FAME – Kombinierte Übung

(1)

HS 2008 Xiangyang Zhang 1

Analytische Chemie

für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren

FAME – Kombinierte Übung

Zusammenfassung: GC, LC, EP

GC LC EP

MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung SP Film-df/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––

Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, df (kompakt) ID, L

Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V) Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-

Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS

Anwendungen Klein, neutral, thermostabil, nicht-zu-polare

Alle (auch polare bei RP, Polymere bei SEC)

Ionische (auch Neutrale bei MEKC)

(2)

Gute Trennung

•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)

•! Analyteneigenschaften

•! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)

!

R = " #1

"

$

% & ' ( ) * k

₂

1 + k

₂

* N

4 = t

_R₂

# t

_R1

(w

₂

+ w

₁

) /2

!

t

_R

= 16R

_S²

H

u " #

# $ 1

%

&

' (

) * " ( 1+ k

₂

)

³

k

₂² Kurze Retentionszeit t_R’ genuge Auflösung R

idealer Peakform (schmal w_b und symmetrisch)

!!

Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )

!!

Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

!!

Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP Derivatisierung:

Analysenmethode:

Auswahl einer Chromatographiemethode

Polarität

NP RP

•! Geeignet für Sehr polare und thermisch labile Substanzen

•! Geeignet für Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

•! Analytische, Präparative und Produktive

•! Grosse Auswahl und Hohe Trennleistung Selektivität

GC EP

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FAME – Ein kombiniertes Beispiel

Entwerfen Sie eine Methode, um die Fettsäureverteilung in einem Fett oder Öl quantitativ zu bestimmen. Nehmen Sie an, das Fett sei bereits aus dem Lebensmittel isoliert.

1. Ist eine Aufarbeitung oder Derivatisierung notwendig?

2. Welches Trennverfahren eignet sich?

3. Wie detektieren Sie die Fettsäuren?

With the implementation of the Nutrition

Labeling and Education Act of 1990 by the U.S.

Food and Drug Administration (FDA), the total fat and saturated fat contents of a food must be listed on its label."

Wichtige Fettsäuren in Milch, Fleisch, Fish und Gemüse"

1 C4:0 (Butryic) "

2 C6:0 (Caproic) "

3 C8:0 (Caprylic) "

4 C10:0 (Capric) "

5 C11:0 (Undecanoic) "

6 C12:0 (Lauric) "

7 C13:0 (Tridecanoic) "

8 C14:0 (Myristic)"

9 C14:1 (Myristoleic) "

10 C15:0 (Pentadecanoic) "

11 C15:1 (cis-10-Pentadecenoic) "

12 C16:0 (Palmitic) "

13 C16:1 (Palmitoleic) "

14 C17:0 (Heptadecanoic) "

15 C17:1 (cis-10-Heptadecenoic) "

16 C18:0 (Stearic) "

17 C18:1n9c (Oleic) "

18 C18:1n9t (Elaidic) "

19 C18:2n6c (Linoleic) "

20 C18:2n6t (Linolelaidic) "

21 C18:3n6 (!-Linolenic)"

22 C18:3n3 ("-Linolenic) "

23 C20:0 (Arachidic) "

24 C20:1n9 (cis-11-Eicosenoic) "

25 C20:2 (cis-11,14-Eicosadienoic) "

26 C20:3n6 (cis-8,11,14-Eicosatrienoic) "

27 C20:3n3 (cis-11,14,17-Eicosatrienoic) "

28 C20:4n6 (Arachidonic) "

29 C20:5n3 (cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic) "

30 C21:0 (Henicosanoic) "

31 C22:0 (Behenic) "

32 C22:1n9 (Erucic) "

33 C22:2 (cis-13,16-Docosadienoic) "

34 C22:6n3 (cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic)"

35 C23:0 (Tricosanoic) "

36 C24:0 (Lignoceric) "

37 C24:1n9 (Nervonic) "

Je 2 C14-C17/C24; je 7 C18/C20, 4 C22 Isomere

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Der erste Schritt

Unfortunately for the food analyst, determining the fatty acid composition is difficult because a food can contain many different fatty acids of various carbon chain lengths. "

Wichtige Punkte:

•! Viele Komponenten, davon es ähnliche Isomere zu entstehen sind

•! Triglyceriden mit sehr höhen Siedpunkt

•! Carboxylic Gruppe: nicht empfindlich bei UV; wenn Elutionsgradient nötig, RI-Detektion ist auch nicht geeignet.

•! Ist der Triglyceride möglich zu derivatisieren?

DB-5ht Säule für Butter Triglyceriden

(5%-Phenyl)-methylpolysiloxane, unpolar 30 m x 0.32 mm I.D., 0.1 µm

Carrier: Hydrogen at 55 cm/sec, measured at 250°C Oven: 35-250°C at 70°/min, 250-400°C at 5°/min 400°C for 20 min

Injector: Cool On-column

1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution) Detector: FID, 400°C

T= Total number of Carbons

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DB-XLB für Butter Triglycerides

Column: DB-XLB

15 m x 0.25 mm I.D., 0.1 µm Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec Oven: 255-365°C at 5°/min 365°C for 10 min

Injector: Split 1:50, 365°C 1 µL of 10 µg/µL

Detector: FID, 365°C

Nitrogen makeup gas at 30 mL/min Exceptionally Low Bleed (XLB)

Low polarity

Extended temperature limit of 340/360°C

Eine polarere Säule

DB-17ht: (50%-Phenyl)-methylpolysiloxane

!"#-polarity; Extended upper temperature limit of 365°C Excellent peak shape and faster elution times for high boilers Improved resolution for triglycerides

Ideal for confirmational analyses

30 m x 0.32 mm I.D., 0.15 µm Carrier: Hydrogen at 40 cm/sec

Oven: 250-365°C at 5°/min; 365°C for 1 min Injector: Cool On-column

1 µL of 9 µg/µL in toluene (approx. 1% w/w solution)

Detector: FID, 400°C, Nitrogen makeup gas at 30 mL/min

Baseline Corrected

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DB-17ht für Butterfett

DB-17ht für Kokosfett

(50%-Phenyl)- methylpolysiloxane 30 m x 0.25 mm I.D., 0.15 µm Carrier: Hydrogen at 50 cm/sec Oven: 255-365°C at 5°/min 365°C for 10 min

Injector: Split 1:50, 365°C 1 µL of 10 µg/µL

Detector: FID, 365°C

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HPLC: Olivenöl

ELSD Detektor UV bei 225 nm

Säule: Hypersil BDS C18, 5 !m, 250 mm x 4.6 mm Mobile Phase: CH₃CN : EtOH Gradient: 80:20 bis 0:100

während 60 min Flussrate: 1.5 ml/min

Detektor: UV bei 225 nm und ELSD

Triglycerides in 100% Olive Oil

•! Alltima^™ C18, 3!m, 150 x 4.6mm

•! Mobile Phase:

–! A: Dichloromethane –! B: Acetonitrile

•! Gradient:

–! Time (min): 0 10 18 20

%B: 70 55 70 70

•! Flowrate: 1.5mL/min

•! Detector: ELSD 2000 1. LLO

2. LLP 3. OOL 4. POL 5. PPL 6. OOO 7. OOP 8. PPO 9. OOS

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Derivatisierung

O O

O

C (CH₂)n₁CH₃ C (CH₂)n₂CH₃ C (CH₂)n₃CH₃ O

O O

3 NaOH

HO HO

HO

O O

OH OH

OH

+

HCl

Ionenchromatographie

1 Oxalsäure "

2 Weinsäure "

3 Citronensäure "

4 Malonsäure "

5 Ameisensäure "

6 Milchsäure "

7 Bernsteinsäure "

8 Essigsäure "

9 Fumarsäure!

Säule: Jordi Organic Acid Column, 500 mm x 10 mm, 5 !m Mobile Phase: 0.01 M

Phosphorsäure, pH 3 mit NaOH

Flussrate: 1.5 ml/min

(9)

GC-FID: DB-FFAP

1 Aceton "

2 Ameisensäure "

3 Essigsäure "

4 Propionsäure "

5 Isobuttersäure "

6 Buttersäure "

7 Isovaleriansäure "

8 Valeriansäure "

9 Isocapronsäure "

10 Capronsäure "

11 Heptansäure "

12 Caprylsäure "

13 Caprinsäure "

14 Laurinsäure "

15 Myristinsäure "

16 Palmitinsäure "

17 Stearinsäure "

18 Arachidinsäure "

High polarity, Nitroterephthalic acid modified polyethylene glycol

Säule: 30 m x 0.25 mm, 0.25 !m Filmdicke Flussrate: 40 cm/s Helium

T: 100° für 5 min, 100°–250°

bei 10°/min, dann stationär Injektor: 250°, "split" 1:50 Detektor: FID, 300°

HPLC: Alltima C-18

1 Linolensäure (C18:3) 2 Linolsäure (C18:2) 3 Ölsäure (C18:1) 4 Stearinsäure (C18:0)

Säule: Alltima C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm "

Mobile Phase: Tetrahydrofuran : Acetonitril : 0.1 % Phosphorsäure "

(24:58:18) "

Flussrate: 1.5 ml/min "

Detektor: UV bei 220 nm!

(10)

CZE für Carbonsäuren

Derivatisierung – FAME

Die beste Lösung des Problems liegt in der Umesterung der Triglyceride mit

O O

O

O O

3 NaOCH₃

H₃CO H₃CO

H₃CO

O O

ONa ONa

ONa

+

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DB-Wax Säule: 34 FAMEs

•! Polyethylene glycol (PEG)

•! Close equivalent to USP Phase G16

•! High polarity

•! Lower temperature limit of 20°C is lowest of any bonded PEG phase; improves resolution of low boiling point analytes

•! Column-to-column repeatability

•! Bonded and cross-linked; solvent rinsable

•! Exact replacement of HP-WAXcement of HP-WAX

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17/18

(50%-Cyanopropylphenyl- dimethylpolysiloxane

H₂, T-Gradient, FID, 13 min