Cornelia Kraus
Einfluss von rekombinantem Follitropin auf die Eizellqualität
Masterarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades eines Master of Science
im Rahmen des Universitätslehrganges Klinische Embryologie
Univ.-Prof. Mag. Dr. Thomas Ebner
Karl-Franzens-Universität Graz und UNI for LIFE
Graz, März 2017
Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen nicht benutzt und die den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich ge- macht habe. Die Arbeit wurde bisher in gleicher oder ähnlicher Form keiner anderen inländischen oder ausländischen Prüfungsbehörde vorgelegt und auch noch nicht veröffentlicht. Die vorliegende Fassung entspricht der eingereichten elektronischen Version.
06. März 2017 Cornelia Kraus
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich einen großen Dank an meine beiden Betreuer/in Dr. rer.
nat. Dagmar Gutknecht und Univ.- Prof. Mag. Dr. Thomas Ebner richten. Vielen Dank für den stets konstruktiven Rat, die Zeit und das Interesse an meiner Arbeit.
Ebenso für die fachliche, strukturelle und menschliche Unterstützung.
Meinen beiden Chefinnen Prof. Dr. med. M.Sc. M. Bals-Pratsch und Dr. med. M.Sc.
A. Eder möchte ich für die Ermöglichung des Studiums und der finanziellen Mittel danken. Auch für das zeitliche Verständnis vielen Dank.
Weiterhin möchte ich meinen Kolleginnen danken für die Unterstützung in jeglicher Hinsicht und das stets offene Ohr.
Einen großen Dank richte ich an den medizinischen Statistiker Herrn Florian Zeman, die Zusammenarbeit war sehr konstruktiv und erfolgreich.
Ich bedanke mich bei meiner Familie für sehr viel Verständnis, insbesondere mei- nem Ehemann Andreas für die stete Geduld, das Durchhaltevermögen, den seeli- schen Beistand und das Korrekturlesen meiner Arbeit. Und meinen Kindern, für die es manchmal nicht einfach war.
Zusammenfassung:
Zielsetzung: Ziel der randomisierten retrospektiven Studie war es, in Abhängigkeit von drei rekombinanten FSH Präparaten (Puregon, Bemfola, Gonal F), zu untersu- chen, ob es einen Unterschied bezüglich der Eizellqualität und der morphokineti- schen Entwicklung gibt. Ferner sollte verifiziert werden, ob sich morphologische Kri- terien zur Eizellqualität, als prognostischen Indikator für die Eizellqualität eignen.
Die Studie befasst sich mit 96 Patienten im Zeitraum von Januar 2014 bis Septem- ber 2016.
Material und Methoden: Die Patienten wurden in Abhängigkeit folgender Kriterien in die Studie aufgenommen: Alter ≤ 37, erste oder zweite ICSI Therapie, Stimulation mit einem der 3 rec FSH Produkten. Alle Eizellen wurden in einem Time lapse Inku- bator kultiviert. Zuerst wurden die Eizellen anhand von 8 morphologischen Kriterien beurteilt. Anschließend wurde die Morphokinetik der Embryoentwicklung beurteilt.
Die Daten wurden retrospektiv ausgewertet.
Ergebnisse: Im Vergleich zwischen den Medikamenten zeigte sich, dass bei der Stimulation mit Follitropin beta signifikant mehr sER aufgetreten sind. Die Schwan- gerschafts- und Implantationsrate fand sich aufgrund der geringen Patientenzahlen nicht aussagekräftig. Die Auswertung der morphokinetischen Kriterien ergaben sig- nifikante Unterschiede beim Medikament Puregon. Embryonen nach Stimulation mit Puregon sind in der Teilung zum 2- Zellstadium (t2) und 4- Zellstadium (t4) zeitlich verzögert. Ab dem 8- Zellstadium wurden keine signifikanten Unterschiede mehr beobachtet, jedoch sind weniger entwicklungsfähige Embryonen entstanden. Nega- tive prognostische morphologische Kriterien sind Auffälligkeiten der Zona pellucida und die Anwesenheit von sER. Morphologische Kriterien mit einer positiven Prog- nose bezüglich embryonaler Entwicklung konnten nicht identifiziert werden.
Schlussfolgerung: Zusammenfassend zeigen die Daten, dass es für die Eizellqua- lität am Punktionstag keine relevanten positiven prognostischen Kriterien gibt. Da- hingegen war für eine Schwangerschaft bei Auffälligkeiten der Zona pellucida ein negativer prognostischer Wert zu erkennen. Bei der Stimulation mit Follitropin beta wäre eine Langzeitkultur zu diskutieren. Für die Auswahl des Embryos zum Transfer sind die Teilung zum Zweizeller (t2) und die Kompaktion (tM) zusätzlich bedeutende Charakteristika.
Abstract:
Objective: The aim of the randomized retrospective study was to investigate whether there is a difference in egg quality and morphokinetic development as a function of three recombinant FSH preparations (Puregon, Bemfola, Gonal F). Fur- thermore, it should be verified whether morphological criteria for egg quality are suitable as a prognostic indicator of egg quality. The study dealt with 96 patients in the period from January 2014 to September 2016.
Material and methods: The patients were included in the study according to the following criteria: Age ≤ 37 years, first or second ICSI treatment, stimulation with exclusively one of the three rec FSH products. All oocytes were cultured in a time lapse incubator. First, 8 oocyte criteria were assessed and subsequently the mor- phokinetics of embryo development were assessed. The data were retrospectively evaluated.
Results: In a direct comparison between the drugs, it was found that after FSH beta stimulated significantly more sER occurred. The pregnancy and implantation rate is not significant because of the low number of patients. The evaluation of the morphokinetic criteria revealed significant differences in the drug Puregon. Em- bryos after stimulation with Puregon are delayed in the division to the 2-cell stage (t2) and the 4-cell stage (t4). No significant differences were observed from the 8- cell stage onwards, but embryos with less developmental development were ob- served. Negative prognostic morphological oozyte criteria are abnormalities of the zona pellucida and the presence of sER. Morphological oozyte criteria with a posi- tive prognosis regarding embryonic development could not be identified.
Conclusion: In summary, the data show that there is no relevant positive prognostic criteria for the egg quality. A negative prognostic value was seen for pregnancy in cases of abnormalities in the zona pellucida. In the case of stimulation with follitropin beta, a long-term culture would have to be discussed. For the selection of the em- bryo for the transfer, the division into the two-cell (t2) and the compaction (tM) are also important characteristics.
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ... 8
Abkürzungsverzeichnis ... 9
1 Einleitung ... 10
2 Material und Methoden ... 13
2.1 Grundlagen der dreiarmigen retrospektiven Studie ... 14
2.1.1 prospektive Randomisierung des rec FSH über den Geburtsmonat der Frau ... 14
2.1.2 Einschlusskriterien ... 14
2.1.3 Ausschlusskriterien ... 14
2.2 Datenerfassung und Datenanalyse ... 15
2.3 Kulturbedingungen ... 15
2.4 Kultur nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz (ESchG) ... 16
2.5 Beurteilungsgrundlage ... 17
2.5.1 Beurteilung der Eizellen ... 17
Beurteilungsbogen Profertilita Eizellqualität... 18
2.5.2 Beurteilung der embryonalen Entwicklung ... 19
2.5.3 Morphokinetische Beurteilung der Embryo Entwicklung ... 20
2.5.4 Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit ... 22
3 Ergebnisse ... 23
3.1 Patientenzahlen ... 23
3.2 Übersicht aller Patienten in dem angegebenen Zeitraum ... 24
3.3 Ergebnisse Alter, BMI, Indikation, Stimulationsdauer, Gesamtdosis rec FSH, Durchschnitt transferierter Embryonen, Anzahl der Eizellen, Rate MII Eizellen, Anzahl PN Stadien und Befruchtungsrate ... 25
3.4 Eizellen ohne sichtbarer Aberrationen (mit maximaler Bewertung) nach Eizellbeurteilungsbogen ... 27
3.5 Ergebnisse der Eizellkultur in Abhängigkeit vom rekombinanten FSH .. 27
3.6 Ergebnisse der Eizellqualität in Bezug auf den Zyklusausgang... 28
3.7 Ergebnisse der Schwangerschafts- und Implantationsraten ... 30
3.8 Ergebnisse der embryonalen Entwicklung ... 31
3.9 Timing morphologischer Ereignisse, Auswertung einzelner Zellzyklen in Abhängigkeit vom Medikament ... 32
3.10 Timing morphologischer Ereignisse, Auswertung einzelner Zellzyklen in Abhängigkeit vom Zyklusausgang ... 33
3.11 Zusammenfassung der häufigsten Zeitfenster... 38
4 Diskussion; Zusammenfassung ... 39
Literaturverzeichnis ... 43
Anhang ... 46
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: EmbryoScope® TM der Firma Vitrolife ... 13
Abbildung 2: Algorithmus Profertilita für die Bestimmung der Anzahl der Weiterkultur ... 17
Abbildung 3: Profertilita Eizellbeurteilungsbogen ... 18
Abbildung 4: Embryonale Entwicklung ... 21
Abbildung 5: Überblick zeitlicher Verlauf nach ICSI (Zeiten Profertilita) ... 22
Abbildung 6: Verteilung der Medikamente ... 24
Abbildung 7: Übersicht der ausgeschlossenen Patienten ... 24
Abbildung 8: Übersicht der Ergebnisse Patientenbeschreibung ... 25
Abbildung 9: Übersicht PN Stadien ... 26
Abbildung 10: Ergebnisse der Eizellqualität bezüglich rec FSH ... 28
Abbildung 11: Ergebnisse der Eizellqualität bezüglich Zyklusausgang ... 29
Abbildung 12: Übersicht der Ergebnisse der Schwangerschaft- und Implantations- raten ... 30
Abbildung 13: Übersicht embryonale Entwicklung am Tag des Transfers ... 32
Abbildung 14: Zeitliche Entwicklungsschritte mit Daten aus dem ES bezüglich dem Medikamentenvergleich ... 33
Abbildung 15: Zeitliche Entwicklungsschritte mit Daten aus dem ES bezüglich des Zyklusausgangs ... 34
Abbildung 16: Graphische Abbildung der signifikanten Unterschiede ... 35
Abbildung 17: Graphische Darstellung aller ausgewerteten Entwicklungszeiten be- züglich Zyklusausgang ... 36
Abbildung 18: Graphische Darstellung t4 mit Nullpunkt PN Fading ... 37
Abbildung 19: Graphische Darstellung tM mit Nullpunkt PN Fading ... 38
Abbildung 20: Häufigste Zeitpunkte der Entwicklung ... 39
Abkürzungsverzeichnis
d Tage
ET Embryotransfer EZ Eizelle(n)
ES EmbryoScope®
h Stunde
HCG humanes Choriongonadotropin
ICSI intrazytoplasmatische Spermieninjektion IVF In-vitro-Fertilisation
Kryo Kryokonservierung PN Pronukleus/i
SS Schwangerschaft
CO2 Kohlenstoffdioxid
sET Single Embryo Transfer
O2 Sauerstoff
FSH Follikel stimulierendes Hormon IE Internationale Einheit
G Gonal F
B Bemfola
P Puregon
LH luteinisierendes Hormon TSH Thyreotropin
sER smooth endoplasmatisches Retikulum rec FSH rekombinantes FSH
Einleitung
10
1 Einleitung
Die Sterilität eines Paares kann in vielen Ursachen begründet sein. Die weibliche Infertilität, die männliche Sterilität, eine Kombination auf beiden Seiten und eine idi- opathische Sterilität. Diese Studie beschäftigt sich hauptsächlich mit der idiopathi- schen (Ursache unbekannt) und der männlichen Sterilität. Bei allen behandelten Paaren wurde eine intrazytoplasmatische Spermieninfektion durchgeführt.
Die Frauen werden in Vorbereitung auf die künstliche Befruchtung hormonell mit rekombinantem FSH unterstützt. In dieser dreiarmigen, retrospektiven Studie wur- den drei unterschiedliche rec FSH Produkte verwendet. Gonal F (Follitropin alfa), Bemfola (Follitropin alfa), ein Biosimilar von Gonal F und Puregon (Follitropin beta).
Die beiden Arten von Follitropinen unterscheiden sich in der Glykosylierung. Follit- ropin besteht aus zwei unterschiedlichen Glykoproteinen, der Alfa Untereinheit und der Beta Untereinheit. Die Beta Untereinheit ist spezifisch für FSH, die Alfa Un- tereinheit kommt auch in den Hormonen HCG, LH und TSH vor1. Ob sie eine unter- schiedliche Wirkung auf die Eizellqualität haben, ist bisher nicht bekannt.
Das Ziel der Untersuchung ist es, das definierte Patientenkollektiv genauer zu ana- lysieren um festzustellen, ob es zwischen den drei oben erwähnten rekombinanten FSH Präparaten einen Unterschied gibt, bezüglich
1. der Eizellqualität und 2. der Embryoentwicklung.
In Bezug auf die Eizellqualität war es ohne Time lapse Gerät bisher schwierig, ein- zelne Parameter zu untersuchen, die Ergebnisse in der Literatur bezüglich Entwick- lungspotenzial und Schwangerschaftsraten waren widersprüchlich. Eine Studie zeigt, dass Auffälligkeiten der Eizellqualität lediglich einen Einfluss auf die Befruch- tungsrate haben, jedoch nicht auf die weitere Entwicklung2.
1 Vgl. Wikipedia Follikelstimulierendes Hormon
2 Vgl. Greuner M. et al. 2012
11 Es wurde untersucht, ob anhand morphologischer Kriterien die Eizellqualität beur- teilbar ist hinsichtlich der Entstehung entwicklungsfähiger Embryonen. Außerdem soll nach Merkmalen gesucht werden, die eine Eizelle kennzeichnen, welche nicht zu einem entwicklungsfähigen Embryo führen. Sofern sich solche eindeutigen mor- phologischen Kriterien festlegen lassen, würde dies ein vorzeitiges Aussortieren der Eizellen vor der Befruchtung ermöglichen.
Außerdem soll überprüft werden, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Art der Stimulation, der Qualität der Eizelle, der Blastozystenbildungsrate und der Implantationsrate gibt.
Trotz extensiver Forschung in der Fruchtbarkeitsmedizin fehlen detaillierte Daten und validierte Prädiktoren für die Eizellqualität nach ovarieller Stimulation3.
Ferner wäre ein Zusammenhang zwischen der Stimulation und der Qualität der Ei- zellen ein wichtiger Aspekt für jedes ART-Labor. Bisher gibt es jedoch keine Para- meter für die Eizellqualität um die Kohorte einheitlich zu beurteilen, zum Zeitpunkt wenn die Eizellen nach der Follikelpunktion im ART-Labor eingehen.
Qualitätskriterien für die Eizellqualität spielen bisher nur eine untergeordnete Rolle, da deren Anwendung auf den Zyklusausgang mit widersprüchlichen Ergebnissen belegt wurde. Ein kombinierter Effekt solcher Kriterien auf die Embryonenqualität bzw. das Implantationspotenzial ist bisher nicht erforscht. Es bleibt die Frage offen:
„Was bewirken als Beispiel sER, Vakuolen, nekrotische Einschlüsse oder ein großer Polkörper?“
Die morphokinetischen Kriterien einer Eizelle, die morphologische Beurteilung der embryonalen Stadien und die zeitliche Entwicklung spielen jedoch für die Auswahl des zu transferierenden Embryos eine große Rolle. Nach diesen Kriterien sollte je- ner Embryo ausgewählt werden, der die größte Wahrscheinlichkeit einer Implanta- tion aufweist.
In dieser Studie wurde nach solchen Markern gesucht, zudem sollten die Unter- schiede zwischen den verwendeten rec FSH Präparaten herausgearbeitet werden.
Wichtig dafür ist eine ungestörte ununterbrochene Kultur. Würde ein klassischer Brutschrank verwendet werden, müsste zu jeder Einzelmessung/Prüfung das Kul- turschälchen herausgenommen werden, was zu einer Exposition der Eizelle bzw.
3 Vgl. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting;
2011
Einleitung
12 des Embryos mit Licht und Raumtemperatur sowie zu einer möglichen pH-Wert- Veränderung führen kann. Ein Time lapse Inkubator aber ermöglicht eine ungestörte Kultur und eine Rund um die Uhr Überwachung, daher können alle Parameter, auch die morphologischen Eizell-Parameter beurteilt und miteinander verglichen werden.
Diese Studie wurde mit nur einem einzigen EmbryoScope®-Gerät (Time lapse Sys- tem, Firma Vitrolife) durchgeführt.
Das EmbryoScope® (siehe Abbildung 1) ist ein Inkubator mit integriertem Mikro- skop und Kamera. Es werden halbstündlich automatisch Zeitraffer-Aufnahmen der Eizellen und Embryonen durchgeführt und abgespeichert, daher ist eine detaillierte Beurteilung der Eizellen, der Eizellbefruchtung sowie der Embryoentwicklung mög- lich 4, ohne die Inkubation zu stören. Entscheidende Entwicklungsabläufe können sicher beurteilt und somit eine bessere Prognose für den Embryo gestellt werden.
Durch die integrierte Software, dem EmbryoViewer®, kann eine detaillierte Analyse erfolgen. Für jeden Embryo wird ein Bewegungshistogramm für die einzelnen Fur- chungsstadien erstellt, welches anschließend einheitlich durch einen Mitarbeiter, miteinander verglichen werden kann. Diese Ergebnisse werden mit dem Istanbul Consensus Workshop verglichen.
Ein Antrag zur Beurteilung ethischer und rechtlicher Fragen eines medizinischen Forschungsvorhabens am Menschen, auf die das Arzneimittelgesetz (AMG) keine Anwendung findet, liegt positiv genehmigt vor. Profertilita ist zertifiziert nach ISO 9001:2008 und arbeitet anhand von Standardarbeitsanweisungen.
4 Vgl. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting;
2011
13 Abbildung 1: EmbryoScope® TM der Firma Vitrolife
Quelle: www.Vitrolife.com
2 Material und Methoden
Der Untersuchungszeitraum dieser Studie umfasst alle Patientinnen mit einer ICSI Behandlung und Kultur im ES von Januar 2014 bis September 2016. Die Studie wurde wie folgt aufgebaut.
Die erste Patientengruppe bekam ausschließlich Bemfola als rekombinantes FSH, die zweite Patientengruppe ausschließlich Gonal F und die dritte Patientengruppe ausschließlich Puregon. Es wurden keine anderen FSH Produkte verwendet. Diese Hauptgruppen wurden anschließend miteinander verglichen. Die Zuordnung des re- kombinanten FSH Produkts erfolgte über einen internen Schlüssel anhand des Ge- burtsmonats der Patientin (siehe Kapitel 2.1.1. Randomisierung über Geburtsmo- nat).
Profertilita legte in Abhängigkeit der zu erwartenden ovariellen Response eine indi- viduelle Anzahl an internationalen Einheiten fest. Von Beginn der Stimulation bis zum Auslösen des Eisprungs wurde ausschließlich eines der drei rekombinanten FSH gespritzt. Nach erfolgreicher Eizellentnahme wurden die Eizellen mit der ICSI Methode befruchtet und im ES kultiviert.
Material und Methoden
14
2.1 Grundlagen der dreiarmigen retrospektiven Studie
2.1.1 prospektive Randomisierung des rec FSH über den Geburtsmonat der Frau
Die Wahl des rekombinanten FSH Präparates für die ovarielle Stimulation erfolgt über die Randomisierung des Geburtsmonats der Patientin:
Bemfola (Januar bis April)
Gonal F (Mai bis August)
Puregon (September bis Dezember)
Die Patienten wurden entsprechend den Profertilita Standardvorgehensweisen be- handelt (ovarielle Stimulation, Eizellpunktion, Eizellkultur, Befruchtung, Kultur und Embryotransfer). Auch die nachfolgende Lutealphasenunterstützung weicht nicht von den Standardvorgehensweisen ab.
In der Studiengruppe erfolgte die Stimulation ausschließlich mit den obigen rekom- binanten FSH Produkten.
2.1.2 Einschlusskriterien
Folgende Einschlusskriterien für die Studie wurden festgelegt:
Alter der Patientin 37 Jahre oder jünger
Erste oder Zweite ICSI Behandlung
Behandlung mit einem der drei aufgeführten FSH Präparaten
Befruchtungsrate > 30 %
2.1.3 Ausschlusskriterien Die Ausschlusskriterien sind:
Alter der Patientin 38 Jahre oder älter
15
Ab der dritten ICSI Behandlung
Behandlung mit einem anderen Präparat zur Stimulation von Ovarien
IVF Behandlung
Befruchtungsrate < 30 %
2.2 Datenerfassung und Datenanalyse
Die Datenerfassung erfolgte täglich über die Software des ES und zusätzlich im Softwareprogramm Meditex von Profertilita. Für die Eizellbeurteilung wurden in der jeweiligen Patientenakte zusätzliche Felder erstellt und dort dokumentiert. Die be- nötigten Daten für diese Studie wurden mit dem Auswertungseditor extrahiert und mit den Zeitrafferwerten des ES zusammengeführt. Einzelne fehlende Daten wur- den von Hand ergänzt. Kategorien werden als Rate (%) angegeben inklusive der zugehörigen absoluten Anzahl. Eine Abbildung der zusammengeführten Daten be- findet sich im Anhang. (Patientenbeschreibung und Morphokinetische Entwicklung) Die Auswertung selbst erfolgte über Microsoft Excel. Hier wurden der Mittelwert (Standardabweichung) und die Häufigkeit (%) berechnet. Für die Auswahl unabhän- giger, statistisch signifikanter Prädiktoren für die Eizellqualität war das Ziel eine schrittweise logistische Regressionsanalyse, hiervon wurde nach ersten Auswer- tungen der Daten vom medizinischen Statistiker abgeraten. Alle statistischen Ana- lysen wurden durch einen medizinischen Statistiker mit einer Signifikantsgrenze von 0,05 zweiseitig durchgeführt. Als statistische Programme wurden ANOVA, Chi- Quadrat und Kruskal Wallis Test eingesetzt.
2.3 Kulturbedingungen
Die Kulturbedingungen sind bei allen gewonnen Eizellen identisch. Die Follikel wer- den 36 Stunden nach HCG Gabe mit einer Aspirationskanüle punktiert. Die Zwi- schenkultur in dieser Studie fand in MINC TM Benchtop Inkubatoren (Firma Cook Medical) statt, bevor sie nach der ICSI Behandlung in das ES zur Weiterentwicklung eingesetzt wurden. Die Denudation der Eizellen findet nach etwa 38 Stunden statt,
Material und Methoden
16 anschließend erfolgt die ICSI ein bis zwei Stunden später. Die sequentiellen Kultur- medien wurden alle bei der Firma Cook Medical bezogen. (Gamete Buffer, Fertiliza- tion Medium, Cleavage Medium, Blastozysten Medium). Der pH-Wert beträgt ± 7,3, die CO2-Konzentration 6,5%. Die gesamte Kultur findet bei 5% Sauerstoff statt. Die Keimzellen und Embryonen aller Patienten wurden in einem ES kultiviert, um Ein- flüsse wie Licht, Temperatur, pH-und CO2-Wert so identisch bzw. vergleichbar wie möglich zu halten. Pro Patient wurden in einem EmbryoSlide maximal 12 Eizellen bzw. Embryonen in Einzelkultur beurteilt. Das EmbryoSlide ist eine Kulturschale die speziell für die Kultur von Embryonen im ES entwickelt wurde.
2.4 Kultur nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz (ESchG)
Der PN-Check findet ca. 18-20 h nach der ICSI Behandlung statt. Anhand eines internen Algorithmus wurde entschieden wie viele PN Stadien weiter kultiviert wer- den damit am Tag des Transfers ein oder zwei (je nach Patientenwunsch) entwick- lungsfähige Embryonen zum Transfer zur Verfügung stehen um den rechtlichen Vorschriften des Embryonenschutzgesetztes (ESchG) zu entsprechen 5. Die über- zähligen 2 PN Stadien wurden eingefroren. (Vitrifikation mit Kitazato Cryotop) PN Stadien mit morphologischen Auffälligkeiten wie Vakuolen (mind. 2 oder 1 große Vakuole), sER und großer Polkörper wurden nicht kryokonserviert, sondern stan- dardmäßig zusätzlich kultiviert. Die Anzahl der Weiterkultivierung ist abhängig von der gewünschten Anzahl der Embryonen zum Transfer und dem Alter der Patientin (siehe Abbildung 2).
Als morphologisch nicht auffällig wurden die Form der Eizelle, die Größe der Eizelle, eine abnormale Zona pellucida, granuläres Zytoplasma, refraktile Körper und nek- rotische Einschlüsse eingestuft, daher wurden diese 2 PN Stadien ebenso wie die unauffälligen PN Stadien vitrifiziert. Die PN Stadien wurden in 2er oder 3 er Portio- nen eingefroren. Da die PN Stadien den Bildern und Beurteilungen nicht mehr zu- ordenbar sind und keine embryonale Entwicklung im ES aufgezeichnet wurde, sind die Daten der Eizellbeurteilung vitrifizierter PN Stadien in dieser Studie nicht ausge- wertet worden. Im Gegensatz zu den vitrifizierten Embryonen, diese wurden einzeln
5 Gesetz zum Schutz von Embryonen (Embryonenschutzgesetz)
17 eingefroren und können den Bildern und Beurteilungen zugeordnet werden. Diese sind daher in die Auswertung einbezogen.
2.5 Beurteilungsgrundlage
Für die einheitliche Beurteilung wurde als Null-Zeitpunkt das PN Fading festgelegt.
Das PN Fading ist der Zeitpunkt wo sich die Vorkerne auflösen und keine Pronuklei mehr sichtbar sind.
Dadurch können alle Bewertungen auch zeitlich miteinander verglichen werden, un- abhängig vom jeweiligen Zeitpunkt der Befruchtung (ICSI).
2.5.1 Beurteilung der Eizellen
Folgende Parameter wurden beurteilt:
1. Rate der Eizellen ohne sichtbare Aberrationen 2. Rate an reifen Eizellen in der Metaphase II
3. Rate an reifen Eizellen ohne sichtbare Aberrationen 4. Befruchtungsrate
5. Rate von Embryonen mit einem normalen Entwicklungsverlauf 6. Blastozystenbildungsrate nach Istanbul Consensus
7. Rate der übertragenen Embryonen zum Transfer und kryokonservierte Emb- ryonen (Rate der entwicklungsfähigen Eizellen)
Gewünschte Anzahl der
Embryonen zum Transfer Alter der
Frau Anzahl der PN Stadien für die Weiterkultur 2 < 35 Jahre 4 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien 2 35-39 Jahre 5 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien 2 ab 40 Jahre 6 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien
1 < 35 Jahre 3 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien 1 35-39 Jahre 4 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien 1 ab 40 Jahre 5 PN Stadien plus die auffälligen PN Stadien
Abbildung 2: Algorithmus Profertilita für die Bestimmung der Anzahl der Weiterkultur
Material und Methoden
18 8. Einnistungsrate (Implantationsrate)
9. Fortlaufende Schwangerschaftsrate mit Fruchthöhle und Herzaktion 10. Stimulationsdauer
11. Benötigte rekombinante FSH Dosis
Beurteilungsbogen Profertilita Eizellqualität
Durch Profertilita wurde ein einheitlicher Beurteilungsbogen für die Eizellqualität er- stellt. Es wurden alle Eizellen der Studienpatientinnen im ES kultiviert und folgender Beurteilungsbogen ausgefüllt.
Eizellstruktur Kriterien Score
Erscheinung: Form Sphärisch/rund 1 Punkt
Asphärisch/oval 0 Punkte
Erscheinung: Größe Normal 1 Punkt
Klein 0 Punkte
Zona pellucida Normal 1 Punkt
Abnormal (z.B. dick, dünn, braun, oval) 0 Punkte
Polkörper
Ja vorhanden 2 Punkte
Stark vergrößert 1 Punkt
Nein 0 Punkte
Zytoplasma Homogen 1 Punkt
Granulär bzw. anders 0 Punkte
sER Nein 1 Punkt
Ja 0 Punkte
Vakuolisierung
Keine 2 Punkte
Eine kleine (5-10 µm) 1 Punkt
Mehrere oder große (>14 µm) 0 Punkte
Einschlüsse
Nein 2 Punkte
Refraktile Körper 1 Punkt
Nekrotische Einschlüsse 0 Punkte
Abbildung 3: Profertilita Eizellbeurteilungsbogen
Die Eizellqualität bzw. Eizellstruktur wurde in 8 morphologische Kriterien unterteilt und im ES beurteilt. Es wurden zwischen 0 und 2 Punkte vergeben. Die höchste
19 Gesamtpunktzahl würde demnach 11 Punkte betragen und einer Eizelle mit opti- maler Prognose entsprechen.
2.5.2 Beurteilung der embryonalen Entwicklung
Die Beurteilung der embryonalen Entwicklung erfolgte nach der Standardisierung der Nomenklatur6.
Pronuklei
18-19 Stunden nach ICSI zeigt eine befruchtete Eizelle zwei Vorkerne, den männli- chen Chromosomensatz und den weiblichen Chromosomensatz. Die Vorkerne (Pronuklei) lösen sich in etwa 18-24 Stunden nach ICSI auf. Dies wird allgemein als PN Fading (oder als PMB, pronuclear membrane breakdown) bezeichnet und wird wie bereits erwähnt in dieser Studie als Ausgangswert für die zeitlichen Berechnun- gen verwendet.
Teilungsstadien
Die erste mitotische Zellteilung findet nach 26-29 Stunden statt, indem sich die Zy- gote zu zwei Blastomeren abschnürt (erstes Furchungsstadium).
Das zweite Furchungsstadium führt nach 42-44 Stunden zu vier Blastomeren. Das dritte Furchungsstadium nach 66-70 Stunden folglich zu acht Blastomeren. Am vier- ten Tag kompaktieren die Blastomeren nach zirka 90-100 h. Anschließend erreichen sie am fünften Tag das Blastozystenstadium. Die verlängerte Kultur ermöglicht die mehrfache Selektion der zeitlichen Entwicklung und somit einen elektiven Single Embryo Transfer. Bei Profertilita besteht kein Unterschied in den Schwanger- schaftsraten nach dem Transfer von Tag 4 oder Tag 5 Embryonen (interne Daten vorhanden). Sie werden daher als gleichwertig prognostisch in Bezug auf den Be- handlungserfolg gesehen.
6 Vgl. Ciray et al. 2014
Material und Methoden
20 2.5.3 Morphokinetische Beurteilung der Embryo Entwicklung
Summary of morphokinetic variables and proposed definitions (Abbildung 4): 7 Zellteilungen:
tPN: Vorkerncheck, Vorkernmuster (Nucleoli polar oder verteilt)
tPNf: PN fading, Vorkerne lösen sich auf, 0-Wert dieser Studie
t2: erste Zellteilung, zwei getrennte Zellmembranen
t3: Beginn des 2. Zellzyklus; 3-Zeller
t4: vierte Zellteilung
t5: fünfte Zellteilung
t6: sechste Zellteilung
t7: siebte Zellteilung
t8: achte Zellteilung
t9: 9-16 Zeller
tn: n Teilungsstadien bis vor der Kompaktierung
tSC: beginnende Kompaktion
tMf: vollendete Kompaktion
tSB: beginnende Blastulation
tByz: volle Blastozyste
tEyz: beginnende Expandierung
tHNyz: schlüpfende Blastozyste
tHDyz: vollständig geschlüpfte Blastozyste
7 Vgl. Ciray et al. 2014
21 Abbildung 4: Embryonale Entwicklung
Quelle: Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time lapse user group 8
Beschreibung der Zellzyklen:
Zellzyklus 1: cc1
Zellzyklus 2: cc2 = t3-t2
Synchronisation: Dauer die Geschwisterblastomeren für die Zellteilung brau- chen s2= t4-t3
In der Literatur wird folgende Rangfolge für die 3 Prädiktoren der Implantation be- schrieben 9 :
1. Zeitpunkt der Zellteilung zum 5- Zeller (t5) 48,8 h-56,6 h 2. Verweildauer als 3 Zeller (s2) < 0,76 h
8 Vgl. Ciray et al. 2014
9 Vgl. Meseguer/Herrero/Tejera et al. 2010
Material und Methoden
22 3. Dauer des zweiten Zellzyklus (cc2) < 11,9 h
2.5.4 Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit
Als morphologisch normales Embryo gilt laut der Konzept Richtlinie für t2 ein sym- metrischer Vierzeller (44 ± 1 h nach ICSI), für t3 ein symmetrischer (Sechs)Achtzel- ler (68 ± 1h nach ICSI). Am vierten Tag (92 ± 1h nach ICSI) sollte die Morula min- destens 50 % der embryonalen Zellen in die Kompaktion mit einbezogen haben.
Embryonen am Tag 5 (116 ± 1h nach ICSI) sind ab einem Entwicklungsstadium einer vollen Blastozyste 3 BB morphologisch ideal. Sie werden nach Schoolcraft et.al (1999) 10 beurteilt. Die Fragmentation sollte zu jedem Teilungsstadium < 10 % betragen. Eine Fragmentierung > 35 % führt oft zu einem Arrest der Embryoent- wicklung. Die Rate verwendbarer Embryonen bezieht sich auf alle Embryonen die transferiert oder kryokonserviert wurden. Die Rate entwicklungsfähiger morpholo- gisch idealer Embryonen bezieht sich auf die Entwicklung an Tag 4 oder 5. Kryo- konserviert wurden auch morphologisch nicht ideale Embryonen.
Abbildung 5: Überblick zeitlicher Verlauf nach ICSI (Zeiten Profertilita)
10 Vgl. Schoolkraft et al. 1999
Tag 2
• symetrischer Vierzeller
• 44 h ± 1h nach ICSI
Tag 3
• symetrischer Achtzeller
• 68 h ± 1 nach ICSI
Tag 4
• Morula mindestens 50 % der embryonalen Zellen in die Kompaktion mit einbezogen
• 92 h ± 1 h nach ICSI
Tag 5
• volle Blastozyste 3BB
• 116 h ± 1 h nach ICSI
23 Irreguläre Entwicklungsvorgänge wie folgt werden dokumentiert und in die Embryo- nenauswahl einbezogen. Zeigt ein Embryo am Tag des Transfers trotz der irregulä- ren Entwicklungsvorgänge eine zeitgerechte Entwicklung wurde er kryokonserviert.
Direkte Teilung vom 1 Zeller zum 3 Zeller 11
Rapid Cleavage, Teilung vom 2 Zeller zum 3 Zeller in weniger als 5 h 12
Reverse Cleavage Zellfusion z.B. 6 Zeller zum 5 Zeller 13
Planare Embryonen (Klee-Embryonen) 14
Embryo Rolling, mehrmaliger Versuch der Teilung
3 Ergebnisse 3.1 Patientenzahlen
Insgesamt wurden 246 Patientinnen behandelt, 150 Patienten erfüllten die festge- legten Einschlusskriterien nicht. (siehe Abbildung 7)
96 Patienten waren für diese Studie auswertbar und konnten weiter beurteilt wer- den. Alle Studienpatientinnen hatten zwischen 1-12 Eizellen im ES zur Kultur. Es wurden 27 Patienten mit Gonal F behandelt, 34 mit Puregon und 35 mit Bemfola.
Dazu kommen 33 Kryozyklen mit vitrifizierten Embryonen, die in die Schwanger- schaftsrate und Implantationsrate kumulativ mit eingerechnet wurden.
11 Vgl. Rubio et al. 2011
12 Vgl. Rubio et al. 2011, 2012
13 Vgl. Hickmann et al. 2012
14 Vgl. Ebner et al. 2012
Ergebnisse
24 Abbildung 6: Verteilung der Medikamente
3.2 Übersicht aller Patienten in dem angegebenen Zeitraum
Insgesamt wurden in dem Zeitraum von Januar 2014 bis September 2016 die Eizel- len von 246 Patientinnen im ES kultiviert. Nach Festlegung der bereits genannten Einschlusskriterien wurde die Studie mit 96 Patientinnen fortgesetzt. Nachfolgend ein kurzer Überblick über alle Patientinnen mit der Begründung, warum diese nicht an der Studie teilnehmen konnten.
Ausschluss Kriterium Anzahl Alter Frau > 37 Jahre 95
IVF Behandlung 12
Medikament Elonva 24
Medikament Ovaleap 5
Behandlungszyklen >2 11 Befruchtungsrate < 30 % 3 Totale Anzahl ausgeschlossen 150
Abbildung 7: Übersicht der ausgeschlossenen Patienten
25
3.3 Ergebnisse Alter, BMI, Indikation, Stimulationsdauer, Gesamt- dosis rec FSH, Durchschnitt transferierter Embryonen, Anzahl der Eizellen, Rate MII Eizellen, Anzahl PN Stadien und Befruch- tungsrate
In der nachfolgenden Tabelle werden erste grundlegende Stammdaten der Studien Patientinnen in Abhängigkeit des Follitropin miteinander verglichen. Die Daten zei- gen entweder den Mittelwert (Standardabweichung) oder die absolute Häufigkeit (%). * ANOVA, ** Chi-Quadrat-Test.
Pro Patient Alle Medika- mente
Bemfola (B)
Gonal F (G)
Puregon (P)
Statistische Auswertung Patientenzah-
len [n] 96 (100 %) 35 (37 %) 27 (28 %) 34 (35 %)
Alter [a] 33,71 (2,61) 33,77 (2,78) 34,22 ( 2,36) 33,24 (2,61) 0,338*
BMI 24,57 24,15 25,62 24,16 0,535*
Männliche Indikation [n]
82 29 22 31
Weibliche Indikation [n]
4 0 3 1
Idiopathische Indikation [n]
10 6 2 2
Stimulations-
dauer [d] 11,59 (2,56) 11,54 (3,72) 11,56 (1,67) 11,68 (1,53) 0,973*
Gesamtdosis
FSH [IE] 2332,66 (946,46)
2323,93 (1051,33)
2244,72 (817,61)
2411,47 (948,94)
0,793*
Durchschnitt transferierter Embryonen [n]
1,43 (0,50) 1,34 (0,48) 1,63 (0,49) 1,35 (0,49) 0,042*
G-B: 0,023, G-P: 0,030, B-P: 0,931 Anzahl EZ [n] 17,21 (8,10) 15,23 (9,07) 17,44 (8,05) 19,06 (6,73) 0,143*
Rate M II Eizel-
len [%] 82,34 (13,91) 82,78 (13,44) 80,69 (15,55) 83,19 (13,31) 0,765*
Anzahl PN [n] 9,43 (5,28)
8,74 (6,06) 9,41 (5,21) 10,15 (4,46) 0,548*
Befruchtungs- rate [%]
74,43 (18,32) 77,66 (18,61) 74,46 (18,17) 71,09 (18,08) 0,334*
Abbildung 8: Übersicht der Ergebnisse Patientenbeschreibung
Ergebnisse
26 Die Patientenzahlen sind in allen 3 Gruppen in etwa gleich groß. Die Auswertung der einzelnen Parameter erfolgte pro Patient in den verschiedenen Gruppen. Das Durchschnittsalter beträgt 33,71 Jahre. Der BMI liegt im Durchschnitt bei 24,57, was sich in allen Gruppen annähernd gleich darstellt. Die Indikation für die Kinder- wunschbehandlung ist in dieser Gruppe hauptsächlich männlich und darauf zurück- zuführen, dass bei allen Paaren die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) durchgeführt wurde. Dies war notwendig, da die denudierten Eizellen nach der ICSI sofort in das ES zur dauerhaften Überwachung und Beurteilung eingesetzt wurden.
Die Beurteilung der morphologischen Eizellkriterien wurde ausschließlich an denu- dierten Eizellen durchgeführt.
Ebenso ist bei allen 3 rekombinanten FSH Präparaten die Stimulationsdauer mit 11,59 Tagen nahezu gleich. Der Mittelwert der Gesamtdosis des gespritzten FSH liegt bei 2332,66 IE, somit vergleichbar. Bei diesen Parametern zeigte sich keine Bedeutsamkeit, die Gruppen sind alle miteinander vergleichbar.
Der Durchschnitt der transferierten Embryonen liegt bei 1,43. Das Medikament Go- nal F zeigte im Vergleich dazu mit gemittelten 1,63 transferierten Embryonen einen leicht erhöhten Wert. Hier zeigt sich daher eine Signifikanz von P= 0,042.
Die durchschnittliche Anzahl der Eizellen lag bei 17,21. Die Rate der reifen Eizellen war ebenso vergleichbar mit 82,34 %. Der Durchschnitt der PN Stadien lag bei 9,43, die Befruchtungsrate bei 74,43 %, daher ergaben sich hier keine signifikanten Un- terschiede in den einzelnen Gruppen.
Ergebnisse aller 2 PN Stadien bezüglich Kultur und Kryokonservierung
In der Abbildung 9 ist dargestellt, wie viele der 2 PN Stadien weiterkultiviert und wie viele davon kryokonserviert wurden, in Abhängigkeit der einzelnen Medikamente.
Diese Tabelle zeigt die Vorgehensweise von Profertilita bezüglich des Algorithmus der Weiterkultur (siehe Kapitel 2.4 Abbildung 2).
Bemfola Gonal F Puregon
2 PN 306 (100%) 254 (100%) 345 (100%)
2 PN Kultur 161 (53%) 140 (55%) 179 (52%)
2 PN Kryokonservierung 144 (47%) 114 (45%) 165 (48%)
Abbildung 9: Übersicht PN Stadien
27
3.4 Eizellen ohne sichtbarer Aberrationen (mit maximaler Bewer- tung) nach Eizellbeurteilungsbogen
Die maximale Punktzahl der Eizellbeurteilung beträgt 11 Punkte, siehe Abbildung 3 in Kapitel 2.5.1.
505 Eizellen von 988 Eizellen haben diese Punktzahl (keinerlei Aberrationen) er- reicht, das entspricht 51,11%.
3.5 Ergebnisse der Eizellkultur in Abhängigkeit vom rekombinan- ten FSH
In der Abbildung 10 wurden die Daten der Eizellqualität in Bezug auf das gespritzte rekombinante FSH Produkt ausgewertet.
Eizellstruktur Alle Medika- mente
Bemfola (B)
Gonal F (G)
Puregon (P)
Statisti- sche Aus- wertung Erscheinung
Form
0 Punkte 27 (100%) 4 (14,8%) 11 (40,7%) 12 (44,4%)
0,093 1 Punkt 591 (100%) 199 (33,7%) 159 (26,9%) 233 (39,4%)
Erscheinung Größe
0 Punkte 21 (100%) 3 (14,3%) 6 (28,6%) 12 (57,1%)
0,137 1 Punkt 597 (100%) 200 (33,5%) 164 (27,5%) 233 (39,0%)
Zona pellucida
0 Punkte 96 (100%) 30 (31,3%) 24 (25,0%) 42 (43,8%)
0,660 1 Punkt 522 (100%) 173 (33,1%) 146 (28,0%) 203 (38,9%)
Polkörper
0 Punkte 16 (100%) 4 (25,0%) 4 (25,0%) 8 (50,0%)
0,813 1 Punkt 2 (100%) 1 (50,0%) 0 (0,0%) 1 (50,0%)
2 Punkte 600 (100%) 198 (33,0%) 166 (27,7%) 236 (39,3%) Zytoplasma
0 Punkte 82 (100%) 25 (30,5%) 21 (25,6%) 36 (43,9%)
0,699 1 Punkt 536 (100%) 178 (33,2%) 149 (27,8%) 209 (39,0%)
sER
0 Punkte 53 (100%) 10 (18,9%) 11 (20,8%) 32 (60,4%)
0,005 1 Punkt 565 (100%) 193 (34,2%) 159 (28,1%) 213 (37,7%)
Ergebnisse
28
Vakuolisierung
0 Punkte 40 (100%) 8 (20,0%) 13 (32,5%) 19 (47,5%)
0,280 1 Punkt 20 (100%) 4 (20,0%) 6 (30,0%) 10 (50,0%)
2 Punkte 558 (100%) 191 (34,2%) 151 (27,1%) 216 (38,7%) Einschlüsse
0 Punkte 24 (100%) 5 (20,8%) 11 (45,8%) 8 (33,3%)
0,117 1 Punkt 132 (100%) 36 (27,3%) 37 (28,0%) 59 (44,7%)
2 Punkte 462 (100%) 162 (35,1%) 122 (26,4%) 178 (38,5%)
Abbildung 10: Ergebnisse der Eizellqualität bezüglich rec FSH
Bei dieser Auswertung zeigten sich signifikante Unterschiede bei den Eizellen mit sER. Beim Medikament Puregon Follitropin beta war die Anzahl der betroffenen Ei- zellen signifikant höher als bei den anderen beiden Präparaten. Dies war der einzige Parameter mit signifikanten Unterschieden.
3.6 Ergebnisse der Eizellqualität in Bezug auf den Zyklusausgang
In der Abbildung 11 wurden die Daten aller beurteilten Eizellen in Bezug auf den Zyklusausgang ausgewertet.
Eizellstruktur Keine SS SS Statistische
Auswertung Erscheinung Form
0 Punkte 25 (92,6%) 2 (7,4%)
0,781
1 Punkt 538 (91,0%) 53 (9,0%)
Erscheinung Größe
0 Punkte 21 (100,0%) 0 (0,0%)
0,145
1 Punkt 542 (90,8%) 55 (9,2%)
Zona pellucida
0 Punkte 93 (96,9%) 3 (3,1%)
0,031
1 Punkt 470 (90,0%) 52 (10,0%)
Polkörper
0 Punkte 16 (100,0%) 0 (0,0%)
0,057
1 Punkt 1 (50,0%) 1 (50,0%)
2 Punkte 546 (91,0%) 54 (9,0%)
Zytoplasma
29
0 Punkte 77 (93,9%) 5 (6,1%)
0,339
1 Punkt 486 (90,7%) 50 (9,3%)
sER
0 Punkte 52 (98,1%) 1 (1,9%)
0,061
1 Punkt 511 (90,4%) 54 (9,6%)
Vakuolisierung
0 Punkte 37 (92,5%) 3 (7,5%)
0,774
1 Punkt 19 (95,0%) 1 (5,0%)
2 Punkte 507 (90,9%) 51 (9,1%)
Einschlüsse
0 Punkte 22 (91,7%) 2 (8,3%)
0,992
1 Punkt 120 (90,9%) 12 (9,1%)
2 Punkte 421 (91,1%) 41 (8,9%)
Abbildung 11: Ergebnisse der Eizellqualität bezüglich Zyklusausgangs
Einen signifikanten Unterschied zeigte die Beurteilung der Zona pellucida mit P=
0,031. Hier wurde mit 0 Punkten eine visuell auffällige Zona pellucida (z. B. dick, dünn, braun, oval) beurteilt und mit 1 Punkt eine visuell unauffällige Zona pellucida.
Außergewöhnlich ist, dass bei einer auffälligen Zona pellucida kaum eine Schwan- gerschaft entsteht. Die Zona pellucida Auffälligkeiten wurden zum Zeitpunkt der Ei- zellbeurteilung (nach der ICSI) festgehalten. Bei 3 Patientinnen (3,1 %) kam es bei einer auffälligen Zona pellucida zu einer Schwangerschaft, die Zona pellucida wurde bei allen drei Patientinnen nicht gelasert. Hierfür gibt es unterschiedliche Gründe, zum Beispiel wird als auffällig auch eine dünne oder ovale Zona gewertet, die aber nach unseren Vorgehensweisen keine Indikation für Laser Hatching darstellt. Die endgültige Entscheidung bezüglich Laser Hatching wird am Tag 2 oder 3 visuell nach den Auffälligkeiten der Zona pellucida entschieden.
Einen Unterschied, auch wenn nicht signifikant, aber sehr interessant, zeigte sich bei den sER, bei nur einer Eizelle mit einem sER konnte eine Schwangerschaft nachgewiesen werden. Die Schwangerschaft ist aus einer Eizelle mit sER entstan- den.
Keinen prognostischen Wert für die Eizell-Qualität zeigten die verschiedenen Arten der Vakuolisierung, das Erscheinungsbild des Zytoplasmas, die Form und die Größe der Eizelle und die nekrotischen Einschlüsse. Dieses Ergebnis ist hilfreich
Ergebnisse
30 für die Anzahl der weiterkultivierten PN Stadien um überzählige Embryonen zu ver- meiden (ESchG). Eizellen bzw. PN Stadien mit diesen morphologischen Merkmalen müssen nicht als auffällig bewertet werden.
3.7 Ergebnisse der Schwangerschafts- und Implantationsraten
Die Auswertung der Schwangerschaftsrate und Implantationsrate wurde zur Voll- ständigkeit ausgerechnet, hier wurden nur klinische Schwangerschaften mit Frucht- höhle und Herzaktion gewertet (7. Schwangerschaftswoche). Das Ziel der Studie war nicht die Beurteilung der Schwangerschafts- und Implantationsrate, sondern des Effekts der rekombinanten FSH Präparate auf die Eizell- und Embryoqualität.
Die Daten in der Abbildung 12 zeigen entweder den Mittelwert und die zugehörige Standardabweichung oder die absolute Häufigkeit (%). * ANOVA, ** Chi-Quadrat- Test.
Es zeigte sich in Kapitel 3.3., dass bei dem Medikament Gonal F die Anzahl der transferierten Embryonen signifikant höher ist als bei den anderen beiden Medika-
Mittelwert und Abwei- chung
Bemfola (B)
Gonal F (G)
Puregon (P)
Statistische Auswertung Patientenzahlen
[n] 96 35 27 34
Implantations- rate Frischzyk- lus [%]
45,83
(48,49) 38,57
(51,57) 50,00
(45,99) 50,00
(47,67) 0,544**
Implantations- rate kumulativ (inkl. Kryo Transfere) [%]
49,20
(46,65) 41,14
(50,69) 53,09
(44,10) 54,41
(44,44) 0,441**
Klinische SS- Rate Frischzyk- lus [%]
50 (52%) 15 (43%) 16 (59%) 19 (56%) 0,378**
Klinische SS- Rate kumulativ (inkl. Kryo Transfere) [%]
56 (58%) 17 (49%) 18 (67%) 21 (62%) 0,315**
Abbildung 12: Übersicht der Ergebnisse der Schwangerschaft- und Implantations- raten
31 menten. Ebenso ist auch die Schwangerschafts- und Implantationsrate etwas hö- her. Die signifikanten Unterschiede in der Anzahl der transferierten Embryonen beim Medikament Gonal F sind darauf zurückzuführen, dass zu Beginn der Studie noch mehr Embryotransfere mit zwei Embryonen durchgeführt wurden. Im Laufe der Studie wurde die Transferpolitik umgestellt und möglichst nur ein Embryo trans- feriert. Ein solches Ergebnis hätte jedoch nur einen Einfluss auf die Schwanger- schafts- und Implantationsrate, deren Untersuchung aber nicht das Ziel dieser Stu- die darstellt.
In die Auswertung der kumulativen Schwangerschafts- und Implantationsrate wur- den zusätzlich Kryozyklen aus vitrifizierten Embryonen mit einbezogen. Jedoch nur von inkludierten Patientinnen bzw. Zyklen. Vitrifizierte PN Stadien wurden aber nicht berücksichtigt, da in diesen Fällen keine zeitliche Auswertung der Entwicklung des Embryos im ES vorliegt. Insgesamt sind 35 Embryo Transfere nach Kryokonservie- rung und Auftaubehandlung in der Berechnung berücksichtigt.
3.8 Ergebnisse der embryonalen Entwicklung
Die Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse aller Embryonen zwischen Tag 2 und Tag 5.
Diese wurden an dem jeweiligen Transfertag der Patientin beurteilt und anschlie- ßend transferiert, vitrifiziert oder verworfen. Die Daten in der Abbildung 13 zeigen die absolute Häufigkeit (%). ** Chi-Quadrat-Test.
Alle Medi- kamente
Bemfola (B)
Gonal F (G)
Puregon (P)
Statisti- sche Aus- wertung Alle kultivierten
Embryonen [%] 480 161 (100 %) 140 (100 %) 179 (100 %) Entwicklungsfä-
hige Embryonen
[%] 297 106 (65,84%) 94 (67,14%) 97 (54,19%) B-G: 0,81**
B-P: 0,03**
G-P: 0,02**
Nicht entwick- lungsfähige Emb-
ryonen [%] 183 55 (34,16%) 46 (32,86%) 82 (45,81%) Transfer der ent-
wicklungsfähigen
Embryonen [%] 137 47 (34%) 44 (32%) 46 (34%) 0,7**
Ergebnisse
32
Kryokonservie- rung der entwick- lungsfähigen Emb- ryonen [%]
160 59 (37%) 50 (31%) 51 (32%)
Abbildung 13: Übersicht embryonale Entwicklung am Tag des Transfers
Die Studienergebnisse zeigen, dass bei dem Medikament Puregon signifikant we- niger entwicklungsfähige Embryonen nach Weiterkultur der PN-Stadien entstehen.
Dies aber keinen Einfluss auf die Schwangerschafts- und Implantationsrate hatte.
Der Grund dafür ist derzeit noch unklar.
3.9 Timing morphologischer Ereignisse, Auswertung einzelner Zellzyklen in Abhängigkeit vom Medikament
In diesem Kapitel wird die Auswertung der morphokinetischen Daten des ES in Ab- hängigkeit des rekombinanten FSH beschrieben.
Die folgenden Entwicklungsschritte (siehe Abbildung 14) wurden miteinander ver- glichen. Im Speziellen wurden der Zeitpunkt der Zellteilungen und die Zeitpanne zwischen den Zellteilungen in Abhängigkeit von dem jeweiligen Medikament und vom Ausgang des Zyklus untersucht.
Die Daten zeigen Median (Interquartile q1 - q3) und wurden mit dem Kruskal-Wallis- Test verglichen.
Zellzyklen Alle Bemfola
(B)
Gonal F (G)
Puregon (P)
Statistische Auswertung Anzahl aller Eizel-
len/Embryonen mit Zeiterfassung
618 (100%) 203 (33%) 170 (27%) 245 (40%)
t 2 – PN fading 3,00 (2,66; 4,00)
3,00 (2,67; 3,50)
3,00 (2,50; 3,57)
3,53 (2,67; 5,33)
<0,001 G-B: 0,63, G-P: <0,001, B-P: 0,001 t 4 – PN fading 15,34
(14,00;
18,00)
15,01 (14,00;
16,70)
15,00 (14,00;
16,33)
16,62 (14,01;
20,79)
0,011 G-B: 0,67, G-P: 0,007, B-P: 0,017
33 In der Abbildung 14 wurden die Zeiten anhand der Entwicklungsschritte der Eizellen bzw. Embryonen aus dem Time lapse ausgewertet und abhängig von den Medika- menten miteinander verglichen. Es wurden die verschiedenen Entwicklungsschritte ab gewägt und nur die gängigsten Entwicklungsschritte ausgewertet. Auf die Aus- wertung von t3 und t5 wurde verzichtet. Dies könnte in einer weiteren Studie aus- geweitet werden.
Es zeigte sich, dass es signifikante Unterschiede zwischen den Stimulationspräpa- raten bei der ersten und zweiten Zellteilung gab (t2).
Das Medikament Puregon zeigte bei der Teilung zum Zweizeller (t2) und zum Vier- zeller (t4) eine signifikante verzögerte Entwicklung im Vergleich zu Bemfola und Gonal F. Ab dem 8- zelligen Stadium gab es keine signifikanten Unterschiede mehr in der Entwicklungskinetik.
Festgestellt wurde, dass das Stimulationsmedikament einen Einfluss auf die mor- phokinetische Entwicklung von Embryonen hat.
3.10 Timing morphologischer Ereignisse, Auswertung einzelner Zellzyklen in Abhängigkeit vom Zyklusausgang
Die Daten in der Abbildung 15 zeigen Median (Interquartile q1 - q3) und wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen.
t 8 – PN fading 36,51 (29,73;
49,60)
36,34 (29,37;
51,19)
34,34 (29,32;
46,81)
39,60 (31,51;
50,87)
0,278
t 8 – t 5 10,00 (3,34;
22,34)
7,67 (3,00;
23,99)
13,00 (3,59;
21,73)
9,50 (3,84;
20,68)
0,933
t M – PN fading 67,48 (61,41;
74,58)
70,35 (63,73;
77,73)
64,99 (59,66;
73,88)
67,70 (61,80;
74,91)
0,082
t EB – PN fading 87,96 (84,91;
91,99)
88,32 (87,36;
91,86)
87,70 (85,98;
91,93)
86,58 (81,72;
92,18)
0,560
Abbildung 14: Zeitliche Entwicklungsschritte mit Daten aus dem ES bezüglich dem Medikamentenvergleich
Ergebnisse
34
Zellzyklen Keine SS SS Statistische
Auswertung t 2 – PN fading 3,03 (2,67; 4,04) 3,00 (2,50; 3,12) 0,001
t 4 – PN fading 15,68 (14,00; 18,75) 14,67 (13,66; 15,39) <0,001 t 4 – t 3 (s2) 1,00 (0,34; 3,34) 0,66 (0,33; 1,09) 0,002 t 8 – PN fading 39,53 (30,34; 55,82) 33,01 (28,34; 41,34) 0,001 t 8 – t 5 (s3) 12,35 (3,67; 24,14) 5,33 (2,67; 16,34) 0,002 tM – PN fading 69,37 (63,72; 76,13) 62,04 (58,32; 68,16) <0,001 tEB – PN fading 89,42 (86,46; 92,12) 86,89 (82,10; 91,07) 0,130
Abbildung 15: Zeitliche Entwicklungsschritte mit Daten aus dem ES bezüglich des Zyklusausgangs
In der Abbildung 15 wurde die Entwicklung verglichen bezüglich des Zyklusaus- gangs. Es wurden nur die Zyklen berücksichtigt und ausgewertet, in denen der im- plantierte Embryo eindeutig zugeordnet werden konnte. Das bedeutet konkret: die Auswertung erfolgt, wenn ein Single Embryotransfer (sET) oder ein Transfer von 2 Embryonen, der zu einer dichorealen Implantation führte (2 Fruchthöhlen), stattge- funden hat.
Nicht bewertet wurden vitrifizierte PN-Stadien und Zyklen die nach Transfer von 2 Embryonen zu einer Einlingsschwangerschaft geführt haben, da der implantierte Embryo nicht zugeordnet werden kann.
Embryonen die nach Vitrifikation transferiert wurden sind miteinbezogen.
Hier zeigten sich in allen Vergleichen signifikante Ergebnisse (siehe graphische Ab- bildung 16):
Teilung zum Zweizeller (t2)
Teilung zum Vierzeller (t4)
Teilung zum 8 Zeller (t8)
Zeitspanne zwischen t5 und t8
Kompaktierung zur Morula
Nicht signifikant war die zeitliche Entwicklung zur expandierten Blastozyste.
Die Anzahl der Embryonen wurden im Verlauf der Kulturtage immer kleiner, dies liegt entweder daran, dass Embryonen schon vorher transferiert wurden oder das
35 ein Embryo zu einem bestimmten Zeitpunkt bereits arretiert war. Deshalb erklärt sich auch warum die zeitliche Entwicklung zur expandierten Blastozyste nicht signi- fikant ist.
Abbildung 16: Graphische Abbildung der signifikanten Unterschiede
Ergebnisse
36 Abbildung 17: Graphische Darstellung aller ausgewerteten Entwicklungszeiten be- züglich Zyklusausgang
37 Abbildung 18: Graphische Darstellung t4 mit Nullpunkt PN Fading
Ergebnisse
38 Abbildung 19: Graphische Darstellung tM mit Nullpunkt PN Fading
3.11 Zusammenfassung der häufigsten Zeitfenster
In der Abbildung 20 werden die häufigsten zeitlichen Bereiche der Entwicklungs- schritte dargestellt in denen 90 % der Werte liegen. Die Zeiten wurden mit dem Zyklusausgang verglichen.
Zellzyklen Keine SS SS
PN fading 20,71 – 35,40 19,58 – 28,63
t2 – PN fading 2,00 - 11,84 2,00 - 5,80
t3 – PN fading 3,67 - 28,78 11,34 - 15,63
t4 – PN fading 5,67 - 33,69 12,34 - 17,41
39
t5 – PN fading 9,56 - 46,14 15,58 - 31,45
t6 – PN fading 16,47 - 57,12 22,88 - 34,30
t7 – PN fading 24,92 - 70,86 23,79 - 42,74
t8 – PN fading 26,14 - 74,60 24,96 - 48,93
t9 – PN fading 33,21 - 80,64 38,59 - 60,58
tM – PN fading 49,56 - 86,42 46,02 - 85,06
tSB – PN fading 70,39 - 91,31 63,80 - 88,70
tB – PN fading 77,49 - 92,52 71,72 - 93,85
tEB – PN fading 79,03 - 106,88 75,59 - 95,24
tHB- PN fading Zu wenig Werte Zu wenig Werte
Abbildung 20: Häufigste Zeitpunkte der Entwicklung
4 Diskussion; Zusammenfassung
Das Ziel dieser 3 armigen retrospektiven Studie war die Validierung des Einflusses von rekombinanten FSH auf die Eizellqualität und die embryonale Entwicklung.
Durch die einheitliche Kultur in einem einzigen ES konnten äußere Unterschiede, wie Licht, Temperatur, CO2-Konzentration und pH-Wert minimalisiert werden. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich bezüglich nachfolgenden Kriterien und Para- metern in Abhängigkeit vom jeweiligen Medikament.
Die betrachtete Patientengruppe ist in allen Parametern wie Patientenzahlen, Alter, BMI, Stimulationsdauer, Gesamtdosis FSH, Anzahl der Eizellen, Rate der reifen MII Eizellen, Anzahl der PN Stadien und Befruchtungsrate miteinander vergleichbar.
Abhängig vom Effekt des jeweiligen Stimulationsmedikamentes auf die Eizellquali- tät stellte sich die Frage, ob sich eine negative Prognose zur Eizellweiterentwicklung bereits vor der ICSI ableiten lässt.
Die Beurteilung der Zona pellucida ergab ein signifikantes Ergebnis, dieses ist auf die äußere Erscheinung (z. B. dick, dünn, oval, braun) bezogen. Zur Beurteilung der Zona pellucida gibt es Studien, die auf eine spezielle mikroskopische Untersuchung
Diskussion; Zusammenfassung
40 der Zona pellucida eingehen (Bewertung der Lichtbrechung von polarem Licht, ge- messener Parameter). Die Zona wird während des Wachstums und der Reifung der Eizelle angelegt. Die Qualität der Zona soll die Qualität der Eizelle widerspiegeln.
Eizellen mit einer qualitativ guten Zona haben eine höhere Wahrscheinlichkeit sich bis zum Blastozysten Stadium weiter zu entwickeln (höhere Blastozystenbildungs- rate). Durch die unterschiedliche Verfahrensweise ist es mit dieser Studie nicht ver- gleichbar.
In der Literatur wurde bestätigt, dass die Messung der inneren Zona Schicht ein Prädiktor für die Blastozystenrate war, jedoch war keine Prognose für die Implanta- tion nachweisbar15.
In dieser Studie wurden keine Differenzierungen im äußeren Erscheinungsbild- durchgeführt, es wurde nur zwischen auffällig und nicht auffällig unterschieden.
Trotz dieser einfachen Methode zeigte sich eine Signifikanz bezüglich des Zyklus- ausganges.
Im nächsten Merkmal der Eizellqualität, dem smoth endoplasmatischen Retikulum (sER) gibt es in der Literatur bereits Studien die das Vorhandensein eines sER als negative Prognose für die Eizell- bzw. Embryoqualität zeigen16.
Diese Studie bestätigt dies, da Eizellen mit einem sER nahezu nie zu einem mor- phologisch normal entwickelten Embryo geführt haben und es daher durchaus ab- geleitet werden könnte, solche Eizellen vor der Befruchtung auszusortieren. Dies kann nur umgesetzt werden, wenn bei der betroffenen Patientin ausreichend mor- phologisch normale Eizellen vorhanden sind.
Bezüglich der Vakuolisierung zeigte sich, dass Vakuolen kaum einen Einfluss auf die Entwicklung des Embryos und die Implantation haben. Somit können diese Ei- zellen normal behandelt werden und müssen nicht wie bisher in unserem Labor als auffällig zusätzlich kultiviert werden. Dadurch können in der deutschen Situation (ESchG) planwidrig überzählige Embryonen eher vermieden werden. In der Litera-
15 Vgl. Ebner et al. 2010
16 Vgl. Ebner et al. 2008
