Fä Farbstoffe

(1)

2010 1

Farbstoffe

und

Färbungen Far ben ,

Biologisches Material

Esther Osterwalder / 2010 2

Mögliche Darstellung von Strukturen, Krankheiten

Braune Käppchen bei den Zellkernen (Virusproteine) Orcein

Hepatitis-B-Antigen

Blaue, kurze, kommaförmige Stäbchen Giemsa C

Helicobacter pylori

Rostrot bis grünbraun Rhodanin

Kupfer

LM: lachsfarbig Polar.: apfelgrün Kongorot

Amyloidose

Fuchsinfarbige Stäbchen Ziehl Neelsen

Säurefeste Stäbchen bei Verdacht auf Tuberkulose

Diastase verdaut allfällige Glykogenschollen: die Differenz der beiden Nachweise (pink) zeigt auf, ob Glykogen vorhanden war oder nicht Immer 2 Färbungen:

PAS + D-PAS

Chemisches Färbeprinzip Glykogen

Kalk schwarz von Kossa = eine

Silberimprägnation Kalk, Mikroverkalkungen

z:B. in der Mamma

Proteindepots rot SFOG = eine

Trichromfärbung Proteinablagerungen in

der Niere bei Kimmelstiel- Wilson

dargestellt Nachweis

Bezeichnung

(2)

Gewebespezifische Färbungen an Kleinbiopsien

HE, EVG,Ab-PAS Darmbiopsien

HE, EVG,Ab-PAS, Gic (Giemsa C) Magenbiopsien

HE, EVG Gefässe (Blut-)

HE, EVG Herzbiopsien

HE, EVG, Ab-PAS, Eisen Lungenbiopsien

HE, Giemsa, Gomöri Lymphknoten

HE, EVG, PAS, D-PAS, CAB, Eisen, Gomöri, Orcein

Leberbiopsie

HE, PAS, Silbermethenamin SFOG, Nierenbiopsie

Färbungen, Nachweise Organ/Gewebe

Voraussetzungen für Färbungen in allen Fachgebieten

Licht, Auge, Farbe

Vorhandensein von biologischem Material

Brauchbare Farbstoffe und richtige Farbstoffwahl Korrekte Ausführung des Färbevorganges

Qualitätskontrolle am Mikroskop

(3)

Farben

(4)

Farben

(5)

Material

Herpes-simplex-Virus infizierte Verozellen

mit Phasenkontrast, links ungefärbt 200x, rechts ungefärbt, 100x

links: TUNEL-Reaktion (Rotfärbung), ca 300x, rechts: gleiches Präparat ohne Phasenkontrast

Blutaustrich normal, nach Pappenheim gefärbt

Biologisches Material

Blutaustrich normal, ungefärbt

(6)

Farben

Biologisches

Material +

Mikroskop:

Spongiosa, KM / Goldner / Kallus am Knochenbälckchen / Osteoporose

Biologische Bausteine

Proteine

Kohlenhydrate Lipide

Mineralien

Zusammenfassung:

sind die Partner der Farbstoffe und Reaktionslösungen.

(7)

Woher stammen die Farbstoffe?

Was sind Farbstoffe?

Welche Farbstoffe werden für die mikroskopischen Färbungen

gebraucht?

Färbende Mittel

Farbstoffe Pigmente

werden mit einem Bindemittel aufgestrichen

anorganische Russ

organische gehen mit dem biologischen

Material

eine feste Bindung ein

Tiere Pflanzen Teerderivate

Woher stammen die Farbstoffe?

Farbstoffe

(8)

Anorganische Pigmente stammen aus dem Mineralreich :

Umbra-Braun

Farbstoffe

Rötel Ocker

Farbstoffe

(9)

Eisen- und Manganhaltige Tonarten

Zinnober

Lapislazuli

Farbstoffe

(10)

Tusche Farb-Russe

Russ besteht zu 80 - 99.5%

aus Kohlenstoff und ist ein schwarzer, pulverförmiger Feststoff.

Darstellung von Gang- systemen

Farbstoffe

Organische Pigmente

Melanin Hämosiderin

Farbstoffe

(11)

Tierreich

Sekrete und Extrakte

Purpur

6,6 -Dibromindigo

Farbstoffe

(12)

Karmin

Cochenille

Farbstoffe

Pflanzenreich

Textilfärberei aller Kulturen

Farbstoffe

(13)

Indigo

Farbstoffe

(14)

Hämatoxylin

Blauholzbaum

Hämalaun nach P. Mayer

**Pflanzen

Farbstoffe

· Bleihämatoxylin nach McConaill

· Chrom-Hämatein nach Hansen

· Eisenhämatoxylin nach Faure

· Eisenhämatoxylin nach Hansen

· Eisenhämatoxylin nach Häggqvist

· Eisenhämatoxylin nach Heidenhain

· Eisenhämatoxylin nach Weigert

· Hämalaun-Erythrosin-Safran nach Masson Hämatoxylin nach Gill

· Hämatoxylin nach Delafield

· Hämatoxylin nach Harris

· Hämatoxylin-Chrysoidin-Färbung

· Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung)

· Hämatoxylin-Safranin-Färbung

· Molybdänhämatoxylin nach Held

· Saures Hämalaun nach Mayer

**Pflanzen

Farbstoffe

(15)

Teerderivate

Synthetische Farbstoffe Erster synthetischer Farbstoff:

die Pikrinsäure 1777

Muskulatur durch Pikrinsäure gelb VG - Färbung

***Teerderivate

Farbstoffe

(16)

Was sind Farbstoffe?

oder

Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?

Farbstoffe

Merkmale der Farbstoffe

a) Sie besitzen ganz bestimmte Absorptionsmaxima

b) Farb Kationen

⁺

oder Farb Anionen

^-

können an Gegen Ionen gebunden sein c) Farbstoffe können echt färben

Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?

Farbstoffe

(17)

Farbstofflösungen absorbieren bestimmte Wellenlängen des sichtbaren Lichtes.

a)Sie besitzen ganz bestimmte Absorptions- maxima:

Der Farbstoff erscheint in der Farbe des durchgelassenen Restlichtes (Mischfarbe)

Mischfarbe

Farbstoffe

(18)

Jeder Farbstoff besitzt seine typische Absorptionskurve.

Farbstoffe

Jeder Farbstoff hat weltweit seine C.I.-Nummer

(Color Index)

Farbstoffe

(19)

Nicht jeder farbige Stoff ist ein Farbstoff.

Ein Farbstoff enthält:

Chromophore Gruppen und

Auxochrome Gruppen

Chromophore

Azo Gruppe - N = N

Nitro Gruppe - NO

₂

Karbonyl Gruppe - C = O

Farbstoffe

(20)

Die Gruppen wirken nur farbig in Verbindung mit einem oder mehreren Benzolringen.

Chromophor Chromophor

Farbstoffe

Auxochrome

Hydroxyl Gruppe - OH

Amino Gruppe - NH

₂

Sulfonsäure Gruppe - SO

₃

H Karboxyl Gruppe - COOH

Farbstoffe

(21)

Chromophor

Chromophor (Aminoazobenzol)

Die auxochromen Gruppen wirken nicht nur Farbvertiefend, sie stellen vielmehr die Ver- bindung zwischen Farbstoff und färbendem Material her.

Der Farbstoff wird salzartig an das biologische Material gebunden.

Proteine

Kohlenhydrate Lipide

Mineralien

Na

⁺

Cl

^-

Farbstoffe

(22)

b) Farb Kationen+

oder Farb Anionen- können an Gegen ionen gebunden sein

Giemsa

Farbstoffe

neutraler Farbstoff

c) Farbstoffe können echt färben

Rep.: Coulomb / van der Waal

Farbstoffe

(23)

Einteilung der Farbstoffe:

positive Ladung negative Ladung

Kationische Farbstoffe Anionische Farbstoffe Alcianblau

Azur A + B (Giemsa) Bismarckbraun Fuchsin bas.

Gentianaviolett Karbolfuchsin Kristallviolett Methylenblau Parafuchsin Kernechtrot (Lack) Hämalaune (Lacke) Harris Hämatoxylin (Lack)

Lichtgrün SF Säurefuchsin

Hämatoxylin resp. Hämatein Pikrinsäure

Eosin Y Orange G Kernechtrot

Buchstaben interpretieren

X = indifferent (in Lösung pH un- abhänig)

M = Mischung

Y = yellowish = gelblich L = lichtecht

W = wasserlöslich H = hitzebeständig

T = tiefer Farbton G = grünstichig

S = besser löslich (solubel) F = klare Töne

R = rotstichig D = zum Drucken

P = Pigment C = chlorecht

O = orange B = blaustichig

N = neu A = Acetatseide

Anzahl vor dem Buchstaben deutet auf die Farbintensität hin.

Luxol Fast Blue MBSN: Mischung, blaustichig, besser löslich, neu Alcianblau 8GX: 8x grünstichig, indifferent

Chromotrop 2R: 2x rotstichig

Toluidinblau O: orange

Siriusrot F3B: klare Töne, 3x blaustichig

Orange G: grünstichig

Farbstoffe

(24)

HE - PAS - VG EVG Alcianblau-PAS Gic - CAB Berlinerblau -

Gomöri von Kossa - Fettnachweis - Kongo

Färbungen

in der

Histologie

Färbungen zuordnen nach:

Übersichtsfärbungen (HE, Giemsa) Nachweisen

Reaktionsprinzipien (3)

Trichromfärbungen (VG, CAB, Goldner, SFOG) Spezialfärbungen (ZN, Versilberung)

Routinefärbungen

HE - PAS - VG EVG Alcianblau-PAS - Gic - CAB Berlinerblau - Gomöri von Kossa Fettnachweis - Kongo

(25)

Die Übersichtsfärbung verschafft einen Überblick über das Gewebe, die Strukturen, die Zellverteilung, Anfärbbarkeit und Kern-Plasma-Relationen.

Sie besteht aus Kernfärbung und Zytoplasmafärbung.

zB: Hämatoxylin-Eosin Giemsa

Zellen/

Zellkern anfärben:

Für alle Färbungen gültig:

(26)

+ - - -

-

Schematischer Aufbau eines Zellkernes:

Nukleoproteid

Protein:

Histon+

Nukleotidkette:

diese besteht aus Nukleinsäuremolekülen,

von denen jedes aus - Phosphorsäure ^-

- Pentose

Hämalaun

Übersichtsfärbung Für alle Färbungen gültig:

(27)

Die Kernfarbstoffe sind meist Farblacke

das Eisen III Hämatoxylin nach Weigert

Hämalaun : Hämatein + Alaun

Hämalaun nach P. Mayer besteht aus Kalium-Aluminiumsulfat plus Hämatein. Alaune sind so genannte Doppelsalze.

Kernechtrot : Kernechtrot + Aluminiumsulfat

Übersichtsfärbung

Gewebe

Metallsalz Fe^III-chlorid

Farbstoff Hämatein

Farblack

Farblack

+

⁺

Zellen/

Zyto- plasma anfärben:

z.B.

Eosin Y v. HE

Übersichtsfärbung Für alle Färbungen gültig:

(28)

Wasser 80,5 85 % Proteine 10 15 %

Lipide 2 4 %

Polysaccharide 0,1 1,5 % DNA 0,4 %

RNA 0,7 %

kleine organische Moleküle 0,4 % anorganische Moleküle und Ionen 1,5 %

Zusammensetzung des Zytoplasmas

Zu den basischen Aminosäuren gehören:

Lysin Arginin Histidin

Zu den sauren Aminosäuren gehören:

Asparaginsäure (Aspartat) Glutaminsäure (Glutamat)

Weitere Aminosäuren mit ionisierbaren Resten:

Cystein Tyrosin

(29)

12,48 basisch

Arg

9,3 9,5 10,53

basisch Lys

9,7 10,1 10,07

semisauer Tyr

8,8 9,1 8,33

semisauer Cys

6,7 7,1 6,0

basisch His

4,2 4,5 4,25

sauer Glu

3,7 4,0 3,68

sauer Asp

im Protein frei

Bezeichnung Aminosäure

Eosin Y Orange G Pikrinsäure Anilinblau Säurefuchsin Chromtrop 2R Lichtgrün

Wichtige Zytoplasma- Farbstoffe

^neg

Wichtige Zellkern- farbstoffe

^pos

Hämalaun Kernechtrot

Weigert s Eisenhämatoxylin Methylenblau

Färbungen

(30)

Jeder der basischen Teerfarbstoffe ist in der Lage mit Eosin ein Salz zu bilden (Methylenblau-Eosinat, Azur-Eosinat).

Mischungen dieser Farbstoffe und ihrer Eosinate färben das Zytoplasma und die Zellkerne je nach pH Wert der Lösung.

Giemsa

Der neutrale Farbstoff färbt das Chromatin von Leukozyten rötlich-violett/marron (Eosin, Methylenblau).

Das kationische Azur bindet an DNA und die Eosin-Anionen an das bereits gebundene Azur.

pH-Wert ist massgeblich (um pH 4)

: ein zu blaues Ergebnis wird durch Differenzieren in 0.01% Eisessiglösung in Richtung Rosa verändert

Übersichtsfärbung

Nachweise

Van Gieson, CAB, Sirius, SFOG Kollagenes Bindegewebe

Kongorot Amyloid

Berlinerblau-Reaktion Eisen

Alcianblau - PAS Neutrale + saure

Glycosaminglycane = GAG

PAS Neutrale Glycosaminglycane = GAG, Kohlenhydrate, Glykogen

Giemsa C / Gic Helicobacter pylori

Sudan III, Sudan schwarz, Ölrot Fettnachweis

Ziehl Neelsen Säurefeste Bakterien (Tb)

von Kossa, Alizarinrot S Kalk

Färbung Substanz

Färbungen zuordnen:

(31)

Esther Osterwalder / 2010 61 Goldner

Knochengewebe

Gallyas Alzheimer Plaque Neurohistologie

Bodian, Bielschowsky Neurofibrillen Neurohistologie

Klüver Barrera, Luxol Fast Blue Markscheiden Neurohistologie

Giemsa Parasiten

Rubeansäure-Färbung, Rhodanin Kupfer

Orcein, Viktoriablau Hepatitis B-Antigen

Toluidinblau Mastzellen

Warthin Starry Spirochäten

Gram, Brown Brenn Bakterien

Grocott Pilze (Soor, Candida sp.)

Diastase-PAS: immer im Vergleich mit PAS!

Glycogen

SFOG Proteinablagerungen

Färbung Substanz

Färbungen zuordnen: Reaktionsprinzipien (3)

1.Chemisches Färbeprinzip: Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substrat verläuft nach den Gesetzmässigkeiten der chemischen Bindung. Die Färbe- ergebnisse lassen sich durch eine chemische Reaktionsgleichung

charakterisieren = Histochemie.

z.B. PAS, Berlinerblau, (Enzymnachweise = Enzymhistochemie)

z.B Nachweis von dreiwertigem Eisen mit der Berlinerblau-Reaktion:

3 K₄[Fe(CN)₆] + 4 FeCl₃ 4 Fe [Fe(CN₆)] ₃+ 12 KCl

Berlinerblau

Gelbes Blutlaugensalz = Ferro-zyankalium = Kaliumhexazyanoferrat II (Fe II)

(32)

PAS Reaktion periodic acid Schiff s reaction 1. Hydrolyse mit Perjodsäure HJO_{4 :}

das Zuckermolekül öffnet sich unter Bildung zweier dichtgelagerter Aldehydgruppen und H₂O

2. Anlagerung des Schiff schen Reagens (Fuchsinsulfit) an diese Aldehyd-Gruppen

+ F (SO₂H)₂

F

Fuchsinsulfit

kationischer Farbstoff Aldehydfuchsin Reaktionsprinzipien

PAS positive Substanzen/Strukturen Chitin

Stärke

Zellulose (Pollen) Dextrane

Glycogen (PAS + D-PAS zusammen) Glycoproteine

Sialomuzine (Sialo- = Speichel ) Basalmembran

Schleimbildende Drüsen, bzw. deren Sekrete Leukozyten, Plasmazellen

Reaktionsprinzipien

(33)

Chemische Färbeprinzipien nennt man in der Histologie meist Histochemie .

Histochemische Nachweise lassen sich nicht mehr entfärben, da das Produkt auf einer chemischer Reaktion beruht.

Verunreinigungen können bei histochemischen Nachweisen zu Fehlreaktionen führen, besonders bei den Enzymnachweisen.

Merke

2. Physikalisches Färbeprinzip Löslichkeiteines Farbstoffes in verschiedenen Medien (z.B. Ethanol / Fett)

z.B. Fettnachweis mit Sudan III, Ölrot

(34)

3. Physikalisch-chemisches oder physiko-chemisches Färbeprinzip

Elektroabsorption:Coulomb Dispersität: Farbstoffgrösse + Zeit spielen eine grosse Rolle

z.B. bei den Trichromfärbungen

Grenzflächenadsorption:Adsorption ist ein physikalischer Prozess Aktivkohle hält Farbstoff aufgrund der aufgerauten Oberfläche fest. Meist van der Waal involviert.

z.B. HE, VG, EVG, AP, Gic, CAB, Kongo

Als Adsorption (lat.: adsorptio bzw. adsorbere = (an-)saugen) bezeichnet man die Anreicherung von Stoffen aus Gasen oder Flüssigkeiten an der Oberfläche eines Festkörpers, allgemeiner an der Grenzflächezwischen zwei Phasen.

Adsorption unterscheidet sich von der Absorption, bei der die Stoffe in das Innere eines Festkörpers oder einer Flüssigkeit eindringen. Der Oberbegriff für diese Anreicherungsvorgänge lautet Sorption.

Adsorbieren zwei oder mehr Spezies an eine Oberfläche, nennt man dies Koadsorption. Dies spielt vor allem bei Katalysatoren eine wichtige Rolle, bei denen die verschiedenen

Atomsorten auf einer Oberfläche adsorbiert werden und dort reagieren.

Abb. a) Adsorbens, b) Adsorbat an der Grenzfläche, c) Gasphase bzw. Lösung mit Adsorptiv

Im allgemeinen Sinn ist Adsorption ein physikalischer Prozess.

Für Interessierte

(35)

VG CAB - Goldner - SFOG

Trichromfärbungen

(36)

Alle Variationen haben gemeinsam:

1 Farblack für die Kernfärbung

mindestens 2 anionische Farbstoffe (oft simultan angeboten)

davon

1x feindispers

zB. Ponceau de Xylidine, Pikrinsäure, Orange G, Chromotrop

davon:

1x grobdispers

zB. Säurefuchsin, Methylblau, Lichtgrün, Anilinblau

(37)

Esther Osterwalder / 2010 73 Proteindepots rot

SFOG Nierenerkrankung

gelb VG / EVG

Muskulatur; glatte, Herz und Skelett

Blau-,Rot- und Violetttöne Giemsa

Knochenmark

orange + grün Goldner

Knochen

grün Goldner

Faserknorpel

dunkelviolett El / EVG

Knorpel elastisch

Bindegewebe elastisch

blau rot CAB

VG / EVG Bindegewebe kollagen

dargestellt Nachweis

Bezeichnung

Welche Strukturen werden angefärbt ausser den Zellkernen?

keine Trichrom- färbung!

Aussagen zu den Fasern im Bindegewebe:

Kollagene Fasern: Anfärbung mit grobdispersen anionischen Farbstoffen wegen der basischen Aminosäuren des Kollagens.

Retikuläre Fasern: Schwach anfärbbar mit anionischen Farbstoffen.

Elastische Fasern

Das Protein Elastin weist zum Kollagen eindeutig weniger basische Aminosäuren auf, dagegen die seltene saure AS Desmosin.

Der saure Charakter der elastischen Fasern erlaubt die Anfärbung mit kationischen Farbstoffen zB. Orcein, Resorcin-Fuchsin

(38)

Spezialfärbungen werden zur Darstellung bestimmter

Strukturen durchgeführt. Sie bestehen aus einer geeigneten Farbstoff- oder Reaktionslösung und einer Gegenfärbung.

(Kernfärbung oder Hintergrundfärbung erhöhen den Farb- kontrast)

Spezialfärbungen Färbungen zuordnen:

zB: Ziehl Neelsen

Silberimprägnationen

Schematische Darstellung der Zellwand von Mykobakterien

Zellwandaufbau der Mykobakterien

Spezialfärbungen

(39)

Mykolsäuren sind Bestandteile der säurefesten Zellwand.

Durch ihre Einlagerung werden die Zellen stark hydrophob.

Sie besitzen lange Alkylketten und sind über Arabinogalaktan an das Murein gebunden, das ein Peptidoglykan ist.

ZN

basisches Fuchsin

Versilberung/Silberimprägnation

meist zur Darstellung von Aldehyden Argentaffine oder argyrophile Stoffe lassen sich mit Silber imprägnieren . - Argentaffine Strukturen können ohne Vorbehandlung metallisches Silber aus Silbernitatlösungen reduzieren. Diese lagern sich dann dort ab. (Kalk)

- Argyrophile Strukturen benötigen eine oxidierende Vorbehandlung, um dieselbe Wirkung zu erzielen. (retikuläre Fasern)

z.B. von Kossa Gomöri

(40)

Versilberung/Silberimprägnation

Silbersalze werden durch starke Laugen in Silberoxyd umgewandelt, das dann als schwarzer Niederschlag ausfällt.

2 AgNO₃+ 2 NaOH Ag₂O + 2 NaNO₃+ H₂O Silbernitrat Silberoxid

Durch Zugabe von Ammoniak entsteht Diaminsilberoxid, das sich durch Formalin reduzieren lässt.

AgO + 4 NH₃ (Ag[NH₃]₂)₂O Diaminsilberoxid

Dabei entsteht metallisches Silber als Niederschlag, Ammoniak und Ameisensäure.

(Ag[NH₃]₂)₂O + HCHO Ag + 4 NH3 + HCOOH Formaldehyd Ammoniak

metallisches Silber

Ameisensäure

1. Kaliumpermanganat (Oxidationsmittel) oxidiert Ethanolgruppen der Glykoproteine zu Aldehyden

2. Eisenalaun imprägniert die Strukturen 3. Silberionen lagern sich an Aldehydgruppen 4. Formalin wirkt als Entwickler

(5. Mit Goldchlorid wird das Silber schwarz getönt)

6. Mit Na-thiosulfat wird fixiert (entfernen

des noch ionisierten Ag)

Prinzip von Gomöri

Spezialfärbungen Versilberung/Silberimprägnation

(41)

meist maschinell gefärbt

HE Übersichtsfärbung für Kerne + Zytoplasma VG Übersichtsfärbung für kollagenes Bindegewebe +

Muskulatur; oft durch EVG ersetzt

PAS neutrale Zucker sind PAS-positiv (ungenaue Aussage) **inkl. *D-PAS beim indirekten Glykogennachweis**

Alcianblau (Ab) saure Muzine der Becherzellen Ab-PAS saure + neutrale Muzine der Becherzellen

unterscheiden

1. Schnitt: normaler PAS-Nachweis + werden positiv pink

2. Schnitt: zuerst mit Diastase das Glykogen verdauen, dann PAS ausführen Glykogen ist verdaut; nur noch wird positiv pink

Diastase- behandlung

PAS nach Diastase- behandlung = D-PAS

= hier war Glycogen vorhanden

*D-PAS indirekter Glykogennachweis beim z.B. primären Leberzellkarzinom

Routinefärbungen

(42)

D-PAS PAS

Parotistumor

Routinefärbungen

Routinefärbungen Alcianblau ist ein kationischer Kupferphthalocyanin- farbstoff und verbindet sich mit negativ geladenen Zellbestandteilen wie z.B. saure GAG.

Meist in Kombination mit PAS als Ab-PAS.

Ab-PAS

(43)

Esther Osterwalder / 2010 85 blau

LFB Myelin

dunkelviolettblau Nissl

Nissl-Schollen

schwarz Silberimprägnation

Nervenzellen

gelb VG / EVG

Muskulatur

Blau-,Rot- und Violetttöne Giemsa

Knochenmark

orange + grün Goldner

Knochen

grün Goldner

Faserknorpel

dunkelviolett EVG

Knorpel elastisch

violettblau HE

Knorpel hyalin

orangerot Sudan III /Oelrot

Fettgewebe

schwarz Gomöri

Bindegewebe retikulär

Bindegewebe elastisch

blau rot rot CAB

VG / EVG Sirius Bindegewebe kollagen

pink schwarz PAS

Silberimprägnation Basalmembran

pink/violettblau PAS / AB-PAS

Becherzellen/Drüsensekret

blau rot HE

HE Zellkerne

Zytoplasma

dargestellt Nachweis

Bezeichnung