Proteinimport in Zellkern: PPKKKRL Proteinimport in ER:
MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLLTKCEVFQ Retention im ER: KDQL
Proteinimport in Mitochondrien:
MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL Proteinimport in Peroxisomen: SKL
Signalsequenzen binden an Transportproteine (Rezeptoren) dadurch wird Weg des
Proteintransports in der Zelle festgelegt
- + ausgedehnter hydrophober Bereich
im Gefrierbruch sichtbare
„Verbindungskanäle“
zwischen Zellkern- Cytoplasma
Import in Zellkern findet über Kernporen statt
Schematische Darstellung Kernpore
Import Kernproteine
annuläre
luminale
säulenförmige ringförmige Untereinheit
Cytosol
Nucleus
Kernpore: aus ca. 100 verschiedenen Proteinen bestehende komplizierte Struktur
ER, Ribosomen und Proteinlokalisation in der lebenden Zelle
Freie Ribosomen cytosolische
Proteine Hämoglobin
Polyribosomen Proteinlokalisation
in Zelle Glycoproteine Membranproteine
sekretorische Proteine rauhes ER
Anordnung als freie oder am ER
gebundene Ribosomen hängt von Anwesenheit
von
Signalsequenzen in translatierter mRNA
ab
Zellkern und Endoplasmatisches Reticulum (ER)
Lenkung cytosolischer bzw. sekretorischer Proteine
Proteinlokalisation in
Endoplasmatisches Reticulum (ER)
Lokalisation in ER-Lumen:
sekretorische und Membranproteine Glycoproteine, Lipoproteine
Proteolytische Prozessierung Transmembranprotein
Verankerung eines Transmembrananteils in Membran
start stop
Signalsequenzen
eukaryotischer sekretorischer Proteine
hydrophob basischbasisch
Kovalente Modifizierung im ER
Proteinmport in Mitochondrien
Chaperone: Protein-Entfaltung vor Import in Mitochondrien und Chaperon (Hsp70)-vermittelte
Faltung
Protein-Qualitätskontrolle beim Austritt aus ER: Chaperone
Chaperone
- verhindern Aggregation - entfalten fasch gefaltete Proteine
- helfen Proteine zu entfalten, welche durch biologische Membranen zu transportieren sind
Dyctiosom
raues ER
Transportvesikel Sekretvesikel
Vesikelabschnürung aus Golgi-Zisternen
Proteinmodifizierung zu Lipoproteinen (lp) glattes ER (ger) und Golgi anschl. Exocytose in Sekretvesikeln (sv)
Golgi-Apparat als Verschiebebahnof und Endfertigung der Zelle
Liganden- bzw. Antikörper-gekoppelte Fluoreszenzmarker
Signalamplifikation mittels Sekundärantikörper
ER -> Golgi -> Zellmembran
ER-> Golgi-> Endosom -> Lysosom
Nach kurzfristigem Angebot radioaktiv markierter Aminosäure (pulse-chase)
Enzymhistochemie: Lichtmikroskop Enzymcytochemie: Elektronenmikroskop
Fraktionierung Zellorganellen in Ultrazentrifuge
Direkte Beobachtung der Fraktionen im Transmissions-EM
Enzymbestimmungen (Markerenzyme für Organellen)
in situ Lokalisierung des Enzyms
Identifizierung organspezifischer Proteine mit spezifisch bindenden Liganden oder
Antikörpern
(Fluoreszenz-, Goldpartikel-)
„leichte“ und „schwere“ Lysosomen mit Detergens bzw. kolloidalen Gold
Zellfraktionierung und Enzymlokalisation
Leitenzyme der Zellorganellen
• Zellmembran: Na+/K+ ATPase
• Zellkern: DNA- bzw. RNA-Polymerase
• Cytosol: Enzyme der Glycolyse
• sER: Hydroxylierungsenzyme
• rER: ribosomale Proteine
• Golgi: Galactosyl-Transferase
• Lysosomen: saure Phosphatase
• Peroxisomen: Katalase
• Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidase
Exocytose (Trans-Golgi-Netzwerk) Endocytose (Endosom, Lysosom)
Transcytose
basolateral apikal
wie werden Proteine an richtigen Ort in der Zelle dirigiert ?
bezüglich Verbreitung in Gewebe kommt es auf Art der Zell-Zell-Verbindung an
Gerichteter
Vesikeltransport von Donator- zu
Acceptororganelle organellspezifische G-
Proteine
auch als Auslöser für Membranfusion
Wie können sogar Proteine ohne Signalsequenz an richtigen Ort in Zelle gelangen?
merokrine (Exocytose)
apokrine (Brustdrüse)
holokrine (Talgdrüse)
Sekretion
Exocytose: konstitutiv bzw. getriggert
Immunogold-Lokalisierung
Sialinsäure-Transferase im Golgi-Apparat
Konstitutive und getriggerte (regulierte) Sekretion
Exocytose sekretorischer Vesikel
hochkonzentriertes, sofort freisetzbares Insulin (stimuliert Glucoseaufnahme)
Mastzelle vor (li) und nach (re)
Triggerung und Freisetzung von Histamin
Trennung Motoneuron (nz) von Muskelzelle (mz) durch
synaptischen Spalt (ss) praesynaptische (prm) postsynaptische (pom)
Membran
Neurotransmitter-Vesikel sec.
neural
min.
hormonell
Koppelung Endocytose/Exocytose
Entkoppelung von Ligand- und Rezeptorkreislauf
„Stachelgrübchen“
„Stachelvesikel“
Clathrin-vermittelte Endocytose
Phagocytose als Spezialfall der Endocytose
Rezeptorvermittelte Endocytose von Cargomolekülen
Clathrin-coated pits an Zellmembran ->Clathrin-coated vesicles in Zytoplasma
->Vesikelbildung mit H+ Pumpe -> frühes Endosom -> Lysosom
Goldpartikel Compartment of Uncoupling Receptor-Ligand
Endocytose
Flüssigkeit (Pinocytose)
Partikel, größeres Molekül (rezeptorvermittelt) Phagocytose Bakterien, Parasiten
Phagocytose Erythrocyt durch Makrophagen
Phagocytose von Bakterien durch Makrophagen
Phagocytose Bakterium durch Leukocyten
Lysosomen:
Orte hydrolytischen Abbaus in Zellen
Enzymcytochemische Lokalisierung saurer Phosphatase in Lysosomen
Aktivität Saure
Phosphatase in (nicht allen s. *) Lysosomen
aber auch in Vesikel des Golgi-Bereichs
Mannose-6-P:
Lokalisierungssignal für Lysosomen
Lysosomen aufgrund räumlicher Nähe zum Golgi als primäre Lysosomen? jedoch
direkter Nachweis: „wer fusionierte in welcher Reihenfolge mit wem?“ ist problematisch
Nachweis: „wo und wie genau“ jedoch nicht immer unproblematisch
primäres Lysosom:
Transportvesikel von Trans-Golgi
sekundäres Lysosom:
Mit Auto- oder Hetero- Phagosomen fusioniertes primäres Lysosom
tertiäres Lysosom:
Autophagosome und
heterophagosome Partikel bzw. Abbauprodukte davon enthaltend (Konfluenz)
Heterophagie
Autophagie Konfluenz
Autophagie
(Abbau Mitochondrium)
a: teilw. Von ER-Cisterne umschlossenes Mitochondrium
b: von einfach- bzw. Doppelmembran umschlossenes Mitochondrium
c: als ehem. Mitochondrium nur noch vage zu erkennen bzw. zu „erahnen“
Beweis: Konfluenz Autophagie mit Heterophagie
Endosom mit Mitochondrium, gleichzeitig Goldpartikel von
Endocytose enthaltend
Aufgrund saurer Phosphatase-Aktivität als Pb3(PO4)2 : Identifizierung als
Lysosom
Pflanzliche Vakuole als „Riesenlysosom“
