activated protein
MDS Myelodysplastisches Syndrom µg, µl, µm, µM Mikrogramm, -liter, -meter, -molar mg, ml, mm, mM Milligramm, -liter, -meter, -molar MGB Minor groove binder
MgCl2 Magnesiumchlorid
MgSO4 Magnesiumsulfat
min Minute
M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus MOPS 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure mRNA Messenger Ribonukleinsäure
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
NSCLC Non-small cell lung cancer
OD Optische Dichte
ORF Offenes Leseraster
PAC P1-derived artificial chromosome
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion PBS Phosphate buffered saline
PMSF Phenylmethansulfonylfluorid PR Progesteronrezeptorstatus qRT-PCR Quantitative Real-time RT-PCR
RAGE Receptor for advanced glycation end products
RB Retinoblastoma
RISH RNA in situ Hybridisierung
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RNAi RNA-Interferenz
rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR SCC Squamous cell carcinoma
SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunde
sRAGE Soluble RAGE
SSC Standard Saline Citrat ssDNA Single stranded DNA
T Thymin
TAE Tris-Acetat EDTA
TAMRA 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin TNF-α Tumornekrosefaktor α
TNM Tumorklassifikation (T - Tumor, N - Nodus, M - Metastasen) TP53 Tumorsuppressorprotein p53
U Unit
UNG Uracil-N-Glykosylase UTR Untranslatierte Region
UV Ultraviolett
v Volumen
V Volt
VEGF Vascular endothelial growth factor
1 Einleitung
In der Krebsbehandlung besteht ein großes Interesse an molekularen Biomarkern, welche in Ergänzung der histopathologischen Standardmethoden die Diagnose, Prognosestellung und Therapieplanung bei malignen Erkrankungen verbessern könnten (Bast et al., 2005; Basil et al., 2006).
Als potentielle Tumormarker werden seit längerem die High Mobility Group (HMG)-Proteine diskutiert, insbesondere HMGA1, HMGA2 sowie HMGB1. In einer Vielzahl von Tumoren konnte eine Überexpression der HMGA-Proteine mit einem aggressiveren Phänotyp korreliert werden (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 2003a; Balcerczak et al., 2003; Flohr et al., 2003; Miyazawa et al., 2004). Für die HMGB1-Proteine wurde ebenfalls eine Überexpression in einer Reihe von Tumoren verglichen mit dem korrespondierenden Normalgewebe beschrieben. HMGB1 scheint bei der Invasion und Metastasierung der Tumoren eine wichtige Rolle zu spielen (Xiang et al., 1997; Taguchi et al., 2000; Brezniceanu et al., 2003). Zu Beginn dieser Arbeit im Jahre 2002 basierten Angaben zur Höhe der HMG-Expression bei malignen Neoplasien zumeist auf Untersuchungen mittels semi-quantitativer RT-PCR oder auf Northern Blot-Analysen. Eine echte quantitative Expressionsanalyse wurde erst mit Einführung der quantitativen Real-time RT-PCR (qRT-PCR) möglich. Die qRT-PCR ist durch Einsatz einer fluoreszenzmarkierten Sonde sehr spezifisch und sensitiv, so dass auch seltene Transkripte verlässlich quantifiziert und falsch negative Ergebnisse vermieden werden können.
Thema der vorliegenden Arbeit ist die quantitative Analyse der HMGA- und HMGB-Expression in verschiedenen malignen Neoplasien des Menschen sowie des Modelltieres Hund im Vergleich zu entsprechenden nicht-neoplastischen Geweben und Zellen. Ziel ist es, über Expressionsanalysen u.a. mit Hilfe der qRT-PCR die Bedeutung einer Reaktivierung der HMG-Gene für die Entstehung und Progression von Tumoren zu untersuchen.
HMG-Proteine sind kleine Chromatin-assoziierte Nicht-Histon-Proteine, welche ursprünglich über ihre gemeinsamen physikochemischen Eigenschaften definiert wurden. So lassen sich die Proteine mit 0,35 M NaCl aus Chromatin extrahieren, sind löslich in 2% Trichloressigsäure bzw. 5% Perchlorsäure und besitzen einen hohen Anteil an basischen und sauren Aminosäuren. Der Name leitet sich aus ihrer hohen
Mobilität im sauren Harnstoff-Polyacrylamidgel ab (Goodwin et al., 1973; Johns, 1982). Sämtliche Proteine der HMG-Familie gehören zu den „architektonischen Transkriptionsfaktoren“ (Grosschedl et al., 1994). Sie können allein keine Trans-kription auslösen, sondern ermöglichen durch Änderung der DNA-Konformation definierte Protein-DNA- sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen und regulieren somit die Expression einer Vielzahl von Zielgenen (Bustin et al., 1996). Gemäß ihrer charakteristischen funktionellen Domänen erfolgte eine Einteilung in drei Proteinfamilien: HMGA, HMGB und HMGN (Bustin et al., 1996; Bustin, 2001). Die Proteine der HMGA-Familie binden über drei so genannte AT-Hooks mit hoher Affinität an AT-reiche Sequenzen in der kleinen Furche der DNA (Solomon et al., 1986; Reeves et al., 1990). Die HMGB-Proteine besitzen zwei HMG-Box-Domänen, mit denen sie sequenzunspezifisch ebenfalls an die kleine Furche der DNA binden (Bianchi et al., 1992), während sich die HMGN-Proteine über eine Nukleosomen-bindende Domäne an nukleosomale DNA anlagern (Crippa et al., 1992). Auch aufgrund dieser unterschiedlichen funktionellen Motive induziert jede der drei HMG-Familien spezifische Änderungen der DNA-Struktur und besitzt individuelle zelluläre Funktionen (Bustin, 1999).
Zur Familie der HMGA-Gene gehören HMGA1 und HMGA2. Das HMGA1-Gen ist in der chromosomalen Region 6p21 lokalisiert und codiert für die Proteine HMGA1a, HMGA1b und HMGA1c, welche Produkte dreier Splicevarianten des HMGA1-Gens sind (Johnson et al., 1989; Friedmann et al., 1993; Nagpal et al., 1999). Das HMGA2-Gen, welches in der chromosomalen Region 12q14-15 lokalisiert ist (Chau et al., 1995; Schoenmakers et al., 1995), hat mindestens zwei Splicevarianten HMGA2a und HMGA2b (Hauke et al., 2002). Neben den drei stark konservierten DNA-bindenden AT-Hooks besitzen die HMGA-Proteine eine saure C-terminale Domäne (Friedmann et al., 1993; Chau et al., 1995). Über die gesamte Länge der HMGA-Proteine wurden posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, Acety-lierung, Methylierung und Poly(ADP)-RibosyAcety-lierung, identifiziert, welche sowohl die Bindungseigenschaften der Proteine als auch ihre biologische Aktivität beeinflussen können (Elton et al., 1986; Nissen et al., 1991; Sgarra et al., 2003). Durch die Anlagerung von HMGA-Proteinen werden Änderungen der DNA-Struktur, wie z.B. Krümmung, Streckung, Entwindung und Supercoils induziert (Lehn et al., 1988; Falvo
Diese Konformationsänderungen der DNA sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen von HMGA-Proteinen mit anderen Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Bildung stereospezifischer Enhanceosomen an Promotoren einer Reihe von Genen, wodurch deren Expression positiv so wie auch negativ reguliert werden kann (Thanos et al., 1995; Klein-Hessling et al., 1996; Zentner et al., 2001). Erst kürzlich wurde gezeigt, dass Hmga1-„knockout“-Mäuse unter Hypertrophie des Herzens und malignen Erkrankungen des hämatologischen und lymphatischen Systems leiden (Fedele et
al., 2006). Die homozygote Deletion des Hmga2-Gens führt bei Mäusen zu einem
stark verminderten Wachstum („pygmy“-Phänotyp) (Zhou et al., 1995), während transgene Mäuse, die eine trunkierte Variante des HMGA2-Gens exprimieren, einen abnorm großen „giant“-Phänotyp mit vorwiegend abdominaler Lipomatose zeigen (Battista et al., 1999). Einen ähnlichen Phänotyp mit übersteigertem Wachstum weist auch ein zum Zeitpunkt der Untersuchung 8-jähriger Junge mit einer Keimbahnmutation im HMGA2-Gen auf, was die Bedeutung von HMGA2 für Wachstum und Entwicklung unterstreicht (Ligon et al., 2005).
Die Expression der HMGA-Proteine ist maximal während der Embryonalentwicklung und in stark proliferierenden Zellen, während sie in voll differenzierten adulten Zellen und Geweben kaum nachweisbar ist (Chiappetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996; Hirning-Folz et al., 1998; Gattas et al., 1999). In einer Reihe von Neoplasien konnte jedoch eine Reexpression der HMGA-Gene detektiert werden. In benignen, zumeist mesenchymalen, Tumoren, wie z.B. Lipomen, Uterus-Leiomyomen, pleomorphen Adenomen der Kopfspeicheldrüse und in chondroiden Hamartomen der Lunge, ist die transkriptionelle Reaktivierung wahrscheinlich auf chromosomale Translokationen zurückzuführen (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Hennig et al., 1997; Williams et al., 1997; Gattas et al., 1999; Kazmierczak et al., 1999; Sornberger
et al., 1999). Bei malignen Tumoren scheinen genregulatorische Mechanismen bei
der Reaktivierung der HMGA-Expression eine wichtige Rolle zu spielen. Eine Expression von HMGA1-Proteinen oder der korrespondierenden mRNA wurde in einer Vielzahl von Karzinomen detektiert, wie z.B. beim kolorektalen Karzinom (Fedele et al., 1996; Abe et al., 1999; Kim et al., 1999; Chiappetta et al., 2001; Balcerczak et al., 2003), Prostatakarzinom (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993), Schilddrüsenkarzinom (Chiappetta et al., 1995; Chiappetta et al., 1998), Mammakarzinom (Liu et al., 1999; Flohr et al., 2003; Chiappetta et al., 2004), Ovarialkarzinom (Masciullo et al., 2003) und Zervixkarzinom (Bandiera et al., 1998).
Weniger Studien sind über die Expression des HMGA2-Gens bei malignen Tumoren durchgeführt worden. Zu den malignen Tumoren, bei denen eine Überexpression von
HMGA2 detektiert wurde, gehören das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
(Miyazawa et al., 2004), das Mammakarzinom (Rogalla et al., 1997), das Pankreaskarzinom (Abe et al., 2003b) und das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (Rogalla et al., 1998). Zudem wurde eine Expression im Blut von AML- bzw. CML-Patienten (Rommel et al., 1997) und bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom festgestellt (Sezer et al., 2000; Langelotz et al., 2003).
Die HMGA-Expression korreliert in einer Reihe von Tumoren mit dem Grad ihrer Malignität bzw. der Metastasierungsneigung und wird deswegen als diagnostischer bzw. prognostischer Marker diskutiert (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Bandiera et al., 1998; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2003a; Balcerczak et al., 2003; Flohr et al., 2003; Chiappetta et al., 2004; Miyazawa et al., 2004). Hinweise auf eine direkte Beteiligung der HMGA-Proteine bei der Tumorgenese wurden durch die Inhibition der HMGA2-Synthese mittels Antisense-Vektoren erbracht, was die neoplastische Transformation durch Retroviren in Schilddrüsenzellen der Ratte verhindert (Berlingieri et al., 1995). Zudem konnte durch eine erhöhte HMGA-Expression in verschiedenen Zelllinien ein transformierter Phänotyp induziert werden (Wood et al., 2000a; Wood et al., 2000b; Reeves et al., 2001; Treff et al., 2004). Die Induktion der Hmga-Expression in transgenen Mäusen führt zur Entwicklung von verschiedenen Tumoren, was die wichtige Rolle der HMGA-Proteine bei der Entstehung von Tumoren in vivo verdeutlicht (Fedele et al., 2002; Xu et al., 2004; Fedele et al., 2005; Zaidi et al., 2006).
Die Familie der HMGB-Proteine umfasst HMGB1, HMGB2 und HMGB3, wovon HMGB1, auch Amphoterin genannt, das am besten untersuchte Protein ist. Das humane HMGB1-Gen ist auf Chromosom 13q12-13 lokalisiert (Ferrari et al., 1996) und codiert für ein 215 AS langes Protein (Wen et al., 1989). Das hochkonservierte HMGB1-Protein besitzt zwei DNA-bindende Domänen HMG Box A und HMG Box B mit überwiegend basischen AS (Reeck et al., 1982; Bianchi et al., 1992) sowie einen sauren C-Terminus, der an Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, z.B. Histonen, beteiligt ist (Stros et al., 1990) und die DNA-Bindungsaffinität von HMGB1 reguliert (Stros et al., 1994). Während HMGB1 mit hoher Affinität an spezielle DNA-Strukturen, wie z.B. „Four-way junction DNA“ (Bianchi et al., 1989; Webb et al., 1999)
und Cisplatin-DNA-Addukte bindet (Pil et al., 1992), ist die sequenzunspezifische Bindung von HMGB1 an die kleine Furche linearer DNA eher schwach. Die Rekrutierung von HMGB1-Proteinen zu bestimmten DNA-Sequenzen erfolgt über Protein-Protein Wechselwirkungen mit anderen nukleären Proteinen (Agresti et al., 2003). Die Anlagerung von HMGB1 an die DNA bewirkt eine starke Krümmung der DNA (Pil et al., 1993), was die Bildung von Multiproteinkomplexen ermöglicht. Durch die Interaktion mit HMGB1 wird die Aktivität einer Reihe von Transkriptionsfaktoren reguliert, wie z.B. des TATA-binding-protein (TBP), p53, NF-κB, verschiedener Steroidhormonrezeptoren und HOX-Proteine (Agresti et al., 2003). Hmgb1-„Knockout“-Mäuse sterben kurz nach ihrer Geburt aufgrund einer unzureichenden Transkription des Glucocorticoid-Rezeptor-Gens an Hypoglykämie, was die wichtige Rolle von HMGB1 bei der Genregulation verdeutlicht (Calogero et al., 1999). HMGB1 wird in fast allen Zelltypen exprimiert, die Expression in Geweben von gesunden Probanden variiert jedoch je nach Differenzierungsgrad und Alter (Muller et al., 2004). Hohe nukleäre HMGB1 Level findet man in wenig differenzierten Zellen, während die Expression in ausdifferenzierten Zellen oft deutlich herunterreguliert ist (Seyedin et al., 1981; Mosevitsky et al., 1989; Begum et al., 1990). HMGB1 wird in transformierten Zelllinien stark exprimiert (Parkkinen et al., 1993) und in den meisten malignen Neoplasien wurde eine Überexpression verglichen mit den entsprechenden Normalgeweben gefunden, so z.B. beim Leberzellkarzinom (Kawahara et al., 1996), beim Magen- und kolorektalen Adenokarzinom (Xiang et al., 1997), beim Mammakarzinom (Brezniceanu et al., 2003) und in leukämischen Zellen (Cabart et
al., 1995).
Neben der Rolle als architektonischer Transkriptionsfaktor im Zellkern hat HMGB1 auch extrazelluläre Funktionen (Muller et al., 2001). Bei Entzündungen oder Verletzungen kann HMGB1 sowohl passiv freigesetzt als auch aktiv sezerniert werden. Eine passive Freisetzung erfolgt bei Zelltod durch Nekrose, jedoch nicht nach Apoptose, und führt zur Einleitung von Entzündungsprozessen (Scaffidi et al., 2002). Außerdem wird die Migration u.a. von glatten Muskelzellen und Mesoangioblasten und damit die Geweberegeneration angeregt (Degryse et al., 2001; Palumbo et al., 2004). Zum anderen wird HMGB1 durch aktivierte Monozyten und Makrophagen als Antwort auf verschiedene Endotoxine oder Zytokine, wie z.B. LPS, TNF-α oder IL-1β, aktiv sezerniert und bewirkt als Zytokin-ähnlicher Faktor die Freisetzung weiterer Zytokine (Wang et al., 1999a; Andersson et al., 2000). Darüber
hinaus fungiert HMGB1 als Ligand von RAGE (Rezeptor for advanced glycation end products) (Hori et al., 1995). Durch Bindung von HMGB1 an RAGE werden die MAP-Kinasen p38, SAP/JNK und p44/p42 aktiviert, welche bei der Wachstumsregulierung von Zellen eine wichtige Rolle spielen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Blockade der HMGB1-RAGE-Signalkaskaden das Wachstum und die Metastasierung von implantierten und spontan auftretenden Tumoren erheblich verringert (Taguchi et
al., 2000).
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollte erstmals die HMG-Expression in größeren Serien maligner Neoplasien bzw. im Blut von Patienten mit malignen und anderen Erkrankungen quantitativ untersucht werden.
Lungenkrebs stellt die häufigste krebsbedingte Todesursache dar. Da die Tumoren meist erst in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert werden, ist die Prognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 10% (Europa) sehr schlecht (Parkin et al., 2005). Lungenkarzinome entwickeln sich aus prämalignen Läsionen, die an verschiedenen Stellen innerhalb des bronchoalveolären Epithels entstehen können (Saccomanno et al., 1974). Dieser Feldkanzerisierungs-Prozess (Strong et al., 1984) ist auf eine wiederholte Exposition der Lunge gegenüber Karzinogenen, hauptsächlich verursacht durch Tabakkonsum, zurückzuführen (Parkin et al., 1994). Lungenkrebs wird in zwei Hauptgruppen unterteilt, das kleinzellige Bronchialkarzinom (SCLC) und das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC). Die häufigsten Formen des NSCLC stellen das Plattenepithelkarzinom (SCC) und das Adenokarzinom (AC) dar. Bisher detektierte genetische Veränderungen bei Lungenkrebs treten jeweils nur bei einer begrenzten Zahl von Fällen auf, so dass weiterhin nach molekularen Markern für die Früherkennung und die Entwicklung neuer Therapieansätze gesucht wird (Kettunen et al., 2004).
Da das HMGA2-Protein als ein solches Target bei NSCLC diskutiert wird, sollten im Rahmen dieser Arbeit korrespondierende Tumor- und Nicht-Tumorgewebe von AC- und SCC-Patienten erstmals quantitativ mittels qRT-PCR hinsichtlich ihrer HMGA2-Expression untersucht werden. Zusätzlich zu den quantitativen Untersuchungen an Frischgewebe sollte die HMGA2-Expression mittels Immunhistochemie (IHC) an HOPE-fixierten, in Paraffin eingebetteten (HFPE) Gewebeschnitten nachgewiesen werden.
In vorangegangenen Untersuchungen wurde eine HMGA2-Reexpression auch im peripheren Blut von Leukämie- und Tumorpatienten detektiert (Rommel et al., 1997; Sezer et al., 2000; Langelotz et al., 2003). Zu Beginn dieser Arbeit lagen jedoch ausschließlich Ergebnisse qualitativer Analysen der HMGA2-Expression mittels konventioneller RT-PCR im peripheren Blut vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss diverser Erkrankungen auf die HMGA2-Expression im Blut erstmalig mittels quantitativer Real-time RT-PCR untersucht werden. Zum einen erfolgten quantitative Genexpressionsanalysen am Blut eines Kollektivs von Mammakarzinompatientinnen vor und während der Therapie, um Auswirkungen der Behandlung auf die HMGA2-Expression zu testen. Zum anderen wurde die HMGA2-HMGA2-Expression im Blut von Patienten mit verschiedenen Tumoren, mit malignen Erkrankungen des hämatopoetischen bzw. lymphatischen Systems, sowie mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen quantitativ bestimmt. Die Expressionsdaten wurden mit denen gesunder Spender verglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte im Folgenden die HMGA2-Expression im peripheren Blut eines umfassenderen Kollektivs von Patienten mit Leukämien und anderen Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems quantitativ untersucht werden.
Neben Untersuchungen zur Expression des HMGA2-Gens wurden im Rahmen dieser Arbeit zudem Analysen zur Expression und Funktion von HMGB1 durchgeführt. Erstmals sollte die HMGB1-Expression in caninen Osteosarkomen untersucht werden. Canine Osteosarkome sind maligne, sehr aggressive Knochentumoren, die ebenso wie humane Osteosarkome standardmäßig mit Cisplatin behandelt werden (MacEwen, 1990; Vail et al., 2002). Da HMGB1 durch Bindung an Cisplatin-DNA-Addukte die Reparatur der DNA durch „nucleotide excision repair“-Mechanismen behindert und damit die antitumorale Wirkung des Zytostatikums Cisplatin verstärkt (Zamble et al., 1996; He et al., 2000), sollte die intertumorale Varianz der HMGB1-Expression mittels Northern Blot-Analyse untersucht werden. Die Entwicklung einer semi-quantitativen RT-PCR sollte zeigen, ob diese Methode eine kosten- und zeitsparende Alternative zum Blot bietet. Darüber hinaus sollte die Funktion des humanen HMGB1-Proteins als angiogener Faktor im in
Als Basis für Untersuchungen am Modelltier Hund sollten im Rahmen dieser Arbeit die caninen HMGA-Gene sowie das canine HMGB1-Gen auf dem Hundegenom gemappt und ihre Struktur und cDNA-Sequenz aufgeklärt werden. Für HMGA1 und
HMGB1 sollten basale Expressionsmuster mittels Northern Blot-Analysen bestimmt
werden. Zudem sollten quantitative Analysen der HMGA2-Expression mittels qRT-PCR bei caninen Prostatageweben verschiedener Histologien zeigen, ob ein Zusammenhang zwischen Höhe der HMGA2-Expression und Aggressivität der Tumoren besteht.
2
Material und Methoden
2.1 Gewebeproben
Die humanen Tumorproben und korrespondierenden tumorfreien Gewebeproben der Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) stammen aus der Klinischen und Experimentellen Pathologie des Forschungszentrums Borstel.
Die verwendeten Gewebeproben des Hundes wurden von der Klinik für kleine Haustiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
2.2 Blutproben
36 Blutproben von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen und 46 Proben von Patienten mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems für die HMGA2-Genexpressionsanalysen wurden von D. Krisponeit des Zentrums für Innere Medizin, Hämatologie und Onkologie, Klinikum Bremen-Mitte entnommen und bereitgestellt. Sieben weitere Blutproben von CML-Patienten stammen von C. Junghanß, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Klinik für Innere Medizin der Universität Rostock.
Das Patientenmaterial für die vergleichenden Expressionsanalysen vor und während der Therapie im Blut von 22 Mammakarzinompatienten wurde von C.-O. Schulz, Innere Klinik mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie der Charité Campus Mitte in Berlin zur Verfügung gestellt.
Die mittels FACS aufgereinigten mononukleären CD33+/CD34+ Zellen aus peripherem Blut bzw. Knochenmark von insgesamt fünf Leukämiepatienten wurden von der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie und Experimentelle Stammzelltransplanta-tion, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Klinik für Innere Medizin, Medizinische Fakultät der Universität Rostock zur Verfügung gestellt.
2.3 Zelllinien
Die verwendeten caninen Zelllinien ZMTH3 und MTH52 wurden im Zentrum für Humangenetik der Universität Bremen etabliert. ZMTH3 leitet sich von einem Pleomorphen Adenom der Mamma und MTH52 von einem malignen kleinzelligen Tumor der Mamma ab.
Die Leukämiezelllinien NB4 (akute Promyelozyten Leukämie, APL) und HL-60 (akute myeloische Leukämie, AML) wurden von der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie und Experimentelle Stammzelltransplantation, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Klinik für Innere Medizin, Medizinische Fakultät der Universität Rostock zur Verfügung gestellt.
2.4 DNA-Isolierung
2.4.1 Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur
Zur Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur wurde das QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers im „Protocol for cultures cells“ verwendet.
2.4.2 Plasmid DNA-Isolierung
Die Isolierung von Plasmid DNA erfolgte mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers. Zur Plasmid-Isolierung wurden standardmäßig 10 ml Übernacht-Kulturen in selektivem LB-Medium verwendet.
2.4.3 BAC DNA-Isolierung
BAC DNA wurde mittels QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers im „Very Low-Copy Plasmid/Cosmid Purification“-Protokoll isoliert. Ausgangsmaterial waren entsprechende 5 ml LB-Kulturen, mit denen nach 8 h Wachstum 250 ml Übernacht-Kulturen mit selektivem LB-Medium angeimpft wurden.
2.4.4 Quantifizierung von DNA im Photometer
Zur Quantifizierung von DNA wurden 2-5 µl DNA-Lösung mit 60 µl Bidest in einer Küvette gemischt und im BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) bei 260 nm gemessen.
2.5 RNA-Isolierung
2.5.1 RNA-Isolierung aus Frischgewebe und Zellen
Die RNA-Isolierung aus Gewebe, mononukleären Zellen und Zellkulturen erfolgte im Allgemeinen mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen) gemäß den Angaben des
Herstellers. Die Zerkleinerung des Gewebes wurde in Puffer RLT mittels Skalpell durchgeführt und die Homogenisierung des Lysats durch Zentrifugation in QIAshredder-Säulen (Qiagen) erreicht. Alternativ wurde die Aufschließung und Homogenisierung der Proben mit Hilfe des TissueLysers durch Schütteln für 2 x 3 min bei 25 Hz unter Verwendung von 5 mm Stahlkügelchen ausgeführt. Bei protein-reichem Gewebe wurde das RNeasy Mini Protokoll für die Isolierung aus Herz, Muskel und Haut-Gewebe verwendet, welches sowohl einen Proteinase K-Verdau als auch einen DNase I-Verdau umfasst.
Die für den Northern Blot benötigten RNA-Mengen wurden aus bis zu 250 mg Gewebe mittels RNeasy Midi Kit (Qiagen) gemäß dem RNeasy Midi Protokoll für die Isolierung aus Herz, Muskel und Haut-Gewebe isoliert, welches einen Proteinase K-Verdau beinhaltet. Dazu wurden die Gewebeproben in 2 ml RLT-Puffer aufgenommen und mit dem Homogenisator Ultra-Turax (IKA-Werke, Staufen) zerkleinert und homogenisiert. Die weitere Durchführung erfolgte gemäß den Herstellerangaben.
2.5.2 RNA-Isolierung aus Blut (PAXgene)
Die Abnahme von je 2,5 ml Vollblut erfolgte direkt in die mit einer RNA-Stabilisierungslösung gefüllten PAXgene Röhrchen der Firma PreAnalytiX (Qiagen). Die Lagerung der gefüllten Röhrchen erfolgte entweder bei 4°C für bis zu 7 Tage oder bei -20°C. Die Isolierung der Gesamt-RNA wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Um eine komplette mechanische Zerstörung der genomischen DNA zu gewährleisten, wurde das Lysat nach dem Proteinase K-Verdau mittels QIAshredder-Säule (Qiagen) homogenisiert. Des Weiteren wurde ein DNase I-Verdau auf der Säule durchgeführt, um DNA-Kontaminationen der RNA zu minimieren. Das Eluat wurde abweichend vom Protokoll ohne Denaturierung sofort quantifiziert und bei -80°C gelagert.
2.5.3 RNA-Isolierung aus Blut (ROCHE)
Je 5 ml Vollblut wurden im Verhältnis 1:10 mit „RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow“ (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und bei -20°C gelagert. Die Isolierung von Gesamt-RNA aus 25 ml des Lysats (enthält 2,5 ml Blut) erfolgte mit Hilfe des High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) nach Angaben
des Herstellers, wobei das Lysat in mehreren Schritten auf jeweils zwei Säulen aufgetragen wurde.
2.5.4 mRNA-Anreicherung
Die Anreicherung von poly A+ mRNA aus Gesamt-RNA erfolgte mittels Oligotex mRNA Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben.
2.5.5 Quantifizierung von RNA im Photometer
Zur Quantifizierung der isolierten RNA wurden in einer Küvette 60 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 3 µl der RNA gemischt und bei 260 nm die Absorbanz mit dem BioPhotometer (Eppendorf) bestimmt. Da für die absolute Quantifizierung über Real-Time PCR eine genaue Konzentrationsbestimmung maßgeblich ist, erfolgten die entsprechenden Messungen in Triplikat. Gegebenenfalls wurden Verdünnungen der RNA mit RNase-freiem Wasser hergestellt, um eine Konzentration von ca. 100 – 125 ng/µl RNA zu erreichen, so dass bei der Verwendung von 250 ng RNA mindestens 2 µl der RNA in die cDNA-Synthese eingesetzt werden konnten.
2.6 Northern
Blot
Die Northern Blot-Analyse erfolgte nach einem modifizierten Hybond XL Protokoll (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Es wurden je 5 µg mRNA in einem denaturierenden 1,2% (w/v) Agarosegel mit 0,67% (v/v) Formaldehyd in 1x MOPS Puffer bei 80 V ca. 3 h aufgetrennt. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 20 min in 50 mM NaOH, gefolgt von zwei Inkubationen für je 15 min in 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) und zwei weiteren Inkubationsschritten für je 15 min in 10x SSC (pH 7,0). Die RNA wurde mittels Kapillarblot über Nacht mit 10x SSC auf eine geladene Hybond-XL Membran (Amersham Biosciences) übertragen. Eine kovalente Bindung der RNA wurde mit Hilfe des Crosslinking unter UV-Licht (0,4 J/cm2) erreicht.
Die Markierung der wie unter Punkt 2.11 beschrieben hergestellten cDNA-Sonden mit dem Radionuklid [α-32P]dCTP mit Hilfe des Megaprime DNA labelling system (Amersham Biosciences) und die Hybridisierung des Blots wurden im Zentrum für Humangenetik von H. Murua Escobar und A. M. Flohr durchgeführt.
Für die Auswertung des Northern Blots wurden die Signale mit dem Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) detektiert und mit dem Computerprogramm „ImageQuant“ (Molecular Dynamics) quantifiziert.
2.7 cDNA-Erststrangsynthese
cDNA-Erststrangsythesen wurden im Allgemeinen mit 2,5 µM Poly-(A)-Adapter-Primer AP2 (5’ AAGGATCCGTCGACATCT(17) 3’), 0,5 mM der vier dNTPs, 0,01 M 1,4-Dithiotreitol und 1x Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2,
pH 8.3) an 5 µg Gesamt-RNA bzw. 500 ng mRNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen, Karlsruhe) gemäß Herstellerangaben in einem 20 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Reaktion erfolgte für 50 min bei 42°C und wurde durch eine Inkubation von 15 min bei 70°C gestoppt.
2.8 PCR
Sämtliche PCR bzw. RT-PCR-Ansätze wurden standardmäßig mit ca. 50-200 ng DNA bzw. 2 µl cDNA und 2,5 U Taq-Polymerase (Invitrogen), 1,5 mM MgCl2, 0,2
mM der vier dNTPs sowie 0,4 µM Forward und Reverse-Primer gemäß Hersteller-angaben in einem 50 µl Reaktionsvolumen angesetzt.
Die Reaktion erfolgte nach folgendem Schema im Mastercycler Gradient (Eppendorf): Initiale Denaturierung für 5 min bei 94°C, anschließend 35 Zyklen mit Inkubationen für 30 sec bei 94°C, 30 sec mit einer dem Primerpaar angepassten Annealingtemperatur und 45 sec bei 72°C gefolgt von einem finalem Elongationsschritt für 10 min bei 72°C.
2.9 Gelelektrophorese
PCR- und RT-PCR-Produkte wurden standardmäßig in einem 1,5% (w/v) Agarosegel versetzt mit 0,1 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Base, 0,04 M Essigsäure, 1 mM EDTA, pH 8,0) elektrophoretisch bei 100 V für ca. 90 min aufgetrennt. Anschließend wurden die Gele im UV-Durchlicht bei 254 nm mit einer Polaroidkamera fotografiert.
2.10 Klonierung
und
Sequenzierung von DNA-Fragmenten
Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung von PCR- bzw. RT-PCR-Produkten wurden einzelne Banden erwarteter Fragmentlänge mittels Skalpell aus dem Agarosegel herausgeschnitten und die darin enthaltene DNA mit Hilfe des QIAEX II Kits (Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.
Die Ligation der aufgereinigten PCR-Produkte über den 3’ terminalen Desoxyadenosin-Überhang erfolgte mit Hilfe des Klonierungsvektors pGEM-T Easy (Promega, Mannheim) gemäß dem Standard Reaktionsprotokoll des Herstellers in 10 µl Reaktionsvolumen bei 4°C über Nacht.
Die Thermotransformation erfolgte ebenso wie die Herstellung der kompetenten Bakterien nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990) (Inoue et al., 1990). Für die Transformation der Ligationsansätze in thermokompetente E. coli DH5α Bakterien wurde SOB-Medium (2% (w/v) Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, pH 7,0), zum Ausplattieren sowie zur
Übernachtkultivierung der Bakterien wurde LB-Medium (1% (w/v) NaCl, 1% (w/v) Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Hefe-Extrakt, pH 7,0) eingesetzt. Positive Klone wurden über „Blue-White-Screening“ auf 2% LB-AIX-Platten (100 µg/ml Ampicillin, 0,5 mM IPTG, 50 µg/ml X-Gal) identifiziert.
Die Isolierung der Plasmid-DNA aus 10 ml LB-Übernachtkulturen erfolgte mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben.
Standardmäßig wurde der Erfolg der Transformation durch einen Restriktionsverdau über die EcoRI Schnittstellen der Multiple Cloning Site des Vektors pGEM-T Easy und gelelektrophoretische Auftrennung verifiziert. Anschließend erfolgte die Sequenzierung derjenigen Klone mit erwarteten Restriktionsfragmentlängen durch die Firma MWG (Ebersberg) unter Verwendung der Standardprimer M13uni (5’ TGTAAAACGACGGCCAGT 3’) und M13rev (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’). Die Sequenzdaten wurden mit Hilfe von Programmen des Softwarepaketes „Lasergene” (DNASTAR, Madison, USA) ausgewertet.
2.11 Herstellung von cDNA/DNA-Sonden
Zur Herstellung der cDNA-Sonden für die Hybridisierung im Northern Blot und der DNA-Sonden zum BAC-Screening wurden geeignete cDNA- bzw. DNA-Fragmente der nachzuweisenden Gene wie beschrieben kloniert und über Sequenzierung verifiziert. Die klonierten Fragmente wurden als Template für die anschließende
Amplifizierung über PCR eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden im Gel aufgetrennt, mittels QIAEX II (Qiagen) aus dem Gel isoliert und dienten wiederum als Template für eine zweite PCR, welche frei von störenden Plasmiden ist und deren Produkte nach Aufreinigung mittels QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) und photometrischer Quantifizierung direkt in die radioaktive Markierung eingesetzt werden konnten (s. Kapitel 2.6).
2.12 BAC-Screening und Verifizierung
Das BAC-Library-Screening erfolgte über zwei unterschiedliche Wege: Für HMGA1 und HMGB1 wurden canine RPCI-81 BAC/PAC Filter (BACPAC Resources, Oakland, USA) mit radioaktiv markierten caninen DNA-Sonden gemäß dem Herstellerprotokoll („Hybridisation of High Density Filters“) durch H. Murua Escobar im Zentrum für Humangenetik hybridisiert. Signale wurden mittels Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics) detektiert und positive Klone identifiziert. Alternativ wurden die caninen CCND1 und NRAS BACs mittels PCR-Screening mit humanen CCND1 Primern bzw. caninen NRAS Primern an der DogBAC library (http://www.dogmap.ch) identifiziert. Sämtliche BAC-Klone wurden mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung verifiziert.
2.13 Semi-quantitative
RT-PCR
Für die semi-quantitative Expressionsanalyse wurde eine Duplex-PCR an caniner cDNA etabliert, um die Expression des Zielgens im Verhältnis zum Housekeeping- Gen GAPDH bestimmen zu können. Gegenüber den unter 2.8 beschriebenen PCR-Bedingungen wurde die Zyklenzahl auf 28 beschränkt, so dass beide Amplifikationen in der exponentiellen Phase gestoppt wurden.
Die Visualisierung der PCR-Fragmente erfolgte in einem 1,2% (w/v) Agarosegel, welches in einer Vistra Green Färbelösung bestehend aus 50 ml 1x TAE-Pffer und 5 µl Vistra Green für 15 min lichtgeschützt gefärbt wurde. Die Signale wurden mit Hilfe des Storm PhosphorImagers (Molecular Dynamics) detektiert und mit dem Computerprogramm „ImageQuant“ (Molecular Dynamics) quantifiziert.
2.14 Quantitative Real-time PCR
Zur quantitativen Analyse der HMGA2-Expression in Blut, Zellen und Gewebe wurde die Methode der quantitativen Real-time RT-PCR (qRT-PCR) nach dem TaqMan-Prinzip (Livak et al., 1995) sowohl zu Anwendung bei humanen wie auch caninen Templates etabliert.
Zwei verschiedene Methoden stehen bei der Expressionsanalyse eines Zielgens mittels Real-time RT-PCR zur Verfügung, die absolute und die relative Quantifizierung. Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Transkriptmenge des Zielgens anhand einer externen Standardkurve mit bekannten Konzentrationen ermittelt. Ergebnisse werden als Kopienzahl pro eingesetzte Nukleinsäuremenge angegeben. Bei der relativen Quantifizierung erfolgt die Normalisierung der Expression eines Zielgens mit Hilfe eines Referenzgens, welches als endogene Kontrolle dient. Damit ist keine spektrometrische Quantifizierung der eingesetzten RNA nötig, was bei der Analyse geringer RNA-Mengen von Vorteil ist. Anders als bei der absoluten Quantifizierung werden die Transkriptmengen nicht auf einen Standard bekannter Konzentration bezogen, sondern die Expression relativ zu einer festgesetzten Probe, dem so genannten Kalibrator, angegeben. Als endogene Kontrolle diente 18S rRNA, welches in Vorversuchen eine konstante Expression in den zu untersuchenden Proben zeigte. Zudem muss bei der relativen Quantifizierung gewährleistet sein, dass die PCR-Amplifikationen von Ziel- und Referenzgen eine vergleichbare Effizienz aufweisen.
2.14.1 Absolute Quantifizierung bei humanen Templates
Zur absoluten Quantifizierung der HMGA2-Expression wurde die Reverse Transkription durch M-MLV Reverse Transkriptase (Invitrogen) mit einem genspezifischen HMGA2 Reverse Primer (5’ GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC 3’) (Gross et al., 2003) unter Verwendung zweier Mastermixe durchgeführt. 2 µl Mastermix I bestehend aus 1 µl HMGA2lo (2 µM) und 1 µl dNTPs (10 mM) wurden zu jeweils 250 ng RNA pipettiert und mit der entsprechenden Menge an dest. H2O auf
ein Volumen von 12 µl gebracht. Zur Auflösung von Sekundärstrukturen wurde jeder Ansatz für 5 min bei 65°C inkubiert und 1 min auf Eis gelagert. Nach kurzer Zentrifugation wurde Mastermix II mit 4 µl 5x Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3), 2 µl 1,4-Dithiotreitol (0,1 M DTT), 1 µl RNaseOUT
vermischt und abzentrifugiert. Die Erststrangsynthese erfolgte für 50 min bei 37°C im Eppendorf Gradient Thermocycler (Eppendorf) und wurde durch Inkubation für 15 min bei 70°C gestoppt.
Für die Real-time PCR zur HMGA2-Expressionsanalyse wurden Dreifach-bestimmungen mit jeweils 2 µl cDNA entsprechend 25 ng RNA-Äquivalenten in einem Reaktionsvolumen von 25 µl durchgeführt. Für alle zu messenden Proben eines Laufes wurde ein Mastermix mit 600 nM Forward Primer (5’ AGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAG 3’) und Reverse Primer (s. oben), 200 nM fluoreszenzmarkierter Sonde (5’ 6-FAM-AGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCA-TAMRA 3’) (Gross et al., 2003), 1x Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems, Darmstadt) und dest. Wasser angesetzt und in 96-well Platten (Sarstedt, Nümbrecht) vorgelegt. Nach der Zugabe von jeweils 2 µl cDNA, dem Verschließen der Platte mit transparenter Klebefolie (Applied Biosystems) und Zentrifugation für 15 sec bei 1000 x g erfolgte die PCR-Amplifikation mittels ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), bzw. mit Hilfe des Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) unter folgenden PCR-Bedingungen: Zunächst erfolgte eine Inkubation für 2 min bei 50°C zur Aktivierung der Uracil-N-Glykosylase (UNG), welche Kontaminationen durch vorherige PCR-Produkte beseitigt. Zur Denaturierung des Templates und gleichzeitiger Deaktivierung der UNG bzw. Aktivierung der HotStart Taq-Polymerase wurde 10 min bei 95°C inkubiert. Anschließend wurden 40-45 Zyklen mit 15 sec Denaturierung bei 95°C und einem kombinierten Annealing- und Elongationsschritt für 1 min bei 60°C durchgeführt. Bei jedem qRT-PCR Lauf wurden zwei „Non-template“-Kontrollen mit Wasser statt cDNA bzw. mit der Wasserkontrolle aus der cDNA-Synthese und eine „-RT“-Kontrolle ohne Reverse Transkriptase durchgeführt, welche als erstes pipettiert und anschließend mit Folie verschlossen wurden.
Da bei der absoluten Quantifizierung die Transkriptmengen in Bezug auf eine Standardgerade ermittelt werden, wurde parallel eine Verdünnungsreihe (102 bis 108 Kopien) eines dem PCR-Fragment entsprechenden synthetisch hergestellten 80 bp ssDNA-Standards (5’ AGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCA-CTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCA 3’) mit bekannter Konzentration sowohl in der cDNA-Synthese als auch bei der PCR mitgeführt (Bustin, 2000). Zur Normalisierung wurden alle Ergebnisse auf 250 ng Gesamt-RNA
bezogen, so dass Transkriptmengen in Kopienzahl / 250 ng Gesamt-RNA angegeben wurden.
2.14.2 Absolute Quantifizierung bei caninen Templates
Eine Real-time RT-PCR zur absoluten Quantifizierung der HMGA2-Expression bei caninem Template wurde entsprechend der unter 2.14.1 beschriebenen Methode etabliert. Auf Grund der hohen Konserviertheit des HMGA2-Gens zwischen Hund und Mensch konnten sowohl der humane Reverse Primer als auch die humane fluoreszenzmarkierte Sonde beibehalten werden, Forward Primer (5’ AGTCCCTCCAAAGCAGCTCAAAAG 3’) und Standard (5’ AGAGTCCCTCCAAAG-CAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCT AGGAAATGGCCA 3’) wurden der caninen HMGA2-Sequenz entsprechend angepasst. Sowohl die cDNA-Synthese als auch die Real-time PCR erfolgten wie unter 2.14.1 beschrieben.
2.14.3 Relative Quantifizierung
Die cDNA-Synthese zur relativen Quantifizierung erfolgte wie für die absolute Quantifizierung unter 2.14.1 beschrieben mit dem Unterschied, dass als Primer ein Hexamergemisch (150 ng/µl Random Hexamers) verwendet wurde, welches die Umschreibung der gesamten RNA einschließlich rRNA in cDNA ermöglicht. Abweichend vom oben angegebenen Protokoll wurde dem 50 min Inkubationsschritt bei 37°C ein Annealingschritt von 10 min bei 25°C vorangestellt.
Für die relative Quantifizierung mittels Real-time PCR wurden sowohl für Ziel- als auch Referenzgen fertige Genexpressionsassays verwendet, welche genspezifische Primer und eine FAM-MGB-markierte Sonde enthalten (HMGA2: Hs00171569_m1; 18S: Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Die Reaktionen erfolgten in einem Reaktionsvolumen von 20 µl in Triplikat. Je 18 µl eines Mastermixes mit 2x Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems), 20x HMGA2- bzw. 18S-Assay und dest. Wasser wurden in 96-well Platten (Sarstedt) vorgelegt. Nach der Zugabe von je 2 µl cDNA wurden die verschlossenen Platten für 15 sec bei 1000 x g zentrifugiert. Anschließend erfolgte die PCR-Amplifikation mittels Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) gemäß den unter 2.14.1 angegebenen Parametern. Analog zur absoluten Quantifizierung wurden bei jedem qRT-PCR Lauf zwei „Non-template“-Kontrollen und eine „-RT“-Kontrolle mitgeführt. Die Auswertung
der Real-time PCR erfolgte gemäß der „comperative CT-method“ (ΔΔCT-Methode)
(Livak et al., 2001) mittels Applied Biosystems 7300 Sequence Detection Software, Version 1.2.3, RQ Study Application (Applied Biosystems).
2.15 Herstellung
rekombinanter
HMGB1-Proteine in Bakterien
Für die Expression rekombinanter HMGB1-Proteine wurde ein bereits fertiges Konstrukt bestehend aus dem humanen HMGB1-ORF kloniert im Expressionsvektor pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences) mit GST-Fusion-Tag verwendet, welches in E.
coli BL21 Zellen als Glycerolstock (H1Oo-4) vorlag.
Die Aufreinigung der HMGB1-GST-Fusionsproteine erfolgte nach einem modifizierten Protokoll des „GST Gene Fusion System Handbook“ (Amersham Biosciences). Dazu wurden die Bakterien auf LBAG-Platten (100 µg/ml Ampicillin, 20 mM Glucose) ausgestrichen, in einer 10 ml LBAG-Vorkultur für 6 h bei 37°C und einer anschließenden 1 l LBAG-Hauptkultur für ca. 17 h bei 18°C kultiviert. Bei einer OD600 von 0,6 - 0,8 erfolgte die Induktion durch Zugabe von 200 µl 0,5 M IPTG. Nach einer Inkubation für 2 h bei 18°C wurden die Bakterien durch Zentrifugation für 15 min mit 4000 x g bei 4°C pelletiert und in 100 ml PBS* (90 ml PBS, 10 ml Glycerol 100%, 50 µl 1 M PMSF, 500 µl 1 M DTT, 100 µl 1 mg/ml Aprotenin) auf Eis resuspendiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff, Auftauen bei 37°C, Zugabe von 200 µl Lysozym (50 mg/ml) und Inkubation für 30 min bei 6°C gefolgt von 2 weiteren Einfrier- und Auftauschritten. Nach Zugabe von 5 ml Tween 20 erfolgte eine weitere Inkubation des Lysats für 30 min bei 6°C unter leichtem Schütteln. Dann wurde das Lysat erneut eingefroren und aufgetaut und für 30 min mit 20.000 x g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 2 ml 50% (v/v) „Slurry“ (Glutathione Sepharose 4B, Amersham Biosciences) versehen und zur Bindung des GST-Tags der Fusionsproteine für 45 min bei 6°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 10 min mit 1000 x g bei 4°C wurde der Überstand verworfen und das „Slurry“ mit den daran gebundenen Fusionsproteinen durch dreimalige Zugabe von 10 ml PBS und Zentrifugation für 5 min mit 500 x g bei 4°C gewaschen. Anschließend wurde erneut mit 10 ml PreScission Cleavage Buffer (PSCB: 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) gewaschen und für 5 min mit 500 x g bei 4°C zentrifugiert. Zum Trennen der Proteine vom GST-Tag und damit auch von der Glutathione Sepharose wurde das Pellet mit 40 µl (40U) PreScission Protease und 960 µl PSCB bei 6°C
über Nacht inkubiert und anschließend für 5 min mit 500 x g bei 4°C abzentrifugiert. Der Überstand mit dem gelösten HMGB1 Protein wurde bei -80°C gelagert.
2.16 SDS-PAGE
Die Überprüfung der rekombinant exprimierten HMGB1-Proteine erfolgte über SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE). Gemäß dem BioRad Mini Protean II- Protokoll zur Herstellung von „Discontinuous Polyacrylamid Gels“ (Bio-Rad Laboratories, München) wurden Gele mit 12% Separationsgel (0,375 M Tris-HCl, pH 8,8) und 4% Sammelgel (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) angefertigt. Die Auftrennung im Laufpuffer (0,1% (w/v) SDS, 0,02 M Tris-Base, 0,2 M Glycine) erfolgte für ca. 40 min bei 200V. Das Gel wurde mit 0,1% (w/v) Coomassie Blue R-250 Färbelösung gefärbt und mit einer 40% (v/v) Ethanol/10% Eisessig-Lösung entfärbt.
2.17 Statistische
Auswertung
Die statistische Analyse der HMGA2-Expressionsunterschiede zwischen Tumor-material und tumorfreien Proben von NSCLC-Patienten erfolgte über den einseitigen Zweistichproben t-Test bei abhängigen Stichproben (Paarvergleichstest). Da die Transkriptmengen keine Normalverteilung aufwiesen, wurde dem t-Test eine logarithmische Transformation der Werte vorangestellt.
Die statistische Auswertung der HMGA2-Expression im Blut von Mamma-karzinompatientinnen und von Leukämiepatienten erfolgte unter Verwendung des Paarvergleichstests bzw. des einseitigen Zweistichproben t-Tests unter Annahme unterschiedlicher Varianzen.
Um einen statistischen Zusammenhang zwischen zwei Merkmalen zu bestimmen, wurden Korrelationstests nach Spearman bzw. Pearson durchgeführt. Sowohl der durchgeführte Test, der entsprechende Korrelationskoeffizient als auch das zugehörige Signifikanzniveau sind angegeben.
3 Ergebnisse
3.1
Mapping und Charakterisierung ausgewählter HMG-Gene
beim Modelltier Hund
Für die im Rahmen dieser Arbeit geplanten Genexpressionsstudien der HMG-Gene wurde auch auf Gewebe des Modelltieres Hund zurückgegriffen, da hier die Bereitstellung von Probenmaterial erheblich einfacher ist als beim Menschen. Der Hund stellt in vielerlei Hinsicht ein geeignetes Tiermodell für die humane Krebsforschung dar. Der Hauptvorteil des caninen Modells besteht in den diversen Tumorerkrankungen, die im Unterschied zu anderen Modelltieren beim Hund spontan auftreten. Zudem zeigen die caninen Krebserkrankungen ein ähnliches biologisches und histologisches Verhalten wie die korrespondierenden menschlichen Erkrankungen. Aufgrund der guten medizinischen Versorgung und der im Vergleich zum Menschen geringeren ethischen Probleme beim Hund ist neben der Beschaffung von Probenmaterial auch die Durchführung von Therapiestudien einfacher als beim Menschen. Zu den Krebserkrankungen des Hundes, welche als geeignetes Modell für humane Neoplasien gelten, zählen u.a. Osteosarkome, Mammakarzinome, Bronchialkarzinome und Prostatakarzinome.
3.1.1 Mapping und Charakterisierung des caninen HMGA1-Gens
I) Becker et al. (2003)
II) Murua Escobar et al. (2004) III) Murua Escobar et al. (2005)
Die HMGA1-Proteine sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, wie z.B. Genregulation, Integration viraler DNA in das Genom und neoplastische Trans-formation von Zellen. Eine Überexpression des HMGA1-Gens wurde für eine Reihe maligner Tumoren beschrieben, wobei die Höhe der HMGA1-Expression oft mit dem Grad der Malignität bzw. der Metastasierungsneigung eines Tumors korreliert. Zudem wurden chromosomale Abberationen des humanen HMGA1-Gens auf Chromosom 6p21 in vielen gutartigen meist mesenchymalen Tumoren, wie z.B. in Uterusleiomyomen, chondroiden Hamartomen der Lunge, Lipomen sowie follikulären Schilddrüsenadenomen, detektiert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das canine HMGA1-Gen unter Verwendung entsprechender BAC-Klone auf Chromosom CFA 23 des Hundes gemappt. Anders als beim Menschen stellt dieses Chromosom keinen Hot-Spot für chromosomale Bruchpunkte beim Hund dar.
Die molekulare Charakterisierung der caninen HMGA1 cDNA ergab hingegen eine sehr hohe Ähnlichkeit zwischen Hund und Mensch. Wie beim Menschen besteht die cDNA des Hundes aus 6 Exons, welche die beiden Splicevarianten HMGA1a und
HMGA1b codieren. Die Ähnlichkeit der gesamten cDNA-Sequenz beträgt für beide
Splicevarianten 80,6%. 5’UTR, CDS und 3’UTR zeigen 95,6%, 95,1% bzw. 74,7% Sequenzähnlichkeit zwischen Hund und Mensch. Die aus der caninen cDNA-Sequenz abgeleiteten Proteine HMGA1a und HMGA1b weisen eine Länge von 107 bzw. 96 AS auf und zeigen eine 100% Sequenzübereinstimmung zu den entsprechenden humanen Splicevarianten. Ein Vergleich zu orthologen Protein-sequenzen anderer Organismen, wie z.B. Maus, Ratte, Hamster, Schwein, Pferd, Rind und Huhn, zeigt, dass nur das Pferd dieselbe Sequenzübereinstimmung zum Menschen aufweist wie der Hund, jedoch ist bislang nur die equine HMGA1b-Variante in der NCBI-Datenbank verzeichnet. Alle anderen Spezies weisen eine Ähnlichkeit zwischen 69,7% (Huhn) und 99,1% (Schwein) auf, wobei die funktionellen AT-Hook Domänen besonders stark konserviert sind. Bei der Sequenzanalyse der CDS von zwölf verschiedenen Hunderassen wurde für HMGA1b bei einer Probe eines Teckels ein Basenaustausch detektiert, welcher zum Einbau einer abweichenden AS an Codon 64 führt. Um einen Eindruck über die Expression des
HMGA1-Gens beim Hund zu gewinnen, wurde ein Northern Blot mit Gesamt-RNA
bzw. mRNA aus Nieren-, Milz-, Herz-, Lungen- und Muskelgewebe durchgeführt. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten HMGA1a-cDNA-Sonde zeigt in allen Geweben außer der Niere eine Bande mit ca. 1,8 Kb Länge. Dieser Wert entspricht der vom Menschen bekannten mRNA-Länge.
3.1.2 Mapping und Charakterisierung des caninen HMGB1-Gens
IV) Murua Escobar et al. (2003)
Das humane HMGB1-Gen hat neben seiner Rolle im Zellkern als architektonischer Transkriptionsfaktor auch eine extrazelluläre Funktion. Dieses „Doppelleben“ macht HMGB1 als Target in der Krebstherapie so interessant. Bestimmte Zellen, wie z.B. Makrophagen, sezernieren HMGB1, welches als Ligand an den RAGE-Rezeptor binden kann. Die Bindung von HMGB1 an RAGE führt zur Aktivierung der MAP-Kinasen p38, SAP/JNK und p44/p42, welche bei entzündlichen Prozessen und der Tumormetastasierung eine wichtige Rolle spielen.
Zur Charakterisierung des caninen HMGB1-Gens wurden die cDNA-Sequenz, die genomische Struktur, die Lokalisation im Hundegenom und das Expressionsmuster untersucht. Das canine HMGB1-Gen liegt auf Chromosom CFA 25 und besteht wie auch das humane Gen aus fünf Exons und vier Introns. Die aus der cDNA-Sequenz abgeleitete Proteinsequenz mit 215 AS stimmt zu 100% mit der des Menschen überein, wohingegen Rind und Maus jeweils einen AS-Austausch in der sauren C-terminalen Domäne des Orthologs aufweisen. Die Expressionsanalyse mittels Northern-Blot mit Gesamt-RNA bzw. mRNA aus Nieren-, Milz-, Herz-, Lungen- und Muskelgewebe ergab eine deutliche Expression in allen Geweben außer der Niere. Analog zum Menschen wurden zwei HMGB1-Transkripte mit einer Länge von 1,4 und 2,4 Kb detektiert.
3.2 Quantitative
Expressionsanalysen
von
HMGA2 und HMGB1
beim Menschen bzw. Hund
3.2.1 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Tumor und
korrespondierenden tumorfreien Lungengewebe von NSCLC-Patienten
V) Meyer et al. (im Druck)
Lungenkrebs ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache. Grund dafür ist das meist fortgeschrittene Stadium des Tumors zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Eine Aufklärung der molekularen Mechanismen, welche bei Entwicklung und Progression der Tumoren eine Rolle spielen, könnte bei der Früherkennung und der Entwicklung von neuen Therapieansätzen helfen. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe mittels konventioneller RT-PCR konnte eine HMGA2-Reexpression im Tumor von 14/19 NSCLC-Patienten detektiert werden, während im nicht-neoplastischen Umgebungsgewebe keine HMGA2-Expression festzustellen war. Ziel dieser Studie war die quantitative Analyse der HMGA2-Expression bei Patienten mit NSCLC. Tumorproben und korrespondierendes tumorfreies Lungengewebe von 17 Adenokarzinompatienten (AC) und 17 Plattenepithel-karzinompatienten (SCC) wurden mittels quantitativer Real-time RT-PCR untersucht und die Ergebnisse immunhistochemisch überprüft.
Eine HMGA2-Expression konnte in allen untersuchten Lungenproben detektiert werden. Die Transkriptmengen variieren zwischen 289 und 525.947 Kopien pro 250 ng Gesamt-RNA im tumorfreien Gewebe und zwischen 5.422 und 16.991.545 Kopien im Tumorgewebe. In 33/34 Fällen konnte eine Überexpression von HMGA2 mRNA im Tumor verglichen zum korrespondierenden Umgebungsgewebe mit statistisch hoch signifikanten Unterschieden sowohl für die Adenokarzinompatienten (p < 0,0001) als auch für die Plattenepithelkarzinompatienten (p < 0,0001) festgestellt werden. Die HMGA2-Expression im Tumor liegt bis zu 911,02-fach (Mittelwert 158,41) für die Adenokarzinome und bis zu 2503,68-fach (Mittelwert 336,26) für die Plattenepithelkarzinome über der Expression im entsprechenden nicht-neoplastischen Gewebe, wobei ein statistisch signifikant höherer Anstieg (p < 0,05) bei den Plattenepithelkarzinomen zu verzeichnen ist. Eine signifikante Korrelation zu Grading oder Staging der Tumoren konnte nicht nachgewiesen werden, jedoch ist die höchste HMGA2-Transkriptmenge unter den Adenokarzinomproben bei der
einzigen Neoplasie mit T4-Klassifizierung detektiert worden. Die qRT-PCR-Ergebnisse konnten durch immunhistochemische Untersuchungen, welche an einem Teil der NSCLC-Proben durchgeführt wurden, bestätigt werden.
3.2.2 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens in Prostatageweben
des Hundes
VI) Winkler et al. (in Vorbereitung)
Neben dem Menschen ist der Hund die einzige Spezies, bei der häufig Prostatatumoren spontan auftreten. Zudem sind große Übereinstimmungen der beiden Spezies hinsichtlich Entwicklung und Progression der Adenokarzinome, wie z.B. Histopathologie und Metastasierungsverhalten, zu beobachten. Ebenso wie beim Menschen variiert die Aggressivität von Prostatatumoren des Hundes stark, so dass die Identifizierung von molekularen Markern, welche Rückschlüsse auf die Malignität eines Tumors erlauben, für eine verbesserte Prognosestellung und Therapie von großem Interesse ist. Bisherige Untersuchungen beim Menschen haben gezeigt, dass die Expression von HMGA1 mit der Aggressivität von Prostatatumoren korreliert. Zudem wird HMGA2 in anaplastischen Zellen der Prostata reexprimiert.
Im Rahmen dieser Studie konnte bei der quantitativen Untersuchung der HMGA2-Expression in 16 caninen Prostatageweben mit unterschiedlichen histologischen Befunden mittels Real-time RT-PCR eine erhebliche Überexpression von HMGA2 in Tumorgewebe verglichen mit gesundem Prostatagewebe nachgewiesen werden. Im nicht-neoplastischen Gewebe schwankt die HMGA2-Expression zwischen 127 und 1.433 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA, in benignen Veränderungen der Prostata zwischen 963 und 20.755 Transkripten und in Adenokarzinomen zwischen 27.215 und 4.239.000 Transkripten. Der mit zunehmender Malignität der Tumoren steigende HMGA2-Level zeigt, dass die HMGA2-Expression als prognostischer Marker sowohl beim Menschen als auch beim Hund dienen könnte.
3.2.3 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Mammakarzinompatientinnen
Unpublizierte Ergebnisse
Brustkrebs ist der häufigste maligne Tumor bei Frauen. Daher wird seit langem neben den histologischen und klinischen Parametern nach molekularen Faktoren gesucht, die Auskunft über die Prognose von Brustkrebserkrankungen geben können. In Untersuchungen an Blutproben von Brustkrebspatientinnen konnte mittels konventioneller RT-PCR eine HMGA2-Expression bei Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom nachgewiesen werden, während dieses Transkript bei gesunden Spendern nicht detektierbar war. Statistische Analysen ergaben eine Korrelation zwischen HMGA2-Expression und schlechter Prognose bezüglich der Überlebens-zeit, so dass die HMGA2-Expression im peripheren Blut als prognostischer Marker dienen könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine quantitative Analyse der HMGA2-Expression mittels Real-time RT-PCR an Blut von Brustkrebspatientinnen durchgeführt werden. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die HMGA2-Expression während einer Therapie verändert und eventuell Rückschlüsse auf das Ansprechen der Therapie zulässt. Dazu wurde von 22 Mammakarzinompatientinnen (s. Anhang, Tab. 1) je eine Blutprobe vor Therapiebeginn (-1) sowie eine zweite Probe während der Therapie (-2) entnommen und relativ quantifiziert.
In allen untersuchten Blutproben war mittels der relativen Quantifizierung eine
HMGA2-Expression nachweisbar. Aufgrund der teilweise sehr geringen
RNA-Ausbeute schwanken einige der Ct-Werte für die endogene Kontrolle 18S jedoch so stark, dass nur in 16 von 22 Fällen eine verlässliche Quantifizierung der HMGA2-Expression möglich war. Bei diesen 16 Patientinnen variiert die HMGA2-HMGA2-Expression vor Therapie um das 19,7-fache und nach der Therapie um das 13,3-fache. Es sind keine statistisch signifikanten Zusammenhänge der Expressionshöhen mit den klinischen Daten festzustellen. Ein Vergleich der HMGA2-Expression im Blut von Patientinnen mit und ohne Metastasen mittels Zweistichproben t-Test unter Annahme unterschiedlicher Varianzen ergab keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen diesen beiden Gruppen. Bezieht man die relative Transkriptmenge im Blut jeder Patientin während der Therapie auf die entsprechende Probe vor der Therapie, so dass diese als Kalibrator den Wert eins annimmt, wird deutlich, dass während der
Behandlung sowohl Expressionssteigerungen bis zum 5,8-fachen (Patient 15) als auch Abnahmen der Expression bis zum 5,2-fachen (Patient 09) zu verzeichnen sind (s. Anhang, Abb. 1). Der Paarvergleichstest zeigt, dass die Therapie keine allgemeine Auswirkung auf die HMGA2-Expression hat, das heißt, die Therapien vermochten die HMGA2-Expression aller Patientinnen weder signifikant zu vermindern noch zu erhöhen.
3.2.4 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen
Unpublizierte Ergebnisse
Frühere HMGA2-Expressionsanalysen mittels konventioneller RT-PCR hatten gezeigt, dass HMGA2 im peripheren Blut gesunder Probanden nicht detektierbar ist, während bei CML- bzw. AML-Patienten sowie in CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen von gesunden Personen eine HMGA2-Expression nachweisbar ist. Zudem konnte, wie unter 3.2.3 beschrieben, eine HMGA2-Reexpression im Blut von Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom festgestellt werden.
Um die Auswirkungen verschiedenster Erkrankungen auf die HMGA2-Expression im Blut zu evaluieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst 36 Blutproben u.a. von Patienten mit soliden Tumoren, mit malignen Erkrankungen des hämatopoetischen bzw. lymphatischen Systems sowie mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen erstmals mittels quantitativer Real-time RT-PCR untersucht und mit Blut von sieben gesunden Spendern verglichen (s. Anhang, Tab. 2).
Im Gegensatz zu vorhergehenden Untersuchungen unter Verwendung der konventionellen RT-PCR war eine HMGA2-Expression in allen Blutproben nachweisbar, sowohl bei den diversen Patienten als auch bei den untersuchten gesunden Probanden (s. Anhang, Abb. 2). Mit Ausnahme der Probe 45 sind im peripheren Blut keine signifikanten Unterschiede in der HMGA2-Expression zwischen den Patienten mit verschiedenen Diagnosen (Mittelwert 6.689 Transkripte / 250 ng Gesamt-RNA ohne Probe 45 bzw. 10.878 Transkripte mit Probe 45) und den untersuchten gesunden Probanden (Proben 30-36, Mittelwert 5.819 Transkripte / 250 ng Gesamt-RNA) festzustellen. Die Blutprobe 45, welche eine 27-fache Über-expression verglichen zum Mittelwert im gesunden Blut zeigt, stammt von einem
Patienten mit CML in Akzeleration nach abgebrochener Therapie, der in der Zwischenzeit verstorben ist. Bei den übrigen Patienten schwanken die Werte zwischen 1.126 Transkripten gemessen bei einem Patienten mit angeborenem gemischten variablen Immundefektsyndrom und 15.131 Transkripten bei einer Immunthrombozytopenie, was einer Varianz um das 13-fache entspricht. Die gesunden Probanden zeigen hingegen nur eine Varianz um das 2-fache. Neben der beschriebenen CML mit HMGA2-Überexpression waren unter den untersuchten Patienten zwei weitere maligne Erkrankungen des hämatopoetischen Systems vertreten. Sowohl Patient 1 mit CLL unter Endoxan-Behandlung als auch Patient 13 mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) zeigten mit 5.809 bzw. 8.221 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA keine erhöhte HMGA2-Expression.
3.2.5 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Patienten mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems im Vergleich zu gesunden Probanden
VII) Meyer et al. (in Vorbereitung) Unpublizierte Ergebnisse
Aufbauend auf den unter 3.2.4 beschriebenen Ergebnissen sollte im Folgenden die
HMGA2-Expression im peripheren Blut eines umfassenderen Kollektivs von 53
Patienten mit verschiedenen Erkrankungen des hämatopoetischen und lympha-tischen Systems, darunter 37 Leukämiepatienten, quantitativ untersucht werden (s. Anhang, Tab. 3).
Die mittels qRT-PCR gemessene HMGA2-Expression schwankt stark mit Werten zwischen 2.870 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei einem Patienten mit hochmalignem Lymphom und 6.360.200 Transkripten bei einem CML-Patienten in der Blastenkrise, was einer Varianz um das 2.216-fache entspricht (s. Anhang, Abb. 3). Da unter den elf am höchsten exprimierenden Patienten ausschließlich Leukämiepatienten zu finden sind, wurde diese Gruppe gesondert betrachtet und ihre Expressionsdaten mit denen der gesunden Probanden aus der vorhergehenden Untersuchung verglichen (s. Anhang, Abb. 4). Bei den Leukämiepatienten schwankt die HMGA2-Expression zwischen 3.936 (AML nach MDS) und 6.360.200 Transkripten (CML in Blastenkrise). Diese Varianz um das 1.616-fache steht einer
ca. 2-fachen Varianz bei den gesunden Probanden gegenüber. Statistische Analysen mittels einseitigem t-Test unter Annahme unterschiedlicher Varianzen ergaben eine signifikant erhöhte HMGA2-Expression im Blut von Leukämiepatienten verglichen mit dem Blut gesunder Probanden (p < 0,05). Um festzustellen, ob die Therapie einen Einfluss auf die HMGA2-Expression hat, wurden Patienten, welche sich zur Zeit der Blutabnahme in der Therapie befanden bzw. eine Therapie hinter sich hatten, mit solchen Patienten, bei denen das Blut vor einer Therapie entnommen wurde, verglichen. Mittels eines entsprechenden t-Tests ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede.
Eine gesonderte Betrachtung der HMGA2-Expression im peripheren Blut aller CML-Patienten (s. Anhang, Tab. 3) einschließlich des CML-Patienten 45 mit CML in Akzeleration aus der vorangegangenen Studie (vgl. 3.2.4) zeigt, dass dieses Patientenkollektiv ebenfalls eine starke Varianz der HMGA2-Expression aufweist. Die gemessene Transkriptmenge reicht von 4.392 bei Patient C2 in Remission bis zu 6.360.200 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei Patient B22 in der Blastenkrise, dem einzigen Patienten ohne Philadelphia-Chromosom bzw. nachweisbarem BCR-ABL-Fusionstranskript (s. Anhang, Abb. 5). Die statistische Analyse der Ergebnisse ergaben signifikante Korrelationen der Leukozytenzahlen zum Zeitpunkt der Blutabnahme und der gemessenen HMGA2-Expressionslevel sowohl für alle untersuchten CML-Patienten (Spearman-Korrelation: r = 0,899; p < 0,0001) als auch bei den Philadelphia-positiven Patienten (Spearman-Korrelation: r = 0,879; p < 0,0001). Da die HMGA2-Expression überproportional zur Leukozytenzahl ansteigt, ist von einer Hochregulierung der HMGA2-Gens in den besonders für die fortgeschrittenen Stadien der CML charakteristischen unreifen leukämischen Zellen auszugehen.
Die Daten der Expressionsanalyse bei AML-Patienten (s. Anhang, Abb. 6) zeigen keine derartige Korrelation mit der Leukozytenzahl (s. Anhang, Tab. 3). Die Transkriptmenge schwankt bei dieser Gruppe der Patienten zwischen 3.936 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei einer AML nach MDS unter Therapie und 2.686.860 bei gleicher Diagnose vor einer Behandlung. Es finden sich jedoch keine generellen signifikanten Unterschiede zwischen allen AML-Patienten während oder nach einer Therapie zu jenen, bei denen noch keine Behandlung aufgenommen wurde. Allerdings ergibt der t-Test, dass AML-Patienten allgemein eine statistisch
