Das Effektorprotein Pep1 und seine Rolle in der Biotrophie von Brandpilzen

Das Effektorprotein Pep1 und seine Rolle in der

Biotrophie von Brandpilzen

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

Dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Christoph Florian Hemetsberger

aus Marburg an der Lahn

Das Effektorprotein Pep1 und seine Rolle in der

Biotrophie von Brandpilzen

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

Dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Christoph Florian Hemetsberger

Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden von Oktober 2009 bis September 2012 unter Betreuung von PD Dr. Gunther Döhlemann in Marburg am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in der Abteilung Organismische Interaktionen durchgeführt.

Vom Fachbereich

der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: 28.12.2012

Erstgutachter: PD Dr. Gunther Döhlemann Zweitgutachter: Prof. Dr. Uwe Maier

Hemetsberger C*, Herrberger C*, Zechmann B, Hillmer M, Doehlemann G. (2012). The Ustilago maydis effector Pep1 suppresses plant immunity by inhibition of host peroxidase activity. PloS Pathogens 2012 May; 8(5): e1002684.

Weitere Veröffentlichungen:

van der Linde K, Hemetsberger C, Kastner C, Kashani F, van der Hoorn RAL, Kumlehn J, Doehlemann G. (2012) A maize cystatin suppresses host immunity by inhibition of apoplastic cysteine proteases. Plant Cell. 2012 Mar;24(3):1285-300.

van der Linde K, Mueller A, Hemetsberger C, van der Hoorn R, Kashani F, Doehlemann G. (2012) The maize cystatin CC9 interacts with apoplastic cysteine proteases. Plant Signaling and Behaviour. 2012 Sep 7;7(11).

Ich versichere, dass ich meine Dissertation mit dem Titel „Das Effektorprotein Pep1 und seine Rolle in der Biotrophie von Brandpilzen“ selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfsmittel bedient habe.

Diese Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.

Christoph Hemetsberger (Ort / Datum)

... die Wissenschaft bildet ein einheitliches Ganzes, und die einzelnen Forscher sind, so verschiedenartige Wege sie auch gehen mögen, doch schließlich alle nur Diener an

einem und demselben Werk. Diese Einheitlichkeit immer wieder in lebendigem Bewußtsein zu erhalten, ist eine mit der Entwicklung der Wissenschaft stetig bedeutungsvoller werdende Aufgabe ...

Max Planck

21 is only half the truth. nach Douglas Adams

Zusammenfassung

Der Brandpilz Ustilago maydis benötigt während der Interaktion mit seiner Wirtspflanze Mais eine Vielzahl sekretierter Effektoren zur Etablierung der Biotropie. Eine Deletion des Gens um01987, das für den sekretierten Effektor Pep1 (protein essential during penetration 1) codiert, führt zum vollständigen Verlust der Pathogenität. Auf Penetrationsversuche der pep1-Deletionsmutante reagiert die Maispflanze mit der Induktion verschiedener Abwehrmechanismen wie der Bildung von Papillen, der Anreicherung reaktiver Sauerstoffspezies und nekrotischen Läsionen. Pep1 lokalisiert in der biotrophen Interaktionszone und ist in verschiedenen Brandpilzarten konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Pep1 durch biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass heterolog in Escherichia coli exprimiertes Pep1 den oxidative burst in Mais inhibieren kann. Eine Behandlung von Maispflanzen mit dem Radikalfänger Ascorbat hatte verminderte Abwehrreaktionen gegenüber Infektionen mit der pep1-Deletionsmutante zur Folge. Weiterhin wurde gezeigt, dass Pep1 die Aktivität einer Klasse-III-Peroxidase aus Meerrettich in vitro hemmt. Klasse-III-Peroxidasen spielen eine zentrale Rolle in der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies beim oxidative burst. Bei Infektionen von Mais mit der pep1-Deletionsmutante ist die sekretierte Peroxidase-12 (POX12) transkriptionell induziert. Durch Bimolekulare Fluoreszenzkompementatiion und Hefe-2-Hybrid-Experimente konnte eine direkte Interaktion von Pep1 mit POX12 nachgewiesen werden. Durch virusinduziertes Gen-Silencing von pox12 in Mais konnte eine partielle Rettung des ∆ pep1-Phänotyps erreicht werden. Das Silencing von pox12 bewirkte verminderte Abwehrreaktionen der Wirtspflanze wie z. B. Papillenbildungen an Penetrationsstellen, so dass die Hyphen der pep1-Deletionsmutante in der Folge die Epidermiszellen penetrieren konnten.

Darüber hinaus konnten Orthologe von pep1 in weiteren Brandpilzspezies identifiziert werden. Es wurde in vitro gezeigt, dass die Pep1-Orthologe aus Ustilago avenae, Ustilago nuda und Melanopsichium pennsylvanicum ebenfalls als Peroxidaseinhibitoren agieren. Weiterhin wurde die Inhibition apoplastischer Peroxidasen aus verschiedenen Wirtspflanzen durch Pep1 nachgewiesen. Schließlich wurde die Funktion der identifizierten Pep1-Orthologe in Infektionen von Mais mit U. maydis bestätigt.

Diese Ergebnisse sprechen für eine Rolle von Pep1 als Inhibitor von Peroxidasen, einer zentralen Komponente der basalen pflanzlichen Abwehrreaktion.

Summary

For establishment of the biotrophic interaction with its host plant maize, the corn smut fungus Ustilago maydis depends on a variety of secreted effector proteins. A deletion of um01987, the gene encoding for the secreted effector Pep1 (protein essential during penetration 1), leads to a complete loss of pathogenicity. Penetration attempts of the deletion mutant elicit strong plant defense responses such as the accumulation of reactive oxygen species (ROS), papilla formation and necrotic lesions. Pep1 localizes in the biotrophic interface and is conserved within different smut fungi. This study focuses on the functional characterization of Pep1 with biochemical and molecular biological methods. It was demonstrated that heterologously expressed Pep1 protein from Escherichia coli inhibits the oxidative burst in maize. Treatment of maize plants with the ROS scavenger ascorbate led to reduced defense responses in reaction to ∆ pep1 infections. In addition, Pep1 was shown to inhibit activity of a class III peroxidase from horseradish in vitro. Class III peroxidases play a pivotal role in ROS production during the oxidative burst. In maize plants, inoculated with the pep1 deletion mutant, the secreted peroxidase 12 (POX12) is transcriptionally induced. Bimolecular fluorescence complementation and yeast-2-hybrid experiments revealed a direct interaction of Pep1 with POX12. Virus induced gene silencing of pox12 in maize partially restored the ∆pep1 phenotype. Silencing of pox12 led to reduced plant defense responses, such as papilla formation at penetration sites. As a consequence, hyphae of the pep1 mutant penetrated epidermal cells of pox12 silencing plants.

Furthermore, orthologs of pep1 in additional smut species were identified. In vitro studies showed peroxidase inhibition by Pep1 orthologs from Ustilago avenae, Ustilago nuda and Melanopsichium pennsylvanicum. Additionally, inhibition of apoplastic peroxidases from different host plants by Pep1 was demonstrated. Maize infection studies with U. maydis confirmed the biological function of the identified pep1 orthologs.

In summary, these results suggest a role of Pep1 as inhibitor of peroxidases, a core component of the basal plant defense response.

Abkürzungen und Fachbegriffe

BMV Brome mosaic virus

bp Basenpaare

BSA bovine serum albumin

bzw. beziehungsweise Cam Chloramphenicol Cbx Carboxin

cDNA complementary DNA

CC9 Mais Cystatin 9 (corn Cystatin

9)

CFP cyan fluorescent protein

C-terminal carboxyterminal ∆ Deletion Da Dalton

DAB Diaminobenzidin

DAMP damage-associated molecular pattern

dpi days post infection

DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DPI diphenylene iodonium chloride

dpi Tage nach Infektion (days post

infection)

DTT Dithiothreitol

eBIFC enhanced bimolecular fluorescence complemetation

ETI effector triggered immunity

ETS effector triggered susceptibility

f.c. Endkonzentration (final

concentration)

fw forward

gDNA genomische DNA GFP green fluorescent protein

h Stunde/Stunden

H20bid zweifach destilliertes Wasser

HA Hemagglutinin hpi hours post infection

HRP horseradish peroxidase

Hyg Hygromycin

ip iron-sulphur protein

JA Jasmonsäure (jasmonic acid) Kan Kanamycin Kap. Kapitel kb Kilobasen kDa Kilodalton M molar (mol/l) m Meter

MAMP microbe associated molecular

pattern

MAPK mitogenaktivierte Proteinkinase mM milimolar (mmol/l)

min Minute(n) mRNA messenger RNA

NADPH Nicotinamidadenin-dinukleotidphosphat nm Nanometer

N-terminal aminoterminal

OD600 optische Dichte gemessen bei

600 nm

PAMP pathogen-associated molecular pattern

PCR Polymerasekettenreaktion

polymerase chain reaction

PD potato dextrose

PEG Polyethylenglycol Pep1 protein essential during

penetration 1

Pep1IA Pep1 inaktiviert

Phleo Phleomycin

Pit proteins important for tumor formation

POX Peroxidase

PR pathogenesis related

PRR pattern recognition receptor

PTI PAMP triggered immunity qPCR quantitative

Polymerase-kettenreaktion

qRT-PCR quantitative real-time Poly-merasekettenreaktion

R resistence

RFP red fluorescent protein

RFU relative fluorescence units

RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA-Interferenz

ROS reactive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) RT Raumtemperatur

RU relative units (Aktivität)

rv reverse

s Sekunde(n) SA Salizylsäure

(salicylic acid)

SDS sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel

electrophoresis

SHAM salicyl hydroxamic acid

siRNA short interfering RNAs

Tab. Tabelle TEM

Transmissions-elektronenmikroskop Tet Tetracyclin

Tris Trishydroxymethylaminomethan u unit (enzymat. Aktivität)

UV Ultraviolett

U/min Umdrehungen pro Minute vgl. vergleiche

VIGS virusinduziertes Gen-silencing wt Wildtyp

YFP yellow fluorescent protein

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung ... I

Summary ... II

Abkürzungen und Fachbegriffe ... III

Inhaltsverzeichnis ... IV

1. Einleitung ... 1

1.1. Das pflanzliche Immunsystem ... 1

1.1.1. Die Rolle des oxidative burst in der pflanzlichen Abwehrreaktion ... 4

1.1.2. Die Bedeutung von Peroxidasen für den oxidative burst ... 5

1.2. Sekretierte Effektoren interferieren mit dem pflanzlichen Immunsystem ... 9

1.2.1. Spezifität und Konservierung von Effektorproteinen ... 11

1.3. Brandpilze und Ustilago maydis als Modellsystem ... 12

1.3.1. Der Maisbeulenbrand U. maydis ... 12

1.3.2. Der Lebenszyklus von U. maydis ... 14

1.3.3. Sekretierte Effektoren von U. maydis ... 17

1.4. Zielsetzung dieser Arbeit ... 19

2. Ergebnisse ... 20

2.1. Funktionelle Charakterisierung des sekretierten Effektors Pep1 aus Ustilago maydis... 20

2.1.1. Bestätigung der Lokalisierung von Pep1 ... 20

2.1.2. Mikroskopische Charakterisierung der pflanzlichen Abwehrreaktion ... 21

2.1.3. Pep1 inhibiert den PAMP-ausgelösten „oxidative burst“ ... 27

2.1.4. Pep1 inhibiert eine pflanzliche Peroxidase ... 29

2.1.5. Pep1 interagiert mit POX12 in vivo ... 31

2.1.6. Silencing von POX12 in Mais führt zur partiellen Wiederherstellung der Virulenz der pep1-Deletionsmutante ... 35

2.2.1. Pep1 aus U. maydis hat eine Funktion im Pathosystem U. hordei /

Hordeum vulgare ... 37

2.2.2. Pep1-Orthologe liegen in Ustilago-Arten und den Gattungen Melanopsichium und Exobasidium vor ... 39

2.2.3. Verschiedene Pep1-Orthologe agieren als Peroxidaseinhibitoren ... 40

2.2.4. Pep1 aus U. maydis inhibiert Peroxidaseaktivität in den Wirtspflanzen anderer Brandpilze ... 41

2.2.5. Pep1 aus verschiedenen Brandpilzspezies kann die Virulenz der pep1-Deletionsmutante in Mais wiederherstellen ... 42

3. Diskussion ... 45

3.1. Pep1 ist ein apoplastischer Effektor ... 45

3.1.1. Pep1 lokalisiert im Apoplasten ... 45

3.1.2. Pep1 unterdrückt die pflanzliche Abwehrreaktion ... 46

3.1.3. Pep1 inhibiert den apoplastischen oxidative burst ... 48

3.2. Pep1 ist ein Peroxidaseinhibitor ... 49

3.2.1. Pep1 inhibiert pflanzliche Peroxidaseaktivität ... 49

3.2.2. Pep1 bindet an die Peroxidase POX12 aus Mais ... 50

3.2.3. Die Peroxidase-Inhibition durch Pep1 ist essentiell für die Etablierung der biotrophen Interaktion ... 51

3.2.4. Modell zur Funktion von Pep1 in der biotrophen Interaktion ... 52

3.3. Pep1 ist innerhalb der Brandpilze konserviert ... 55

3.3.1. Pep1-Orthologe sind in verschiedenen Arten konserviert ... 55

3.4. Ausblick ... 58

4. Material und Methoden ... 60

4.1. Material und Bezugsquellen ... 60

4.1.1. Chemikalien ... 60

4.1.2. Puffer und Lösungen ... 60

4.1.3. Enzyme und Antikörper ... 60

4.1.4. Verwendete Kits ... 61

4.2.1. Kultivierung von E. coli ... 61

4.2.2. Kultivierung von A. tumefaciens ... 62

4.2.3. Kultivierung von U. maydis ... 62

4.2.4. Bestimmung der Zelldichte von Bakterien- und Pilzkulturen ... 63

4.3. Verwendete Stämme, Oligonukleotide und Plasmide ... 63

4.3.1. E. coli – Stämme ... 63 4.3.2. A. tumefaciens – Stämme ... 64 4.3.3. U. maydis - Stämme ... 64 4.3.4. U. hordei - Stämme ... 66 4.3.5. S. cerevisiae - Stämme ... 66 4.3.6. Oligonukleotide ... 66 4.3.7. Plasmide ... 70 4.4. Mikrobiologische Standardmethoden ... 76

4.4.1. Rubidiumchlorid-vermittelte Transformation von E. coli ... 76

4.4.2. Transformation von A. tumefaciens durch Elektroporation ... 77

4.4.3. Transformation von U. maydis ... 77

4.4.4. Transformation von S. cerevisiae ... 79

4.4.5. Blau-Weiß-Selektion von E. coli-Transformanden ... 79

4.5. Molekularbiologische Methoden ... 79

4.5.1. In vitro Modifikation von Nukleinsäuren ... 79

4.5.2. Isolierung von Nukleinsäuren ... 83

4.5.3. Southern Blot ... 84

4.6. Biochemische Methoden ... 86

4.6.1. Heterologe Expression von Proteinen in E. coli ... 86

4.6.2. Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatografie (IMAC) ... 87

4.6.3. Auftrennung von Proteinen ... 88

4.6.4. Coomassie-Proteinfärbung ... 89

4.6.5. Proteinbestimmung nach Bradford ... 90

4.6.7. Nachweis von Wasserstoffperoxid durch Xylenolorange-Färbung ... 90

4.6.8. Messung der Peroxidaseaktivität ... 91

4.6.9. Analyse von Proteininteraktionen mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System ... 92

4.7. Mikroskopie ... 92 4.7.1. Konfokale Mikroskopie ... 92 4.7.2. Transmissionselektronenmikroskopie ... 94 4.8. Pflanzenmethoden ... 94 4.8.1. Virusinduziertes Gen-Silencing ... 94 4.8.2. Zea mays ... 96 4.8.3. Tabak ... 98

4.8.4. Präparation von apoplastischer Flüssigkeit aus Pflanzenblättern ... 99

4.9. Bioinformatische Analysen ... 99

5. Literaturverzeichnis... 100

1. Einleitung

1.1 Das pflanzliche Immunsystem

Das pflanzliche Immunsystem hat die Aufgabe, Pathogene zu erkennen und deren Eindringen zu verhindern. Die Abwehrstrategie kann dabei in zwei grundlegend verschiedene Klassen eingeteilt werden: die präformierte und die induzierte Abwehr. Unter präformierter Abwehr versteht man physische Barrieren wie die mechanisch stabile Zellwand oder die Cuticula, die nicht nur das Eindringen von mikrobiellen Pathogenen erschweren, sondern auch einen Schutz gegen Austrocknung und abiotischen Stress darstellen, sowie chemische Barrieren wie sekretierte Metabolite. Die induzierte Abwehr hingegen basiert auf der Erkennung bestimmter nichtpflanzlicher Muster, sogenannter pathogen associated molecular patterns (PAMPs) bzw. microbe associated molecular patterns (MAMPs), wie z. B. das bakterielle Flagellin oder das pilzliche Chitin. Die Erkennung dieser Muster erfolgt durch spezifische Rezeptoren, die pattern recogniton receptors (PRRs) (Boller, 1995; Felix et al., 1993; Gomez-Gomez und Boller, 2000; Iriti und Faoro, 2009; Zhang und Zhou, 2010; Zipfel et al., 2006). PRRs sind hochkonserviert und bestehen aus einer extrazellulären leucin rich repeat - Domäne und einer intrazellulären Kinasedomäne. Die Detektion von PAMPS durch PRRs führt zur Aktivierung abwehrspezifischer Signalwege in der Pflanzenzelle, die primäre Abwehrreaktionen wie z. B. die Anreicherung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) (vgl. Kap. 1.1.1), die Verstärkung der Zellwände durch Calloseauflagerungen (Papillen) und Lignifizierungen (Bhuiyan et al., 2009; Ros Barceló, 1997), die Akkumulation des Phytohormons Salizylsäure (salicylic acid, SA) (Bennett und Wallsgrove, 1994; Enyedi et al., 1992; Vlot et al., 2009) und die Aktivierung von pathogenesis related (PR)-Proteinen wie Chitinasen oder Proteasen (Sels et al., 2008; Shewry und Lucas, 1997; van Loon et al., 2006) auslösen und ein Vordringen des Pathogens verhindern sollen. Man spricht hierbei von PAMP-vermittelter Immunität (PAMP triggered immunity, PTI) (Jones und Dangl, 2006). Neben der Immunreaktion auf PAMPs als exogene Elicitoren können auch endogene Elicitoren eine Abwehrreaktion in der Pflanze auslösen. Diese pflanzeneigenen Moleküle, die sogenannten damage associated molecular patterns (DAMPs) werden durch Verletzung des pflanzlichen

Gewebes, zum Beispiel durch Fressfeinde oder eben das Eindringen eines mikrobiellen Pathogens aus der Pflanzenzelle freigesetzt und durch PRRs detektiert (Boller und Felix, 2009; Lotze et al., 2007; Rubartelli und Lotze, 2007). Bei solchen Formen der Abwehrreaktion handelt es sich um eine Immunantwort, die nicht spezifisch für das eindringende Pathogen ist, sondern nur auf der Erkennung molekularer Muster beruht, die mit einem Pathogenbefall assoziiert werden. Um dieser frühen Immunantwort zu entgehen, sekretieren adaptierte Pathogene sogenannte Effektorproteine, die mit der Immunantwort interferieren und so eine Besiedelung der Wirtspflanze ermöglichen (De Wit et al., 2009; Stergiopoulos und de Wit, 2009) (siehe auch Kap. 1.2). Man spricht hierbei von Effektor-vermittelter Suszeptibilität (effector triggered susceptibility, ETS). Generell lässt sich festhalten, dass jedes erfolgreiche biotrophe Pathogen die PAMP-induzierte Abwehrreaktion inhibieren muss, um eine Besiedelung des Wirtes zu erreichen (Nomura et al., 2005). Pflanzen wiederum unterliegen einem Selektionsdruck, der die Hervorbringung von Abwehrstrategien begünstigt, die einen Befall durch Pathogene verhindern. Demnach haben sich in den Pflanzen Resistenzmechanismen ausgebildet, die die erste Welle von sekretierten Effektoren der Pathogene erkennen und so Effektor-induzierte Immunität (effector triggered immunity, ETI) auslösen. In einem evolutionären „Wettrüsten“ (arms race) kam es so zu einer diversifizierenden Koevolution zwischen Wirt und Pathogen, wobei sich jeweils neue Abwehr- und Infektionsstrategien entwickelten, um einen Selektionsvorteil zu erlangen (Birch et al., 2006; Pieterse et al., 2009) (Abb. 1). Dieses Phänomen wurde von Jones und Dangl im sog. zig-zag-zig-Modell dargestellt, in dem die Intensität der pflanzlichen Abwehrreaktion der Sekretion von Effektorproteinen gegenübergestellt wird (Jones und Dangl, 2006).

Anhand ihrer Ernährungsweise werden Pflanzenpathogene in drei Gruppen eingeordnet: Biotrophe, Hemibiotrophe und Nekrotrophe. Während Nekrotrophe das befallene Pflanzengewebe abtöten und in der Folge als Nährstoffquelle nutzen, besiedeln hemibiotrophe Pathogene zunächst das lebende Wirtsgewebe und töten dieses erst nach einiger Zeit (van Kan, 2006). Biotrophe Pathogene hingegen befallen ausschließlich lebendes Gewebe und ernähren sich von den Stoffwechselprodukten des Wirtes (Glazebrook, 2005). Sie sind somit von der Konstitution der Wirtspflanze abhängig. Diese Lebensweise macht es erforderlich, dass Biotrophe aktiv in den Stoffwechsel und das Immunsystem des Wirtes eingreifen, um die Nährstoffverteilung umzuleiten und die pflanzliche Abwehr, insbesondere programmierten Zelltod, zu unterdrücken. Hierbei spielen ebenfalls sekretierte Effektorproteine eine zentrale Rolle.

Abbildung 1: Modell der Funktion des pflanzlichen Immunsystems

A: Beim Eindringen eines Pathogens erkennt die Pflanze PAMPs durch PRRs. Dies löst eine

Signalkaskade aus, die eine PAMP-induzierte Immunantwort (PTI) zur Folge hat. B: Ein angepasstes Pathogen sekretiert Effektorproteine, die mit der PTI interferieren, die Immunreaktion unterdrücken und so Suszeptibilität herstellen (ETS). C: Resistente Pflanzen haben R-Proteine ausgebildet, die spezifisch Effektoren erkennen und eine Immunantwort auslösen (ETI). Abbildung modifiziert nach Pieterse et al. (2009).

Im Rahmen der ETI sind resistente Pflanzen in der Lage, Effektorproteine durch spezifische resistance (R)-Proteine zu erkennen und so eine Immunreaktion auszulösen. R-Proteine verfügen über eine Nukleotid-Bindestelle und eine leucine rich repeat – Domäne (Meyers et al., 2003; Takken et al., 2006). Die Resistenzvermittlung durch R-Proteine, also die Erkennung eines sog. Avirulenzproteins (Avr) durch einen spezifischen Rezeptor, wird als gene-for-gene-Interaktion bezeichnet (Flor, 1971; Keen, 1990). In beiden Formen der induzierten Resistenzvermittlung, PAMP-induzierte- und Effektor-induzierte Immunität (effector triggered immunity, ETI), spielen die Phytohormone SA und Jasmonsäure (jasmonic acid, JA) jeweils eine wichtige Rolle (Dong, 1998). Diese beiden Phytohormone induzieren verschiedene Abwehrmechanismen, die auf unterschiedlichen PR-Genen basieren und verhalten sich dabei antagonistisch zueinander (Kunkel und Brooks, 2002; Takahashi et al., 2004). Vereinfacht kann man sagen, dass SA bei einem Befall durch biotrophe Pathogene ausgeschüttet wird und JA als Reaktion auf nekrotrophe Pathogene sowie Fressfeinde (Glazebrook, 2005). Eine JA-vermittelte Abwehrreaktion führt zur vermehrten Sekretion von Sekundärmetaboliten wie z. B.

Flavenoiden und Terpenen, die toxisch auf eindringende Pathogene wirken (Gundlach et al., 1992; Memelink et al., 2001). Die Akkumulation von SA beim Eindringen eines Pathogens führt hingegen zur Induktion eines Abwehrmechanismus, der auf der Anreicherung von ROS in der Zelle basiert (Shirasu et al., 1997) und schließlich zur Induktion einer hypersensitiven Antwort (hypersensitive response, HR) führen kann (Morel und Dangl, 1997). Hierbei handelt es sich um eine Form des programmierten Zelltods (programmed cell death, PCD), die darauf ausgerichtet ist, die befallenen Pflanzenzellen mitsamt des eindringenden Pathogens abzutöten. Die rasche Anreicherung von ROS im Rahmen einer Pathogenabwehr wird oxidative burst genannt (Bolwell et al., 2002; Lamb und Dixon, 1997). Die gebildeten ROS können direkt mit DNA und Proteinen reagieren, Seneszenz beschleunigen und programmierten Zelltod auslösen (Sharma und Davis, 1997). Darüber hinaus tragen sie ihrerseits zur weiteren Synthese von SA bei und verstärken so die Immunreaktion (Glazebrook, 2005).

1.1.1 Die Rolle des oxidative burst in der pflanzlichen Abwehrreaktion

Die Anreicherung von reaktiven Sauerstoffspezies ist eine zentrale Komponente der frühen pflanzlichen Immunantwort. Einerseits können ROS direkt toxisch auf eindringende Pathogene wirken, da sie oxidative Eigenschaften besitzen und so Peptide und Nukleinsäuren des Pathogens schädigen können (Apel und Hirt, 2004; Kohen und Nyska, 2002; Mehdy, 1994). ROS sind überdies auch an der mechanischen Stabilisierung des Zellwandmaterials bei der Bildung von Papillen beteiligt (Bhuiyan et al., 2009; Hückelhoven, 2007; Ros Barceló, 1997). So stellt Wasserstoffperoxid (H2O2) ein

Oxidationsmittel für die peroxidasevermittelte Ligninsynthese dar, bei der Monolignole zu Radikalen umgesetzt werden, bevor sie ein Ligninpolymer bilden können (Davin und Lewis, 2005; Freudenberg, 1959). Weiterhin sind ROS aber auch an der Signalweiterleitung beteiligt und können als Signalmoleküle im Rahmen der SA-vermittelten Abwehr agieren (D'Autreaux und Toledano, 2007). Hierbei besteht eine positive Rückkopplung zwischen SA-Anreicherung und ROS-Produktion (Vlot et al., 2009).

Der oxidative burst kann in zwei Phasen eingeteilt werden. Beide Phasen sind durch einen schnellen Anstieg der ROS-Produktion gekennzeichnet, wobei die erste Phase innerhalb weniger Minuten nach PAMP-Erkennung startet und meist für 60 bis 180 min anhält (Lamb und Dixon, 1997). Hierbei werden zu Beginn bereits vorhandene apoplastische Enzyme genutzt und gleichzeitig die Produktion weiterer ROS-synthetisierender Enzyme induziert (Daudi et al., 2012; Mehdy, 1994). Die zweite Phase

des oxidative burst beginnt meist 3 – 4 h nach Pathogenbefall, wenn es dem Pathogen nicht gelingt, eine kompatible Interaktion zu etablieren (Lamb und Dixon, 1997). Sie ist durch eine länger anhaltende ROS-Produktion gekennzeichnet, wobei die Menge der akkumulierten ROS stark zunimmt (Baker und Orlandi, 1995). In der Folge führt diese Reaktion zur Aktivierung einer HR und zum programmierten Zelltod im infizierten Pflanzengewebe (Torres et al., 2006).

1.1.2 Die Bedeutung von Peroxidasen für den oxidative burst

Während des oxidative burst werden ROS, insbesondere Wasserstoffperoxid (H2O2),

schnell in hohen Konzentrationen angereichert. Dies geschieht durch enzymatische Aktivität zweier verschiedener Enzymklassen: NADPH-Oxidasen und Klasse-III-Häm-Peroxidasen (Bolwell et al., 1995; O'Brien et al., 2012). Membranständige NADPH-Oxidasen setzen molekularen Sauerstoff durch Reduktion eines Elektrons zu Superoxid um, das sehr instabil ist und eine kurze Halbwertszeit von < 1 s besitzt (Sawyer et al., 1978). Bei Anwesenheit von Wasser kommt es zur Dismutation zum stabileren H2O2,

Hydroxid (OH-) und molekularem Sauerstoff (O2), die durch die Superoxid-Dismutase

vermittelt wird (Sagi und Fluhr, 2001; Sutherland, 1991; Taylor et al., 1993). Peroxidasen umfassen drei Klassen, von denen nur die Klassen I (intrazelluläre Peroxidasen) und III (sekretierte Peroxidasen) in Pflanzen vorkommen, während die Klasse II nur durch Pilze sekretiert wird (Vlasits et al., 2010; Zamocky et al., 2009, 2010). Klasse-III-Häm-Peroxidasen besitzen ein Häm als prosthetische Gruppe und können zwei katalytische Wege durchlaufen, den hydoxylischen oder Oxidase-Zyklus und den peroxidativen bzw. Peroxidase-Zyklus (O'Brien et al., 2012; Passardi et al., 2005). Im peroxidativen Zyklus setzen sie H2O2 durch Dismutation zu Wasser und molekularem Sauerstoff um und

agieren so als ROS-abbauende Enzyme (Zamocky et al., 2012), während im hydroxylischen Zyklus H2O2 bei verhältnismäßig hohem pH und unter Anwesenheit eines

starken Reduktionsmittels direkt aus Eisen-Superoxid gebildet werden kann (Berglund et al., 2002; Bolwell et al., 1999; Bolwell et al., 1995; Pichorner et al., 1992) (Abb. 2).

Abbildung 2: Der Oxidase/Peroxidase-Zyklus von Klasse-III-Peroxidasen

Abbau (Peroxidasezyklus) und Produktion (Oxidasezyklus) von H2O2 durch

Klasse-III-Peroxidasen. Peroxidasezyklus: Im Grundzustand können Peroxidasen H2O2 durch Übertragen

eines Sauerstoffatoms auf die Häm-Gruppe der Peroxidase abbauen, es entstehen Wasser und Verbindung I (Fe(IV)). Für die Rückkehr zum Grundzustand ist die Reaktion mit einem Reduktionsmittel (Substrat) erforderlich – es wird zunächst Verbindung II gebildet und der Grundzustand nach einer weiteren Reaktion mit einem Reduktionsmittel erreicht. Oxidasezyklus: Bei Anwesenheit eines starken Reduktionsmittels kann die Peroxidase aus dem Grundzustand zum Ferro-Enzym (Fe(II)) reduziert werden, das nach der Reaktion mit Sauerstoff Verbindung III bildet. Durch Reaktion von Verbindung III mit einem Reduktionsmittel wird dann die Bildung von H2O2 katalysiert und die Peroxidase geht wieder in den Grundzustand über. Verbindung III kann

auch bei hoher Konzentration von H2O2 unter Abgabe von Wasser direkt aus Verbindung II

hervorgehen. Abbildung modifiziert nach O’Brien et al. (2012) und Passardi et al. (2005).

In Abhängigkeit von der Art des Pathogenbefalls, dem untersuchten Gewebe und dem Entwicklungsstand des einzelnen pflanzlichen Individuums ist die Produktion von H2O2 im

oxidative burst entweder auf NADPH-Oxidasen oder auf Peroxidasen zurückzuführen (Bindschedler et al., 2006; Torres et al., 2002; Torres et al., 2006). In einigen Beispielen wurde die konzertierte Aktivität beider Enzymklassen als notwendig für die Katalyse des oxidative burst beschrieben (Ranieri et al., 2003; Tang und Smith, 2001).

Die Rolle der Peroxidasen in der Pathogenabwehr wurde in verschiedenen Pathosystemen untersucht. In Baumwollpflanzen wurde die Anreicherung von ROS durch apoplastische Peroxidasen nach Befall mit Xanthomonas campestris dokumentiert (Delannoy et al., 2003; Martinez et al., 1998). Auch in Reis ist eine sekretierte Peroxidase an der Abwehr von Xanthomonas-Infektionen beteiligt (Hilaire et al., 2001). In Gartensalat (Lactuca sativa) konnte eine gesteigerte Peroxidaseaktivität im Rahmen lokaler Peroxidanreicherung bei einer Nichtwirts-Immunreaktion nachgewiesen werden (Bestwick et al., 1998) und in der grünen Bohne Phaseolus vulgaris ist ebenfalls eine Peroxidase für den apoplastischen oxidative burst verantwortlich (Blee et al., 2001). Darüber hinaus konnte in Arabidopsis thaliana durch Silencing der Peroxidase FBP1 eine Reduktion des oxidative burst und eine erhöhte Suszeptibilität gegen mikrobielle Pathogene erreicht werden (Bindschedler et al., 2006). Umgekehrt führt die Überexpression einer Peroxidase in A. thaliana zu erhöhter Pathogenresistenz (Choi et al., 2007). Es darf also als gesichert gelten, dass sekretierten Peroxidasen eine Schlüsselrolle in der Vermittlung apoplastischer Immunität zukommt. Eine schematische Darstellung des Zusammenspiels von NADPH-Oxidasen und Peroxidasen während des oxidative burst und der Rolle von ROS in der pflanzlichen Pathogenabwehr zeigt Abbildung 3.

Abbildung 3: Quellen für ROS und deren Rolle in der Pathogenabwehr

1: Bei Erkennung eines Pathogens durch einen PRR wird eine Signalkaskade ausgelöst. 2: Dies

führt zur Aufnahme von Ca2+ und Freisetzung von Cl- und K+ durch die Zelle. Hierdurch steigt der extrazelluläre pH vorübergehend an. 3: Die Aktivierung der Signalkaskaden und die gestiegene Ca2+-Konzentration im Cytosol induzieren die ROS-Produktion durch NADPH-Oxidasen und Peroxidasen. Dies führt zur apoplastischen Peroxidanreicherung (4). 5: ROS diffundieren ins Cytosol und induzieren dort verschiedene Abwehrreaktionen. Darüber hinaus wirken sie direkt in der Zellwandverstärkung. ROS: reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species), R pattern recognition receptor (PRR), Gp G-coupled protein, MAPK: mitogenaktivierte Proteinkinase, CDPK: Calcium-abhängige Proteinkinase (calcium-dependent protein kinase), RBOH: NADPH-Oxidase (respiratory burst oxidase homologue), POX: Klasse-III-Peroxidase, -RH: Reduktionsmittel, TF: Transkriptionsfaktor. Abbildung modifiziert nach O’Brien et al. (2012).

1.2 Sekretierte Effektoren interferieren mit dem pflanzlichen

Immunsystem

Im Laufe der Evolution haben Pathogene Strategien entwickelt, um die Abwehrmechanismen der Wirtspflanzen außer Kraft zu setzen. So bilden phytopathogene Pilze Appressorien aus, Infektionsstrukturen, die die mechanische Barriere aus Cuticula und Zellwand überwinden, indem sie teils lytische Enzyme sekretieren und mechanischen Druck aufbauen, um die Zellwand zu durchbrechen (Deising et al., 2000). Die induzierte Abwehr kann anschließend durch sekretierte Effektorproteine überwunden werden (De Wit et al., 2009; Stergiopoulos und de Wit, 2009).

Bakterielle Pathogene beispielsweise injizieren Effektorproteine über ein Typ-III-Sekretionssystem in ihre Wirtszellen. Dort können die Effektoren z. B. Transkriptonslevels verändern (Thilmony et al., 2006; Truman et al., 2006), den intrazellulären Vesikeltransport inhibieren (DebRoy et al., 2004; Nomura et al., 2006), die frühe Signaltransduktion im Rahmen von PTI verhindern, indem sie PRRs oder deren Signalweiterleitung inhibieren (Göhre und Robatzek, 2008; He et al., 2006; Xiang et al., 2008) oder programmierten Zelltod unterdrücken (Abramovitch et al., 2003; Fujikawa et al., 2006). Phytopathogene Nematoden sekretieren Effektoren entweder in den Apoplasten oder – ähnlich des bakteriellen Typ-III-Sekretionssystems – durch ein Stilett direkt ins Cytoplasma der Pflanze (Vanholme et al., 2004).

Nicht zuletzt nutzen auch filamentöse Pilze und Oomyceten Effektoren, die in den Apoplasten sekretiert werden und dort entweder direkt agieren oder ins pflanzliche Cytoplasma aufgenommen werden (Kamoun, 2006; Panstruga und Dodds, 2009). So interagiert der Effektor Avr3a des Oomyceten Phytophthora infestans mit der Ubiquitin-Ligase CMPG1 seiner Wirtspflanze Kartoffel, einem Bestandteil einer PCD-Abwehrreaktion. Avr3a stabilisiert CMPG1, inhibiert so dessen proteasomalen Abbau und verhindert auf diesem Wege das Absterben der Wirtszelle (Bos et al., 2010). Die Aufnahme des Effektors in die Pflanzenzelle wird dabei durch eine N-terminale RxLR (Arg – x – Leu – Arg) – Signalsequenz in Kombination mit einem zusätzlichen dEER (Asp – Glu – Glu – Arg) – Motiv vermittelt (Morgan und Kamoun, 2007; Whisson et al., 2007). Das RxLR-Motiv wurde überdies in weiteren Oomyceten-Effektoren gefunden und als genereller Translokationsfaktor für Effektorproteine diskutiert (Dou et al., 2008; Kale et

al., 2010; Schornack et al., 2010). Sekretierte Effektoren können innerhalb der Pflanzenzelle auch in spezifischen Kompartimenten lokalisieren. So besitzt der Effektor SNE1 aus P. infestans beispielsweise eine Kernlokalisierungssequenz (nuclear localization sequence, NLS). Für SNE1 wurde eine Funktion als Zelltodinhibitor in Tabak- und Tomatenblättern gezeigt (Kelley et al., 2010). Ähnlich zu SNE1 verfügt auch der Effektor RTP1 aus dem Rostpilz Uromyces fabae über eine NLS. Für RTP1 konnte eine Translokation in den Kern der Pflanzenzellen nachgewiesen werden (Kemen et al., 2005). Der hemibiotrophe Ascomycet Magnaporthe oryzae, der Auslöser des Reisbrandes, bildet beim Eindringen der invasiven Hyphe einen sog. biotrophic interface complex (BIC) aus, in den der Pilz ein Set aus Effektoren sekretiert (Couch und Kohn, 2002; Khang et al., 2010). Für zwei dieser Effektoren, AvrPita1 und AvrPiz-t konnte eine Lokalisierung im pflanzlichen Cytoplasma und die Translokation in benachbarte Zellen nachgewiesen werden (Khang et al., 2010; Li et al., 2009). Während die Funktion von AvrPita1 bisher nicht aufgeklärt wurde, weiß man von AvrPiz-t, dass es BAX-induzierten programmierten Zelltod in Reis unterdrücken kann (Li et al., 2009).

Neben translozierten Effektoren wurden auch für pathogene Pilze apoplastische Effektoren beschrieben, die mit dem pflanzlichen Immunsystem interferieren. Der erste charakterisierte Effektor eines biotrophen Pilzes ist Avr9 aus Cladosporium fulvum, dem Erreger des Blattschimmels auf Tomatenpflanzen (Thomma et al., 2005). Während die molekulare Funktion von Avr9 noch nicht bekannt ist, weiß man aus Untersuchungen mit resistenten Tomatenlinien, dass ein Resistenzgen existiert, das für ein Protein kodiert, das Avr9 erkennen und eine HR auslösen kann (Van den Ackerveken et al., 1992). Demnach ist Avr9 gleichzeitig ein gutes Beispiel für eine Gen-für-Gen-Interaktion im Rahmen der pflanzlichen Abwehr. Aus der Interaktion von C. fulvum mit Tomate sind aber auch Effektoren bekannt, die die pflanzliche Abwehr inhibieren. So bindet der Effektor Avr2 an apoplastische Cysteinproteasen und inhibiert deren enzymatische Aktivität im Rahmen der frühen Immunantwort (van Esse et al., 2008). Apoplastische Effektoren können die pflanzliche Abwehr aber auch indirekt unterdrücken, indem sie die Erkennung durch PRRs verhindert. Pflanzen sekretieren neben anderen Enzymen auch Chitinasen, die die pilzliche Zellwand angreifen und auf diese Weise zur Freisetzung von Chitin-Oligomeren beitragen, die als PAMPs agieren und in der Folge eine pflanzliche Immunantwort auslösen oder verstärken können. Um dies zu unterbinden, sekretiert C. fulvum die Effektoren Avr4 und Ecp6. Avr4 verfügt über eine Chitin-Bindedomäne und bindet an das Chitin in der pilzlichen Zellwand; dadurch wird der Abbau durch Chitinasen verhindert (van den Burg et al., 2004). Analog dazu besitzt Ecp6 eine LysM-Domäne. LysM ist eine Chitin-Bindedomäne mit einer hohen Affinität für kurze Chitin-Oligomere und vermittelt die Bindung von Ecp6 an freigesetzte Chitin-Oligomere, die nun nicht mehr

von PRRs der Pflanze detektiert werden können (de Jonge und Thomma, 2009; de Jonge et al., 2010). So können Effektoren eine Erkennung durch das pflanzliche Immunsystem verhindern, ohne direkt mit dessen Komponenten zu agieren.

1.2.1 Spezifität und Konservierung von Effektorproteinen

Bedingt durch die Spezifität von Gen-für-Gen-Interaktionen und die Koevolution mit der jeweiligen Wirtspflanze sind sekretierte Effektoren und deren Interaktionspartner einem hohen diversifizierenden Selektionsdruck ausgesetzt (Hogenhout et al., 2009; Misas-Villamil und van der Hoorn, 2008). So wurde beispielsweise für Glucanasen aus Soja eine hohe diversifizierende Selektion nachgewiesen (Bishop et al., 2005) und auch der Glucanaseinhibitor GIP1 aus P. infestans unterliegt diversifizierender Selektion (Damasceno et al., 2008). Für pflanzliche Proteasen konnte gleichfalls eine Diversifizierung gezeigt werden: die Papain-ähnliche Cysteinprotease C14 aus der Kartoffel spielt eine wichtige Rolle in der Abwehr gegen das Pathogen P. infestans. P. infestans sekretiert zur Unterdrückung dieser und anderer Proteasen die Effektoren EPIC1 und EPIC2b (Kaschani et al., 2010; Tian et al., 2007). Der daraus resultierende Selektionsdruck auf C14 führt zu einer Diversifizierung von C14 (Kaschani et al., 2010). Ausgehend von diesen Beobachtungen nimmt man an, dass Effektorproteine und deren pflanzliche Interaktionspartner in einer bestimmten Form jeweils nur in einem bzw. wenigen nah verwandten Pathosystemen vorkommen.

Da verschiedene Pathogene, die die gleiche Wirtspflanze befallen, auch die gleichen Immunreaktionen überwinden müssen, kommt es jedoch auch vor, dass sich in verschiedenen Pathosystemen ähnliche Effektoren ausbilden, die die gleiche Funktion übernehmen: die Proteaseinhibitoren EPIC1 und EPIC2b aus dem Oomyceten P. infestans hemmen neben C14 auch die Protease Rcr3pim aus Tomate (Song et al., 2009). Der Ascomycet C. fulvum sekretiert den Proteaseinhibitor Avr2, der ebenfalls in der Lage ist, die Aktivität von Rcr3pim zu inhibieren (Rooney et al., 2005; Song et al., 2009). An diesem Beispiel zeigt sich, dass der Selektionsdruck auch zur Ausbildung analoger Strukturen in Pathogenen aus verschiedenen Klassen bzw. Reichen führen kann.

Da die Komponenten der basalen pflanzlichen Abwehr sich in allen Pflanzen zu einem gewissen Grad ähneln, besteht darüber hinaus die Möglichkeit konservierter universeller Infektionsmechanismen, die mit der gegebenen Abwehrreaktion interferieren. Ein Beispiel hierfür stellt das sekretierte Protein MC69 aus M. oryzae dar. MC69 lokalisiert im Apoplasten und vermittelt die Virulenz von M. oryzae auf der monokotylen Wirtspflanze

Reis (Saitoh et al., 2012). Interessanterweise existieren Homologe von MC69 in vielen weiteren Pilzen, darunter Colletotrichum arbiculare, Glomerella graminicola, Neurospora crassa und Fusarium oxysporum (Saitoh et al., 2012). C. orbiculare ist der Erreger von Anthraknose auf Gurke, einem dikotylen Pflanzenwirt. Auch C. orbiculare exprimiert MC69 bei der Infektion des Wirtsgewebes, und auch in dieser Interaktion ist die Funktion von MC69 essentiell für die pathogene Entwicklung (Saitoh et al., 2012). Das bedeutet, dass der Wirkmechanismus einiger Effektoren in verschiedenen Pathosystemen auch über die Grenze zwischen ein- und zweikeimblättrigen Pflanzen konserviert sein kann.

1.1. Brandpilze und Ustilago maydis als Modellsystem

Die Gruppe der Brandpilze (Ustilaginomycotina) aus der Abteilung der Basidiomyceten besteht aus 3 Klassen obligat biotropher Pathogene: den Ustilaginomycetes, den Exobasidiomycetes und den Enterrhizomyzetes (Begerow et al., 2006). Die Ordnung der Ustilaginales umfasst ca. 1100 Arten und ist damit die größte innerhalb der Brandpilze. Die meisten Brandpilze parasitieren Blütenpflanzen, darunter auch wirtschaftlich bedeutende Gräser wie Gerste (Ustilago nuda, Ustilago hordei), Hafer (Ustilago avenae), Mais (Ustilago maydis, Sporisorium reilianum), Weizen (Ustilago tritici) und Zuckerrohr (Sporisorium scitamineum), wo sie zur Ausbildung von melanisierten Teliosporen in den Fruchtständen der Pflanzen führen. Die dunkle Färbung der Sporen verleiht den Pflanzen ein verbranntes Aussehen, daher begründet sich der Name Brandpilze. Charakteristisch für Brandpilze ist, dass eine Infektion immer durch eine dikaryotische Hyphe erfolgt, die aus der Fusion zweier kompatibler haploider Zellen hervorgehen (Bakkeren et al., 2008). Nur dieses Dikaryon ist zur Infektion der Wirtspflanze in der Lage. Da Brandpilze meist die Fruchtstände von Nutzpflanzen zur Verbreitung ihrer Teliosporen umwandeln und somit weltweit zu beträchtlichen Ernteausfällen beitragen, besteht ein zunehmendes wirtschaftliches Interesse an der Aufklärung ihrer Infektionsmechanismen und der Erarbeitung möglicher Abwehrstrategien (Martinez-Espinoza et al., 2002).

1.3.1 Der Maisbeulenbrand U. maydis

Der bekannteste Vertreter der Brandpilze ist der Erreger des Maisbeulenbrands Ustilago maydis (Kahmann et al., 2000). U. maydis infiziert ausschließlich Maispflanzen (Zea mays) sowie deren Urform Teosinte (Zea mays ssp. mexicana) und induziert die

Bildung von Pflanzengallen, den sog. Tumoren, an allen überirdischen Teilen der Pflanze (Abb. 4). Die Teliosporen reifen in den Tumoren heran und werden durch Aufreißen der Tumore freigesetzt (Christensen, 1963). Dies stellt eine Besonderheit innerhalb der Ustilaginomycetes dar, die sonst ausschließlich die Blütenstände der Wirtspflanzen zur Sporenbildung nutzen.

U. maydis stellt heute ein wichtiges Modellsystem für genetische, cytologische und phytopathologische Fragestellungen dar (Banuett, 1995; Martinez-Espinoza et al., 2002; Steinberg und Perez-Martin, 2008). Dies hat mehrere Ursachen: einerseits hat U. maydis einen biphasischen Lebenszyklus mit einer haploiden, saprophytischen und einer dikaryotischen, obligat biotrophen Phase (Kahmann et al., 2000). In seinem saprophytischen Stadium (den sog. Sporidien) kann U. maydis leicht unter axenischen Bedingungen im Labor kultiviert werden. Dies hat dazu beigetragen, dass beispielsweise die homologe Rekombination von DNA an U. maydis als frühem genetischen Modellorganismus untersucht werden konnte (Holliday, 1961, 1964, 2004). Zudem erweist es sich als Vorteil, dass die pathogene Entwicklung von U. maydis unter Laborbedingungen innerhalb eines Monats von der Infektion bis zur Sporenreife und -keimung durchlaufen werden kann (Banuett, 1995). Dies ermöglicht es, phytopathologische Untersuchungen unter kontrollierten Bedingungen durchzuführen. Des weiteren wurden für U. maydis konstitutive und induzierbare Promotoren charakterisiert (Brachmann et al., 2001; Zarnack et al., 2006) und sowohl integrative als auch selbstreplizierende Plasmide beschrieben, die die genetische Manipulation der Sporidien ermöglichen (Tsukuda et al., 1988). So können u. a. Fluoreszenzmarker zur subzellulären Proteinlokalisierung in den Pilz eingeführt werden (Spellig et al., 1996). Nicht zuletzt führten die Entschlüsselung des 20,5 Mbp umfassenden Genoms (Kämper et al., 2006) und die Etablierung von Transkriptomanalysen durch DNA-Mikroarrays (Eichhorn et al., 2006) dazu, dass sich U. maydis auch als Modellsystem in der molekularen Phytopathologie etablieren konnte (Basse und Steinberg, 2004; Bölker, 2001; Brefort et al., 2009; Djamei und Kahmann, 2012; Kahmann et al., 2000).

Es soll an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, dass U. maydis nicht ausschließlich als Schädling angesehen wird. Vielmehr gelten die Ustilago-induzierten Pflanzentumore in Mittel- und Südamerika, vor allem in Mexiko, als schmackhafte Delikatesse namens Huitlacoche (Juarez-Montiel et al., 2011).

Abbildung 4: Tumorbildung auf Mais, induziert durch U. maydis

(linker Abbildungsteil aus Djamei und Kahmann (2012))

So kommt es, dass in dieser Region Maisfelder zur Huitlacoche-Produktion bewusst mit U. maydis infiziert werden und außerdem an der Verbesserung von Ertrag und Geschmack der Tumore geforscht wird (Pataky und Chandler, 2003; Valverde et al., 1995). Somit bestehen wirtschaftliche Interessen an U. maydis nicht nur an der Ertragsminderung der Maisernte durch Infektionen sondern auch an den Tumoren als Nahrungsmittel.

1.3.2 Der Lebenszyklus von U. maydis

Der biphasische Lebenszyklus von U. maydis ist gegliedert in eine saprophytische haploide und eine infektiöse dikaryotische Phase. In der haploiden Phase vermehren sich die Sporidien asexuell durch Knospung und können so schnell große Individuenzahlen erreichen – unter optimalen Bedingungen beträgt die Verdopplungszeit von Sporidien ca. 2 h. Erst wenn zwei kompatible Sporidien verschiedenen Paarungstyps auf einer geeigneten Pflanzenoberfläche aufeinandertreffen, beginnt der infektiöse Teil des Lebenszyklus (Abb. 5). Zunächst wird dabei die gegenseitige Erkennung der Paarungspartner durch ein Pheromon/Rezeptor-System vermittelt, das durch den biallelischen Paarungstyplokus a kodiert wird (Bölker et al., 1992; Gillissen et al., 1992; Rowell, 1955). Nach der Pheromonperzeption erfolgt die Ausbildung von Konjugationshyphen, die entlang des Pheromongradienten aufeinander zu wachsen und schließlich fusionieren (Snetselaar et al., 1996). Nach der Fusion erfolgt die Aktivierung des zweiten, multiallelischen Paarungstyplokus b. Dieser kodiert zwei verschiedene Homeodomänenproteine, bEast (bE) und bWest (bW), die nur dimerisieren, wenn sie von

verschiedenen Allelen kodiert werden und für die Filamentbildung essentiell sind (Brachmann et al., 2001). Das so entstehende Heterodimer agiert als Transkriptionsfaktor für ca. 350 pathogenitätsrelevante Gene (Bakkeren et al., 2008; Brachmann et al., 2001). Im Anschluss erfolgt ein Zellzyklusarrest, der erst nach erfolgreicher Infektion der Wirtspflanze wieder aufgehoben wird, d. h. eine Rückkehr zu saprophytischem Wachstum ist in dieser Phase des Lebenszyklus nicht mehr möglich. Das gebildete dikaryotische Filament wächst nun auf der Pflanzenoberfläche, wobei nur die Spitzenzelle mit Cytoplasma gefüllt ist und durch den regelmäßigen Einzug von Septen von leeren Hyphenabschnitten am distalen Ende abgetrennt wird (Banuett und Herskowitz, 1994). An einer geeigneten Stelle der Pflanzenoberfläche, die durch die Stimuli Hydrophobizität und den Gehalt bestimmter Fettsäuren determiniert wird (Mendoza-Mendoza et al., 2009), erfolgt die Bildung der Infektionsstruktur, des sog. Appressoriums (Snetselaar und Mims, 1992). Durch die Sekretion lytischer Enzyme wird die Zellwand der Pflanze abgebaut und mit einer invasiven Hyphe durchbrochen (Schirawski et al., 2005). Dabei bleibt die Plasmamembran der Pflanze intakt und umschließt die invaginierende Hyphe eng (Doehlemann et al., 2008b; Snetselaar und Mims, 1993). Auf diese Weise entsteht eine apoplastische biotrophe Interaktionszone zwischen Pilz und Pflanze, in der zahlreiche sekretierte Vesikel, aller Wahrscheinlichkeit nach pilzlichen Ursprungs, akkumulieren (Bauer et al., 1997). Als biotrophes Pathogen sekretiert U. maydis Effektoren in diese Interaktionszone, die die pflanzlichen Abwehrreaktionen unterdrücken und Genexpressionsmuster der Wirtspflanze modifizieren (Doehlemann et al., 2008a, b). Nach erfolgreicher Etablierung einer biotrophen Interaktion wird der Zellzyklusarrest aufgehoben und der Pilz beginnt mit der Kolonisierung von Epidermis, Mesophyll und vaskulärem Gewebe der Maispflanze (Banuett und Herskowitz, 1996). Nach drei bis vier Tagen kommt es zu einer massiven Proliferation der Hyphen im Apoplasten und bereits nach fünf Tagen können frühe Stadien der Tumorentwicklung auf der Pflanzenoberfläche beobachtet werden. Im Laufe der Tumorentwicklung kommt es zu einer umfassenden Umprogrammierung des pflanzlichen Metabolismus, so dass infizierte Bereiche zu sink-Gewebe werden, um dem Pilz die für die Proliferation benötigte Energie zur Verfügung zu stellen (Doehlemann et al., 2008a; Doehlemann et al., 2008b). Schließlich fragmentieren die Hyphen in den Tumoren, lagern Melanin in die Zellwand ein und werden so zu Teliosporen (Banuett und Herskowitz, 1996). Im Laufe dieser Entwicklung kommt es zur Karyogamie, so dass der Pilz in seiner Überdauerungsform eine diploide Kernphase aufweist. Nach ihrer Freisetzung können die Teliosporen durch biotische und abiotische Vektoren verbreitet werden und behalten ihre Keimfähigkeit über viele Jahre (Christensen, 1963). Unter geeigneten Bedingungen kommt es zur Auskeimung der Sporen. Nach einer Meiose

bildet sich eine Metabasidie, aus der jeweils vier Sporidien hervorgehen, die Basidiosporen entsprechen.

Abbildung 5: Der Lebenszyklus von U. maydis

Schematische Darstellung des diphasischen Lebenszyklus von U. maydis. Die saprobe Phase beginnt mit der Sporenreife, aus der die haploiden Sporidien hervorgehen, die sich durch hefeartige Knospung vermehren. Auf einer geeigneten Pflanzenoberfläche wird ein dikaryotisches Filament durch die Fusion zweier kompatibler Sporidien gebildet und die biotrophe Phase beginnt mit der Ausbildung eines Appressoriums, das die pflanzliche Epidermis penetriert. Es kommt zur Besiedelung des Pflanzengewebes im apoplastischen Raum und schließlich zur Proliferation der Hyphen. Dies geht mit der Induktion tumorartigen Wachstums des Pflanzengewebes einher. In den Tumoren werden durch Karyogamie und Fragmentierung der Hyphen diploide Teliosporen gebildet. Diese werden durch Aufreißen der Tumore freigesetzt und durch biotische und abiotische Vektoren verbreitet. Abbildung modifiziert nach Doehlemann et al. (2008b) und Kämper et al. (2006).

1.3.3 Sekretierte Effektoren von U. maydis

Zur Interaktion mit seiner Wirtspflanze nutzt U. maydis sekretierte Effektoren. Diese sind meist in Genclustern organisiert und nur während der Besiedelung der Wirtspflanze transkriptionell hochreguliert (Doehlemann et al., 2008a; Kämper et al., 2006).

Das Genom von U. maydis weist mehrere Gencluster auf, die für sekretierte Proteine kodieren (Kämper et al., 2006; Schirawski et al., 2010). In einer in-silico Analyse wurden 554 potentiell sekretierte U. maydis – Proteine identifiziert, von denen für 168 eine enzymatische Funktion zugeschrieben wurde, während für 386 Proteine keine Vorhersage getroffen werden konnte (Mueller et al., 2008). Nur für wenige dieser sekretierten Proteine wurde bisher eine Funktion beschrieben, allerdings befinden sich darunter auch Effektoren, die essentiell für die pathogene Entwicklung von U. maydis sind. So weiß man bereits, dass der Effektor Pit2 zusammen mit dem Transmembranprotein Pit1 eine Rolle in der Tumorbildung spielt (Doehlemann et al., 2011). Ein weiteres sekretiertes Protein von U. maydis, für das bereits eine Funktion beschrieben wurde, ist die sekretierte Chorismatmutase Cmu1, die von den Pflanzenzellen aufgenommen wird, durch Plasmodesmata von Zelle zu Zelle transferiert wird und diese durch metabolic priming für die Infektion empfänglich macht (Djamei et al., 2011). Dabei greift Cmu1 in den Shikimisäureweg (Knaggs, 2003) ein und katalysiert die Umwandlung von Chorismat zu Prephenat. Dies führt dazu, dass weniger Chorismat für die Synthese von SA zur Verfügung steht und inhibiert so die SA-abhängige Abwehr (Djamei et al., 2011). Bislang ist jedoch nur ein Effektor beschrieben, der als essentiell für die Besiedelung der Maispflanze durch U. maydis gilt: Pep1 (protein essential during penetration 1) (Doehlemann et al., 2009). Das pep1-Gen (um01987) ist nicht in einem Gencluster lokalisiert und wird spezifisch während der pathogenen Entwicklung von U. maydis, nicht aber in der saprophytischen Phase des Lebenszyklus exprimiert (Doehlemann et al., 2009). Deletionsmutanten von pep1 sind apathogen und nicht in der Lage, das Wirtsgewebe zu besiedeln (Abb. 6). Vielmehr lösen sie bei Penetrations-versuchen eine starke pflanzliche Immunantwort aus, die zu programmiertem Zelltod führen kann (Doehlemann et al., 2009). Infolgedessen ist ein makroskopischer Phänotyp von ∆pep1-Infektionen in Form nekreotischer Läsionen auf der Blattoberfläche sichtbar (Abb. 6 A).

Abbildung 6: Deletionsmutanten von pep1 sind apathogen

A: Tumorbildung auf Blättern von Maiskeimlingen, 12 dpi (days post infection). Der Kontrollstamm

SG200 induziert die Bildung von großen Tumoren, während die pep1-Deletionsmutante SG200∆pep1 pflanzliche Abwehrreaktionen in Form von Nekrosen (braune Blattbereiche) auslöst.

B: Konfokale Abbildung von U. maydis auf Maisblättern. Der Kontrollstamm SG200RFP (Rotkanal:

cytoplasmatisch exprimiertes RFP) wächst intrazellulär in Maisepidermiszellen und invaginiert die pflanzliche Plasmamembran (Grünkanal: GFP-Fusion des membranständigen Auxintransporters PIN1). Der pep1-Deletionsmutante gelingt keine Penetration der Epidermiszelle, die Infektion arretiert nach dem Durchbruch der Zellwand. Maßstabsbalken: 15 µm. Abbildungsteil B modifiziert nach Döhlemann et al. (2009).

In mikroskopischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass Pep1 in der biotrophen Interaktionszone lokalisiert und nicht von der Pflanzenzelle aufgenommen wird. Weiterhin konnte an den Penetrationsstellen die Akkumulation von ROS und die Ausbildung von Papillen beobachtet werden (Doehlemann et al., 2009). Im Vergleich zu Wildtypinfektionen induziert die pep1-Deletionsmutante nicht den JA-Signalweg, sondern es konnte die Aktivierung SA-abhängiger Abwehrreaktionen beobachtet werden. Dies ist typisch für eine inkompatible Interaktion (Doehlemann et al., 2009). Darüber hinaus ist die Funktion von Pep1 nicht auf das U. maydis / Mais – Pathosytem beschränkt: Auch der verwandte Gerstenhartbrand Ustilago hordei besitzt ein pep1-Ortholog und auch dieses codiert für einen sekretierten Effektor, der essentiell für die Virulenz des Pathogens ist (Doehlemann et al., 2009). Das deutet auf eine funktionelle Konservierung des Effektors Pep1 hin. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche Funktion Pep1 in der biotrophen Interaktion zukommt und inwieweit diese Funktion tatsächlich in anderen Pathosystemen konserviert ist.

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der biologischen Funktion des sekretierten Effektorproteins Pep1 aus Ustilago maydis. Zu Beginn der Arbeiten war bereits bekannt, dass die Deletion des für Pep1 codierenden Gens um01987 zu einem vollständigen Pathogenitätsverlust auf der Wirtspflanze Mais führt, jedoch waren keine Rückschlüsse auf die Funktion dieses Effektors anhand der Aminosäuresequenz möglich (Doehlemann et al., 2009). Durch mikroskopische Lokalisierungs- und Interaktionsstudien sowie funktionelle biochemische und molekularbiologische Untersuchungen sollten pflanzliche Interaktionspartner identifiziert und die Rolle von Pep1 in der biotrophen Interaktion aufgeklärt werden. Weiterhin lagen Hinweise auf eine funktionelle Konservierung von Pep1 in verwandten Pathosystemen vor. Es sollte daher untersucht werden, ob und inwieweit die Funktion von Pep1 in weiteren Pathosystemen konserviert ist.

2. Ergebnisse

2.1 Funktionelle Charakterisierung des sekretierten Effektors

Pep1 aus Ustilago maydis

In dieser Arbeit wurde das sekretierte Effektorprotein Pep1 aus Ustilago maydis mikroskopisch und biochemisch charakterisiert. Es war zuvor bereits beschrieben worden, dass Pep1 in die biotrophe Interaktionszone der Wirtspflanze sekretiert wird und dort verbleibt. Dies war konfokalmikroskopisch mittels eines C-terminal mCherry-markierten Pep1-Fusionsproteins sowie durch Immunolokalisation eines C-terminal HA-markierten Pep1-Fusionsproteins gezeigt worden (Doehlemann et al., 2009). Weiterhin war gezeigt worden, dass Deletionsmutanten von pep1 in U. maydis nicht in der Lage sind, Epidermiszellen von Mais erfolgreich zu kolonisieren, vielmehr führt ein Penetrationsversuch zu lokalen Abwehrreaktionen der Pflanze (Doehlemann et al., 2009).

2.1.1 Bestätigung der Lokalisierung von Pep1

Für die funktionelle Charakterisierung von Pep1 war es zunächst erforderlich, die apoplastische Lokalisierung von Pep1 zu bestätigen, um so Rückschlüsse auf potentielle Interaktionspartner ziehen zu können und eine fehlerhafte Lokalisierung durch Abspaltung der C-terminalen Markierungen im Rahmen posttranslationaler Modifikation auszuschließen. Hierzu wurde ein Konstrukt für ein N-terminal mCherry-markiertes Pep1-Fusionsprotein erzeugt und durch homologe Rekombination in den ip-Lokus von SG200∆pep1 integriert. Der resultierende Stamm SG200-mCherry:pep1 wurde in 7 Tage alte Maiskeimlinge des Kultivars (cultivar, cv) Early Golden Bantam infiziert und die Lokalisierung 48 hpi (hours post infection) konfokalmikroskopisch untersucht. Als Vergleich diente eine Infektion mit dem bekannten Stamm SG200pep1:gfpR (Doehlemann et al., 2009). In beiden Fällen akkumuliert das Fluoreszenzsignal in der Peripherie der intrazellulär wachsenden Hyphen, wobei die höchste Signalintensität nahe der Hyphenspitze beobachtet werden konnte (Abb. 7). An Zell/Zell-Übergängen wurde dabei eine Diffusion des Fluoreszenzsignals im apoplastischen Raum zwischen den

beiden penetrierten Zellen sichtbar (Abb. 7 B). So konnte die Lokalisierung von Pep1 in der biotrophen Interaktionszone und im Apoplasten infizierter Zellen bestätigt werden, d. h. die biotrophe Interaktionszone konnte für die funktionellen Untersuchungen als Wirkungsort von Pep1 angenommen werden.

Abbildung 7: Pep1 lokalisiert in der biotrophen Interaktionszone

Konfokale Aufnahme von markiertem Pep1-Protein in planta, 48 hpi. A: C-terminal GFP-markiertes Pep1 (Grünkanal) lokalisiert in der Peripherie der intrazellulär wachsenden Hyphe; das stärkste Signal ist an der Hyphenspitze sichtbar (Pfeilspitzen). Das Cytoplasma der Hyphenzelle ist durch RFP markiert (Rotkanal), so dass die extrazelluläre Lokalisierung von Pep1 ersichtlich wird. B: N-terminal mCherry-markiertes Pep1 (Rotkanal) lokalisiert ebenfalls in der Peripherie der biotrophen Hyphe, wobei das stärkste Signal an der Hyphenspitze sichtbar ist. Darüber hinaus kann an einem Zell/Zell-Übergang (punktierte Linie) beobachtet werden, dass das Fluoreszenzsignal auch im apoplastischen Raum zwischen zwei benachbarten Zellen nahe der Hyphe sichtbar ist (Pfeilspitzen). Dies deutet auf eine Diffusion von Pep1 im apoplastischen Raum hin. Maßstabsbalken: 5 µm.

2.1.2 Mikroskopische Charakterisierung der pflanzlichen Abwehrreaktion

Im Rahmen der funktionellen Charakterisierung von Pep1 wurde zunächst die pflanzliche Immunantwort auf Infektionen mit der pep1-Deletionsmutante untersucht. Hierzu wurden konfokalmikrokopische Studien mit den Stämmen SG200RFP und SG200∆pep1RFP durchgeführt. Diese wurden in 7 Tage alte Maiskeimlinge infiziert und die Proben nach 24 h bzw. 48 h geerntet und mit Anilinblau gefärbt, um die Zellwandkomponente Callose zu markieren. Hierbei wurde ersichtlich, dass die Wirtspflanze direkt bei Penetration durch U. maydis mit der Auflagerung von Callose an die Zellwand unterhalb der Penetrationsstelle beginnt; dies wurde durch ein erhöhtes Fluoreszenzsignal im Blaukanal sichtbar, das an Penetrationsstellen auftrat. In der SG200-Infektion ist jedoch nur eine örtlich stark begrenzte Struktur direkt an der Penetrationsstelle sichtbar

(Abb. 8 A), an penetrierten Hyphen ist kein oder nur wenig Signal sichtbar (Abb. 8 A & C). Dagegen sind die Hyphen in der Infektion mit SG200∆pep1 von einem starken Fluoreszenzsignal umgeben (Abb. 8 B). Dies deutet auf einen Einschluss der Hyphen durch Zellwandmaterial hin, die Pflanze bildet also als Abwehrreaktion Papillen aus. In einigen Fällen wurde beobachtet, dass U. maydis nach einem erfolglosen Penetrationsversuch ein weiteres Appressorium an einer anderen Stelle der Pflanzenoberfläche bildet, das wiederum eine Papillenbildung auslöst (Abb. 8 D).

Abbildung 8: Infektionen mit der pep1-Deletionsmutante lösen Papillenbildungen in Mais aus

Mit U. maydis infiziertes Maisgewebe 24 (A & B) bzw. 48 hpi (C & D). Der Rotkanal zeigt die Floureszenz von cytoplasmatisch in U. maydis exprimiertem RFP, der Cyankanal zeigt die Fluoreszenz von Anilinblau. A: Appressorium (Pfeil) und penetrierende Hyphe (Pfeilspitzen) von SG200RFP. Die Anilinblaufärbung macht eine fokale Akkumulation von Zellwandmaterial direkt unterhalb des Appressoriums sichtbar, die bei erfolgreicher Etablierung der Biotrophie und

intrazellulärem Hyphenwachstum unterdrückt wird. B: Penetrationsversuche von

SG200∆pep1RFP. Die Färbung zeigt die Bildung von Papillen unterhalb von Appressorien (linkes Panel, Pfeil) oder um kurze penetrierende Hyphen (rechtes Panel, Pfeil). C: Mit U. maydis besiedelte Epidermisschicht. Die Hyphen wachsen, ohne eine sichtbare Abwehrreaktion auszulösen. D: Auch nach 48 h sind nur erfolglose Penetrationsversuche sichtbar, die eine Papillenbildung induzieren (Pfeile). In manchen Fällen wächst die Hyphe nach einem Penetrationsversuch auf der Pflanzenoberfläche weiter (Pfeilspitzen) und bildet ein weiteres Appressorium aus, das ebenfalls eine Papillenbildung induziert. Maßstabsbalken: 10 µm. (Anm.: Unterschiedliche Intensität des Anilinblausignals in den Zellwänden ist auf schwankende Färbungseffizienz sowie verschiedene Schichtdicke der den Einzelbildern zugrundeliegenden konfokalen Aufnahmen zurückzuführen.)

Da für die Lignifizierung von Zellwandmaterial im Rahmen der Papillenbildung reaktive Sauerstoffspezies benötigt werden (Davin und Lewis, 2005; Freudenberg, 1959) und bereits zuvor eine erhöhte ROS-Produktion in mit pep1-Deletionsmutanten infizierten Zellen beobachtet worden war (Doehlemann et al., 2009), wurde die Akkumulation von ROS in infizierten Maisepidermiszellen untersucht. Hierzu wurden in Kooperation mit Dr. Bernd Zechmann (Karl-Franzens-Universität Graz, Österreich) transmissions-elektronenmikroskopische (TEM) Untersuchungen durchgeführt und dabei die Anreicherung von ROS mit CeCl3 markiert. CeCl3 bildet in Anwesenheit von H2O2 ein

elektronendichtes Präzipitat, das in der TEM-Analyse als dunkle Flecken visualisiert wird (Bestwick et al., 1997; Wi et al., 2005). Es wurden 7 Tage alte Keimlinge mit SG200 bzw. SG200∆pep1 infiziert und die Proben nach 24 h gemäß Protokoll vorbereitet (siehe Kap. 4.7.2). Die anschließenden TEM-Untersuchungen der SG200-Infektionen zeigten keine Akkumulation von ROS im pflanzlichen Gewebe auf, in infizierten Zellen konnte kein CeCl3-Präzipitat beobachtet werden. Jedoch wurden in Pflanzenzellen, die von

SG200∆pep1 penetriert wurden, dunkle Flecken in der Peripherie von eindringenden Hyphen (Abb. 9 B), sowie zu späteren Zeitpunkten in der kompletten pflanzlichen Zelle beobachtet (Abb. 23). Dies ist ein Hinweis auf eine lokale apoplastische Anreicherung von ROS um das Penetrationsereignis herum, die im weiteren Verlauf zu massivem oxidativem Stress in der gesamten Zelle führen kann. Darüber hinaus konnte in infizierten Zellen das Reißen des Tonoplasten (Abb. 9 B) und die strukturelle Auflösung des Zellinneren (Abb. 24) beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die mit der pep1-Deletionsmutante infizierten Zellen als Abwehrreaktion programmierten Zelltod durchlaufen.

Abbildung 9: Penetrationsversuche der pep1-Deletionsmutante führen zu lokaler Anreicherung von H2O2

TEM-Analyse von infiziertem Maisgewebe, gefärbt mit CeCl3, 30 hpi A: Penetrationsereignis mit

SG200, die Hyphe (H) ist quergeschnitten. Die pflanzliche Plasmamembran (Pfeilspitzen) umschließt die Hyphe. Die Vergrößerung der biotrophen Interaktionszone zeigt keine Anzeichen von CeCl3-Färbung (Inset). V: Vakuole der Pflanzenzelle, C: Cytosol der Pflanzenzelle, UZW:

Ustilago maydis Zellwand, PZW: pflanzliche Zellwand, M: Mitochondrium, Sparren: Tonoplast. B: Penetrationsereignis mit SG200∆pep1, die Hyphe (H) ist längsgeschnitten. Eine starke CeCl3

-Färbung in der Interaktionszone deutet auf eine Akkumulation von ROS als Antwort der Pflanze auf den Pathogenbefall hin (Pfeile). Der pflanzliche Tonoplast (Sparren) ist eingerissen (Pfeilspitzen), ein Hinweis auf ein frühes Stadium von programmiertem Zelltod (Inset links unten). Maßstabsbalken: 1 µm. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden in Kooperation mit Bernd Zechmann angefertigt.

Die beobachtete spezifische Anreicherung von ROS an Hyphen von SG200∆pep1 warf die Frage auf, ob die Suppression dieser ROS-Antwort allein genügt, um die Biotrophie – zumindest teilweise – wiederherzustellen. Zur Beantwortung dieser Frage wurde ein Radikalfänger-Experiment (ROS scavenging) durchgeführt, wobei Ascorbat als Antioxidans genutzt wurde, um die Anreicherung von ROS in infiziertem Pflanzengewebe zu unterbinden (Asada, 1999). Wiederum wurden Maiskeimlinge mit SG200∆pep1RFP infiziert und ggf. 12 hpi mit Ascorbat behandelt. Makroskopisch zeigte sich eine Reduzierung der nekrotischen Blattbereiche in Ascorbat-behandelten Pflanzen verglichen mit der Wasserkontrolle (Abb. 26). Zur Quantifizierung der Besiedlung durch U. maydis wurde eine Anilinblaufärbung des infizierten Gewebes vorgenommen. Anschließend wurde die Länge der intrazellulär wachsenden Hyphen mikroskopisch ermittelt. Zur Bestimmung der pflanzlichen Abwehrreaktion wurden Keimlinge des Mais-Kultivars B73 PIN1_YFP infiziert, dessen Plasmamembran durch eine YFP-Fusion an den membranständigen Auxintransporter PIN1 fluoreszenzmarkiert ist. So konnte die Rate von Zellen, die eine erhöhte Autofluoreszenz als Stressreaktion auf ein Infektionsereignis aufweisen, ermittelt werden. Als Kontrolle dienten jeweils mit SG200∆pep1RFP infizierte

Pflanzen, die mit Wasser statt mit Ascorbat behandelt wurden. Bei diesem Experiment zeigte sich, dass die Behandlung mit dem Antioxidans tatsächlich sowohl die Besiedlungseffizienz durch U. maydis als auch die Abwehrreaktion der Pflanze beeinflusst. Während die Kontrollpflanzen Papillen an der Penetrationsstelle ausbildeten (Abb. 10 A), war in den ascorbatbehandelten Pflanzen deutlich weniger Fluoreszenzsignal in Blaukanal sichtbar. Den Hyphen gelang eine Penetration der Epidermis sowie Zell/Zell-Übergänge und Proliferationen (Abb. 10 B). In der Quantifizierung war ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Hyphenlänge von ca. 10 µm in Kontrollpflanzen auf ca. 60 µm in ascorbatbehandelten Pflanzen zu beobachten (Abb. 10 E). Bei der Betrachtung der Autofluoreszenz wurde deutlich, dass in der Wasserkontrolle nicht nur direkt penetrierte Epidermiszellen, sondern auch Nachbarzellen eine erhöhte Autofluoreszenz aufwiesen (Abb. 10 C). Im Gegensatz dazu wurden in ascorbatbehandelten Pflanzen Hyphen beobachtet, die Epidermiszellen penetrierten, ohne dass eine verstärkte Autofluoreszenz sichtbar war (Abb. 10 D). Die Rate von Epidermiszellen, die erhöhte Autofluoreszenz aufwiesen, sank durch die Ascorbatbehandlung von ca. 75 % auf ca. 30 %.(Abb. 10 F). Die Behandlung infizierter Pflanzen mit einem Antioxidans führte also zu einem weiteren Vordringen der pep1-Deletionsmutante im Vergleich zur Wasserkontrolle.