Tierärztliche Hochschule Hannover
Effekte skrotaler Hyperthermie auf die Perfusion sowie auf histologische und immunhistochemische Merkmale
des caninen Hodens und Nebenhodens
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Annika Herr
Hamburg
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für Kleintiere
1. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel 2. Gutachter: Prof. Dr. C. Pfarrer
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2010
Meinen Eltern Meinem Freund
Frieda
1 Einleitung ...9
2 Literaturübersicht...11
2.1 Anatomie des Hundehodens...11
2.1.1 Morphologie... 11
2.1.2 Blutgefäßversorgung der Hoden... 13
2.1.3 Histologie des Hodens... 13
2.2 Spermatogenese, Spermiogenese und Keimepithelzyklus...16
2.3 Apoptose...17
2.3.1 Allgemein... 17
2.3.2 Nachweisverfahren der Apoptose... 20
2.3.3 Apoptose am Hoden ... 21
2.4 Nekrose ...23
2.5 Degenerative Prozesse an den Hoden ...23
2.6 Proliferation am Hoden...24
2.6.1 Allgemein... 24
2.6.2 Nachweisverfahren... 24
2.7 Sonographie der Hoden...25
2.7.1 Technische Grundlagen... 25
2.7.2 Dopplersonographie ... 25
2.7.3 Auswertung von Dopplerkurven... 27
2.7.4 Zweidimensionale Sonographie der Hoden ... 28
2.7.5 Dopplersonographie der Hoden... 29
2.7.6 Zweidimensionale Sonographie der Prostata ... 29
2.8 Wärmeregulation am Hoden...30
2.9 Einfluss einer Hyperthermie auf das Hodengewebe...31
3 Material und Methoden ...35
3.1 Tiere...35
3.2 Versuchsaufbau ...36
3.2.1 Vorlauf ... 36
3.2.2 Wärmeapplikation... 37
3.2.3 Untersuchungen nach 48-stündiger Wärmeapplikation ... 38
3.3 Morphologische Untersuchung ...39
3.4 Ultraschalluntersuchung ...40
3.5 Kastration und Aufbereitung der Hoden ...40
3.6 Histologische und immunhistochemische Verfahren...42
3.6.1 Hämalaun-Eosin Färbung... 42
3.6.2 TUNEL - Verfahren... 42
3.6.3 Immunhistologischer Nachweis der aktivierten Form der Caspase-3 ... 42
3.6.4 Ki-67-Antigen... 43
3.7 Mikroskopische Auswertung ...44
3.8 Statistische Auswertung ...45
4 Ergebnisse ...46
4.1 Befunde der morphologischen Untersuchung ...46
4.2 Befunde der sonographischen Untersuchung ...49
4.3 Histologische und immunhistochemische Befunde ...56
4.3.1 Hoden ... 56
4.3.2 Nebenhoden ... 73
5 Diskussion ...81
5.1 Versuchsdurchführung...81
5.2 Morphologische Befunde ...82
5.3 Sonographische Befunde ... 83
5.4 Histologische Befunde ... 85
5.5 Schlussfolgerungen...95
6 Zusammenfassung...96
7 Summary ...99
8 Literaturverzeichnis ...102
9 Anhang ...114
9.1 Histologische und immunhistochemische Verfahren – Arbeitsprotokolle...114 9.2 Skrotale Wärmeapplikation und Aufbereitung der Hoden:
Materialien, Chemikalien und Geräte ...122
9.3 Verläufe der Skrotaltemperatur...125
9.4 Alter und Gewicht der Rüden...127
Abkürzungsverzeichnis Ak = Antikörper
°C = Grad Celsius
c = Geschwindigkeit der Ultraschallwellen
ca. = circa
cm = Zentimeter
DNA = Desoxyribonucleic acid = Desoxyribonucleinsäure
DPV = diastolic peak velocity = diastolische Maximalgeschwindigkeit EDV = enddiastolic velocity = enddiastolische Geschwindigkeit evt. = eventuell
HE = Hämalaun-Eosin kg = Kilogramm
m = Meter
min = Minute ml = Milliliter mm = Millimeter MHz = Megahertz μm = Mikrometer
PBS = phosphatgepufferte Natriumchlorid-Lösung PCR = Polymerase Ketten Reaktion
PI = pulsatility index = Pulsatilitätsindex RI = resistance index = Widerstandsindex RNA = Ribonucleic acid
SPV = systolic peak velocity = systolische Maximalgeschwindigkeit
s = Sekunde
TAMAX = time averaged maximum velocity
= amplitudengewichtete mittlere Geschwindigkeit TNF = Tumor Nekrose Faktor
TUNEL = TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling v = relative Geschwindigkeit
z.B. = zum Beispiel
Einleitung
1 Einleitung
Die Bedeutung der Fruchtbarkeit ihrer Hunde rückt zunehmend in das Bewusstsein der Hundezüchter. Züchten ist nicht mehr nur ein Hobby, sondern für viele Züchter auch ein wirtschaftlicher Faktor. Aus diesem Grunde besteht zunehmendes Interesse an einer umfassenden Fertilitätsdiagnostik auch bei Rüden.
Eine herabgesetzte Fruchtbarkeit kann unter Anderem auf einer zu geringen Spermienproduktion in den Hoden bestehen. Degenerative Veränderungen des spermienbildenen Hodenparenchyms entstehen in der Mehrzahl der Fälle ohne eine akute klinische Symptomatik. Vielmehr kommt es häufig über eine aufsteigende Infektion zu einer subakuten oder chronischen Orchitis mit schleichender, fortschreitender Abnahme der Fruchtbarkeit bis zur Infertilität. Von anderen Haustierarten ist bekannt, dass es aufgrund einer Hyperthermie zu einer akuten, klinisch nicht apparenten Entzündung, jedoch in der Folge zu reversiblen oder irreversiblen degenerativen Gewebeveränderungen kommen kann. So wurden bei Ratten, Bullen, Hengsten und Lamas massive Effekte einer kurzzeitigen moderaten Hyperthermie auf die Ejakulatbeschaffenheit sowie auf morphologische und histologische Hodenparameter nachgewiesen (KHAN u. BROWN 2002; ALBRECHT 2006; SCHWEIZER 2006; SCHWALM et al. 2007).
Die Spermatogenese läuft beim Hund in 8 bis 10 Keimepithelzyklen ab (FOOTE et al.
1972; IBACH et al. 1976; SOARES et al. 2009). Es ist davon auszugehen, dass auch unter physiologischen Bedingungen nicht alle Spermatogonien zu Spermien werden, sondern viele dem programmierten Zelltod, der Apoptose unterworfen sind. Apoptose kann durch verschiedene externe und interne Faktoren ausgelöst werden (MAJNO u.
JORIS 1995). So z.B. durch Erhöhung der Skrotaltemperatur. Eine weitere Form des Zelluntergangs ist die Nekrose, die im Gegensatz zur Apoptose keinen genetisch kontrollierten Prozess darstellt und häufig mit einer Entzündung einhergeht.
Einleitung
Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss einer kurzfristigen moderaten skrotalen Hyperthermie auf Morphologie und gewebliche Beschaffenheit der Hoden gesunder Beagle-Rüden zu untersuchen sowie deren Ausmaß und Reversibilität zu erfassen.
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Anatomie des Hundehodens
2.1.1 Morphologie
Die Hoden des Hundes liegen im Hodensack und sind kaudal im Zwischenschenkelspalt sichtbar (GUTZSCHEBAUCH 1936). Üblicherweise befinden sich die Hoden beim Hund nicht nebeneinander, sondern hintereinander (GUTZSCHEBAUCH 1936) wobei sich der linke Hoden etwas weiter kaudal als der rechte befindet (EVANS u. CHRISTENSEN 1993). Die Hoden werden auch als samenbereitende Organe bezeichnet und damit funktionell von den Organen der Spermienreifung und -speicherung unterschieden. Mit seiner ovalen Form besitzt der Hoden eine Extremitas capitata (dem Nebenhodenkopf anliegend) sowie eine Extremitas caudata (dem Nebenhodenschwanz anliegend). Der Bereich, der dem Nebenhodenkörper anliegt wird als Margo epididymalis bezeichnet, die ihm gegenüberliegende Seite als Margo liber. Die seitlichen Flächen des Hodens werden als Facies lateralis und Facies medialis bezeichnet (GASSE 2004).
Die intraskrotale Lage der Hoden ist bei der überwiegenden Mehrzahl der Rüden horizontal, wobei die Extremitas capitata leicht nach kranioventral geneigt und die Extremitas caudata entsprechend nach kaudodorsal angehoben ist (GUTZSCHEBAUCH 1936; GÜNZEL-APEL 1994).
Es besteht eine Korrelation zwischen der Hodengröße und dem Gewicht des Rüden (GÜNZEL-APEL et al. 1994)
Die Nebenhoden werden unterteilt in Kopf, Körper und Schwanz (CORNWALL 2009).
Sie liegen den Hoden direkt an und sind am Margo epididymalis mit diesem verwachsen (LIEBICH 2004). Der Nebenhodenkopf des Hundes besteht zum größten Teil aus den 15-16 Ductuli efferentes (GASSE 2004), welche die Samenzellen aus dem Rete testis in den Nebenhodenkopf befördern. Je nach Größe des Hundes sind die Nebenhodenköpfe stecknadelkopf- bis erbsengroß. Der Nebenhodenkörper liegt
Literaturübersicht
dem Hoden strangförmig dorsolateral auf und mündet in den Nebenhodenschwanz.
Der den Nebenhodenkörper durchziehende Nebenhodenkanal liegt im Bereich des Nebenhodenschwanzes in extrem stark aufgeknäuelter Form und dient als Spermienreservoir, während Nebenhodenkopf und –körper primär der Spermienreifung dienen (CORNWALL 2009). Die Größe des Nebenhodenschwanzes variiert ebenfalls mit der Körpergröße des Hundes und ist linsen- bis haselnussgroß (GÜNZEL-APEL et al. 1994). Die Form des Nebenhodenschwanzes kann kappen-, halbkugel-, kugel- oder spitzkegelförmig sein. In der Regel ist der Nebenhodenschwanz deutlich vom Hoden abgesetzt (GUTZSCHEBAUCH 1936).
Die Hoden sind von mehreren Häuten umgeben (GUTZSCHEBAUCH 1936). Ganz außen befindet sich das Skrotum, welches anatomisch aus der Haut und der Unterhaut (Tunica dartos), sowie der Fascia spermatica externa besteht. Die Tunica dartos bildet ein kontraktiles Netz aus glatten Muskelzellen. Im Inneren wird das Skrotum durch ein Septum unterteilt. In jedem dieser Hohlräume liegt ein Hoden, umgeben vom Processus vaginalis. Dieser besteht aus der Fascia spermatica interna und der Tunica vaginalis. Direkt dem Hoden anliegend hält die Tunica albuginea testis durch ihre derbe Konsistenz den Hoden unter Druck. Die Tunica albuginea ist ca.
1 bis 2 mm dick, reich an Kollagenfasern und führt die Versorgungsgefäße in einer Tunica vasculosa in sich. Außerhalb des Processus vaginalis liegt für jeden Hoden separat der Musculus cremaster mit seiner Fascie. Außer dem Ligamentum scroti, einem derben Bindegewebsband welches im distalen Bereich den Processus vaginalis mit dem Skrotum verbindet, hat der Hoden keine feste Verbindung zum Skrotum. Dieses wird lediglich durch lockeres Bindegewebe gefüllt. Die äußere Haut des Skrotums ist dünn und wenig behaart, eine individuelle Pigmentierung wird beobachtet. Auch sind zahlreiche Schweiß- und Talgdrüsen vorhanden (GUTZSCHEBAUCH 1936; EVANS u. CHRISTENSEN 1993; GASSE 2004).
Literaturübersicht
2.1.2 Blutgefäßversorgung der Hoden
Die Blutgefäße im Hoden haben drei Hauptaufgaben, die Regulation der Temperatur und des Blutdruckes und den Transport von Hormonen (SINOWATZ 2001). Der Blutfluss zum Hoden erfolgt über die im Samenstrang verlaufende Arteria testicularis, welche aus der Arteria spermatica interna entspringt (GUTZSCHEBAUCH 1936). Dort ist sie, im Plexus pampiniformis, rankenförmig geschlängelt und tritt im weiteren Verlauf an der Extremitas capitata in den Hoden ein. In diesem verläuft sie am Margo epididymalis als so genannte Marginalarterie zur Extremitas caudata. An dieser angekommen, teilt sie sich (als so genannte Zentripetalarterie) in einen medialen und einen lateralen Ast auf, welche weitere Zweige in das zwischen den Lobuli des Hodens befindliche Bindegewebe abgegeben. Im Mediastinum testis knäueln sich die Arterien erneut auf und laufen als Zentrifugalarterien zurück in Richtung Hodenkapsel.
Der venöse Abfluss läuft zu einem geringen Teil über kleinere Venen, die dem Verlauf der Ductuli efferentes folgen und schließlich die Extremitas capitata erreichen. Der überwiegende Teil verläuft durch das Parenchym zur Hodenkapsel und bildet dort ein Venennetz, welches an der Basis des Samenstrangs als Plexus pampiniformis vorliegt (GUTZSCHEBAUCH 1936; SINOWATZ 2001). Durch diese speziell entwickelte Form des Plexus wird eine große Austauschfläche zwischen Arterie und Vene gebildet.
Diese fördert den Wärmeaustausch und erleichtert die Diffusion (COULTER u.
KASTELIC 1994). Um die Fließgeschwindigkeit im Plexus herabzusetzen, sind mehrere Anastomosen zwischen den einzelnen Venen ausgebildet (LIEBICH 2004).
2.1.3 Histologie des Hodens Hoden
Die dem Hoden direkt anliegende Tunica vasculosa liegt beim Hund und beim Schafbock oberflächlich, bei Hengst und Eber in tieferen Schichten (SINOWATZ 2001; LIEBICH 2004). Zusätzlich enthält die Tunica albuginea, neben der Tunica vasculosa, elastische und einzelne glatte Muskelzellen (MONTKOWSKI 1992;
LIEBICH 2004). Der Hoden wird komplett von ihr umschlossen und von aus ihr
Literaturübersicht
entlassenen Bindegewebstrabekeln durchzogen (MONTKOWSKI 1992; LIEBICH 2004). Durch diese Bindegewebssepten (Septula cortis) wird der Hoden in mehrere Lobuli testis, mit den darin befindlichen stark geschlängelten Samenkanälchen (Tubuli seminiferi convoluti oder contorti), unterteilt. Diese münden in einen gestreckten Endabschnitt, die Tubuli seminiferi recti und vereinigen sich im Mediastinum zum Rete testis (LIEBICH 2004). Das Mediastinum testis ist ein aus den Septula testis gebildeter bindegewebiger Bereich, welcher beim Hund zentral im Hodenparenchym liegt und den Hoden auf seiner gesamten Länge durchzieht (MONTKOWSKI 1992). Das Rete testis liegt als Netzwerk im Mediastinum und ist von einer deutlichen Schicht elastischer Fasern umgeben. In den Septula testis verlaufen größere Blut- und Lymphgefäße sowie Nerven (MONTKOWSKI 1992). Am Hoden ist vor allem der sympathische Anteil des vegetativen Nervensystems stark ausgebildet (SINOWATZ 2001). Die Tubuli seminiferi convoluti sind 50 bis 80 cm lang und im Durchschnitt 200 bis 300 μm breit (LIEBICH 2004). Sie bestehen aus Keim- und Stützzellen (Sertolizellen). Beim Hund liegen die Sertolizellen direkt der Basalmembran der Tubuli an, sowie vereinzelt zwischen den Spermatogonien (FORD 1969). Der Kern scheint direkt an der Basalmembran zu kleben. Die Tubuli seminiferi convoluti werden außen durch eine Basalmembran sowie durch lockeres Bindegewebe begrenzt, in welches die hormonproduzierenden Leydigschen Zwischenzellen eingebettet sind (GASSE 2004). Die Leydigschen Zwischenzellen liegen sowohl solitär als auch in Gruppen im Bereich des Rete testis oder an Lymphgefäßen (MONTKOWSKI 1992).
Die oben erwähnten Tubuli recti sind beim Hund, genau wie beim Bullen, noch mit einem als Terminalsegment bezeichneten Abschnitt versehen. Hier ragen Sertolizellgruppen keilförmig in das Lumen und behindern so ein Zurückfließen der Samenzellen. Außerdem besitzen sie auch hier phagozytotische Fähigkeiten.
MONTKOWSKI (1992) unterteilt dieses Terminalsegment aufgrund der Epithelbeschaffenheit in drei Abschnitte sowie eine endständige kelchartige Erweiterung.
Das intertubuläre Segment besteht zum Einen aus den intertubulären Spalträumen innerhalb eines Lobulus, welche beim Hund fast vollständig mit in Gruppen liegenden
Literaturübersicht
Leydigschen Zwischenzellen und von kleineren Blut- und Lymphgefäßen sowie von elastischen Fasern ausgefüllt werden. Zum Anderen gibt es den Bereich, der aus der Tunica albuginea einstrahlenden Bindegewebstrabekel. Hier befinden sich größere Blut- und Lymphgefäße sowie Fibrozyten und mononukleäre Zellen und, wie in den intertubulären Spalträumen, elastische Fasern und Leydigsche Zwischenzellen.
Nebenhoden
Im Bereich des Nebenhodenkopfes befinden sich Kanälchen welche als Ductuli efferentes testis, gesäumt mit glatten Muskelzellen zum Spermientransport, die Tunica albuginea des Hodens durchbrechen.
Am Ende des Nebenhodenkopfes vereinigen sich diese, beim Hund nach LIEBICH (2004) 15 bis 16 Kanälchen, zu dem Nebenhodenkanal, dem Ductus epididymidis (GASSE 2004). Gesäumt ist dieser Gang von einem zweireihigen hochprismatischen Epithel, welches ein ideales Milieu für die Spermienreifung schafft. Aus dem Nebenhodenkanal entspringt der Samenleiter, Ductus deferens, in welchem die Spermien während der Ejakulation durch die Kontraktion glatter Muskulatur zum Beckenstück der Harnröhre befördert werden (GASSE 2004). Im Samenleiter befindet sich zusätzlich ein mit Drüsengewebe ausgekleideter Abschnitt, die Pars glandularis ductus deferentis.
REHM (2000) wertete HE-gefärbte präparierte Hoden von 50 einjährigen Beagle- Rüden aus. Bei 30% der Rüden stellte er eine bilaterale, segmentale Hypospermatogenese fest, welche sich in Form verkleinerter Keimzellen, geschrumpfter Tubuli seminiferi contorti, Sertoli only, multinukleärer Riesenzellen und geschwollener Spermatozyten manifestierte. Bei 20% der Beagle-Rüden im Alter von 6 bis 32 Monaten wiesen GOEDKEN et al. (2008) eine Hypospermie nach, davon bei 31,3% bilateral. Bei allen Rüden war ein multifokales Fehlen elongierter Spermatozyten zu verzeichnen. Häufig traten Zelldebris, Riesenzellen und geschwollene Spermatozyten auf. 75% der betroffenen Rüden waren sechs bis acht Monate alt und demzufolge noch nicht geschlechtsreif. Über elf Monate alte Rüden waren weniger als 10% betroffen. Bei 10% der Rüden wurden apoptotische Zellen in
Literaturübersicht
minimalem Umfang gefunden. Die multinukleären Riesenzellen waren bei 73,8% der Rüden zu finden, davon 85% beidseits mit ein bis sechs Zellen pro Tubulus und weniger als zehn Tubuli pro Hoden. Im Nebenhoden wurden nur eine multinukleäre Riesenzelle und einige unreife Spermien gefunden.
2.2 Spermatogenese, Spermiogenese und Keimepithelzyklus
Im Rahmen der Spermatogenese entstehen aus den Spermatogonien haploide Spermatiden, welche dann während der Spermiogenese zu morphologisch reifen Spermien ausdifferenzieren. Dieser Prozess läuft zyklisch in den Tubuli seminiferi ab (FORD 1969; SCHNORR u. KRESSIN 2001). Zunächst kommt es durch mitotische Teilungen zur Vermehrung der Spermatogonien, gefolgt von einer Wachstumsphase, die zur Entstehung von Spermatozyten 1. Ordnung führt. Durch Reduktion der Chromosomenzahl entstehen Spermatozyten 2. Ordnung, welche ziemlich schnell durch meiotische Teilung zu Spermatiden werden. Die haploiden Spermatiden gehen nun zur Spermiogenese über, die in vier Schritten abläuft (FORD 1969;
MONTWKOWSKI 1992). In der Golgi-Phase wandern abgeschnürte Vesikel zum Kern und bilden so eine akrosomale Vakuole. In der darauf folgenden Kappen-Phase verdichtet sich die Vakuole zu einem Granulom, welches sich halbkugelförmig ausbreitet und im weiteren Verlauf die Kopfkappe bildet. In der sich anschließenden Akrosom-Phase kondensiert der Kern und nimmt eine längliche Gestalt an. Zusätzlich verlagert sich das Zytoplasma hinter den Zellkern. Nachfolgend findet eine Reifungsphase statt.
FOOTE und SWIERSTRA (1972) teilen den Keimepithelzyklus des Hundes in acht Stadien ein, beginnend mit dem Zeitpunkt, an dem alle reifen Stadien in das Lumen entlassen werden. Als Kriterien gelten sowohl die Kernform, als auch die Lage zur Basalmembran. Insgesamt unterteilen sie A- und B-Spermatogonien, welche aber nicht weiter klassifiziert werden. Die A-Spermatogonien zeigen sich in den Stadien zwei bis fünf, in deren Verlauf sie zahlenmäßig zunehmen, die B-Spermatogonien in den Stadien sechs bis acht. Anschließend folgt die Wandlung zu präleptotenen
Literaturübersicht
Spermatozyten 1. Ordnung, welche nach den vier Meiosestadien die zweite Reifeteilung durchlaufen. In den ersten vier Stadien existieren zwei Zellgenerationen.
Die Dauer eines Keimepithelzyklus wird mit 13,6 Tagen angegeben. Insgesamt dauert die Spermatogenese beim Hund acht bis neun Wochen und läuft dementsprechend in vier bis fünf Zyklen ab.
Ebenfalls in acht Stadien, basierend auf dem Akrosomsystem, wird der Keimepithelzyklus des Hundes von SOARES et al. (2009) eingeteilt. In dieser Studie wurden zusätzlich Unterschiede zwischen einzelnen Rassen und Mischlingen beleuchtet. Des Weiteren untersuchten sie anhand von intratestikulären Thymidin- Injektionen die Dauer des Keimepithelzyklus. Die gefundenen Ergebnisse decken sich mit denen von FOOTE und SWIERSTRA (1972). Die durchschnittliche Dauer eines Zyklus wurde mit 13,7 Tagen angegeben. Einzig beim American Pitbull zeigte sich eine durchschnittliche Dauer von 12,6 Tagen. Zwischen den anderen untersuchten Rassen (Pinscher, Beagle, Pudel, Labrador und Mischlinge) wurden keine Unterschiede entdeckt.
Dagegen teilen IBACH et al. (1976) den Keimepithelzyklus des Hundes in zehn Stadien ein. Sie beginnen mit der Verlagerung der Kopfkappe in Richtung Basalmembran und unterteilen die Zellgruppen in A- (mehrere Generationen), I- und B-Spermatogonien sowie in primäre und sekundäre Spermatozyten. Im Anschluss daran entstehen die Spermatiden, welche einen runden oder gestreckten Kern aufweisen. Die Entwicklungsrichtung läuft von der Basalmembran zum Lumen hin ab (Ford 1969).
2.3 Apoptose
2.3.1 Allgemein
Unter Apoptose ist der aktive, programmierte Tod einer einzelnen Zelle zu verstehen (KATAOKA u. TSURUO 1996). Sie funktioniert als Gegenspieler zur Mitose und ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper unerlässlich (ELMORE 2007).
Literaturübersicht
Entscheidend ist immer, dass der apoptotische Prozess unter genetischer Kontrolle steht (MAJNO u. JORIS 1995).
Es existieren zwei mögliche Ursachen, die einen apoptotischen Prozess auslösen können.Zum einen der genetisch programmierte Zelltod, welcher bei der embryonalen Entwicklung greift und zum anderen eine durch äußere Reize (z.B. Strahlung, Medikamente und Wärme) ausgelöste Apoptose (MAJNO u. JORIS 1995).
Initiiert werden kann die Apoptose über extrinsische und intrinsische Stimuli (NAGATA 1997). Eine wichtige Rolle spielen hierbei Noxen wie radioaktive Strahlung oder Medikamente, die die DNA schädigen (KATAOKA u. TSURUO 1996).
Der extrinsische Weg läuft über eine Bindung von TNF und Fas-Ligand, beide gehören zu den Zytokinen, an ihre spezifischen Rezeptoren (NAGATA 1997). Hierbei kommt es zur Aktivierung über die Procaspase-8 zur Caspase-8 (SCHULTZ u.
HARRINGTON 2003).
Bei dem intrinsischen Weg steigt die Permeabilität der Mitochondrienmembran infolge dessen das Membranpotential abnimmt. Dies hat zur Folge, dass es zum Austritt verschiedener Proteine kommt, wie z.B. Cytochrom C, welches die Procaspase-9 aktiviert (NAGATA 1997; SCHULTZ u. HARRINGTON 2003; SINHA HIKIM et al.
2003). Der intrinsische Weg wird zum einen durch positive Faktoren (Strahlung, Toxine, freie Radikale, Hitze), zum Anderen durch negative Faktoren, die über das eigene Fehlen apoptotische Prozesse starten können (Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine), ausgelöst (ELMORE 2007).
Beide Wege führen zur Aktivierung der Effektorcaspasen, allen voran der Caspase-3, welche von allen Initiatorcaspasen aktiviert werden kann. Alle Effektorcaspasen aktivieren Endonukleasen, welche dann DNA-Brüche hervorrufen. Caspase-3 speziell bewirkt die Spaltung des ICAD (Inhibitor of Caspase Activating DNA-ase), eines Proteins, welches die DNA schützt. Zusätzlich wird eine DNA-Helicase gespalten, welche die Chromatinkondensation bewirkt. Ferner werden von den Caspasen Cytoskelettbestandteile gespalten, so dass die für die Apoptose typische Zellschrumpfung stattfinden kann (FISCHER et al. 2003).
Literaturübersicht
Der dritte, auch von ELMORE (2007) erwähnte, Weg entspricht der von MARTINVALET et al. (2005) beschriebenen Caspase unabhängigen Apoptose. Dabei spielt das Granzym A eine entscheidende Rolle. Es bewirkt einen intrazellulären Anstieg reaktiver Sauerstoffverbindungen sowie ein Absinken des Membranpotentials der Mitochrondrien. Eingebracht in die Zelle wird das Granzym A über zytotoxische T- Zellen und natürliche Killerzellen. Im weiteren Verlauf zeigt die betroffene Zelle viele Merkmale der Apoptose, lediglich die äußere Mitochondrienmembran bleibt intakt, so dass kein Cytochrom C austreten kann, und somit keine Caspasen aktiviert werden.
Dagegen kommt es zu einer Spaltung des sogenannten Set-Komplex, einem aus mehreren Proteinen bestehenden Komplex, dessen Aufgabe im Schutz der DNA besteht. Wird dieser Komplex gespalten, kommt es zu einer Aktivierung von DNAsen die die DNA spalten. Im Unterschied zu den intrinsischen und extrinsischen Wegen wird in diesem Fall die DNA einzelsträngig gespalten (MARTINVALET et al. 2005).
Einen Caspase-3 unabhängigen Weg des Zelltodes zeigen JÄHNICKE et al. (1998) auf. Hierbei wurden MCF-Brustkrebszellen, welche aufgrund eines Gendefektes keine Caspase-3 beinhalten, mit Tumor Nekrose Faktor behandelt. Auch diese Zellen zeigten eine apoptotische Reaktion, allerdings ohne DNA-Fragmentation, Zellschrumpfung oder Ausbildung des typischen „blebbings“ (Vorgang der Ausstülpung von Plasma- und Kernmembran, welche weiter zu Vesikeln abgeschnürt werden).
Zu Beginn des apoptotischen Prozesses kommt es zu einer Verringerung des Zellvolumens mit anschließender Kondensation des Zellkerns (MAJNO u. JORIS 1995; KATAOKA u. TSURUO 1996). Letztere erfolgt als halbmondförmige Ablagerung, der Margination des Chromatins (MAJNO u. JORIS 1995). Andere Zellorganellen sind von diesem Prozess nicht betroffen (KATAOKA u. TSURUO 1996). Nach MAJNO und JORIS (1995) kann jedoch eine geringe Schwellung der Mitochondrien auftreten, welche jedoch für den Ablauf der Apoptose nicht notwendig ist. Nachdem die Zellmembran Blasen geschlagen hat („blebbing“), zerbricht der Zellkern und es entsteht der apoptotische Restkörper (MAJNO u. JORIS 1995;
KATAOKA u. TSURUO 1996). Dieser wird komplett von neutrophilen Granulozyten
Literaturübersicht
phagozytiert (KATAOKA u. TSURUO 1996). Dagegen schreiben MAJNO und JORIS (1995) sowie JACOBSON et al. (1997) die Phagozytose den Makrophagen und benachbarten Zellen zu. Andererseits kann der apoptotische Restkörper auch als freier apoptotischer Körper bestehen bleiben (MAJNO u. JORIS 1995). Eine Entzündungsreaktion bleibt aus, da apoptotische Zellen eine so geringe Menge an Chemo-Attraktanzien produzieren, dass keine Leukozyten angelockt werden.
Apoptose kann innerhalb von Minuten ablaufen (MAJNO u. JORIS 1995). In der Agonie der Apoptose entlassen die Zellen viele Pseudopodien, es kommt zum
„budding“ (KERR u. HARMON 1991). Bei der Nekrose zeigen sich dagegen auch Veränderungen am Zytoplasma in Form von Eosinophilie, Zusammenbruch der Zellstrukturen und Fragmentation (MAJNO u. JORIS 1995).
2.3.2 Nachweisverfahren der Apoptose
Die üblichsten Verfahren für den Nachweis apoptotischer Zellen ist das TUNEL- Verfahren (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) und der Nachweis aktivierter Caspase-3.
Bei dem TUNEL-Verfahren wird die Tatsache genutzt, dass es während der Apoptose durch Endonukleasen zu einer DNA-Fragmentation kommt. Die frei werdenden Enden werden im Laufe des Verfahrens durch das Enzym TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) mit markierten Nukleotiden versehen, welche lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden können (GAVRIELI et al. 1992). Apoptotische Zellen sind nur über eine kurze Zeitspanne vorhanden. Von der Initiierung bis zur Elimination dauert es maximal drei Stunden (GAVRIELI et al. 1992). Dabei ist nicht sicher, wie viele Strangbrüche vorhanden sein müssen, um ein positives Ergebnis zu erzielen (ELMORE 2007). Auch Zellen, welche nekrotisch sind, können sich gerade in der DNA-Reparationsphase oder der Transkriptionsphase befinden und aufgrund dessen ebenfalls positiv dargestellt werden.
Bei dem Caspase-3-Verfahren wird in einem immunhistochemischen Verfahren die aktivierte Form der Caspase-3 im Gewebe nachgewiesen. Mittels eines spezifischen Caspase-Markers können zytoplasmaständige Enzyme markiert und sichtbar gemacht
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werden. Allerdings ist eine Aktivierung von Caspasen nicht unbedingt mit Apoptose gleichzusetzen. Hinzu kommt, dass die Caspasen oft nur in einem geringen Zeitfenster darstellbar sind (ELMORE 2007).
Weitere mögliche Verfahren zur Erfassung apoptotischer Zellen stellen die Elektronenmikroskopie und PCR-Assays dar.
2.3.3 Apoptose am Hoden
Am Hoden können folgende Faktoren Apoptose auslösen: Entzug oder Zugabe von Wachstumsfaktoren oder Hormonen, eine veränderte Interaktion benachbarter Zellen sowie DNA -Schädigung (zum Beispiel durch Strahlung) (DANSRANJAVIN 2000).
Beim Menschen zeigen ca. 8% der ausgewerteten Hodentubuli mit normaler Spermatogenese mindestens eine apoptotische Zelle. Am häufigsten sind Spermatozyten (63%) betroffen, doch können auch alle anderen Spermatogenesestadien apoptotische Prozesse aufweisen. Im Keimepithelzyklus dient die Apoptose dem Schutz vor geschädigten Zellen sowie fehlerhaften Mitose- und Meiose-Produkten. Des weiteren kommt der Apoptose eine Bedeutung in der Regulation der Zellhomöostase zu, da die Sertolizellen nur eine bestimmte Anzahl Keimzellen versorgen können (DANSRANJAVIN 2000). 75% der Keimzellen sterben während ihrer Entwicklung, vor allem in den frühen Stadien der Spermatogenese ab.
Bei Mäusen kam es nach vollständigem Testosteronentzug zu einer gesteigerten Apoptoserate im Hoden (TROJANO et al. 1994). BILLIG et al. (1995) erzielten diesen Effekt am Rattenhoden durch Entzug von Gonadotropinen. Betroffen waren jedoch nur Tiere im Alter von 16 bis 32 Tagen. Bei erwachsenen Tieren zeigte sich, unabhängig vom Gonadotropin-Entzug eine vermehrte DNA-Fragmentation in den Stadien XII bis XIV des Keimepithelzyklus, während das Stadium VIII kaum betroffen war. SINHA HIKIM et al. (2003) zeigten bei Ratten mit Hilfe eines Testosteronimplantats eine Steigerung der Apoptose in den Stadien VII bis VIII, welche in der Studie von BILLIG et al. (1995) eher die weniger betroffenen Stadien darstellten.
Literaturübersicht
Nach 15-minütiger Erwärmung auf 42°C zeigten die Hoden adulter Ratten eine erhöhte Apoptoserate. Diese trat in den Tagen 1 und 2 nach Wärmeapplikation vor allem in den Stadien I bis IV und XII bis XIV auf. In den Stadien V bis VIII waren dagegen nur geringe Veränderungen nachzuweisen. Am empfindlichsten zeigten sich pachytäne Spermatozyten, frühe Spermatiden, diplotäne und sich teilende Spermatozyten. Neun Tage nach der Wärmeapplikation waren schwere Schäden an den Tubuli seminiferi contorti zu finden. Apoptotische Zellen wurden nur noch vereinzelt nachgewiesen. 56 Tage nach der Wärmeapplikation hatte eine komplette Regeneration stattgefunden (SINHA HIKIM et al. 2003). Durch Kombination des Testosteronimplantats mit der kurzzeitigen Hitzeeinwirkung konnte nahezu eine Azoospermie erzeugt werden. SINHA HIKIM et al. (2003) verdeutlichten durch ihre Studie außerdem die Beteiligung von Mitochondrien durch den Nachweis von ausgetretenem Cytochrom C und Caspasen. Zusätzlich zeigten sie anhand von Knock-out Mäusen, dass der Weg der Apoptose über den FAS/FAS-Ligand Komplex bei der hitzeinduzierten Apoptose am Hoden eine eher untergeordnete Rolle spielt.
Bei Lamas wurden nach einer vierwöchigen Erhöhung der Umgebungstemperatur auf 29°C 22 bis 30 TUNEL-positive Zellen pro 100 Tubuli festgestellt. Betroffen waren hier vor allem primäre Spermatozyten. Diese Veränderungen waren im Vergleich zur Kontrollgruppe allerdings nicht signifikant (SCHWALM et al. 2007).
KAWAKAMI et al. (2000) bestimmten die Anzahl apoptotischer Zellen bei vier Rüden mit Azoospermie und bei drei Hunden mit normaler Ejakulatbeschaffenheit.
Durchschnittlich 3% der runden Spermatiden stellten sich mittels TUNEL-Verfahren positiv dar. Drei Hunde mit Azoospermie wiesen in 3% der Leydigschen Zwischenzellen DNA-Fragmentation auf. Sertolizellen konnten zu keinem Zeitpunkt TUNEL-positiv dargestellt werden. In den Hoden der Hunde mit normaler Ejakulatbeschaffenheit wurde keine Keimzellapoptose nachgewiesen.
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2.4 Nekrose
Im Gegensatz zur Apoptose ist die Nekrose kein genetisch kontrollierter sondern ein energieunabhängiger Prozess, an dem die Zelle passiv beteiligt ist (ELMORE 2007).
Gekennzeichnet ist die Nekrose durch irreversible Veränderungen im Zellkern wie Karyolysis, Pyknose und Karyorrhexis sowie durch Veränderungen im Zytoplasma in Form von Kondensation, Eosinophilie und Fragmentation (MAJNO u. JORIS 1995).
Durch Störung der Ionenkanäle kommt es bei nekrotischen Prozessen zur Verschiebung des osmotischen Gradienten und in der Folge dessen zu einem Wassereinstrom in die Zelle. Die Zelle schwillt an und rupturiert. Dadurch werden intrazelluläre Komponenten in die Umgebung freigesetzt und locken Immunzellen an, die wiederum durch Zytokinproduktion einen entzündlichen Prozess bewirken (SCHEIDEL 2000). Weiter treten vermehrt Zytoplasmavakuolen, zytoplasmatische Bläschen sowie kondensierte, rupturierte oder geschwollene Mitochondrien auf (ELMORE 2007). Eine Nekrose kann ebenfalls durch verschiedene intrinsische und extrinsische Faktoren ausgelöst werden. Dauer und Stärke eines Stimulus sind entscheidend dafür, ob die Zelle durch Nekrose oder Apoptose zu Grunde geht.
2.5 Degenerative Prozesse an den Hoden
Erkrankungen der Hoden, die mit Degenerationserscheinungen und verminderter Ejakulatbeschaffenheit einhergehen können, haben verschiedenste Ursachen. In der Bauchhöhle verbliebene Hoden sind gewöhnlich kleiner als skrotale Hoden und weisen keine Spermatogenese auf. Solche Hoden besitzen eine erhöhte Neigung zur tumorösen Entartung (WEISS u. KÄUFER-WEISS 2007). Akute degenerative und atrophische Zustände sind häufig nur histologisch an hydropischer Degeneration, Kernpyknosen, mehrkernigen Riesenzellen und Störungen der Samenzellbildung zu erkennen. Als Ursachen kommen hier vor allem Traumata, akute oder chronische entzündliche Prozesse, Infektionskrankheiten, klimatische Veränderungen und Ernährungsfehler zum Tragen. Eine senile Hodenatrophie, also eine
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Altersdegeneration, geht in der Regel mit einer Lipofuszinablagerung einher, welche den Hoden braun verfärbt.
2.6 Proliferation am Hoden
2.6.1 Allgemein
Aufgrund der verschiedenen gleichzeitig in den Tubuli ablaufenden Spermatogenesestadien ist das Hodengewebe von ständigen Proliferationsprozessen gekennzeichnet. Hierbei proliferieren in erster Linie die Spermatogonien welche sich durch mitotische Teilung vermehren. In den anderen Stadien der Spermatogenese erfolgen lediglich Umbauvorgänge bzw. meiotische Teilungen (MONTKOWSKI 1992).
Beim Bullen ist die Proliferation am stärksten in den Stadien fünf bis acht ausgeprägt, wenn die B- Spermatogonien sich teilen. Sertolizellen können hingegen in keinem Bereich mithilfe eines Proliferationsmarkers dargestellt werden (WROBEL et al. 1993).
Bei Lamas waren unter Kontrollbedingungen in 20,5% der Tubulusanschnitte keine einzige positive Zelle zu finden. Durch vierwöchige Wärmeapplikation stieg der Prozentsatz unmittelbar auf 54,3% an, um im Verlauf der darauf folgenden sechs Wochen auf 11% abzufallen.
2.6.2 Nachweisverfahren
Proliferationsprozesse lassen sich mithilfe des Markers Ki-67 nachweisen (SCHOLZEN u. GERDES 2000). Während der Ruhephase des Zellzyklus befindet sich das Ki-67 Protein ausschließlich im Zellkern, weshalb es in diesem Stadium nicht nachgewiesen werden kann.
Das Ki-67 Antigen eignet sich besonders gut zur Bestimmung der Proliferation, da es ein größeres Zeitfenster bietet als andere immunhistochemische Verfahren wie z.B.
der Nachweis des PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) (WROBEL et al. 1993).
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2.7 Sonographie der Hoden
2.7.1 Technische Grundlagen
Bei der Ultraschalltechnik werden durch piezoelektrische Kristalle im Schallkopf impulsartige Schallwellen (durch Ionenverschiebung im Kristall) erzeugt. Diese werden nach Reflexion des betroffenen Gewebes vom Schallkopf wieder empfangen.
Ultraschallwellen liegen im Bereich von 20 kHz bis zehn MHz und sind für den Menschen nicht hörbar (POULSEN NAUTRUP 2007). Sie werden im Ultraschallgerät in Spannungssignale umgewandelt und als zweidimensionales Bild dargestellt (GIESE 1997). Es können nur senkrecht getroffene Grenzflächen sicher beurteilt werden (POULSEN NAUTRUP 2007). Zwischen Schallkopf und Körperoberfläche befindliche Luft verhindert eine Ultraschalldarstellung oder führt zu Artefakten. Aus diesem Grunde sind sowohl die Entfernung des Haarkleides und als auch die Verwendung eines Ultraschallgels unverzichtbar.
2.7.2 Dopplersonographie
Der so genannte Dopplereffekt ist ein Effekt, welcher die Änderung einer Frequenz beschreibt, wenn sich Sender und Empfänger relativ aufeinander zu bewegen (GIESE 1997). Wichtig ist hierbei die Geschwindigkeit der Wellen (c) und die Relativgeschwindigkeit (v) von Sender und Empfänger. Mithilfe dieses Effektes können Blutströmungsgeschwindigkeit und Blutflussrate in peripheren Arterien bestimmt werden. Reflektiert werden die eintretenden Ultraschallwellen hierbei von den sich bewegenden Erythrozyten (GIESE 1997). Fließt das Blut auf den Schallkopf zu, erscheinen die Wellen gestaucht (f1 > f0 und fd > f0). Definitionsgemäß wird dieses Blut oberhalb der Nulllinie und rot dargestellt. Bei vom Ultraschallkopf weg fließendem Blut werden die Schallwellen gedehnt (f1 < f0 und fd < f0). Diese Blutflüsse werden unterhalb der Nulllinie und blau dargestellt (POULSEN NAUTRUP 2007). Die Kombination aus Dopplerverfahren und der zweidimensionalen
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Sonographie wird auch als Duplexsonographie bezeichnet. Sie ermöglicht die exakte Zuordnung des Blutflusses zu bestimmten Strukturen.
Beim farbcodierten Dopplerverfahren werden die Messvolumina eher flächenhaft abgebildet. Dieses Verfahren ist schnell und bietet als Einziges eine wirkliche Kombination aus zweidimensionalem Ultraschallbild und Dopplerfunktion (POULSEN NAUTRUP 2007).
Unterschieden wird hierbei zwischen dem kontinuierlichem Dopplerverfahren (CW) mit zwei Piezokristallen (einen zum Senden, einen zum Empfangen), und dem gepulsten Dopplerverfahren (PW) mit nur einem Kristall. Bei der gepulsten Dopplersonographie besteht die Möglichkeit einer Winkelkorrektur, so dass auch in nicht exakt parallel verlaufenden Gefäßen der Blutfluss gemessen werden kann (POULSEN NAUTRUP 2007). Bei der gepulsten Duplexsonographie wird zuerst die richtige Platzierung im zweidimensionalen Bild geprüft und anschließend auf den Dopplerbetrieb umgeschaltet.
Fehlerquellen ergeben sich bei der gepulsten Dopplersonographie sowie der farbkodierten Dopplersonographie aus dem Aliasing-Phänomen und der Nyquist- Frequenz (maximal eindeutig messbare Doppler-Shift).
Das Aliasing-Phänomen zeigt die Grenzen einer gepulsten Messung auf. Eine hohe Beobachtungsfrequenz erlaubt auch eine präzise Angabe der Geschwindigkeit. Dazu muss der Dopplershift etwas kleiner als die maximale Pulsrepetitionsrate gewählt werden (POULSEN NAUTRUP 2007). Wird eine Blutströmung oberhalb der Nyquist- Frequenz gemessen kommt es zum Aliasing-Phänomen und der Blutfluss wird, obwohl er auf den Schallkopf zufließt, unterhalb der Nulllinien angezeigt.
Um diesem Phänomen vorzubeugen, können die Eindringtiefe oder die Dopplerfrequenz verringert werden. Dabei sind eventuelle Einbußen der Abbildungen zu beachten. Durch Verschiebung der Nulllinie kann ein Messbereich zu Lasten des anderen verdoppelt werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit der Erhöhung der Pulsrepetitionsrate mittels HPRF (high-puls-repetition-frequency) Dopplerverfahren.
Hierbei werden weitere Messvolumina eingerichtet, was allerdings wiederum zu einer gewissen Ungenauigkeit führen kann (NEUERBURG-HEUSLER u. HENNERICI 1999).
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2.7.3 Auswertung von Dopplerkurven
Dopplerultraschallkurven können sowohl qualitativ als auch quantitativ ausgewertet werden. Die qualitative Auswertung erfolgt über die Parameter Flussmuster, Fließrichtung, Art der Strömung (laminar oder turbulent) sowie die Geschwindigkeitsverteilung im Gefäß.
Zur quantitativen Auswertung werden verschiedene Geschwindigkeiten und Indizes berechnet (TAYLOR u. HOLLAND 1990). Für die Bestimmung arterieller Blutflüsse werden die systolische Maximalgeschwindigkeit (systolic peak velocity = SPV), die diastolische Geschwindigkeit (diastolic peak velocity = DPV), die enddiastolische Geschwindigkeit (enddiastolic peak velocity = EDV) und die amplitudengewichtete mittlere Maximalgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity = TAMAX) gemessen. Als Indizes stehen der Pulsatilitätsindex (PI) und der Widerstandsindex (RI) im Vordergrund.
Der PI ist unabhängig von dem Winkel der Arterie und von der Geschwindigkeit der Trägerflüssigkeit (GOSLING u. KING 1974). Er wurde als Indikator für proximale Stenosen etabliert.
Der Widerstandsindex (RI) (POURCELOT 1974) wurde zur Charakterisierung der Arteria carotis communis etabliert. Er gibt eine Aussage über den Gefäßwiderstand distal der Messstelle.
Ein weiterer Index, der A/B-Quotient (STUART et al. 1980) eignet sich besonders für Arterien mit niedrigem peripheren Widerstand.
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Bei Arterien mit hohem peripheren Widerstand wird häufig der S/D-Quotient nach DEEG u. WILD (1990) verwendet:
BIAGIOTTI et al. (2002) konnten bei Männern durch Messung von RI und SPV zwischen obstruktiver und nicht obstruktiver Dysspermie unterscheiden. Hierbei zeigten Männer mit nichtobstruktiver Dyspermie signifikant niedrigere Werte.
Bei Männern mit pathologischem Spermabefund fanden PINGGERA et al. (2008) einen signifikanten Anstieg des RI im Vergleich zu einer gleichaltrigen Kontrollgruppe mit Normospermie. Bei Vorliegen von Variozelen (Krampfadern im Venengeflecht des Hodens) waren die Werte am höchsten. Dieses deckt sich mit den Untersuchungen von BIAGIOTTI et al. (2002). Auch hier wiesen die Männer mit Variozelen die höchsten Werte auf.
2.7.4 Zweidimensionale Sonographie der Hoden
Zur Sonographie der Hoden eignet sich besonders ein hochauflösender Linearschallkopf (SEYREK-INTAS et al. 2010). Empfohlen wird die Verwendung einer Vorlaufstrecke, z. B. der kontralaterale Hoden (LÜERSSEN u. JANTHUR 2007), sowie das direkte Aufsetzen des Schallkopfes auf den zu untersuchenden Hoden (SEYREK- INTAS et al. 2010). Die Sonographie der Hoden kann sowohl am stehenden, wie auch am liegenden Tier durchgeführt werden (LÜERSSEN u. JANTHUR 2007). Der physiologische Hoden ist gut umschrieben, oval, mit einer glatten Oberfläche. Eine definierte Kapsel ist als dünne echoreiche Linie darstellbar (PUGH et al. 1990). Die Echogenität sollte homogen, feinkörnig sein (BARR 1992; LÜERSSEN u. JANTHUR 2007; SEYREK-INTAS et al. 2010). Andere Quellen sprechen von grob-körnig (PUGH et al. 1990). Im Zentrum des Hodens zeichnet sich eine echoreiche Linie, das Mediastinum testis, ab (PUGH et al. 1990; BARR 1992; LÜERSSEN u. JANTHUR 2007). Der Nebenhoden stellt sich beim Hund etwas gröber als der Hoden dar und
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auch die Oberfläche kann etwas unregelmäßig erscheinen (BARR 1992; GÜNZEL- APEL et al. 2001).
2.7.5 Dopplersonographie der Hoden
Am Hoden des Hundes zeigten sich im physiologischen Zustand ein monophasisches Flussmuster sowie ein hoher diastolischer Blutfluss. Tumorös veränderte Hoden weisen eine signifikante Zunahme der systolischen Maximalgeschwindigkeit und der amplitudengewichteten mittleren Geschwindigkeit auf. Am Nebenhoden konnte kein Blutfluss festgestellt werden (GÜNZEL-APEL et al. 2001). Eine Studie an 42 klinisch geschlechtsgesunden Beagle-Rüden ergab in der Marginalarterie einen durchschnittlichen PI von 0,78 und RI von 0,49 (GUMBSCH et al. 2002).
2.7.6 Zweidimensionale Sonographie der Prostata
Die Untersuchung der Prostata wird in Rückenlage oder seitlicher Lage durchgeführt.
Bei kurzen Untersuchungen ist auch eine Untersuchung am stehenden Tier möglich.
Der üblicherweise gewählte Konvexschallkopf (5 MHz) wird hierbei parapräputial, leicht zum Becken hin gekippt, aufgesetzt (PRÜFER et al. 2007, SEYREK-INTAS et al. 2010). Die Prostata befindet sich kaudal der Blase. Das Prostataparenchym zeigt sich mittelechogen und ist beim jüngeren Hund fein gekörnt. Ältere Hunde zeigen eine gröbere Körnung. Im Längsschnitt stellt sich die Prostata oval dar, im Querschnitt zeigt sie aufgrund der Lappung eine Schmetterlingsform (GÜNZEL-APEL et al. 2001;
PRÜFER et al. 2007; SEYREK-INTAS 2010). Die Prostata sollte sich symmetrisch mit weichen Grenzlinien darstellen (JOHNSTON et al. 1991). Die Länge der Prostata wird definiert nach RUEL et al. (1998) als die längste die beiden Lappen teilende Strecke, die Höhe als die maximale Strecke im 90° Winkel dazu. Eine Studie an 100 intakten erwachsenen Hunden (die im Rahmen einer Impfung vorgestellt wurden) ergab eine durchschnittliche Länge von 3,3 cm (± 0,9) sowie eine durchschnittliche Breite von 2,6 cm (± 0,7) (RUEL et al. 1998).
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2.8 Wärmeregulation am Hoden
Die Innentemperatur des Skrotums liegt bei Säugetieren 2 bis 7°C unter der Körperkerntemperatur.
Bei adulten Ratten zeigte sich ein konstanter Temperaturgradient zwischen Hoden und Rektum von 3 bis 5°C. Dieser wurde bei einem Anstieg der Rektaltemperatur größer, da die Temperatur im Hoden sich nicht verändert (KORMANO 1967). Die Adaptation männlicher Ratten an eine Umgebungstemperatur von 35°C führte zu einer Herabsetzung der Befruchtungsraten, einhergehend mit Degeneration der Hoden. Der Gradient zwischen Rektal- und Hodentemperatur blieb dabei aber erhalten (SOD-MORIAH et al. 1974). Entscheidend ist also das Gleichgewicht zwischen der über die Arteria testicularis eingebrachten Wärme und der durch Stoffwechselvorgänge entstehenden Wärme sowie der über das Skrotum abgegebenen Wärme.
An der Aufrechterhaltung der Skrotaltemperatur sind verschiedene Mechanismen beteiligt (SETCHELL 1978a/b). Der Hauptmechanismus, die vom Körper produzierte Wärme zu reduzieren, liegt im Gegenstromprinzip. Das Gegenstromprinzip funktioniert aufgrund von Temperaturdifferenzen. Diese resultieren daraus, dass das venöse Blut kälter ist als das arterielle Blut. Bestandteile des Gegenstromprinzips sind die stark geknäuelte Arteria testicularis sowie der darum angeordnete Venenplexus, Plexus pampiniformis, die zusammen als testicular vascular cone bezeichnet werden (COULTER u. KASTELIC 1994). Da Arterie und Vene an vielen Stellen nur durch die Gefäßwand begrenzt sind, kann ein effektiver Wärmeaustausch stattfinden. Ein weiterer, wenn auch geringerer Anteil der Wärme wird über oberflächlich verlaufende Arterien abgegeben (SETCHELL 1978a).
Die testikulären Blutgefäße sind sympathisch innerviert. Ein vermehrter Blutfluss bewirkt immer auch, durch größere Abstrahlung der Wärme über oberflächliche Arterien sowie eine verstärkte Evaporation, eine Kühlung des Hodengewebes (SETCHELL 1978b). Zusätzlich kommt es durch den erhöhten Blutfluss auch zu
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einem stärkeren Verlust von Flüssigkeit, sowie vermehrter Schweißbildung am Skrotum.
Durch Kontraktionen der Muskelanteile der Tunica dartos kann das Skrotum in Falten gelegt und die Hoden hochgezogen und näher an die Bauchhöhle gebracht werden.
Neben dem Musculus cremaster, der als quergestreifter Muskel zu keiner lang anhaltenden Kontraktion befähigt ist, sind die in die Skrotalhaut integrierten glatten Muskelzellen beteiligt, welche über Katecholamine stimuliert werden (SETCHELL 1978a).
2.9 Einfluss einer Hyperthermie auf das Hodengewebe
Der Einfluss einer Hyperthermie auf den Hoden wurde bereits bei verschiedenen Haustierarten untersucht. ALBRECHT (2006) erwärmte die Hoden von vier Bullen über 48 Stunden um durchschnittlich 4,3°C durch Anbringen eines Suspensoriums.
24 Stunden nach Entfernung des Suspensoriums war eine Zunahme des Umfangs um 9%, des Volumens um 22% und der Länge und Breite um 7% zu verzeichnen. Auch bei Hengsten, welche 48 Stunden ein Suspensorium trugen, führte der dadurch erreichte Temperaturanstieg um 2 bis 3°C zu einer Verringerung der Disulfidbindungen und der Chromatinstabilität, gemessen mittels sperm chromatin structure assay (SCSA). Betroffen waren hier vor allem primäre Spermatozyten, während sich bereits im Nebenhoden befindliche Spermien keinen Schaden nahmen (LOVE u. KENNEY 1999). Dieses deckt sich mit Ergebnissen anderer Studien. So bewirken die meisten Methoden zur Erwärmung der Hoden Schäden an den primären Spermatozyten und den frühen Spermatiden. Einige Studien weisen aber auch Effekte auf die Spermatogonien und die Sertolizellen nach (SETCHELL 2006). Ebenfalls bei Bullen konnte nach 48 Stunden Erwärmung mittels Suspensorium Auswirkungen auf die Samenqualität beobachtet werden. So kam es zwar nicht zu einer Veränderung der Ejakulatmenge, wohl aber zu einer geringen Verschlechterung der Motilität sowie zu massiven Schäden der Morphologie (VOGLER et al. 1993).
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Im Falle einer akuten Orchitis kommt es ebenfalls zu einer Hyperthermie am Hoden (SINOWATZ 2001).
Diese Erkrankung führt innerhalb kürzester Zeit zu irreparablen Schäden am Keimepithel mit erheblicher Beeinträchtigung der Samenbeschaffenheit. Auch subakute und chronische Orchitiden können den Untergang des Keimepithels bedingen. In experimentellen Studien zeigten sich die durch Wärmeapplikation enstandenen Schäden oftmals als reversibel. In einigen Fällen aber zeigten sich nicht zu unterschätzende Langzeiteffekte, welche die Fruchtbarkeit nachhaltig einschränkten (SETCHELL 2006). Es existieren aber auch große individuelle Schwankungen zwischen den einzelnen Rassen einer Tierart sowie einzelnen Tieren einer Spezies.
Bei Lamas führte die vierwöchige Haltung in Wärmeställen bei 29°C zu einer Abnahme der Spermienkonzentration, die ein bis vier Wochen nach Hitzeeinwirkung am stärksten war. Gleichzeitig stieg der Anteil morphologisch abweichender Spermien an. Ab der dritten Woche sank die Mortalität der Spermien bis zu einem Minimum von 20% in der achten Woche ab (SCHWALM et al. 2007).
Die mittlere Blutflussgeschwindigkeit fiel bei allen vier von ALBRECHT (2006) untersuchten Bullen, z. T. biphasisch, ab. Die Werte normalisierten sich sehr unterschiedlich. Nach initialem Abfall bei allen Bullen, zeigten zwei Bullen einen weiteren kontinuierlichen Abfall bis Woche zwei mit anschließender Normalisierung in Woche vier bzw. fünf. Bei einem Bullen normalisierte sich der Blutfluss zwischen Woche zwei und vier mit leichten Schwankungen. Der letzte Bulle zeigte bis Woche vier sehr niedrige Werte mit anschließendem Anstieg auf Ausgangsniveau in Woche fünf. Keinen Einfluss auf den Blutfluss in der Arteria testicularis hat eine Kühlung des Skrotums. Hier kam es lediglich zu einem reduzierten Blutfluss innerhalb der Skrotalgefäße (GLODE et al. 1984).
Zur Darstellung der Ödematisierung eines einzelnen Hodens wurde sowohl von ALBRECHT (2006) als auch SCHWEIZER (2006) die Ermittlung des Grauwertes genutzt. So zeigten die vier Bullen von SCHWEIZER (2006) maximale Grauwerte in Woche eins nach Wärmeapplikation. Ein Abfall auf Aufgangswerte erfolgte, mit einer Ausnahme in Woche sechs, in den Wochen zwei bis vier. Bei drei Hengsten, welche
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eine Erwärmung der Hoden um durchschnittlich 2 bis 4°C mittels Suspensorium über 48 Stunden erfahren hatten, zeigten sich unterschiedliche Ergebnisse in der Auswertung des mittleren Grauwertes. So zeigte ein Hengst kaum Veränderungen, wohingegen ein anderer Hengst einen massiven Abfall direkt nach der Wärmeapplikation mit anschließender Regeneration zeigte. Der dritte Hengst zeigte ebenfalls einen massiven Abfall des Grauwertes direkt nach Wärmeapplikation mit einem Anstieg auf Ausgangswert bis Woche sieben nach Wärmeapplikation.
HE gefärbte Hodengewebsschnitte von Lamas, nach vierwöchiger Haltung im Wärmestall, wurden von SCHWALM et al. (2007) untersucht. Der Anteil vollständig degenerierter Hodentubuli betrug in der Kontrollgruppe 5%, unmittelbar nach der vierwöchigen Hyperthermie 40% und sank innerhalb der darauf folgenden zwei bis sechs Wochen auf 10% ab. Der am häufigsten bei Hyperthermiestudien dokumentierte Effekt des Zelluntergangs ist die Apoptose unter Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies, sowie dem Tumor supressor Gen p53 und der Freisetzung von Cytochrom C (SETCHELL 2006).
So wurde auch die Apoptoserate von SCHWALM et al. (2007) mit Hilfe des TUNEL- Verfahrens untersucht. In der Kontrollgruppe waren 22 bis 30 Zellen pro 100 Hodentubuli positiv. Es zeigten sich keine signifikanten Veränderungen gegenüber den behandelten Tieren, welche drei, fünf, sieben und neun Wochen nach der vierwöchigen Wärmephase kastriert wurden. Betroffen waren bei allen Tieren vor allem primäre Spermatozyten. Insgesamt wurde postuliert, dass nicht eine verminderte Apoptoserate sondern eine vermehrte Proliferation der Keimzellen wieder eine Normalisierung der Spermaparameter bedingte.
Eine 45-minütige Erhöhung der Umgebungstemperatur auf 42°C führte bei Ratten zu einem Anstieg TUNEL-positiver Zellen bis 15 Minuten nach Wärmeapplikation, gefolgt von einer Abnahme. Betroffen waren vor allem die Typ A-Spermatogonien, während die Spermatiden relativ resistent erschienen (KHAN u. BROWN 2002).
Mithilfe des Ki-67-Verfahrens stellten SCHWALM et al. (2007) die Proliferation im Hoden dar. Hierbei wurde ein Quotient aus positiven Zellen gegenüber negativen Zellen, bezogen auf zehn Hodentubuli aufgestellt. In 20,5% der Tubuli der Kontrolltiere zeigten sich keine positiven Zellen. Dagegen stieg die Zahl auf 54,4%
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direkt nach der Hitzeeinwirkung, anschließend erfolgte ein langsamer Abfall auf 11,1%
sechs Wochen nach Hitzeeinwirkung.
Durch den Nachweis von Cytochrom C und Caspasen wurde eine Beteiligung der Mitochrondrien an den apoptotischen Prozessen nachgewiesen (SINHA HIKIM et al.
2003). Auch zeigte sich in Hoden nach 20 Minuten bei 43°C mittels RNA-Extraktion und PCR eine verminderte Anzahl DNA - reparierender Gene, sowie eine vermehrte Anzahl apoptotischer Zellen und Hitzeschockproteine (ROCKETT et al. 2001).
Material und Methoden
3 Material und Methoden
Dieser Tierversuch wurde mit dem Aktenzeichen Tierversuchsnummer 08/1469 genehmigt.
3.1 Tiere
Für die Studie standen insgesamt zehn Beagle-Rüden im Alter von ein bis drei Jahren (Durchschnitt zu Beginn der Studie 23,7 Monate) aus der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken, Klinik für Kleintiere mit einem durchschnittlichen Gewicht von 14,8 kg zur Verfügung. Die Rüden wurden in Gruppen von zwei bis drei Hunden in Außenzwingern mit Schutzhütten gehalten. Einmal täglich wurden sie mit einer kommerziellen Mischung aus Feucht- und Trockenfutter gefüttert.
Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Drei Tiere dienten als Kontrollgruppe; bei sieben Hunden wurde ein- bzw. zweimalig eine skrotale Temperaturerhöhung induziert. Alle Hunde befanden sich während des gesamten Studienzeitraumes in einem guten Pflege- und Allgemeinzustand. Anhand andrologischer, spermatologischer und mikroskopischer Parameter wurde bei allen Rüden klinische und bakterielle Geschlechtsgesundheit sowie Normospermie diagnostiziert.
Material und Methoden
3.2 Versuchsaufbau
3.2.1 Vorlauf
Tabelle 1: Versuchsablauf Vorlauf (n = 10)
Woche Morphologie Ultraschall Anzahl der Tiere
1 * * 10
2 * 10
3 * 10
4 * * 10
Kastration Kontrollgruppe (n = 3) Hyperthermie 1 (n = 7)
5 * * * * * * 7
6 * * 7
7 * * 7
8 * 7
9 * 7
10 * 7
11 * 7
12 * 7
13 * 7
14 * (n = 2) * 7
Kastration (n = 2) Hyperthermie 2 (n = 5)
15 * * * * * * 5
16 * * 5
17 * (n = 3) * * 5
Kastration Tag 10 nach 2. Hyperthermie (n = 3)
18 * * 2
19 * 2
20 * 2
21 * (n = 2) * 2
Kastration Tag 40 nach 2. Hyperthermie (n = 2)
Material und Methoden
Zu Beginn und am Ende einer vierwöchigen Vorlaufzeit wurden Hoden, Nebenhoden und Prostata aller zehn Hunde morphologisch untersucht. Außerdem fand einmal pro Woche eine Ultraschalluntersuchung statt. Die Rüden der Kontrollgruppe (n = 3) wurden anschließend kastriert.
3.2.2 Wärmeapplikation
Bei den verbleibenden sieben Rüden wurde über einen Zeitraum von 48 Stunden eine Temperaturerhöhung im Bereich des Skrotums erzeugt. Alle sechs Stunden wurden die Rüden an der Leine zum Harn- und Kotabsatz auf eine Wiese geführt. Wasser stand ad libitum zur Verfügung, gefüttert wurden die Hunde wie gewohnt einmal täglich. Um eine kontinuierliche Wärmeapplikation zu gewährleisten, wurde den Hunden ein Suspensorium angelegt. Dieses bestand aus einer äußeren wasser- und luftundurchlässigen Schicht aus thermoplastischem Kautschuk (Ethylen-Propylen- Dien-Kautschuk und Polypropylen, Fa. Engineering Technology Marketing GmbH, Saalburg-Eversdorf) wie er zur Abdeckung für Türfeststeller im Automobil Verwendung findet. Die zweite Schicht bestand aus Rolta Polsterwatte (Fa.
Tierärztebedarf J. Lenecke, Schortens) um das Skrotum gegen mechanische Schädigungen zu schützen. Direkt dem Hodensack anliegend befand sich ein weiches Babysöckchen, bestehend aus 60% Baumwolle, 20% Nylon, 19% Polyester und 1%
Elastane-Lycra (Fa. KiK Textilien und Non-Food GmbH, Bönen).
Das Suspensorium wurde mit Hilfe von vier gepolsterten Bändern (Abb. 1) an einem handelsüblichen Geschirr befestigt, so dass ein sicherer Sitz gewährleistet war.
Material und Methoden
Abbildung 1: Suspensorium zur Erhöhung der Skrotaltemperatur bei Rüden
In das Suspensorium wurde ein Temperaturfühler (Fa. TFA Klima Logger, Dostmann GmbH, Wertheim-Reicholtsheim) so eingearbeitet, dass er dem Skrotum unmittelbar auflag. Das zugehörige Kabel wurde so am Geschirr befestigt, dass kein Zug auf den Fühler entstehen konnte und dann über die Abdeckung der Box zum Sender geleitet.
Die Messstation gab ein Alarmsignal ab, sobald sich die Temperatur aus dem vorgegebenen Temperaturbereich (36 bis 42°C) entfernte. Auf diese Weise konnte ein evtl. Verrutschen des Fühlers oder des Suspensoriums sofort bemerkt und behoben werden. Alle 60 Minuten wurde die aktuelle Skrotaltemperatur aufgezeichnet.
Während des gesamten 48-stündigen Zeitraums der Wärmeapplikation wurden die Rüden lückenlos im Wechsel von zwei Personen beaufsichtigt. Falls erforderlich wurde zusätzlich ein Halskragen aufgelegt um die Tiere am Benagen des Suspensoriums sowie der Haltekonstruktionen und Temperaturkabel zu hindern.
3.2.3 Untersuchungen nach 48-stündiger Wärmeapplikation
Im Anschluss an die Wärmeapplikation wurden alle sieben Rüden über neun Wochen folgenden Untersuchungen unterworfen: unmittelbar und 24 Stunden nach Entfernen des Suspensoriums morphologische Untersuchung sowie Sonographie von Hoden und Prostata und dopplersonographische Untersuchung der Hodenperfusion.
Material und Methoden
In den darauf folgenden drei Wochen wurden eine zweimalige sonographische Untersuchung von Hoden und Prostata sowie dopplersonographische Untersuchungen der Hodenperfusion in drei- bis viertägigen Abständen durchgeführt, danach wurden eine sonographische Untersuchung von Hoden und Prostata sowie dopplersonographische Untersuchung der Hodenperfusion pro Woche durchgeführt.
Am Ende der neun Wochen zusätzlich eine morphologische Untersuchung von Hoden und Prostata. Danach wurden zwei Rüden kastriert. Bei den fünf verbleibenden intakten Rüden fand eine zweite Hyperthermiephase, identisch zur ersten statt. Die daran anschließenden Untersuchungen entsprachen der oben beschriebenen Vorgehensweise. Drei Rüden wurden zehn Tage und zwei Rüden 40 Tage nach der zweiten Wärmeapplikation kastriert.
3.3 Morphologische Untersuchung
Die morphologische Untersuchung der Genitalorgane erfolgte in der von GÜNZEL- APEL (1994) beschriebenen Vorgehensweise. Die äußere Haut des Skrotums wurde adspektorisch auf ihre Beschaffenheit und eventuelle Veränderungen untersucht.
Palpatorisch wurde die Verschieblichkeit der einzelnen Schichten gegeneinander und gegen den Hoden geprüft. Der Skrotalumfang wurde mit Hilfe eines Maßbandes gemessen. An den Hoden wurden folgende Parameter erfasst: adspektorisch geschätzte Größe, mittels Schieblehre gemessene Länge und Breite, Lage, Form und Konsistenz der Hoden. Die Nebenhodenanteile, Kopf, Körper und Schwanz, wurden auf ihre Abgrenzbarkeit untersucht. Am Nebenhodenschwanz wurde zusätzlich die Größe geschätzt und Form, Lage und Konsistenz bestimmt. Ferner wurden die Samenstränge bezüglich der Verschieblichkeit der Schichten und die Hodensacklymphknoten bezüglich ihrer Palpierbarkeit untersucht.
Bei der rektalen Palpation der Prostata wurden die Größe sowie Oberfläche, Lappung, Schmerzhaftigkeit und Konsistenz beurteilt.
Die Untersuchung von Penis und Präputium erfolgt durch Adspektion und Palpation.
Material und Methoden
3.4 Ultraschalluntersuchung
Alle Ultraschalluntersuchungen wurden mit einem Gerät des Typs Logiq 5 Pro (General Electrics Medical Systems, Solingen) durchgeführt.
Die Hunde wurden auf einer gepolsterten Unterlage in Seitenlage verbracht. Aufgrund der guten Kooperation der Hunde war eine Sedation in keinem Fall erforderlich. Zur besseren Ankopplung wurden der Hodensack und ein kleiner Bereich paramedian ca.
3 cm vom Penis entfernt geschoren und handelsübliches Ultraschallgel aufgetragen.
Die Hoden wurden nacheinander mit einem 12-MHz-Linearschallkopf untersucht. Die Darstellung erfolgte im Real-time-Modus im Längs- und Querschnitt. Es wurde die Echogenität und Homogenität des Hodenparenchyms beurteilt. Länge und Breite der Hoden wurden am jeweils größten Durchmesser gemessen. Anschließend wurde mittels Farbdoppler die Arteria marginalis im kranialen Hodenabschnitt und der Blutfluss durch dreimalige Messung der systolischen Maximalgeschwindigkeit (SPV) in cm/s, der Widerstandsindex (RI) und der Pulsatilitätindex (PI) ermittelt. Alle Bilder wurden zur Dokumentation und zur Auswertung abgespeichert.
Von der Prostata wurde im zweidimensionalen Bild (5 MHz Konvexschallkopf) die Parenchymbeschaffenheit beurteilt und die maximale Länge und Höhe jeweils zweimal gemessen.
3.5 Kastration und Aufbereitung der Hoden
Die Kastration der Hunde fand zu den im Versuchsablauf (Tabelle 1) angegebenen Zeitpunkten in der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt.
Nach Einleitung der Narkose wurde der Bereich zwischen Penis und Skrotum rasiert und mehrfach nach Standard der Klinik gewaschen und desinfiziert. Die Operation erfolgte nach der in der Klinik üblichen Vorgehensweise. Direkt nach Entnahme der Hoden wurden diese mittels scharfer Mikrotomklinge in drei Teile geschnitten und in entsprechend beschriftete (Name des Rüden, Tag der Kastration, Hodenabschnitt) Behälter mit 4% Formalinlösung gelegt.
Material und Methoden
Nach 24 Stunden wurden die Hoden aus dem Formalin entnommen und im Institut für Pathologie in jeweils eine Scheibe pro Abschnitt geschnitten. Diese Proben wurden anschließend in einen Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter II, Shandon, Frankfurt/Main) überführt. In dem Gerät wurden die Proben nach einstündiger Fixation in 10%igem Formalin und Spülung mit Leitungswasser in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 85%, 96%) dehydriert. Anschließend erfolgte die Entfernung des Alkohols mittels Isopropanol und Essigsäure-Butylester.
Am nächsten Tag erfolgte die Einbettung mit Hilfe des Einbettsystems Tissue Tek (Sakura, AT Zoeterwounde, Niederlande). Hierbei wurden die Präparate in 64°C warmes Paraplast Plus® (Shandon, Frankfurt/Main) eingebettet und auf 5°C gekühlt.
Aus den Blöcken wurden mittels Rotationsmikrotom (Microm International GmbH, Walldorf) 2 μm dicke Schnitte angefertigt und auf Superfrost® Plus Objektträger (Fa.
Menzel Gläser, Braunschweig) gezogen. Um gleichmäßige Präparate zu erhalten wurden die Blöcke um ca. ¼ herunter geschnitten. Die darauf folgenden Schnitte wurden der Untersuchung zugeführt. Vor dem unmittelbaren Aufziehen wurden die Schnitte in ein Wasserbad mit Raumtemperatur überführt, anschließend folgte ein zweites Wasserbad bei 40°C, um gestreckte gleichmäßige Schnitte zu gewährleisten.
Im weiteren Verlauf wurden die Schnitte im Wärmeschrank (Heraeus, Hanau) bei 70°C getrocknet. Insgesamt wurden pro Hund sechs Schnitte angefertigt, pro Hoden je ein Schnitt aus dem kranialen, mittleren und kaudalen Segment.
Material und Methoden
3.6 Histologische und immunhistochemische Verfahren
3.6.1 Hämalaun-Eosin Färbung
Für die HE-Färbung wurde ein Färbautomat Leica 4040 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) genutzt. Dieser arbeitet nach einem standardisierten Protokoll (siehe 9.1).
Die Schnitte wurden entparaffiniert und anschließend mit Hämalaun und Eosin gefärbt und im weiteren Verlauf mittels eines Eindeckautomaten (Promounter RCM 2000, Medite Medizintechnik Burgdorf) mit Deckgläsern versehen.
3.6.2 TUNEL - Verfahren
Zur Darstellung apoptotischer Zellen wurde zum einen das TUNEL-Verfahren angewandt. Hierfür kam das ApopTag® Plus Kit (Fa. Chemicon® International, Ltd., Hampshire, United Kingdom) zum Einsatz, welches die Aufbereitung der Schnitte in mehreren Schritten und enzymatische Reaktionen mittels TdT-Enzymen beinhaltet (siehe 9.1). Hierbei werden alle Zellen mit fragmentierter DNA im mikroskopischen Bild braun dargestellt. Jede dieser verfärbten Zellen wird zusätzlich auf ihre Morphologie untersucht. Ausgezählt wurden nur Zellen mit typischer pyknotischer Morphologie. Als Positivkontrolle diente ein Präparat der Milchdrüse einer Ratte.
Folgeschnitte der zu untersuchende Gewebeschnitte wurden mit PBS anstelle der working strenghth Tdt solution inkubiert und dienten so der Negativkontrolle.
3.6.3 Immunhistologischer Nachweis der aktivierten Form der Caspase-3
Zum Nachweis der aktivierten Caspase-3 wurde nach der ABC-Methode (siehe 9.1) für formalinfixierte Paraffinmaterialien verfahren. Als Blockserum wurde ein Ziegenserum verwandt. Dieses dient der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen.
Als primärer Antikörper diente ein polyklonaler, vom Kaninchen stammender Antikörper. Dieser ist gegen die p17 Untereinheit der aktivierten Caspase-3 gerichtet.
Material und Methoden
Als sekundärer Antikörper kam ein GAR-b (Goat-anti Rabbit, Ziege anti Kaninchen Antikörper) zum Einsatz.
Aufgrund der beschleunigten Umwandlung von DAB (3,3`-Diaminobenzidin- tetrahydrochloridihydrat) durch das Enzym Peroxidase entsteht an der Reaktionsstelle ein präzipitierendes Farbprodukt, welches sich ablagert und im mikroskopischen Bild braun darstellt.
Auch hier lief eine Positivkontrolle der Methode in Form eines Präparates einer Hundemilz mit. Als Negativkontrollen dienten parallele Schnitte des zu untersuchenden Gewebes welche mit 1:3000 in PBS mit 1% BSA verdünntem Kaninchenserum anstelle des Primärantikörpers (Kaninchen anti Caspase-3) inkubiert wurden.
3.6.4 Ki-67-Antigen
Für den Nachweis des Ki-67-Antigens kam der monoklonale Anti-Human Ki-67- Antikörper Clone MIB-1 zum Einsatz. Dieser monoklonale Mausantikörper gilt als Referenzantikörper für formalinfixierte Präparate. Die Reaktion läuft ebenfalls mit Hilfe der ABC – Methode ab. Als zweiter Antikörper fand ein GAM-b (Goat-anti Mouse) Verwendung (siehe 9.1). Zunächst werden hierbei antigene Vernetzungen gelöst und mittels NHS (Natural Horse Serum) blockiert. Anschließend kann der spezifische primäre Antikörper binden. Als weitere Komponente wird das mit einer Peroxidase konjungierte Streptavidin hinzugegeben. Dieses kann nun mit Hilfe eines peroxidasespezifischen Chromogens sichtbar gemacht werden. So wird das Antigen über zwei Antikörperbrücken indirekt lokalisiert und sichtbar gemacht. Bei jeder immunhistochemischen Reaktion lief ein Schnittpräparat eines Hundedarms als Positivkontrolle mit. Für die Negativkontrolle wurden Schnitte des zu untersuchenden Gewebes durch Weglassen des Primärantikörper mit geführt.
