der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Histomorphologische und immunhistochemische (Ki-67) Untersuchungen am Oberflächenepithel des Ovidukts im Zyklusverlauf
der Hündin
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Nicola Steinhauer
aus Rheine
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
Apl.-Prof. Dr. A. Boos
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. N. Parvizi
Tag der mündlichen Prüfung: 06.07.2002
Meinen Eltern
1 Einleitung...9
2 Literaturübersicht ...11
2.1 Physiologie des Sexualzyklus der Hündin... 11
2.2 Zyklusphasen ... 11
2.3 Endokrinologie des Sexualzyklus der Hündin ... 13
2.4 Anatomie des Eileiters der Hündin ... 14
2.5 Histomorphologie des Ovidukts... 15
2.6 Histomorphologie des caninen Eileiters im Zyklusverlauf ... 18
2.7 Pathologische, entwicklungsbedingte und altersgemäße Veränderungen des Ovidukts der Hündin ... 26
2.8 Ki-67-Antigen ... 28
2.9 Östrogen- und Progesteronrezeptoren des caninen Ovidukts im Zyklusverlauf ... 29
3 Material und Methoden ...31
3.1 Tiere... 31
3.2 Versuchsdurchführung ... 31
3.2.1 Untersuchungszeitpunkte... 31
3.2.2 Bestimmung des Zyklusstandes ... 32
3.2.3 Klinisch-gynäkologische und vaginalzytologische Untersuchung... 32
3.2.4 Quantitative Hormonuntersuchung ... 33
3.2.5 Histologische Befunde ... 34
3.3 Organgewinnung, Präparation und Fixierung... 34
3.4 Organzuschnitt für die Einbettung ... 35
3.4.1 Technovitschnitte ... 36
3.4.2 Paraplasteinbettung ... 36
3.5 Schnitttechnik... 36
3.5.1 Technovitschnitte ... 36
3.5.2 Paraplastschnitte ... 36
3.6 Histologische Färbetechnik ... 37
3.6.1 Färbung der Technovitschnitte... 37
3.6.2 Färbung der Paraplastschnitte ... 37
3.7 Immunhistochemische Darstellung proliferierender Zellen... 37
3.8 Untersuchungsgang ... 38
3.8.1 Auswertung und Dokumentation ... 38
3.8.2 Histologische Befunde ... 38
3.8.3 Immunhistochemische Befunde ... 39
3.9 Statistische Auswertung... 40
4.2 Endokrinologische Befunde... 42
4.3 Eileiterlänge und –durchmesser... 42
4.4 Histologische Veränderungen des Ovidukts in Abhängigkeit vom Organabschnitt und der Zyklusphase ... 44
4.5 Histomorphologische Befunde ... 48
4.5.1 Anöstrus... 49
4.5.2 Späte Follikelphase... 57
4.5.3 Lutealphase (d 25 bis 30 p.ov.)... 67
4.6 Freie Zellen ... 84
4.7 Statistische Auswertung der histomorphometrischen Befunde ... 84
4.8 Ki-67-Antigen-Expression ... 88
5 Diskussion...94
5.1 Untersuchungsmaterial ... 94
5.2 Endokrinologische Befunde... 95
5.3 Histomorphologische Befunde ... 95
5.4 Statistische Auswertung... 104
5.5 Ki-67-Antigen-Expression ... 104
5.6 Stiftchen-Zellen ... 106
5.7 Freie Zellen ... 107
5.8 Intrazelluläre Zysten... 108
6 Zusammenfassung ...110
7 Summary...112
8 Literaturverzeichnis ...114
9 Anhang...137
A. bidest. Aqua bidestilata Abb. Abbildung AÖ Anöstrus
bzw. beziehungsweise ca. circa
°C Grad Celsius
d.h. das heisst
E2 Östradiol-17β Fa. Firma
FSH Follikel stimulierendes Hormon g Gramm
ggr. geringgradig H.E. Hämatoxylin-Eosin hgr. hochgradig
IN Infundibulum incl. inklusive kg Kilogramm Lam. Lamina
LH Luteinisierendes Hormon
LU Lutealphase mg Milligramm mgr. mittelgradig ml Milliliter mm Millimeter musc. muscularis
n.b. nicht beurteilbar
Nr. Nummer
NZZ nicht-zilientragende Zellen OV Ovidukt
p.ov. post ovulationem
P4 Progesteron PAS periodic acid-Schiff PBS phosphate buffered saline Primf Primärfalten
rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum s. siehe
S. Seite
Sekf Sekundärfalten
T4 Thyroxin Tab. Tabelle Tertf Tertiärfalten T. Tunica u. und
u.a. unter anderem
UE undifferenziertes Epithel UTV uterotubale Verbindung vgl. vergleiche
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
ZZ zilientragende Zellen
1 Einleitung
Der Eileiter nimmt eine Vielzahl von Funktionen innerhalb des Reproduktionsgeschehens wahr. Hierzu gehört u.a. die Aufnahme der Eizellen durch das mit Fimbrien besetzte Infundibulum, der Transport derselben in den Uterus und in entgegengesetzter Richtung der Spermien zu befruchtungsfähigen Eizellen sowie die Aufrechterhaltung der Lebens- und Befruchtungsfähigkeit von Eizellen und Spermien durch Bereitstellung von Sekretionsprodukten zur Schaffung adäquater Konditionen auch für die frühe Embryonalentwicklung.
Beim Hund scheint dem weiblichen Genitale eine besondere Rolle zuzukommen, da die Zeitspanne der Fruchtbarkeit innerhalb des Zyklus sehr lang ist. So kann eine Bedeckung 9 Tage vor und 8 Tage nach erfolgter Ovulation erfolgreich sein (ENGLAND et al. 1989). Deswegen muss gewährleistet sein, dass Spermien in den Reproduktionsorganen gespeichert werden können, die bis zum Zeitpunkt der Anwesenheit befruchtungsfähiger Eizellen lebensfähig und fertil bleiben. Diese Zeitspanne scheint beim Hund bis zu 11 Tage einzunehmen (DOAK et al. 1967;
ENGLAND et al. 1989). Die Funktion eines Spermienreservoirs wurde beim Hund bisher den Uterindrüsen zugeordnet (DOAK et al. 1967), während sie bei anderen Tierarten für die uterotubale Verbindung und den kaudalen Eileiteristhmus nachgewiesen wurde (HUNTER 1981; HUNTER u. NICHOL 1983; SMITH u.
YANAGIMACHI 1990; HUNTER et al. 1991; LEFEBVRE et al. 1995). Die mit caninen Eileiterepithelzellkulturen erzielten Ergebnisse von ELLINGTON et al. (1995) und PACEY et al. (2000) beweisen, dass Spermien engen Kontakt und Bindungen zum Eileiterepithel aufnehmen und besonders im Östrus am Oberflächenepithel länger als 48 Stunden motil bleiben.
Darüber hinaus werden die Eizellen bei der Hündin, im Gegensatz zu anderen Säugetierspezies, als unreife primäre Oozyten ovuliert (HOLST u. PHEMISTER 1971). Sie erreichen erst 2-3 Tage später, während der Metaphase der zweiten meiotischen Reifeteilung und nach Abschnürung des ersten Polkörperchens, auf
ihrem Weg vom kranialen zum kaudalen Eileiterdrittel die Befruchtungsfähigkeit (FARSTAD et al. 1989; TSUTSUI 1989).
Anatomisch-histologische Studien am Eileiter der Hündin sind rar und wenig detailliert. Zyklische, insbesondere durch Östrogene und Progesteron bedingte Veränderungen werden zwar von VERHAGE et al. (1973 a, b) und SAWYER et al.
(1984) beschrieben, die Untersuchungen beschränken sich jedoch auf den ampullären Bereich des Eileiters. Zudem erfolgten die Studien an hormonbehandelten präpubertären Beagles oder an adulten Hündinnen, bei denen sich die Bestimmung des Zyklusstandes auf die Erhebung äußerer Merkmale beschränkte und deswegen entsprechend ungenau ist.
Ziel der vorliegenden Studie ist es, die hormon-induzierten Veränderungen des Eileiters über die gesamte Länge des Organs unter physiologischen Bedingungen und zu genau definierten Zeitpunkten im Zyklus darzustellen. Besonderes Augenmerk wird hierbei auf das Oberflächenepithel gelegt. Dabei sollen einerseits die einzelnen Eileiterabschnitte hinsichtlich des Vorkommens und der Verteilung verschiedener Epithelzelltypen miteinander und in Abhängigkeit vom Zyklusstand verglichen werden. Andererseits werden die Konzentrationsniveaus der Ovarsteroide mit den histomorphologischen Veränderungen in der zellulären Ausprägung korreliert. Zusätzlich erfolgt ein immunhistochemischer Nachweis proliferierender Zellen mittels Ki-67-Antigen-Detektion.
Damit sollen Gundlagen für weiterführende Untersuchungen im Hinblick auf die Lokalisation und den Vorgang der Spermienspeicherung im Zusammenhang mit der Befruchtung erarbeitet werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Physiologie des Sexualzyklus der Hündin
Der Sexualzyklus der Hündin weist endokrine und funktionelle Eigenarten auf (JÖCHLE u. ANDERSEN 1977). Besonders auffällig ist, im Vergleich zu allen anderen Haussäugetierspezies, der zeitlupenartige Verlauf der einzelnen Zyklusphasen (CONCANNON et al. 1989) und die nahezu identischen Charakteristika der Lutealphase tragender und nicht tragender Hündinnen (CHRISTIE u. BELL 1971; MEYER 1994).
Die Hündin wird im Alter von 6 bis 24 Monaten geschlechtsreif (JÖCHLE 1976;
CONCANNON 1984). Wegen der für diese Tierart besonders langen, rassespezifisch divergierenden Zyklusdauer von 6 bis 12 Monaten wird sie als monöstrisch (ANDERSEN u. SIMPSON 1973; STABENFELDT u. SHILLE 1977; CONCANNON et al. 1989) bzw. diöstrisch (SCHNORR u. KRESSIN 2001) bezeichnet. Eine erhöhte Reproduktionsaktivität wird laut TEDOR und REIF (1978) in unseren Breiten im Frühjahr und im Herbst beobachtet, während SOKOLOWSKI et al. (1977) und CONCANNON (1993) keine Saisonalität feststellten.
2.2 Zyklusphasen
Die ursprünglich von HEAPE im Jahr 1900 eingeführte Unterteilung und Terminologie der Zyklusphasen ist inzwischen weithin akzeptiert. Auch ANDERSEN und SIMPSON (1973), JÖCHLE und ANDERSEN (1977) sowie GÜNZEL und KOIVISTO (1984) teilen den Zyklus entsprechend in folgende vier Phasen auf:
Proöstrus (Follikelanbildung), Östrus (Ovulation und Gelbkörperanbildung), Metöstrus (Lutealphase und endometriale Reparation) und Anöstrus (Ruhephase).
Die Zeitspanne vom Austritt des ersten blutigen Läufigkeitssekrets aus der Vulva bis zum Einsetzen der Deckbereitschaft wird als Proöstrus bezeichnet und dauert etwa 9
Tage, allerdings werden individuelle Schwankungen von 3 bis zu 17 Tagen angegeben (EVANS u. COLE 1931; SHILLE et al. 1974; CONCANNON 1984;
FRESHMAN 1991). Daran schließt der Östrus, die Phase der Paarungsbereitschaft, an, der durchschnittlich ebenfalls etwa 9 Tage dauert, mit einer Spanne von 3 bis 21 Tagen (SHILLE et al. 1974; HOLST u. PHEMISTER 1974; CONCANNON 1984;
OLSON et al. 1987 a; FRESHMAN 1991). Der Beginn des nachfolgenden Metöstrus ist äußerlich durch das Abklingen der Deckbereitschaft (FRESHMAN 1991) und
zytologisch durch charakteristische Veränderungen der Vaginalepithelzellkonstellation gekennzeichnet (HOLST u. PHEMISTER 1974). Die
insgesamt etwa 4,5 Monate dauernde Phase läßt sich in zwei Abschnitte einteilen:
die Lutealphase und die Endometriumsreparation.
Die Lutealphase beginnt mit der Ovulation bereits im Östrus und zwar 5 bis 7 Tage vor dem Metöstrus (HOLST u. PHEMISTER 1974). Sie lässt sich in bezug auf die endokrine Aktivität der Gelbkörper in drei Abschnitte teilen: die Gelbkörperanbildung, die maximale sekretorische Aktivität und die Phase der Gelbkörperregression (ANDERSEN u. SIMPSON 1973; JÖCHLE u. ANDERSEN 1977). Die Lutealphase ist beim tragenden Tier mit der Geburt terminiert, bei der nicht tragenden Hündin ist sie individuell unterschiedlich nach 54 bis 70 Tagen beendet (CONCANNON et al. 1989;
MEYER 1994). Die sich anschliessende Endometriumsreparation nimmt einen Zeitraum von etwa 70 bis 80 Tagen in Anspruch (ANDERSEN u. SIMPSON 1973;
JÖCHLE u. ANDERSEN 1977).
Die verbleibende Zeit bis zum Beginn einer neuen Läufigkeit wird als Anöstrus bezeichnet und ist mit einer Dauer von einem bis zu sechs Monaten sehr variabel (CONCANNON 1984). In dieser sexuellen Ruhephase ist eine unterschwellige Ovaraktivität mit wellenförmigen Follikelanbildungs- und Rückbildungswellen zu verzeichnen, die mit der Entstehung Graaf'scher Follikel in den Proöstrus münden (OLSON et al. 1982; CONCANNON 1986).
2.3 Endokrinologie des Sexualzyklus der Hündin
Bereits im Anöstrus werden durch Follikelan- und -rückbildungswellen basal schwankende Östrogenkonzentrationen von 8 bis 15 pg/ml festgestellt (CONCANNON 1986; FELDMAN u. NELSON 1996). Vier bis fünf Wochen vor Beginn des Proöstrus kommt es zum Anstieg von Östradiol-17β (E2) im Plasma von ca. 7 auf 13 pg/ml (EDQVIST et al. 1975). Auch OLSON et al. (1982) berichten von einem E2-Anstieg auf Werte zwischen 20 bis 46 pg/ml schon 45 Tage vor dem Beginn des Proöstrus, während die Progesteronwerte unter 1 ng/ml verbleiben. Als basale Progesteronwerte werden in der Literatur bis zu 2,9 ng/ml im Plasma angegeben (WILDT et al. 1979).
Im späten Anöstrus kommt es zunächst zur vermehrten Ausschüttung von FSH aus dem Hypophysenvorderlappen, welches zur Initiation der Follikulogenese führt (OLSON et al. 1982; KOOISTRA et al. 1999). Mit gesteigerter Frequenz und Amplitude der pulsatilen LH-Freisetzung wird der Anöstrus terminiert (CONCANNON 1993; KOOISTRA et al. 1999; VERSTEGEN et al. 1999) und Graaf'sche Follikel werden angebildet (MONNIAUX et al. 1997; KOOISTRA et al. 1999). LH induziert in den Granulosazellen der Follikel eine Steroidhormonsynthese, so dass diese mit hohen Östrogenwerten korreliert (TANI et al. 1999). Im späten Proöstrus werden E2- Werte von 46 bis zu maximal 113 pg/ml erreicht (EDQVIST et al. 1975;
CONCANNON et al. 1975; DREIER et al. 1987; CONCANNON 1989).
Übersteigt das von den wachsenden Follikeln sezernierte Östradiol einen gewissen Schwellenwert für mindestens 36 Stunden, so kommt es durch einen positiven Rückkopplungsmechanismus zu einer massiven Ausschüttung von LH, dem sogenannten LH-Peak (NETT et al. 1975; CONCANNON 1986). Dieser koinzidiert meist mit dem Beginn der Paarungsbereitschaft und induziert durch die Transformation der östrogensezernierenden Granulosazellen in progesteronsezernierende Luteinzellen die präovulatorische Follikelluteinisierung (ANDERSEN u. SIMPSON 1973). Diese ist von einem initialen Progesteronanstieg im Blut gekennzeichnet (CONCANNON et al. 1977; WILDT et al. 1979).
Durchschnittlich 48 Stunden nach dem LH-Peak findet die Ovulation statt
(PHEMISTER et al. 1973; CONCANNON et al. 1977; WILDT et al. 1979;
CONCANNON et al. 1989; BAAR 1995). Während der Ovulation werden Progesteronwerte zwischen 3 und 8 ng/ml im Plasma erreicht (CONCANNON et al.
1975, 1977; CONCANNON 1984; DIETERICH 1994).
Post ovulationem steigt die Progesteronkonzentration weiter an, um nach 10 bis 30 Tagen Maximalwerte von 20 bis 90 ng/ml zu erreichen (CONCANNON 1986;
JEFFCOATE 1998). Dem entsprechen die Untersuchungen von CONCANNON und HANSEL (1973) sowie DREIER et al. (1987), die einen Progesteronanstieg bis zu Maximalwerten von 22,9 ng/ml nach 25 bis 30 Tagen, respektive 40 ng/ml nach 30 Tagen verzeichnen, während die Östrogenwerte über die gesamte Lutealphase konstant bei 9 bis15 pg/ml liegen. Einhergehend mit der Gelbkörperregression sinken die Progesteronspiegel kontinuierlich wieder ab. Es ist kein wesentlicher Unterschied im Verlauf der Progesteronwerte tragender und nicht-tragender Hündinnen zu verzeichnen (JEFFCOATE 1998).
2.4 Anatomie des Eileiters der Hündin
Der Eileiter wird erstmalig von Gabriel Fallopius im Jahr 1561 erwähnt (zit. nach HUNTER 1988). Dieser beschreibt das Hohlorgan sowohl beim Menschen als auch bei Kuh, Schaf und anderen Tierarten als ein aus dem Uterus entspringenden
"Samengang" mit trompetenförmigem Ende. Entsprechend wird das Organ als
"Fallopian tube" bezeichnet. Synonyme sind Tuba uterina, Salpinx und Ovidukt. In der Literatur wird die Länge des Eileiters der Hündin mit 6 bis 10 cm (LEISER 1999) bzw. 4 bis 7 cm bei einem Durchmesser von 1 bis 3 mm (EVANS 1993) angegeben.
Bauchhöhlenwärts beginnt das Organ mit dem mit Fortsätzen, sog. Fimbrien, versehenen trichterförmigen Infundibulum, welches für die Aufnahme der Oozyten während der Ovulationsperiode sorgt (SMOLLICH 1992). Mit dem Ostium abdominale tubae schließt sich der Ampullenteil an, welcher der Ort der Befruchtung ist (SMOLLICH 1992; LIEBICH 1999; SCHNORR u. KRESSIN 2001). Das kaudale Drittel des Eileiters wird als Isthmus bezeichnet (BECK u. BOOTS 1974). Dieser Teil
ist beim Hund, im Gegensatz zu anderen Tierarten, wie z.B. dem Schwein, makroskopisch nicht durch eine Abnahme des Organdurchmessers gekennzeichnet.
Der Eileiter verläuft in der sehr fetthaltigen Mesosalpinx, welche, zusammen mit dem Aufhängeapparat des Ovars, die Bursa ovarica bildet (EVANS 1993). Er schlängelt sich annähernd zirkulär um das Ovar, verläuft zunächst medial, dann bogenförmig nach lateral, anschließend mit dem Isthmusteil uteruswärts und mündet dort mit einer in das Uterushorn vorspringenden Papille (Ostium uterinum tubae) (McENTEE 1990;
LEISER 1999; KÖNIG u. LIEBICH 1999). Bei Hund und Katze wird der Eintrittswinkel des Organs in den Uterus mit 120° angegeben (ANDERSEN u. SIMPSON 1973).
HAFEZ und BLACK (1969) beschreiben die Papille als hügelförmiges, ovales Gebilde, welches zu ¾ das Uteruslumen einnimmt. Die Papille ist ca. 3 mm lang und 2 mm breit mit einem 1 mm langen Schlitz.
Der Bereich des Übergangs wird der Funktion entsprechend als uterotubale Verbindung (UTV) bezeichnet (HOOK u. HAFEZ 1968; BECK u. BOOTS 1974).
2.5 Histomorphologie des Ovidukts
Unabhängig von der Spezies besteht die Eileiterwand aus drei Anteilen (NILSSON u.
REINIUS 1969; BECK u. BOOTS 1974; GELBERG u. McENTEE 1986; McENTEE 1990; SMOLLICH 1992).
Dabei handelt es sich um die außen liegende Tunica serosa, die aus mesothelialen Anteilen des Peritoneums besteht, welche von lockerem Bindegewebe unterlegt sind.
LIEBICH (1999) beschreibt darüber hinaus eine Tela subserosa mit im Isthmusbereich befindlichen Längsmuskelfasern. Daran schließt sich nach innen die Tunica muscularis an, deren Dicke zwischen den einzelnen Eileiterabschnitten variiert und im Isthmusbereich am kompaktesten ist (NILSSON u. REINIUS 1969;
BECK u. BOOTS 1974; HUNTER 1988; SMOLLICH 1992; PRIEDKALNS 1993;
EVANS 1993; LIEBICH 1999). Hier ist die Muskelschicht durch einen vorherrschend spiraligen Verlauf der glatten Muskelzellen gekennzeichnet, während ansonsten longitudinal ausgerichtete Fasern und schräg spiralig verlaufende Myozyten eine nur undeutlich regelmäßige Anordnung erkennen lassen (LIEBICH 1999).
Die innen gelegene Tunica mucosa besteht aus der Lamina propria und der Lamina epithelialis.
Die drüsenlose Lamina propria setzt sich aus einem zellreichen und faserigen Bindegewebe zusammen (GELBERG u. McENTEE 1986; HUNTER 1988;
SMOLLICH 1992; LIEBICH 1999). Sie bildet bei Hund und Katze tiefe, Drüsen ähnelnde Ausbuchtungen. Nach McENTEE (1990) sind sie in Ampulle und Infundibulum zu finden. Das Bindegewebe bildet das Grundgerüst der Schleimhautfalten des Eileiters (Plicae tubariae), die generell verzweigende longitudinale Kämme darstellen. Die Fältelung ist tierartlich variierend, aber im Allgemeinen in der Ampulle mit Sekundär- und Tertiärfalten am stärksten ausgeprägt (NILSSON u. REINIUS 1969; SMOLLICH 1992; LIEBICH 1999). Im Isthmus dagegen kommen nur kürzere, dickere Primärfalten vor (McENTEE 1990). Insgesamt nimmt die Dicke der salpingealen Wand vom Isthmus zum Infundibulum ab, während die Größe des Lumens sowie die Länge und Komplexität der Mucosafalten zunehmen (BECK u. BOOTS 1974).
In der meist einschichtigen Lamina epithelialis dominieren zwei Zelltypen:
zilientragenden Zellen, auch Flimmerzellen genannt, und sekretorische Zellen, auch als Drüsenzellen bezeichnet (BRENNER 1969; NILSSON u. REINIUS 1969; NAYAK et al. 1976; HUNTER 1988; LIEBICH 1999).
Beide Zellformen sind im höchsten Maße zyklischen Veränderungen unterworfen (HUNTER 1988; SMOLLICH 1992; LIEBICH 1999). Sie werden in zahlreichen Tierarten über den Zyklusverlauf genauer untersucht, da ihnen eine zentrale Rolle im tubalen Reproduktionsgeschehen zukommt (VERHAGE et al. 1973 a, b; VERHAGE u. BRENNER 1975; WEST et al. 1977; ODOR et al. 1983; VERHAGE et al. 1990;
ABE u. OIKAWA 1991; ODOR u. AUGUSTINE 1995; MURRAY 1995, 1996, 1997;
ABE et al. 1999).
Kinozilien sind das charakteristische Merkmal der zilientragenden Zellen. Man findet diese Zellart gehäuft in der Ampulle und weniger oft, bzw. nur solitär, im Isthmusteil des Ovidukts (NILSSON u. REINIUS 1969; MYERS et al. 1984). Nach HOOK und HAFEZ (1968) fehlen sie bei Ratte und Hund sogar ganz im kaudalen Eileiterabschnitt. Ihre Hauptaufgabe wird im Transport von Eizellen und Sekreten
gesehen. Ihre Veränderungen im Zyklus variieren stark je nach Tierart und damit verbundener Länge des Zyklus. Bei Primaten und Tierarten mit einer langen Lutealphase, wie dem Hund, werden sie zyklisch regeneriert (FLERKO 1954;
BRENNER 1969; VERHAGE et al. a; ODOR et al. 1980; VERHAGE et al. 1990; ABE et al. 1993). Im Gegensatz dazu werden beim Menschen und Tierarten mit kurzer Zyklusdauer nur zu einem geringen Prozentsatz Zilienverluste notiert (VERHAGE et al. 1979).
Die sekretorischen Zellen haben, tierartlich verschieden stark ausgeprägt, ein sehr charakteristisches Aussehen während des Zyklus. Im Östrus erreichen Zellhöhe und sekretorische Aktivität ihr Maximum, während nach der Ovulation Sekretionsmaterial abgegeben wird und sich die Epithelhöhe verringert (ODOR u. AUGUSTINE 1995;
ABE et al. 1999). Die Abgabe von Sekretionsprodukten erfolgt via Exozytose (BAREITHER u. VERHAGE 1981; VERHAGE et al. 1990; ODOR u. AUGUSTINE 1995), apokrin (VERHAGE et al. 1973 a; NAYAK et al. 1976) oder durch beide Prozesse (ODOR u. AUGUSTINE 1995; MURRAY 1995, 1996). Sie sorgen wahrscheinlich für die notwendigen Konditionen für Spermamigration, Eitransport, Fertilisation und frühe Embryonalentwicklung (NILSSON u. REINIUS 1969;
BRACKETT u. MASTROIANNI 1974; HUNTER 1994; ABE et al. 1995, 1999). Sie durchlaufen bei Mensch, Primaten und diversen Tierarten incl. Hund einen komletten Zyklus von Differenzierung in der Follikelphase und Dedifferenzierung in der Lutealphase (WEST et al. 1977; VERHAGE et al. 1979; VERHAGE et al. 1973 a;
ODOR et al. 1980; VERHAGE et al. 1990).
Als weitere Zellform neben den sekretorischen und zilientragenden Zellen werden teilweise die sogenannten "peg cells", "intercalary cells" oder auch "Stiftchenzellen"
beschrieben. Es handelt sich um stäbchenförmige Zellen mit einem flachen komprimierten Nucleus und nahezu vollständig fehlendem Zytoplasma (HORSTMANN u. STEGNER 1966; NILSSON u. REINIUS 1969). Nach BECK und BOOTS (1974) kommen sie nur zu 0,5 bis 1 Prozent im Epithel vor und werden vermehrt im kaudalen Eileiterabschnitt angetroffen. Es ist noch immer unklar, ob die peg cells eine eigenständige Zellform sind, wie SCHAFFER schon 1908 konstatierte,
oder ob es sich hierbei um entleerte sekretorische Zellen handelt (HÖRMANN 1909), wie die meisten Autoren glauben (NOVAK u. EVERETT 1928; DEDES u. KRAUER 1974; LIEBICH 1999). BULLON et al. (1980) sehen sie generell als Ausdruck untergehender, auch zilientragender, Zellen an. Auch eine Übergangsform der zilientragenden und sekretorischen Zellen während der Dedifferenzierung wird erörtert (VERHAGE et al. 1973 a). Die Funktion der peg cells ist nach wie vor unklar (NILSSON u. REINIUS 1969). Da sie scheinbar keine bedeutende Rolle im Eileiterepithel einnehmen, widmen sich keine aktuellen Studien diesem Zelltyp.
Eine vierte Zellform, als "basal cell", "indifferent cell", "helle Zelle" oder "freie Zelle"
bezeichnet, wird noch teilweise als Reservezelle für das Eileiterwachstum angesehen (PAUERSTEIN u. WOODRUFF 1967; BULLON et al. 1980; LIEBICH 1999). Sie liegt, wie der Name schon sagt, basal im Epithel, ist klein, erreicht nicht die luminale Grenzfläche und besitzt einen hyperchromatischen Kern. Sie wird zu etwa 1 Prozent in sämtlichen Eileiterabschnitten im Epithelverband beobachtet (BECK u. BOOTS 1974). Es scheint mittlerweile gesichert, dass es sich bei diesen Zellen um eingewanderte Leukozyten handelt (ODOR 1974; ABUGHRIEN et al.
2000), wie NOVAK und SAMPSON schon 1928 vermuteten.
2.6 Histomorphologie des caninen Eileiters im Zyklusverlauf
Generell weist das Schleimhautepithel im Verlauf des ovarialen Zyklus hormonell bedingte strukturelle und funktionelle Veränderungen auf (HUNTER 1988).
Die Phasen des Wachstums und der Differenzierung der Zellen lassen sich bei der Hündin aufgrund des protrahierten Zyklus gut voneinander abgrenzen und den mit geringeren Veränderungen einhergehenden Phasen gegenüberstellen. Damit eignet sich der canine Eileiter als Untersuchungsmodell zur Darstellung hormoneller Einflüsse auf Schleimhautepithelien (VERHAGE et al. 1973 a).
Bisherige Untersuchungen zu hormonellen Veränderungen des caninen Schleimhautepithels beschränken sich im wesentlichen auf die Eileiterampulle und verwendeten in der Hauptsache Organe von präpubertären Beagles nach Hormonstimulation (VERHAGE et al. 1973 b; SAWYER et al. 1984). Wurden Organe
geschlechtsreifer Hündinnen entnommen, so erfolgte die Erhebung des Zyklusstandes auf äußerlichen Merkmalen und ist entsprechend ungenau.
Gemessene Hormonverläufe über die Entnahmezeitpunkte werden zwar beschrieben, allerdings fehlen Messwerte (VERHAGE et al. 1973 a). Orientierend an diesen Studien lassen sich folgende Vorgänge während des caninen Zyklus beschreiben:
Ausgehend vom späten Metöstrus und Anöstrus, in dem sich die Sekretion der ovarialen Steroidhormone auf einem basalen Niveau befindet, stellt sich das Infundibulum als ein aus verästelten transversalen und longitudinalen Mucosafalten bestehendes Organ dar. Die Mucosafalten formen Spalten und Divertikel, welche bei jungen Hunden eher flach sind und mit zunehmendem Alter tiefer und verzweigter werden (ANDERSEN u. SIMPSON 1973; MYERS et al. 1984). Die Fimbrien werden in diesem Zusammenhang als Mucosafalten betrachtet, die als breite flache Falten mit zungenförmigen Fortsätzen über die anderen Falten hinausragen.
Sowohl bei jungen als auch erwachsenen Hündinnen sind in diesem Abschnitt zilientragende und sekretorische Zellen in einer Relation von etwa 1:1 zu finden.
Zilientragende Zellen sind durch zahlreiche, gleich lange Zilien von etwa 0,3 µm Breite und 0,5 µm Länge gekennzeichnet. Kurze Mikrovilli sind zwischen den Zilien verstreut angeordnet (MYERS et al. 1984).
Die sekretorischen Zellen sind durch kurze stumpfe Mikrovilli auf einer seicht gewölbten Oberfläche gekennzeichnet. Variierende Mengen eines amorphen Materials, bei dem es sich wahrscheinlich um ein Sekretionsprodukt handelt, bedecken die Mikrovilli, so dass nur deren Enden sichtbar sind (MYERS et al. 1984).
Ein charakteristisches Merkmal der Eileiterampulle sind die mit zunehmendem Alter immer stärker verzweigten Longitudinalfalten, die unregelmäßig unterteilt sind und an ihrer Oberfläche zu Krypten- und Grubenformationen neigen. Hündinnen mittleren Alters haben hier sowohl sekretorische als auch zilientragende Zellen, letztere jedoch in geringerer Anzahl als im Bereich des Infundibulums. Das Aussehen der Zellen ist mit denen im Infundibulum vergleichbar (MYERS et al. 1984).
Die longitudinalen Mucosafalten im Isthmusteil des Eileiters sind besonders bei jüngeren Hunden breiter, flacher und kürzer als die in der Ampulle. Auch hier sind laut MYERS et al. (1984) weniger zilientragende als sekretorische Zellen zu finden.
Zilientragende Zellen zeigen ein eher solitäres Vorkommen.
In allen Abschnitten des caninen Eileiters sind unabhängig vom Alter unregelmäßig sekretorische Zellen mit einer über die Mikrovilli herausragenden zentralen Projektion zu finden. Sowohl die Funktion als auch die Struktur der Projektion sind nach MYERS et al. (1984) unbekannt.
Während des sehr frühen Proöstrus, zu Beginn steigender Östrogenlevel der frühen Follikelphase, ist die Mukosa im Ampullenbereich tief gefältelt und das Eileiterlumen eng und gewunden (VERHAGE et al. 1973 a). Das Epithel zyklischer Hündinnen gleicht in diesem Stadium morphologisch dem präpubertärer Hündinnen (VERHAGE et al. 1973 b). Es besteht aus einem uniform angefärbten kubischen Epithel (VERHAGE et al. 1973 b; MYERS et al. 1984) von etwa 10,3 µm Höhe (SAWYER et al. 1984). Es sind weniger als 1% ovoid geformter zilientragender Zellen im Epithelverband feststellbar (VERHAGE et al. 1973 a). Die lateralen und basalen Grenzflächen der zu diesem Zeitpunkt undifferenzierten Zellen sind gewunden und gefältelt. Ihre Oberfläche stellt sich relativ flach dar und wird nur von kurzen Mikrovilli durchbrochen (VERHAGE et al. 1973 a, b). Das Zytoplasma zeichnet sich durch zahlreiche Ribosomen, wenige verstreute Mitochondrien und einen kleinen unscheinbaren Golgiapparat aus. Die Nuclei sind relativ klein, pleomorph und tief gefaltet. Das Nucleoplasma ist durch große Lappen kondensierten Heterochromatins und einen kleinen Nucleolus charakterisiert (VERHAGE et al. 1973 a, b).
Bei Hündinnen mit spontanem Zyklus sind im fortgeschrittenen Proöstrus, durch die in den Follikeln vermehrt gebildeten Östrogene, die ersten zytologischen Veränderungen im Sinne einer Zellhypertrophie und Differenzierung, besonders auf ultrastruktureller Ebene, sichtbar. Ähnliche Veränderungen werden bei präpubertären Beagles 32 bis 48 Stunden nach Östrogenstimulierung, z.B. nach Positionierung
eines Östrogenimplantats verzeichnet. Dieses sorgt für einen Östradiolanstieg von basalen 9,6 pg/ml auf Werte von etwa 22,8 pg/ml (SAWYER et al. 1984). Besonders auffallend sind die zelluläre Hypertrophie und die Vergrößerung der dann sphärisch aussehenden Nuclei um das Zweifache. Es lassen sich allerdings noch keine distinkten Zelltypen unterscheiden. Bei den präpubertären Tieren sind vermehrt Mitoseformen zu beobachten, die bei spontan zyklischen, geschlechtsreifen Hündinnen allerdings fehlen (VERHAGE et al. 1973 a, b).
Der Zellkern ist unter Zunahme von Euchromatin rapide gewachsen und der Nucleolus besitzt vermehrt fibröses und amorphes Material. Die Lateralflächen der Zellen sind weniger stark gewunden und ihr apikales Ende wölbt sich in das Lumen vor und besitzt im Vergleich zum Anöstrus verlängerte Mikrovilli. Die Anzahl an polyribosomalen Komplexen und kurzen rER Profilen wächst, der Golgi-Apparat ist deutlich vergrößert. Zudem finden VERHAGE et al. (1973 b) in den apikalen Regionen mancher Zellen verschiedene Formen von "basal body precursors", die ursprünglich von DIRKSEN und CROCKER (1965) im zilientragenden Epithel des Respirationstrakts verschiedener Säugetiere gefunden und beschrieben worden sind.
So kommen auch sog. "proliferative elements" als große amorphe Massen von elektronendichtem, fibrogranulären Material in der Nähe des Golgi-Apparates vor, sowie zahlreiche, als "condensation forms" bezeichnete, kompakte, abgerundete Strukturen von variablem Durchmesser und Aussehen, die in den Apices verstreut sind. Voll entwickelte Basalkörperchen sind in einigen Zellen linear an der luminalen Epithelgrenze zu sehen, für VERHAGE et al. (1973 b) ein Beweis der Ziliogenese.
Unter dem zunehmenden Einfluss von Östrogenen in der fortgeschrittenen Follikelphase bzw. im späten Proöstrus, oder nach 6-tägiger Östrogengabe bei juvenilen Hündinnen, ist die Hypertrophie und Zytodifferenzierung nun auch lichtmikroskopisch evident (VERHAGE et al. 1973 a; SAWYER et al. 1984). Die Drüsenlumina sind größer und komplexer geformt. Das Oberflächenepithel hat im Verhältnis zum Stroma zugenommen (VERHAGE et al. 1973 a, b). Zwei Zelltypen, chromophobe zilientragende Zellen und basophile sekretorische Zellen, lassen sich differenzieren.
Während die Ziliogenese nach 6 bis 8 Tagen der Östrogenbehandlung komplett vollzogen ist, differenzieren sich die sekretorischen Zellen noch weiter aus (VERHAGE et al. 1973 b).
Im frühen bis mittleren Östrus, unter zunächst maximalen und dann rapide abfallenden Östrogenwerten und einer langsam steigenden Progesteronkonzentration, bzw. nach 12 Tagen der experimentellen Östrogenstimulation, ist das Oberflächenepithel maximal differenziert und besitzt eine Höhe von etwa 29 bis 31 µm (VERHAGE et al. 1973 a, b; SAWYER et al. 1984;
FERNANDES u. SAWYER 1987). Dieser Zeitpunkt würde der späten Follikelphase bzw. dem Beginn der Lutealphase entsprechen. In der Ampulle sind 56 bis 68 Prozent der Zellen zilientragend (VERHAGE et al. 1973 a, b; SAWYER et al. 1984;
FERNANDES u. SAWYER 1987). Auch MYERS et al. (1984) finden während des Östrus mehr zilientragende Zellen in allen Anteilen der Tube, verglichen mit den anöstrischen Präparaten. Zilien sind von annähernd gleicher Länge und Anzahl.
Dagegen erscheinen Mikrovilli länger als in der anöstrischen Schleimhaut und sind generell frei von Ansammlungen sekretorischen Materials.
Die zilientragenden Zellen besitzen in dieser Phase einen großen, apikal liegenden Zellkern und einen deutlich sichtbaren Nucleolus (VERHAGE et al. 1973 a; SAWYER et al. 1984). Die freie Oberfläche der Zellen ist nicht mehr gefältelt, so dass die Grenzen benachbarter Zellen ebenfalls nicht mehr ineinander greifen (VERHAGE et al. 1973 a). Apikal in den Zellen finden sich Basalkörperchen und zahlreiche lange fingerförmige Mikrovilli und Zilien ragen in das Lumen. Letztere entsprechen der typischen 9x2+2 Tubulusstruktur. Vergesellschaftet mit dem Zilienapparat sind an der lumenzugewandten Seite der Zelle zahlreiche Mitochondrien und ein komplexes, eher lateral orientiertes Netzwerk aus Mikrofilamenten zu beobachten (VERHAGE et al. 1973 a, b). Oberhalb des Nucleus findet sich der moderat große Golgi-Apparat, der aus einer gegenüber früheren Zyklusstadien vermehrten Anzahl von Zisternen und Vesikeln besteht. Die erheblich vergrößerte Basalregion des Zytoplasmas enthält vermehrt polyribosomale Komplexe sowie verstreut gelegene Mitochondrien und kurze rER-Fortsätze (VERHAGE et al. 1973 a).
Die dunkler gefärbten sekretorischen Zellen besitzen im Gegensatz dazu häufig apikale Zytoplasmavorwölbungen und sind deutlich von den heller gefärbten zilientragenden Zellen zu unterscheiden (SAWYER et al. 1984). Sie sind darüber hinaus schmaler und der Zellkern liegt mehr basal. Auch die Menge an rER, das sich zu 2/3 im basalen Zytoplasmabereich befindet, steigt graduell an. Parallel dazu nehmen die Anzahl und die Größe der Mitochondrien zu, und der hypertrophe, supranukleär gelegene Golgi-Apparat formt eine tassenförmige Masse aus Zisternen, kleinen Vesikeln und zahlreichen konfluierenden Vakuolen. Auch einige PAS-positive Sekretgranula fallen im Apex der Zelle auf (VERHAGE et al. 1973 a).
Östrogene sind für die Differenzierung und die Hypertrophie des Schleimhautepithels, sowohl bei juvenilen als auch zyklischen Hündinnen verantwortlich, während Progesteron, allein oder dominierend über Östrogen, für die Dedifferenzierung sorgt (VERHAGE et al. 1973 b; FERNANDES u. SAWYER 1987).
Im frühen Metöstrus, zur Zeit der Gelbkörperanbildung, die mit mittleren bis hohen Progesteronwerten und deutlich gesunkenen Östrogenwerten einhergeht, sind folglich graduelle Prozesse der Dedifferenzierung und Regression zu beobachten (VERHAGE et al. 1973 a).
SAWYER et al. (1984) und FERNANDES und SAWYER (1987) beschreiben die Folgen der hormonellen Veränderungen als rapide. Sie konstatieren, dass die Schleimhautabdeckung nach 6-tägigem Progesteroneinfluss durch regelmäßige Injektionen, sowohl mit und als auch ohne gleichzeitigen Östrogeneinfluß durch noch positionierte Implantate, bzw. am Beginn des Metöstrus wieder aus isoprismatischen Epithelzellen von 9 bis 14 bzw. 15 µm Höhe besteht, wobei es sich nur noch bei etwa 20 % der Zellen um zilientragende Zellen handelt.
Das Zellvolumen ist deutlich erniedrigt (SAWYER et al. 1984), bei den zilientragenden Zellen um die Hälfte, bei den sekretorischen Zellen um ein Drittel (VERHAGE et al. 1973 a). Des weiteren sind Abschilferung des apikalen Zytoplasmas, Abstossung kompletter Zellen und Zellkerne sowie Resorption von Zilien und Basalkörperchen in den ersten 6 Tagen der Progesterondominanz
festzustellen. In dieser Zeit werden von SAWYER et al. (1984) Makrophagen und Zelltrümmer im Lumen des Ovidukts beschrieben, während sie Zelltod durch Apoptose nicht nachweisen können.
Ultrastrukturell sind die Anzahl der Mitochondrien, die Ausbreitung des rER und die Größe des Golgi-Apparats verringert. Trotzdem spiegelt die Feinstruktur der Zellen noch funktionierende Transport- und Sekretionsvorgänge wider (VERHAGE et al.
1973 a). Die Spitze der sekretorischen Zellen ragt über die der umliegenden zilientragenden Zellen vor.
Diese degenerativen Vorgänge finden nicht in allen Abschnitten der Eileiterampulle gleichermaßen statt. Häufig variiert die Ausprägung schon von Falte zu Falte (SAWYER et al. 1984). Nach 9 Tagen experimenteller Progesteronexponierung, bei der Werte von ca. 41,2 ng/ml erreicht wurden, erscheint das Eileiterepithel uniform zurückgebildet, wobei die zilientragenden Zellen sich durch ihre schmale und sphärische Gestalt deutlich von ihrer ursprünglich hochprismatischen Form unterscheiden. Zudem sind sie an ihrer basolateralen Seite weniger eng mit den benachbarten Zellen verbunden und scheinen eher in einem Zustand der Ablösung aus dem Epithelverband zu sein (SAWYER et al. 1984).
Im Gegensatz dazu stellen VERHAGE et al. (1973 a) noch im fortgeschrittenen Metöstrus, zur Zeit maximaler Gelbkörperaktivität, eine komplexe Verzweigung der Lateralflächen benachbarter Zellen fest, während die anderen regressiven zytoplasmatischen Veränderungen der Zellen entsprechend evident sind.
Die sekretorischen Zellen sind bezüglich Zellvolumen und Ultrastruktur vergleichbar mit den undifferenzierten Zellen des frühen Proöstrus und machen 70 % der Zellen im ampullären Epithelverband aus (VERHAGE et al. 1973 a). Das Zytoplasma ist durch zahlreiche freie Ribosomen, wenige Mitochondrien und einen sehr kleinen Golgi-Apparat gekennzeichnet. Der Nucleus ist mit einigen tiefen Falten ausgestattet und von pleomorpher Gestalt ist. Große Bereiche des Nucleoplasmas sind durch kondensiertes Chromatin gekennzeichnet. Die zilientragenden Zellen besitzen ein zwei- bis dreifach größeres Zellvolumen als die sekretorischen Zellen und sind nun, im Gegensatz zum vorangegangenen Östrus, mit einem basal lokalisierten Zellkern
versehen. Demzufolge erreicht die sekretorische Zelle ihr Differenzierungsmaximum später als die zilientragende Zelle und dedifferenziert auch eher (VERHAGE et al.
1973 a).
Nach FERNANDES und SAWYER (1987) haben zilientragende Zellen zu knapp 20
% Anteil am Zellverband der Ampulle. Die polyribosomalen Komplexe der zilientragenden Zellen sind nicht so zahlreich wie im Östrus, der Golgi-Apparat ist sehr klein, und rER scheint fast nicht mehr vorhanden zu sein. Die Basalkörperchen und Zilien erscheinen intakt, auch Mitochondrien sind noch zahlreich vorhanden (VERHAGE et al. 1973 a).
In den späten Stadien des Metöstrus bzw. im Anöstrus, ausgehend von der Gelbkörperregression über die Endometriumsreparation und die anschließende Zyklusruhe, sinkt der Anteil zilientragender Zellen von 30 % auf 16 % und schließlich auf 4 % (VERHAGE et al. 1973 a; FERNANDES u. SAWYER 1987). Das Profil der Mukosafalten ähnelt wieder dem des sehr frühen Proöstrus. Die verbleibenden zilientragenden Zellen präsentieren sich ähnlich wie im Mittmetöstrus. Die Verbindungen der sekretorischen Zellen zu benachbarten Zellen sind weniger gewunden und die Zellen selbst ragen nicht mehr über die zilientragenden Zellen hinaus (VERHAGE et al. 1973 a). Dies zeigt deutlich, dass die Rückbildung der Membranen noch über die zytoplasmatische Dedifferenzierung hinaus anhält.
Morphologisch sind die sekretorischen Zellen zu diesem Zeitpunkt mit denen im frühen Proöstrus vergleichbar (VERHAGE et al. 1973 a).
2.7 Pathologische, entwicklungsbedingte und altersgemäße Veränderungen des Ovidukts der Hündin
Entwicklungsbedingte Rudimente para- und besonders mesonephrischen Ursprungs sind nicht ungewöhnlich und finden sich in der Mesosalpinx (GELBERG u. McENTEE 1986). Sie nehmen häufig eine zystische Form an und wachsen langsam über mehrere Jahre, so dass sie hauptsächlich bei alten Tieren zu beobachten sind (McENTEE 1990).
MYERS et al. (1984) stellen zwischen präpubertären und 4-jährigen oder älteren Beagles eine deutlichere Unterteilung sowie Höhen- bzw. Tiefenzunahme der Epithelkämme und -invaginationen im Eileiterepithel fest. Zudem beschreiben sie einzelne zelluläre Veränderungen bei über 8-jährigen Hündinnen, die sie einem Mangel an hormoneller Stimulation zuordnen. ANDERSEN und SIMPSON (1973) finden bei älteren Tieren vereinzelt eine Fibrosierung der mittleren und kaudalen Eileiteranteile, die mit einem Verlust der ausgeprägten Schleimhautfältelung einhergeht. Außerdem erscheinen Zilien bei älteren Hündinnen, verglichen mit jungen Tieren, um etwa die Hälfte kürzer.
Zysten sind die am häufigsten beobachtete Veränderung im Eileiter (ANDERSEN u.
SIMPSON 1973; GELBERG u. McENTEE 1986). Sie werden, je nach Größe, von einem einschichtigen, hochprismatisch bis flachen Epithel und kompaktem Bindegewebe umgeben. Sie können auf der gesamten Länge des Hohlorgans auftreten, sind aber am häufigsten am oder nahe des Infundibulums zu finden. Ihre Größe reicht von mikroskopisch klein bis zu einem Durchmesser von einem oder mehreren Zentimetern. Zu einem Verschluß des Eileiterlumens scheint es dabei nicht zu kommen. Als Ursache wird eine Anhäufung von epithelialen Sekreten vermutet (ANDERSEN u. SIMPSON 1973; GELBERG u. McENTEE 1986).
Salpingitiden und aufsteigende Infektionen des Eileiters sind bei Hund und Pferd, wahrscheinlich aufgrund der Barrierefunktion der Papille, selten (OLSON at al. 1987 b; KÖNIG u. LIEBICH 1999; DAHME u. WEISS 1999). Lediglich GELBERG und McENTEE (1986) und McENTEE (1990) beschreiben Entzündungsvorgänge mit dem Nachweis von neutrophilen Granulozyten im Lumen des Hohlorgans. Bei wenigen
Hündinnen und in schweren Fällen sind, in Verbindung mit einer gleichzeitig vorliegenden Metritis bzw. Pyometra, neutrophile Granulozyten auch in der Submukosa zu finden.
Der komplette Verschluss des Ovidukts wird in der Literatur zwar erwähnt (OLSON et al. 1987 b), hinsichtlich seiner Inzidenz jedoch als sehr selten eingestuft (SENIOR 1979; FELDMAN u. NELSON 1996).
Tumore sind im Ovidukt selten zu finden (BENIRSCHKE 1969; ANDERSEN u.
SIMPSON 1973; McENTEE 1990; ENGLAND 1998). In Studien zur Dokumentation von Neoplasien im weiblichen Genitaltrakt werden sie nicht erwähnt (BRODEY u.
ROSZEL 1967; CRUZ et al. 1997). Aufgrund der erheblichen Ansammlung von Fettgewebe in der Bursa ovarica ist die Entstehung von Lipomen möglich. Sie wird von McENTEE (1990) bei zwei alten Hündinnen beschrieben. Auch Metastasen von Granulosazelltumoren können auftreten (GELBERG und McENTEE 1986). Vereinzelt werden Tumore anderen Ursprungs (z.B. Adenomyom: 7 1/2 Jahre alter Labrador- Retriever und 8 1/2-jähriger Boxer; Adenocarcinom: 12 Jahre alter Mischling) gefunden, deren Ursache zum Teil in einer langfristigen Strahlenexponierung vermutet wird (ANDERSEN u. SIMPSON 1973; MINOCCHERI u. MELUZZI 1979;
GELBERG u. McENTEE 1986; McENTEE 1990).
In Untersuchungen zur Infertilität der Hündin findet der Ovidukt explizit keine Erwähnung (MILLER-LIEBL et al. 1994). Ebenso konstatieren GELBERG und McENTEE (1986), dass strukturelle Veränderungen, mit Ausnahme von Tumoren, nur selten die Reproduktionsfähigkeit negativ beeinfussen oder mit anderen pathologischen Zuständen im Genitaltrakt verknüpft sind.
2.8 Ki-67-Antigen
Das Ki-67-Antigen wurde Anfang der 80er Jahre von GERDES et al. (1983) entdeckt und genauer definiert. Der monoklonale Antikörper gegen das "Ki-67"-Antigen wurde nach dem primären Wachstum in der 67. Vertiefung einer Mikrotiterplatte in einem Kieler Labor benannt. Diesem Zusammenhang verdankt das zelluläre Antigen, welches das homologe Epitop aufweist, seinen Namen.
Die Expression von Ki-67, einem großen kerngebundenen Proteinpaar in proliferierenden Zellen (GERDES et al. 1991), erfolgt während der Mitose (DU MANOIR et al. 1991). Sie beginnt in der Mitte der Gap1-Phase, der Spiegel steigt im Laufe der Synthese- und Gap2- Phasen an und erreicht seinen Höhepunkt in der Mitose-Phase (GERDES et al. 1984; SASAKI et al. 1987; MURRAY et al. 1995). Mit dem Ende der Mitose-Phase erfolgt ein rascher Abbau des Antigens mit einer Halbwertszeit von weniger als einer Stunde (BRUNO u. DAZYNKIEWICS 1992).
Nach bisherigen Analysen gibt es keinen eindeutigen Hinweis auf die Funktion des Ki-67-Antigens (BROWN u. GATTER 1990; GERDES et al 1991, 1992). Eine Stabilisierung der DNA wird ebenso postuliert (SAWHNEY u. HALL 1992) wie eine Funktion des Ki-67-Antigens bei der Zerstörung der Kernmembran zu Beginn der Mitose (GERDES et al. 1991, 1992).
Ein ursächlicher Zusammenhang besteht offensichtlich zwischen Zellproliferation und der Expression von Ki-67 (SCOTT et al. 1991).
Das Kernantigen kommt nicht nur in humanem Gewebe (GERDES et al. 1983), sondern auch in gesunden und neoplastischen Geweben zahlreicher Säugetierspezies, wie z.B. Kuh, Schaf, Kaninchen, Ratte, Katze, Hund und Pferd, vor (FALINI et al. 1989; TETER et al. 1995).
Heutzutage wird der Nachweis des Proliferationsantigens beim Hund zum Beispiel in der histopathologischen Routinediagnostik verwendet und zur Darstellung physiologischer Proliferationsvorgänge u.a. auch beim Hund herangezogen (LAPRIE et al. 1998; WILKE 2000). Es dient der Charakterisierung und Diagnose von Lungentumoren (GRIFFEY et al. 1999), Mammatumoren (LOHR 1996), degenerativen Veränderungen prädisponierender Faktoren für Kreuzbandrisse
(NARAMA et al. 1996) oder auch zur Bestimmung des Proliferationsindex von malignen Lymphomen im Hinblick auf eine Verbesserung der Prognostik (MÜLLER 1998).
Die Anwendung von Proliferationsmarkern im Rahmen von Untersuchungen am Ovidukt der Hündin wurde bis dato nicht beschrieben.
2.9 Östrogen- und Progesteronrezeptoren des caninen Ovidukts im Zyklusverlauf
Eine Abhängigkeit der Östrogen- und Progesteronrezeptorkonzentrationen von den zyklischen Veränderungen des Bluthormonspiegels ist weitgehend anerkannt (MULDOON 1980; SCHMIDT u. MEYER 1994; ING u. TORNESI 1997).
Während ein hoher Östrogenspiegel im Uterus der Hündin sowohl hohe Östrogen- als auch Progesteronrezeptorkonzentrationen bewirkt, sinken beide unter dem Einfluss hoher Progesteronwerte ab (LESSEY et al. 1981; JOHNSTON et al. 1985;
FERNANDES et al. 1989).
Im Uterus und Eileiter von Beagle-Welpen fanden LESSEY und GORRELL (1980 a) mittlere Östrogenrezeptorkonzentrationen, die unter wiederholter Östrogenapplikation zunahmen. Der Gehalt an Progesteronrezeptoren war gleichzeitig hoch (LESSEY u. GORELL 1980 b). Damit wird auch am Eileiter die Förderung der Synthese von Östrogen- und Progesteronrezeptoren durch Östrogene deutlich.
PAULSMEIER (1998) führte mit immunhistochemischer Methodik differenzierte Untersuchungen über die Verteilung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Zyklusverlauf adulter Beagle-Hündinnen sowohl im Stroma, in der Muskulatur und im Oberflächenepithel der Tube durch.
Die Östrogenrezeptormenge ist in den zilientragenden Zellen im Anöstrus und in der frühen Follikelphase gleichbleibend hoch, um anschließend geringgradig zu sinken.
Der maximale Gehalt wird im Zeitraum der Endometriumsreparation beobachtet. Der Unterschied ist zu allen anderen Phasen signifikant. In der Lamina propria sind die höchsten Färbeintensitäten im Anöstrus nachweisbar, in der frühen Follikelphase
nimmt sie geringfügig ab und bleibt im weiteren Zyklusverlauf auf diesem niedrigen Niveau. In der Muskulatur bestehen im Anöstrus und in der frühen Follikelphase signifikant niedrigere Östrogenrezeptorimmunoreaktionen als in der späten Follikelphase. Zur Zeit hoher Gelbkörperaktivität erfolgt eine signifikante Abnahme auf Ausgangswerte.
Die Progesteronrezeptormenge erreicht in den zilientragenden Zellen und in der Tunica muscularis in der späten Follikelphase ihr Maximum. Im übrigen Zyklus dagegen, auch in der Phase der Gelbkörperaktivität, ist sie signifikant niedriger und im Anöstrus und in der frühen Follikelphase am geringsten. Im Verlauf der Gelbkörperphase und Endometriumsreparation sinkt die Rezeptorimmunreaktion kontinuierlich. Im Stroma verläuft die Rezeptorimmunreaktion ähnlich, allerdings ist im Anöstrus ein signifikanter Anstieg feststellbar, dem eine signifikante Abnahme in der frühen Follikelphase folgt.
Insgesamt ist die zyklusabhängige Variation der Östrogenrezeptormenge im Eileiter gering, während die Progesteronrezeptoranfärbung in der späten Follikelphase besonders ausgeprägt ist (PAULSMEIER 1998).
3 Material und Methoden
3.1 Tiere
Für die vorliegende Studie standen neun gesunde, nullipare Hündinnen zur Verfügung. Es handelte sich um sechs Tiere des Instituts für Reproduktionsmedizin sowie um drei Hündinnen aus privatem Besitz, bei welchen aus unterschiedlichen Gründen eine Ovariohysterektomie durchgeführt wurde.
Die institutseigenen Hunde wurden in Gruppen von drei Tieren in einem Zwinger mit Boxen gehalten. Die Fütterung erfolgte mit handelsüblichem Trockenfutter. Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Die restlichen drei Hunde lebten in Privathaushalten.
3.2 Versuchsdurchführung
3.2.1 Untersuchungszeitpunkte
Als signifikante Phasen im Zyklusverlauf wurden der Anöstrus (AÖ), die späte Follikelphase (SF) und die Lutealphase (LU) zum Zeitpunkt maximaler Gelbkörperaktivität gewählt. Diese Stadien zeichnen sich durch signifikante Unterschiede der relevanten Steroidhormonkonzentrationen und entsprechende charakteristische ovariale und endometriale Veränderungen aus (vgl. Tab. 1).
Pro Zyklusphase wurden drei Tiere untersucht:
Anöstrus: drei Privathunde (je ein Golden Retriever, Labrador Retriever, DSH- Mischling, 1-, 2- und 4-jährig)
Späte Follikelphase : drei institutseigene Labrador-Beagle-Mischlinge, 4-jährig Lutealphase: drei institutseigene Beagle, 4-jährig
3.2.2 Bestimmung des Zyklusstandes
Um den Zyklusstand der Tiere so exakt wie möglich bestimmen zu können, wurde bei den aus Privatbesitz stammenden Tieren am Tag der Ovariohysterektomie durch Anamnese das Läufigkeitsintervall, Zeitpunkt, Verlauf und Dauer der letzten Läufigkeit(en), Auffälligkeiten, Krankheiten und/oder Behandlungen erfragt.
Die institutseigenen Tiere wurden zu Beginn einer eingehenden allgemeinen und gynäkologischen Untersuchung (Vaginoskopie, Vaginalzytologie, mikrobiologische Untersuchung eines Vaginaltupfers, ggf. antibiotische Behandlung, Sonographie von Ovarien und Uterus, Untersuchung von P4, E2, T4 und Cortisol im peripheren Blut) unterzogen, um einerseits den Zyklusstand festzustellen und andererseits hormonelle sowie andere Erkrankungen auszuschließen. Im folgenden wurden sie über einen Zeitraum von 2 bis 8 Monaten regelmäßig alle 3 Wochen und in der Läufigkeit alle 1 bis 2 Tage gynäkologisch kontrolliert. Diese Maßnahmen hatten zum Ziel, definierte Zeitpunkte der Follikel- oder Lutealphase zu bestimmen. Bei den drei Tieren der späten Follikelphase wurde der initial geringfügige Progesteronanstieg als Merkmal der ca. 4 Tage vor der Ovulation einsetzenden präovulatorischen Follikelluteinisierung gewählt. Bei den drei Tieren der Lutealphase wurde die Ovulation terminiert, um die Ovariohysterektomie gezielt zwischen Tag 25 und 30 p.ov. vornehmen zu können.
Als diagnostische Verfahren kamen hierfür neben der Vaginoskopie und Vaginalzytologie die semiquantitative Progesteronbestimmung über einen Enzymimmunoassay (Target® Canine Ovulation Timing Test; Fa. Albrecht, Aulendorf) (GÜNZEL-APEL et al. 1990) und die sonographische Verlaufskontrolle der Ovarien zur Anwendung, um das Wachstum der Follikel und die Ovulation so präzise wie möglich zu erfassen (HAYER et al.1991; GÜNZEL-APEL u. DIETERICH 2001).
3.2.3 Klinisch-gynäkologische und vaginalzytologische Untersuchung
Die klinisch-gynäkologische Untersuchung wurde mit der Adspektion der Vulva, der Beurteilung evtl. vorhandenen Sekrets und der Palpation der Vulva zur Prüfung der
Gewebekonsistenz und Paarungsbereitschaft eingeleitet. Danach erfolgte die vaginoskopische Untersuchung mit einem sterilen, mit physiologischer Kochsalzlösung gleitfähig gemachten Röhrenspekulum, welches nach trockener Reinigung des äußeren Genitale in die Scheide eingeführt wurde. Die Befunderhebung an der Scheidenmukosa erfolgte mit Hilfe einer Lichtquelle in Anlehnung an die Untersuchungen von HELBIG (1986), JEFFCOATE und LINDSAY (1989), WABERSKI und GÜNZEL-APEL (1990), BAAR (1995) und GÜNZEL-APEL (1997). Sie umfasste den Ödematisierungsgrad und die Form der Schleimhautfalten sowie Farbe und Feuchtigkeitsgrad der Schleimhaut.
Mit Hilfe eines mit physiologischer Kochsalzlösung befeuchteten Wattestieltupfers wurde zusätzlich ein Abstrich aus dem kranialen Scheidendrittel entnommen und im weiteren wie bei GÜNZEL und KOIVISTO (1984) und GÜNZEL-APEL (1997) beschrieben, aufgearbeitet und ausgewertet.
Bei der lichtmikroskopischen Beurteilung bei 128-facher Vergrößerung wurden Art und Lage der Epithelzellen, das Vorkommen von Erythrozyten und/oder neutrophilen Granulozyten sowie der Ausstrichhintergrund beurteilt.
3.2.4 Quantitative Hormonuntersuchung
Am Tag der Ovariohysterektomie wurde eine Blutprobe durch Punktion der Vena cephalica antebrachii in einem Röhrchen zur Serumgewinnung entnommen und bei 3000 U/min zentrifugiert. Das so abgetrennte Serum wurde abpipettiert und bis zur Untersuchung bei -18 °C gelagert.
Die quantitative Bestimmung der Konzentrationen von Östradiol-17β und Progesteron diente der zusätzlichen Charakterisierung des Zyklusstandes zum Zeitpunkt der Organgewinnung. Die Messung der beiden Ovarsteroide erfolgte in der Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit Hilfe radioimmunologischer Methoden, wie von SIEME (1989) und HÖVELER (1991) beschrieben.
Den Assays liegen folgende Kriterien zugrunde:
Östradiol-17β: untere Nachweisgrenze 4,0 pg/ml, Intraassay-Variationskoeffizient 4,8
%, Interassay-Variationskoeffizient 1,4 %, Progesteron: untere Nachweisgrenze 0,06 ng/ml, Intraassay-Variationskoeffizient 4,5 %, Interassay-Variationskoeffizient
5 %.
3.2.5 Histologische Befunde
Zur Unterstützung und Absicherung der Zyklusdiagnostik wurden die Ovarien und ein Uterusquerschnitt von jeder Hündin mikroskopisch untersucht. In Anlehnung an die Ergebnisse von FOWLER et al. (1971), ANDERSEN und SIMPSON (1973), SOKOLOWSKI et al. (1973), BARRAU et al. (1975) und McENTEE (1990) wurden an den Ovarien Menge, Art und Vorhandensein von Funktionskörpern beurteilt, bei den Uterusschnitten wurde die Struktur und Konfiguration des luminalen und glandulären Epithels ausgewertet.
3.3 Organgewinnung, Präparation und Fixierung
Die Ovariohysterektomie erfolgte nach den üblichen Operationsverfahren unter allgemeiner Anästhesie. Es wurde besonderer Wert darauf gelegt, die Organe möglichst schnell und unter größtmöglicher Sorgfalt zu entnehmen, um eine Traumatisierung und Vorschädigung des Gewebes durch zu langen Blutstau, durch Ligaturen und Klemmen sowie grobes Handling zu vermeiden. Alternierend wurde der Eileiter der einen Körperseite jeweils für die lichtmikroskopische Aufarbeitung, der der anderen Seite für eventuell folgende weiterführende Untersuchungen vorgesehen. Unmittelbar nach Organentnahme wurde der Eileiter in dem das Ovar umgebenden Fettkörper aufgesucht, aus der Fettasche und von Adnexen gelöst und in gesamter Länge vom Infundibulum bis zur Uterushornspitze in einem Stück freipräpariert. Es wurden Länge und Dicke des Ovidukts protokolliert. Sodann wurde das Hohlorgan in adspektorisch abgeschätzter Mitte vorsichtig eröffnet und durch die Inzision in beide Richtungen mittels 22G Vasofix-Braunüle® (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) und aufgesetzter Spritze mit 4%igem, neutral gepufferten Formol
nach LILLIE (1951) sanft durchgespült. Anschließend wurden die Organe in gläserne, beschriftete (Tier-Nr., Datum) Probenbehältnisse mit gleichem Fixationsmittel verbracht.
Die Ovarien beider Seiten wurden ebenfalls aus der Fettasche präpariert, der Uterus von seinen Bändern gelöst und an mehreren Stellen quer eingeschnitten, um ein Eindringen des Fixierungsmittels zu erreichen. Diese Organe wurden ebenfalls in 4%igem Formalin eingelegt.
3.4 Organzuschnitt für die Einbettung
Der gesamte Ovidukt (OV) jeweils einer Seite wurde in seiner Länge vermessen und mit Mikrotomklingen in 6 gleichlange Teile geschnitten, die von der uterotubalen Verbindung (UTV) bis zum Infundibulum (IN) als OV 1-6 bezeichnet wurden. Die Nummerierung von kaudal nach kranial erfolgte entsprechend der aufsteigenden Reihenfolge der von den Spermien erreichten Organabschnitte während des Spermientransports.
Die Proben des Hohlorgans wurden für die lichtmikroskopische Auswertung sowohl in Technovit, als auch in Paraplast eingebettet. Hierfür wurden die 6 OV-Segmente noch einmal in ein größeres und ein kleineres Stück unterteilt, wobei das jeweils kleinere zur Technoviteinbettung verwendet wurde. Alle Proben wurden so ausgerichtet, dass schlussendlich ein Organquerschnitt betrachtet werden konnte.
Die uterotubale Verbindung wurde, mit dem uterusseitigen Anteil zuerst, als ganzes in Paraplast eingebettet. Das Infundibulum wurde nach einem Längsschnitt, der dann zur Auswertung kam, beiden Einbettungsverfahren unterzogen.
Auch die Ovarien der beiden Körperseiten wurden nach Längsschnitt durch vorhandene Funktionskörper in Paraplast eingebettet. Ebenso wurde mit einem Querschnitt aus der Uterushornmitte (HY) verfahren.
Während des geschilderten Procedere des Zuschneidens wurde insbesondere darauf geachtet, dass durch regelmäßiges Aufträufeln des Fixationsmittels ein Austrocknen der Proben verhindert wurde.
3.4.1 Technovitschnitte
Nach einer 48-stündigen Fixierung der Organe in 4%igem Formalin wurde das zugeschnittene Untersuchungsmaterial über Nacht in Leitungswasser gespült und anschließend entwässert.
Dann erfolgte die Einbettung in den Kunststoff Technovit 7100 (Heraeus Kulzer, Wehrheim/Ts.) (GERRITS u. SMID 1983). Schließlich wurden die Kunststoffblöcke nach Aushärtung mit Technovit 3040 (Heraeus Kulzer, Wehrheim/Ts.) auf Plastikförmchen geblockt (s. Protokoll im Anhang). Die Einbettung in Technovit verhindert Schrumpfungsartefakte weitestgehend (HANSTEDE u. GERRITS 1983).
3.4.2 Paraplasteinbettung
Das 48 Stunden formolfixierte Untersuchungsmaterial wurde nach Zuschnitt 12 Stunden in Leitungswasser gespült, dann in einer aufsteigenden Ethanolreihe und schließlich in Xylol (Riedel-de-Haen, Seelze) dehydriert und in Paraplast Plus® (Sherwood Medical Co., St. Louis, MO, USA) eingebettet (s. Protokoll im Anhang).
3.5 Schnitttechnik
3.5.1 Technovitschnitte
Von den aufgeblockten Kunststoffpräparaten wurden am Autocut-Mikrotom (Fa.
Jung, Heidelberg) etwa 3 µm dicke Querschnitte angefertigt und anschließend auf einer Wärmeplatte bei 90 °C dauerhaft auf Objektträgern fixiert.
3.5.2 Paraplastschnitte
Die formalinfixierten Paraplastproben wurden mit einem manuell betriebenen Rotationsmikrotom (Fa. Reichert-Jung, Heidelberg) ca. 3-5 µm dick geschnitten und
für die Routineuntersuchung auf unbeschichtete Objektträger (Superior, Marienfeld), für die immunhistochemische Untersuchung auf Adhäsionsobjektträger (HistoBond®, Superior, Marienfeld) aufgezogen und im Brutschrank bei 60 °C fest fixiert.
3.6 Histologische Färbetechnik
3.6.1 Färbung der Technovitschnitte
Von jeder Gewebeprobe wurden je 4 Anschnitte mit Toluidinblau und H.E. gefärbt (nach BÖCK 1989) (s. Protokoll im Anhang).
3.6.2 Färbung der Paraplastschnitte
Die Paraplastschnitte wurden sorgfältig entparaffiniert, bevor von jeder Gewebeprobe 2 Objektträger sowohl H.E. als auch Masson-Goldner gefärbt wurden (nach BÖCK 1989) (s. Protokoll im Anhang).
3.7 Immunhistochemische Darstellung proliferierender Zellen
Mit Hilfe eines monoklonalen Anti-Ki-67-Antikörpers (Maus-Anti-Human-Ki-67- Antigen, Klon MIB-1, DAKO Diagnostika, Hamburg) und einer Avidin-Biotin-Komplex- Peroxidase-Methode, modifiziert nach SHI et al. (1991, s. Protokoll im Anhang), erfolgte die Markierung proliferierender Zellen. Bei jeder immunhistochemischen Reaktion wurde ein Schnittpräparat von Plazentommaterial vom Rind als Positivkontrolle sowie Dubletten der reagierenden Schnitte durch Weglassen des Primärantikörpers als Negativkontrollen mitgeführt.
Das Prinzip des Nachweises beruht auf einer Bindung des monoklonalen Antikörpers an dem für die Proliferation einer Zelle charakteristischen Ki-67-Antigen. Nachdem durch die Erhitzung im Citratpuffer zunächst antigene Vernetzungen gelöst und durch eine Maskierung mit NHS (Natural Horse Serum) unspezifische Bindungen verhindert wurden, kann an den spezifischen Primärantikörper ein mit Biotin
konjugierter Sekundärantikörper gebunden werden. Als dritte Komponente wird das mit einer Peroxidase konjugierte Glykoprotein Streptavidin hinzugegeben, welches mit Biotin einen Komplex bildet. Dieser kann durch ein peroxidasespezifisches Substrat (Chromogen) mit Hilfe von H2O2 und Peroxidase umgewandelt und sichtbar gemacht werden, so dass das Ki-67-Antigen über zwei Antikörperbrücken indirekt lokalisiert werden kann.
3.8 Untersuchungsgang
3.8.1 Auswertung und Dokumentation
Alle histologischen und immunhistochemischen Präparate wurden mit einem Zeiss- Photomikroskop II (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena) unter Verwendung verschiedener Vergrößerungsstufen sowie auch Interferenzkontrast durchgemustert und ausgewertet. Als Photomaterial diente der Kleinbilddiafilm Kodak-Ektachrom-64T Professional®.
3.8.2 Histologische Befunde
Die Organschnitte (UTV, OV 1-6, IN) wurden anhand der unterschiedlich gefärbten Präparate untersucht. Protokolliert wurden zunächst Dicke und Vorhandensein der Tunica muscularis, Dichte und Fältelung der Lamina propria sowie der Inhalt der Gefäße und des Oviduktlumens. Das Vorhandensein von Mastzellen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten in Epithel und Stroma wurde, je nach Vorkommen, mit positiv = + oder negativ = - bewertet.
Erst danach wurde besonderes Augenmerk auf die Zellausbildung und die Charakteristika der Lamina epithelialis gelegt. Hierbei wurden Reihung bzw. Stufung des Epithels, Epithelhöhe, Differenzierung sowie die verschiedenen Epithelzelltypen notiert. An diesen wurden Zellform, Anfärbbarkeit, charakteristische Eigenheiten des Zytoplasmas, Ausbildung und Lage von Zellkern und Nucleolus, sowie evtl.
vorhandene Zilien und Mikrovilli gesondert vermerkt.
Besonderheiten in der epithelialen Zellmorphologie wurden zusätzlich erfasst.
Unterschiede in Ausbildung und Vorhandensein der Zellen innerhalb eines Oviduktquerschnitts wurden speziell in lumennahe und lumenferne Bereiche bzw. in Drüsen differenziert.
Als zilientragende Zellen (ZZ) wurden lediglich Zellen angesprochen, die lichtmikroskopisch auch zilientragend erschienen oder aufgrund ihrer typischen Morphologie als ZZ identifizierbar waren. Als sekretorische Zellen (SZ) wurden Zellen bezeichnet, die sich basophil anfärbten und Zeichen von sekretorischer Aktivität aufwiesen. Alle nicht eindeutig sekretorisch aktiven Zellen oder noch nicht ausdifferenzierte sowie in Regression befindliche Zellen wurden als nicht- zilientragende Zellen (NZZ) bezeichnet. Der Übergang zwischen diesen Zellformen und zu dem gänzlich undifferenzierten Epithel (UE) ist fließend.
3.8.3 Immunhistochemische Befunde
Die Auswertung des immunhistochemischen Nachweises des Ki-67-Antigens in den einzelnen Eileiterabschnitten und der zugehörigen Uterusgewebeprobe erfolgte nacheinander unter Berücksichtigung der histologischen Schichten: luminales Epithel, Drüsen, Lamina propria, Gefäße und Tunica muscularis. Beim Uterus wurde zusätzlich in Drüsenmündung, -körper und -fundus differenziert. Waren im gesamten Organquerschnitt nicht mehr als 10 Kerne braun und somit positiv angefärbt, wurde auf eine detaillierte Differenzierung der verschiedenen Gewebeschichten verzichtet.
So wurden Immunreaktionen über den gesamten Organquerschnitt beurteilt und ihrem Vorkommen entsprechend als (+) in Spuren, + geringgradig, ++ mittelgradig und +++ hochgradig positiv oder aber als negativ = - bewertet.
3.9 Statistische Auswertung
An 80 möglichst optimal angeschnittenen und zufällig ausgewählten Zellen jedes tubalen Querschnitts wurde mit Hilfe des computergestützten Bildanalysesystems CUE-3, in der Version 4.5 (Galai Productions Ltd., Israel) die Zellhöhe ermittelt. Das System verfügt über eine Videokamera, deren Bild auf einen Computerbildschirm übertragen wird, so dass nach Kalibrierung eines über die Kamera aufgenommenen Maßstabs die Zellhöhen direkt in µm abgelesen werden konnten. Soweit das luminale Epithel differenziert war, betraf die Auswertung 40 zilientragende und 40 nicht zilientragende Zellen. Zilientragende Zellen (ZZ) beziehen sich hierbei auf lichtmikroskopisch erkennbare Zilien aufweisende Zellen. Zu den nicht- zilientragenden Zellen (NZZ) werden entsprechend differenzierte sekretorische Zellen (SZ), dedifferenzierte und deziliierte oder in Ziliogenese befindliche Zellen gezählt. Es wurden jeweils verschiedene Zellen aus mehreren zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern beurteilt. Zur Ausmessung von Zellen wurden ausschließlich gefärbte Technovitschnitte verwendet, da diese aufgrund ihrer histologischen Aufarbeitung wenig Schrumpfungsartefakte aufweisen (HANSTEDE u. GERRITS 1983).
Aus den jeweiligen Zellmaßen der einzelnen Probanden wurde der arithmetische Mittelwert gebildet, der in die weitere statistische Auswertung einging. Des weiteren wurden an 4 x 100 benachbarten Zellen des Oberflächenepithels sowohl der Schleimhautfalten als auch der Drüsen der Anteil an Zellen notiert, die lichtmikroskopisch zilientragend waren.
Die Ergebnisse wurden als arithmetischer Mittelwert (X) angegeben und graphisch in Form von Box-Plots dargestellt. Das Höhenniveau der Säule stellt hierbei den arithmetischen Mittelwert aller Tiere dar, die senkrechte Linie zeigt jeweils die Distanz zwischen Minimal- und Maximalmittelwert eines Einzeltieres an.
Am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover erfolgte mittels SAS®-Statistikprogramm (Version 6.12) die Überprüfung auf signifikante Unterschiede der ermittelten Daten zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Hierzu fand eine einfaktorielle Varianzanalyse mit nachfolgendem t-
Test Anwendung. Dabei gelten Werte mit p ≤ 0,05 mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von <5 % als signifikant unterschiedlich. Sie werden in den Diagrammen zusätzlich mit Symbolen markiert.
4 Ergebnisse
4.1 Zuordnung der Zyklusphasen
Der Zyklusstand der zur Organuntersuchung herangezogenen Hündinnen am Tag der Ovariohysterektomie konnte durch Kombination folgender Parameter sehr exakt bestimmt werden: Anamnese, klinisch-gynäkologische und vaginalzytologische Befunde der Verlaufskontrollen sowie der Befunde am Tag der Operation, ferner Blutplasmaspiegel von Östradiol-17β und Progesteron (Tab. 2) und histologische Untersuchung von Ovarien und Uterusquerschnitten (Tab. 1).
4.2 Endokrinologische Befunde
Die Konzentrationen von Progesteron und Östradiol-17β im Blut der zur Organuntersuchung zur Verfügung stehenden Hündinnen wiesen in den
verschiedenen Zyklusphasen charakteristische Werte auf (Tab. 2). Sie ergaben somit keinen Hinweis auf eine gestörte Ovarfunktion.
Die in der späten Follikelphase gemessenen Hormonkonzentrationen charakterisieren die unter Einfluss von LH stehende präovulatorische
Follikelluteinisierung und damit auch den Übergang vom Proöstrus zum Östrus.
4.3 Eileiterlänge und –durchmesser
Die Eileiterlängen der linken und rechten Körperseite schwankten unabhängig von der Zyklusphase zwischen 6,3 und 12,8 cm (Tab. 3). Der Durchmesser des Hohlorgans lag bei den anöstrischen Tieren bei etwa 1 mm, währenddessen er zur Zeit der Lutealphase und vor allen Dingen im Proöstrus bis zu 3 mm annehmen konnte.
Tab. 1: Übersicht über die charakteristischen histologischen Ergebnisse von Ovarien und Uterus zu den in dieser Arbeit gewählten
Organentnahmezeitpunkten sowie Hormonstatus
Zyklusphase Ovar Uterus Hormonstatus
Anöstrus Primärfollikel, Sekundärfollikel,
evtl.
Restgelbkörper oberflächenfern
luminales Epithel und Drüsenepithel kubisch oder flach, Drüsen kurz mit
geringem Durchmesser
basale, ggf.
steigende E2- Konzentration,
basale P4- Konzentration
Späte Follikelphase
mehrere Tertiär- und Graaf'sche
Follikel, evtl.
beginnende Luteinisierung
luminales Epithel kubisch, Drüsenepithel hochprismatisch, Drüsenschläuche
gestreckt
basale bis ggf.
initial steigende P4- Konzentration,
hohe E2- Konzentration
Lutealphase d 25-30 p.ov.
mehrere Blüte- Gelbkörper oberflächennah, atretische Follikel
luminales Epithel und Drüsenepithel
hochprismatisch, Drüsen maximal
verästelt
hohe P4- Konzentration,
basale E2- Konzentration
Tab. 2: Individuelle und mittlere (X) Östradiol-17β- und Progesteron- konzentrationen der untersuchten Hündinnen in verschiedenen Zyklusphasen
Anöstrus Späte Follikelphase
Lutealphase (d 25 bis 30 p.ov.)
Tier-Nr. 1 2 3 X 4 5 6 X 7 8 9 X
E2 (pg/ml)
24,4 17,3 17,6 19,8 39,0 41,3 45,0 41,8 34,6 31,8 25,5 30,6
P4 (ng/ml)
1,2 0,21 0,71 0,7 2,3 4,5 2,0 2,9 22,6 33,7 32,4 29,6
Tab. 3: Individuelle und mittlere (X) Länge des Ovidukts (OV) (cm) der linken und rechten Körperseite in verschiedenen Zyklusphasen
Anöstrus Späte Follikelphase
Lutealphase Mittel- wert Tier-
Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 X
li. OV 8,8 11,6 8,3 12,8 10,4 11,2 8,8 9,8 7,0 9,85 re. OV 8,5 10,4 7,0 11,8 9,5 10,8 8,7 8,3 6,3 9,03
4.4 Histologische Veränderungen des Ovidukts in Abhängigkeit vom Organabschnitt und der Zyklusphase
In der UTV besteht eine deutliche Abgrenzung des Ovidukts vom Uterus (Abb. 1 u.
2). Auf einigen Querschnitten sind ein oder zwei Faltenzugänge zum Eileiterlumen zu erkennen, ansonsten ist als Grenze Bindegewebe und eine ausgeprägte Muskelschicht zu finden. Die Richtung der Falten zeigt, dass der Eileiter nicht gestreckt, sondern im leichten Winkel in das Uteruslumen einmündet.
Die im Uterusanteil sichtbaren Drüsen sind je nach Zyklusstand unterschiedlich ausgeprägt. In der späten Follikelphase sind sie groß, häufig sekretgefüllt und meist
