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15-LIPOXYGENASE-mRNS UND ATHEROMATOSE IM WHHL- KANINCHEN: UNTERSUCHUNG EINER ANTIOXIDANTIEN- THERAPIE UND HMG-CoA-REDUCTASE-HEMMERTHERAPIE
AUF ATHEROMATOSE UND 15-LIPOXYGENASE-mRNS IM ATHEROM DURCH KOMPETITVE PCR
VOM FACHBEREICH BIOLOGIE DER UNIVERSITÄT
KAISERSLAUTERN ZUR VERLEIHUNG DES AKADEMISCHEN GRADES DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN1
GENEHMIGTE DISSERTATION
VORGELEGT VON HEIKE LUKHAUP
7. Mai 1993
VORSITZENDER:
1. BERICHTERSTATTER:
2. BERICHTERSTATTER:
PROF. DR. H. ZANKL
PROF. DR. E.A. FRIEDRICH PD DR. DR. H.A. DRESEL
- KAISERSLAUTERN 1993 -
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ZUSAMMENFASSUNG 1 A EINLEITUNG 2 B MATERIAL 14 1. Hersteller, Substanzen und Chemikalien 14 2. Geräte 16 C METHODEN 17 1. LDL-Präparation 17
1.1 Präparation des LDL durch sequentielle
Ultrazentrifugation 17 LDL aus Humanplasma 1 7 LDL aus Kaninchenblut 1 7 Charakterisierung des LDL 1 8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 1 8 Agarosegelelektrophorese zur Charakterisierung von Lipoproteinen 1 9 Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R 250 1 9 Proteinfärbung mit Silberreagenz 1 9 Proteinbestimmung 2 0
Tierhaltung, Fütterung und Testsubstanzen 21
Das Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL)
Kaninchen 2 1 2.2 Tierhaltung und Fütterung 2 1 2.3 Testsubstanzen 2 1 2.3.1 Probucol 2 1 2.3.2 Mevinacor® 2 2
3 Cholesterinbestimmung 23
3.1 Gewebecholesterin 2 3 3.2 Serumcholesterin 2 3 1.1.1.1.
1.2 1.2.
1.2, .1.2.
1 .2 1.2.3 1.2.
1.2
2
2.1 4 .5
L
4 DNS-Methoden 24
4.1 DNS-Präparation 2 4 4.1.1 Kartuschen-Methode (Qiagen) 2 4 4.1.1.1 Maxi- Präparation von Plasmid-DNS (bis zu 500 ug DNS) 2 4 4.1.1.2 Mini-Präparation von Plasmid-DNS (bis zu 20 |ig DNS) 2 4 4.2 Gelelektrophorese zur Auftrennng von DNS 2 5 4.2.1 Horizontale Agarosegelelektrophorese 2 5 4.2.2 Vertikalelektrophorese - Polyacrylamidgele 2 5 4.3 DNS-Fragmentisolierung 2 5 4.4 DNS-Sequenzierung 2 6 4.4.1 Herstellen der Sequenziergele 2 6 4.4.2 Sequenzierreaktion 2 7 4.5 Subklonierung von DNS-Fragmenten 2 8 4.5.1 Annealing der Oligonukleotide 2 8 4.5.2 Kinasierung der Oligonukleotide 2 8 4.5.3 Dephosphorylierung des Vektors 2 8 4.5.4 Ligation 2 9 4.5.5 Transformation 2 9
5 RNS-Methoden 30
5.1 RNS-Präparation 3 0 5.1.1 CsCl-Gleichgewichtszentrifugation 3 0 5.1.2 Phenol-Chloroform-Methode (Promega) 3 1 5.1.3 RNAzol™ B Methode 3 2 5.1.4 Quantitative und qualitative Analyse der RNS 3 2 5.1.4.1 Quantifizierung der RNS durch Bestimmung der OD 3 2 5.1.4.2 Elektrophorese der RNS in denaturierendem Agarose/ 3 3
Formaldehydgel
5.2 Reverse Transkription 3 4 5.2.1 Primerwahl für die Reverse Transkription 3 4 5.2.2 Reverse Transkription 3 4
6 Polymerase Chain Reaction (PCR) 35
6.1 PCR-Parameter 3 5 6.2 Primerwahl für die PCR 3 5 6.3 Qualitative PCR 36
6.4 Prinzip der kompetitiven PCR 3 6 6.4.1 Auswertung und Quantifizierung der PCR-Produkte 3 7
D ERGEBNISSE 38 1 Die Kompetitive PCR zur Quantifizierung von
GAPDH und 15-Lipoxygenase aus Gewebeproben 38
1.1 Präparation der internen Standards 3 8 1.1.1 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
aus Kaninchen 3 8 1.1.2 15-Lipoxygenase (15-LOX) aus Kaninchen 4 2
2 Evaluierung der optimalen Bedingungen für
die RNS-Quantifizierung durch kompetitive PCR 45
2.1 Reverse Transkription 4 5 2.1.1
2.1.2
3
3.1 3.2 3.3
3.4 3.5
RNS-Präparation
Primerwahl für die Reverse Transkription
PCR
Quantifizierung von cDNS durch kompetitive PCR Detektionsschwelle
Einfluß der Deletion des Kompetitors auf die Amplifikationseffizienz in der PCR
Reproduzierbarkeit der kompetitiven PCR
AmDlifikationseffizienz der GAPDH- und 15-LOX-
45 46 47 47 48 49 50
Primerpaare 5 0
4 Serumcholesterin, Oxidation von LDL, Gewebe- cholesterin und 15-LOX-mRNS in der Aorta von
hypercholesterinämischen WHHL-Kaninchen 52
4.1 Charakteristik der WHHL-Kaninchen 5 2 4.1.1 Serumcholesterinbestimmung 5 2 4.1.2 LDL-Oxidationskinetiken 5 4 4.2 15-LOX-mRNS in verschiedenen Geweben von
WHHL-Kaninchen 5 7
