Kombinierte Übung Fettsäuren
Zur Bestimmung von Fremdfetten in Lebensmitteln dient unter anderem die Verteilung der Fettsäuren, die innerhalb kleiner Grenzen ein
Fingerabdruck eines Pflanzen- oder Tierfettes darstellt.
Entwerfen Sie eine Methode, um die Fettsäureverteilung in einem Fett oder Öl quantitativ zu bestimmen. Nehmen Sie an, das Fett sei bereits aus dem Lebensmittel isoliert.
Ist eine Aufarbeitung oder Derivatisierung notwendig?
Welches Trennverfahren eignet sich?
Wie detektieren Sie die Fettsäuren?
Musterlösung Fettsäuren
In einem Fett oder Öl biologischer Herkunft sind die Fettsäuren mit Glycerin verestert.
O
O
(CH 2 ) n1 CH 3
(CH 2 ) n2 O
O CH 3
O
O
(CH 2 ) n3 CH 3
Die Fettsäuren sind meist linear und gesättigt. Wenn Doppelbindungen auftreten, sind sie nicht konjugiert. Als die Kurzbezeichnung für die Fettsäuren hat sich folgende Schreibweise eingebürgert: Cn:m bedeutet eine Kettenlänge von n Kohlenstoffatomen (die Carbonylgruppe wird mitgezählt) mit m Doppelbindungen.m=0 wird meist weggelassen.
Einige Trivialnamen:
C4 Buttersäure C6 Capronsäure C8 Caprylsäure C10 Caprinsäure C12 Laurinsäure C14 Myristinsäure C14:1 Myristoleinsäure C16 Palmitinsäure C16:1 Palmitoleinsäure C18 Stearinsäure C18:1 Ölsäure C18:2 Linolsäure C18:3 Linolensäure C20 Arachidinsäure C22 Behensäure C22:1 Erucasäure C24 Lignocerinsäure
Eine direkte Trennung der Triglyceride ist an sich möglich, aber mit Schwierigkeiten verbunden. Eine gaschromatographische Methode wurde beschrieben, die anhand der Triglyceride eines Butterfettes illustriert wird:
P: Palmitinsäure (C16:0) S: Stearinsäure (C18:0) O: Ölsäure (C18:1)
Säule: DB-17ht, 30 m x 0.32 mm, 0.15 µm Filmdicke Flussrate: 40 cm/s Wasserstoff
Temperaturprogramm: 250°–365° bei 5°/min, dann stationär Injektor: unbeheizt, "on-column"
Einspritzmenge: 1 µl (9 µg/µl in Toluol) Detektor: FID, 400°
Die einzelnen Triglyceride lassen sich nicht vollständig trennen, eine Quantifizierung ist nicht sinnvoll möglich. Eine Säulentemperatur von 365° ist nahe dem maximal Möglichen in der organischen Chemie. Bei noch höheren Temperaturen zersetzen sich fast alle organischen
Verbindungen.
Eine deutliche Verbesserung lässt sich mit einem veränderten Trennsystem erreichen:
Säule: DB-XLB, 15 m x 0.25 mm, 0.1 µm Filmdicke Flussrate: 50 cm/s Wasserstoff
Temperaturprogramm: 255°–365° bei 5°/min, dann stationär Injektor: 365°, "split" 1:50
Einspritzmenge: 1 µl (10 µg/µl in Toluol) Detektor: FID, 365°
Die Drift der Basislinie infolge des Temperaturprogrammes hält sich in Grenzen, so dass eine Quantifizierung möglich erscheint. Dennoch sind viele Peaks ungenügend voneinander getrennt.
Eine flüssigchromatographische Methode hilft auch nicht viel weiter. Es wurde eine Methode zur Trennung von Triglyceriden beschrieben, das hier anhand eines Olivenöls illustriert wird:
Säule: Hypersil BDS C18, 5 µm, 250 mm x 4.6 mm Mobile Phase: Acetonitril : Ethanol
Gradient: 80:20 bis 0:100 während 60 min Flussrate: 1.5 ml/min
Detektor: UV bei 225 nm und ELSD
Zur Trennung der Säuren wird die Polarität der Laufmittels
kontinuierlich verändert. Von den beiden eingesetzten Lösungsmitteln ist Ethanol der polarere Teil. Die Polarität des Laufmittels wird also während 60 Minuten kontinuierlich erhöht. Das ist eher ungewöhnlich.
Im allgemeinen wird die Polarität gegen Ende des Chromatogramms jener der stationären Phase angeglichen. Substanzen, die sich auf der stationären Phase besonders wohl fühlen, setzen sich dort gewisser- massen fest. Sie müssen nach Beendigung des Chromatographievorgangs doch noch irgendwie in die mobile Phase übergeführt werden. Es ist zu vermuten, dass am Ende jedes Chromatogramms mit Acetonitril gespült wird, was in der Vorschrift nicht erwähnt wird.
Das Chromatogramm aufgenommen mit dem UV-Detektor ist völlig unbrauchbar. An sich ist die Carbonylgruppe des Esters bei sehr tiefer Wellenlänge von 225 nm sichtbar, aber das Laufmittel absorbiert ebenfalls merklich. Da ein Konzentrationsgradient gefahren werden muss, weist die Basislinie eine derart hohe Drift auf, dass die Peaks nur als kleine Aufsetzer erscheinen.
Als Alternative wird ein "Evaporative Light Scattering Detector"
vorgeschlagen. Das Eluat wird zerstäubt, damit das Laufmittel verdampft. Die zurückbleibenden Partikel streuen das Licht eines Lasers. Weil das Laufmittel vorgängig abgetrennt wird, kann der Konzentrationsgradient also nicht störend wirken. Die Basislinie ist daher weitgehend horizontal. Trotz der Verbesserung sind die Peaks nicht ausreichend voneinander getrennt, um sinnvoll quantifiziert zu werden.
Die Vielfalt der Triglyceride ist enorm. Es ist nicht möglich, die
Triglyceride genügend voneinander zu trennen. Das ist aber auch nicht nötig. Gesucht ist die Verteilung der Fettsäuren, nicht ihre Kombination in Triglyceriden. Um diese Verteilung feststellen zu können, müssen die Fettsäuren aus dem Fett isoliert werden. Dies geschieht z.B. durch
Verseifung. Die isolierten Fettsäuren können dann nach neuen Kriterien getrennt werden. Ein Kriterium ist der Siedepunkt, der im Wesentlichen mit der Grösse der Moleküle steigt. Im folgenden Beispiel werden
einige organische Säuren (aber nicht alle wichtigen Fettsäuren) gaschromatographisch getrennt.
1 Aceton
2 Ameisensäure 3 Essigsäure 4 Propionsäure 5 Isobuttersäure 6 Buttersäure 7 Isovaleriansäure 8 Valeriansäure 9 Isocapronsäure
10 Capronsäure 11 Heptansäure 12 Caprylsäure 13 Caprinsäure 14 Laurinsäure 15 Myristinsäure 16 Palmitinsäure 17 Stearinsäure 18 Arachidinsäure
Säule: DB-FFAP, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm Filmdicke Flussrate: 40 cm/s Helium
Temperaturprogramm: 100° für 5 min, 100°–250° bei 10°/min, dann stationär
Injektor: 250°, "split" 1:50 Detektor: FID, 300°
Mit dieser Methode scheint eine genügende Trennung erreicht zu werden. Damit auch die höheren Fettsäuren bis C24 in sinnvoller Zeit getrennt werden können, müsste das Temperaturprogramm angepasst werden. Dies ist allerdings nur dann möglich, wenn die stationäre Phase eine weitere Temperaturerhöhung verkraftet.
Ein weiteres Trennkriterium für Fettsäuren ist deren Azidität. Das folgende Beispiel einer Trennung von Carbonsäuren (keine Fettsäuren) stammt aus dem Bereich der Ionenchromatographie.
1 Oxalsäure 2 Weinsäure 3 Citronensäure 4 Malonsäure 5 Ameisensäure 6 Milchsäure 7 Bernsteinsäure 8 Essigsäure 9 Fumarsäure
Säule: Jordi Organic Acid Column, 500 mm x 10 mm, 5 µm Mobile Phase: 0.01 M Phosphorsäure, pH 3 mit NaOH Flussrate: 1.5 ml/min
Detektor: UV bei 210 nm und RI
O O HO OH
1
O HO
O OH OH
OH
O HO
OH HO
O
O HO
O
HO OH
O
O OH H
O OH
HO O
HO
O
OH O
OH
O HO
O OH
2 3 4
5 6 7 8 9
Je azider eine Säure, desto eher liegt sie in der ionisierten Form als Anion vor, und kann vom stationären Ionentauscher gebunden werden, eluiert also spät. Der pH-Puffer im Laufmittel sorgt für definierte Trennbedingungen. Ohne Puffer könnten die zu trennenden Säuren einander beeinflussen, was zu Peakformen und Retentionszeiten führen könnte, die von der Zusammensetzung des zu trennenden Gemisches abhängt.
Zwei Detektoren wurden verwendet. Der Brechungsindex-Detektor (RI für Refractive Index) ist sehr universell einsetzbar. An die zu
trennenden Substanzen werden keine besonderen Ansprüche gestellt. Die Empfindlichkeit ist allerdings bescheiden. Der UV-Detektor behandelt die Substanzen sehr unterschiedlich. Bei 210 nm absorbieren alle
Carbonsäuren aufgrund der Präsenz einer Carboxylgruppe. Wenn aber zusätzlich konjugierte Doppelbindungen vorhanden sind, wird die
Absorption sehr stark. Dies gilt für die Oxalsäure (2 Doppelbindungen) und insbesondere für die Fumarsäure (3 Doppelbindungen).
Das Trennsystem scheint zur Trennung der Fettsäuren nicht geeignet.
Die Peaks sind zu breit, um die vielen Fettsäuren genügend voneinander trennen zu können.
Beim nächsten Beispiel aus dem Bereich der HPLC wird eine klassische RP-18-Säule verwendet. Als Trennkriterium dient die Polarität der Verbindungen. Damit die Fettsäuren nicht als Carboxylate, sondern als ungeladene Säuren vorliegen, wird dem Fliessmittel Phosphorsäure zugesetzt. Nur einige C-18-Fettsäuren wurden eingespritzt.
1 Linolensäure (C18:3) 2 Linolsäure (C18:2) 3 Ölsäure (C18:1) 4 Stearinsäure (C18:0)
Säule: Alltima C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile Phase: Tetrahydrofuran : Acetonitril : 0.1 % Phosphorsäure (24:58:18)
Flussrate: 1.5 ml/min Detektor: UV bei 220 nm
Die Polarität der Fettsäuren steigt mit der Anzahl Doppelbindungen. Die Stearinsäure, die keine Doppelbindungen aufweist, fühlt sich also am wohlsten auf der apolaren stationären Phase und eluiert demnach als letzte. Auch dieses Trennsystem ist offensichtlich nicht geeignet, um eine genügende Anzahl Fettsäuren zu trennen. Die Trennleistung reicht dazu nicht aus.
Im nächsten Beispiel wird eine Methode aus dem Bereich der
Kapillarzonen-Elektrophorese vorgestellt. Die Fettsäuren liegen hier als Carboxylationen vor, zusammen mit anderen organischen anorganischen Anionen. Auch hier scheint die Trennung nicht genügend.
1. Bromid, 20 mg/l 2. Iodid, 20 mg/l 3. Nitrit, 20 mg/l 4. Nitrat, 20 mg/l 5. Oxalat, 200 mg/l 6. Aconitrat, 20 mg/l 7. Malonat, 200 mg/l 8. Citrat, 20 mg/l 9. Malat, 200 mg/l 10. Tartrat, 200 mg/l 11. Succinat, 200 mg/l 12. Phthalat, 10 mg/l 13. Glutarat, 200 mg/l 14. Acetat, 200 mg/l
15. Propionat, 200 mg/l 16. Salicylat, 10 mg/l 17. Benzoat, 10 mg/l 18. Butyrat, 200 mg/l 19. 20. Pyroglutamat, 200 mg/l 21. A-picolinat, 200 mg/l 22. Valerat, 200 mg/l 23. Capronat, 200 mg/l 24. Glutamat, 200 mg/l 25. Heptanoat, 200 mg/l 26. Caprylat, 200 mg/l 27. Gluconat, 200 mg/l Probe: Kapillare: Puffer: Einspritzung: Spannung: Temperatur: Detektion:
Carbonsäuren und anorganische Anionen Belegt mit PVA, I/L 56/64.5 cm 20 mM Phosphat, pH 6.5 100 mbar*sec –15 kV 20° C UV 195 mn, Ref. 450 nm
10 8 6 4 2 0
mAU 05101520min
Die beste Lösung des Problems liegt in der Umesterung der Triglyceride mit Natriummethanolat. Die entstehenden Fettsäure- methylester (fatty acid methyl esters, FAMEs) lassen sich leicht mittels Gaschromatographie trennen. Die Detektion mit dem FID ist problemlos möglich. Der leichte Anstieg der Basislinie infolge des Temperatur- programmes stört die Quantifizierung nicht. Die meisten Peaks sind basisliniengetrennt.
