Aus der Klinik für Neurologie (Prof. Dr. med. M. Bähr) im Zentrum Neurologische Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
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Charakterisierung der Skelettmuskelregeneration im Mausmodell der Einschlusskörpermyositis
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von Patrick Schellhöh
aus Lüneburg Göttingen 2013
Dekan: Prof. Dr. med. H. K. Kroemer I. Berichterstatter: Prof. Dr. med. J. Schmidt II. Berichterstatter/in: PD Dr. med. L. Klinge III. Berichterstatter/in: Prof. Dr. med. M.W. Sereda Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2014
I Inhaltsverzeichnis II Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis
1. Einleitung 7
1.1 Einschlusskörpermyositis 7 1.2 Tiermodell: IBM-Maus 10
1.3 Notexin 11
1.4 Versuchsablauf 12
1.5 Evans Blue 12
1.6 Klinische Verlaufsparameter 12
1.7 Expression entzündungsassoziierter Gene 13
1.7.1 CXCL9 13
1.7.2 β-2-Mikroglobulin 13
1.7.3 Interleukin-6 13
1.7.4 Interleukin-1β 14
1.8 Expression degenerationsassoziierter Gene 14
1.8.1 MURF1 14
1.9 Expression regenerationsassoziierter Gene 14
1.9.1 Myogenin 15
1.9.2 MyoD 15
1.9.3 Myf5 16
1.9.4 MYH8 16
1.9.5 Pax7 16
1.10 Ziel dieser Arbeit 17
2. Material und Methoden 18
2.1 Tiere 18
2.1.1 IBM 18
2.1.2 B6J 18
2.2 Notexin 18 2.3 Versuchsablauf 18 2.4 Klinischer Grad 20 2.5 Kraftmessung 21 2.6 RotaRod 22 2.7 Gewebeaufbereitung 22
2.8 Histologie 22
2.9 Auswertung der Gewebeschnitte 22
2.10 RNA-Extraktion und cDNA-Synthese 23
2.11 Quantitative PCR 24
2.12 CK-Messungen 25
2.13 Statistik 25
3. Ergebnisse 26
3.1 Etablierung des Versuchsmodells 26
3.1.1 Klinischer Verlauf nach Injektion in den Musculus soleus 26
3.1.2 CK-Serumspiegel 27
3.1.3 Histologie des Musculus soleus 28
3.1.4 Evans-Blue gestützte Kontrolle der Injektionstechnik in den Musculus tibialis anterior 30
3.1.5 RotaRod-Messungen 32
3.2 Charakterisierung der regenerativen Kapazität 32 3.2.1 Klinischer Verlauf 32
3.2.2 CK-Serumspiegel 38
3.2.3 Histologische Untersuchungen 39
3.2.4 Expression entzündungsassoziierter Gene 42
3.2.4.1 CXCL9 42
3.2.4.2 β-2-Mikroglobulin 43
3.2.4.3 Interleukin-6 43
3.2.4.4 Interleukin-1β 44
3.2.5 Expression degenerationsassoziierter Gene 45
3.2.5.1 MURF1 45
3.2.6 Expression regenerationsassoziierter Gene 46
3.2.6.1 Myogenin 46
3.2.6.2 MyoD 47
3.2.6.3 Myf5 47
3.2.6.4 MYH8 48
3.2.6.5 Pax7 48
4. Diskussion 50 5. Zusammenfassung 63
6. Literaturverzeichnis 66
II Abkürzungsverzeichnis
* Multiplikationszeichen, in Abbildungen p<0,05
** in Abbildungen p<0,01
*** in Abbildungen p<0,001
Abb. Abbildung
β Beta
β2M β-2-Mikroglobulin B6J Kontrollmausstamm/Wildtyp bzw. beziehungsweise
cDNA complementary Desoxyribonucleinsäure CK Kreatinkinase
CO2 Kohlenstoffdioxid
CXCL9 CXC-Ligand 9 et al. et alii (und andere) Gamma einfügen
g Gramm GAPDH Glyzerin-Aldehyd-3-Dehydrogenase γ Gamma
GSM Grip-Strengh-Meter
GSK3-β Glykogensynthase-Kinase 3-β
h Stunde hIBM hereditäre IBM
IBM Einschlusskörpermyositis
i.M. intramuskulär IL-1β Interleukin-1β
IL-6 Interleukin-6 kg Kilogramm
l Liter LD50 mittlere Letaldosis
m Meter, milli µ Mikro MHC I Major Histocompatibility Complex I mRNA messenger Ribonucleinsäure MRT Magnetresonanztomographie N Newton
qPCR quantitative Polymerasekettenreaktion
Tab. Tabelle
U units
vs. versus vgl. vergleiche
III Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Regenerationsassozierte Gene im Zeitverlauf 15
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs 19 Abbildung 3: IBM-Maus bei der Griffkraftmessung 21 Abbildung 4: Klinischer Grad der Versuche am M. soleus 27 Abbildung 5: Kreatinkinasespiegel im Serum (Versuche am M. soleus) 28 Abbildung 6: Histologische Kontrollschnitte vom M. soleus 29 Abbildung 7: Histologische Schnitte vom M. soleus nach Injektion von
Notexin 30
Abbildung 8: Evans-Blue gestützte Kontrolle der Injektionstechnik 31
Abbildung 9: Klinischer Verlauf (Versuche am M. tibialis anterior) 34 Abbildung 10: Regenerationszeiträume (Versuche am M. tibialis anterior) 35
Abbildung 11: Lineare Regression (Versuche am M. tibialis anterior) 36
Abbildung 12: Absolute Griffkraft im Verlauf 37 Abbildung 13: Relative Griffkraft im Verlauf 38 Abbildung 14: Kreatinkinasespiegel im Serum
(Versuche am M. tibialis anterior) 38 Abbildung 15: Histologische Schnitte im Verlauf nach Notexin-Injektion
in den M. tibialis anterior 40 Abbildung 16: Graphische Darstellung der semiquantitativen Nekrose-
und Regenerationsgrade 41 Abbildung 17: Expression entzündungsassoziierter Gene 44
Abbildung 18: Expression degenerationsassoziierter Gene 46 Abbildung 19: Expression regenerationsassoziierter Gene 49
IV Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Klinische Bewertungstabelle 20
Tabelle 2: Bewertungstabelle für die Histologie 23
1. Einleitung
1.1 Einschlusskörpermyositis
Die Einschlusskörpermyositis (engl. inclusion body myositis; IBM) ist eine entzündliche Muskelerkrankung und die häufigste erworbene Myopathie im Patientenkollektiv über 50 Jahren (Griggs und Rose 2007).
Die ersten Beschreibungen gehen auf das Jahr 1967 zurück. Zu dieser Zeit wurden erstmalig strukturelle Veränderungen in Muskelbiopsien beschrieben, die nach heutigen Maßstäben als IBM-ähnlich zu bezeichnen sind, darunter filamentöse Einschlüsse im Zytoplasma und Nukleus und die Zentralisierung dieser (Chou 1967).
Der Begriff „inclusion body myositis“ wurde 1971 eingeführt (Yunis und Samaha 1971).
Die Prävalenz der IBM ist nicht eindeutig gesichert, die Angaben differieren zwischen 4,9/Million in den Niederlanden und 9,3/Million in West-Australien (Badrising 2000;
Phillips 2000). Zur Inzidenz finden sich Angaben von 2,23/Million in Göteborg, Schweden (Lindburg et al. 1994). Studien ergaben eine scheinbare Zunahme der Prävalenz, welche allerdings auf eine erhöhte Diagnoserate der IBM zurückgeführt wird (van der Meulen 2003). Es wird vermutet, dass 60 - 70 % aller neu diagnostizierten erworbenen Myositiden auf eine IBM zurückzuführen sind. 80 % der Patienten zeigen einen Krankheitsbeginn nach dem 50ten Lebensjahr (Lotz et al.
1989). Das Geschlechterverhältnis wird mit 2:1 zu Ungunsten des männlichen Geschlechts angegeben (Badrising, 2000).
Die IBM ist charakterisiert durch eine schleichend beginnende, progressive Schwäche proximaler sowie distaler Muskelgruppen, vor allem aber sind hier der vierköpfige Kniestrecker (Musculus quadrizeps femoris) und die tiefen Fingerbeuger (Musculus flexor digitorum longus und Musculus flexor indices) zu nennen (Amato et al. 1996). Im späteren Krankheitsverlauf sind viele Patienten auf Hilfsmittel wie Rollstühle angewiesen. Auch bulbäre Verlaufsformen mit Beeinträchtigung der Speiseröhre wurden beschrieben (Rose und Griggs 2007).
Bis heute ist es nicht gelungen eine effektive Therapie zu entwickeln. Weder eine Gabe von Immunglobulinen, noch Glukokortikosteroiden oder Zytostatika führten zu einer reproduzierbaren Verbesserung der verbliebenden Kraft (Griggs 2006).
Die Pathogenese der IBM ist weitestgehend ungeklärt. Biopsien von betroffenen Muskeln zeigen regelmäßig sowohl atrophische wie auch hypertrophische Muskelfasern (Verma et al. 1992). Ausserdem findet sich eine Zunahme des um die Muskelfasern befindlichen Binde- und Fettgewebes, sowie eine erhöhte Durchsetzung der Proben mit CD4+- und CD8+-positiven T-Zellen (Arahata und Engel 1984;1988). Darüber hinaus finden sich in den Muskelfasern typische Proteinablagerungen, die sogenannten „red-rimmed vacuoles“, die aufgrund ihrer Anfärbbarkeiten ihre Bezeichnung erhielten, und vor allem β-Amyloid, phos- phoryliertes Tau und weitere Proteine enthalten, wie man sie auch bei degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie etwa Morbus Alzheimer, findet.
Diese Beobachtungen sprechen sowohl für eine degenerative als auch eine entzündliche Komponente der Pathogenese der IBM.
2004 konnte gezeigt werden, dass sich neben den beschriebenen Veränderungen in Biopsien von IBM-Patienten Anzeichen für eine ständig ablaufende Regeneration finden (Armardottir et al. 2004). Was eine ständige und zugleich erfolgreiche Regeneration allerdings unwahrscheinlich erscheinen lässt, ist das Ergebnis einer Studie aus dem Jahr 1997, in der beschrieben worden ist, dass neben den erwähnten Therapieansätzen auch ein strukturiertes Training der Muskulatur keinen verbessernden Effekt auf die Kraft der Patienten hat (Spector et al. 1997). Eine Studie zu möglichen MRT-morphologischen Veränderungen ergab passend dazu und passend zu der histologisch nachgewiesenen Vermehrung von Fett- und Bindegewebe (Arahata und Engel 1984) eine auffällig erhöhte Durchsetzung der Muskeln der IBM-Patienten mit Fettgewebe. Ausserdem zeigten sich die zu erwartenden inflammativen Veränderungen, welche aber im Vergleich als MRT- morphologisch weniger im Vordergrund stehend zur Darstellung kamen (Cox et al.
2011).
Zellkulturversuche an Myoblasten, die aus Proben von IBM-Patienten gewonnen wurden, ergaben eine verminderte Proliferationsrate und eine vermindert Fähigkeit zur Klonierung (Morosetti et al. 2010). In der selben Studie beschrieben die Autoren eine im Vergleich zu Kontrollen verminderte Konzentration der aktivierten Form der Glykogensynthase-Kinase 3-β (GSK3-β) und eine Akkumulation ihres Substrats β- Catenin. Die Phosphorylierung von β-Catenin durch die GSK3-β und die
dazugehörige Signalkaskade gehört zu den induzierenden Schritten der Myogenese (Polesskaya et al. 2003).
Schon 2006 wurden Daten veröffentlicht, die eine verminderte Differenzierung von IBM-Mesangioblasten in Myoblasten bzw. Myozyten beschreiben. Diese ließen sich auf eine verminderte Expression von MyoD zurückführen (Morosetti et al. 2006).
Eine weitere Veröffentlichung fasste Daten zusammen, die auf eine erhöhte Expression antiregenerativer Faktoren wie den „tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis“ und den dazugehörigen Rezeptor Fn14, in Zellkultur- experimenten und Muskelbiopsien von betroffenen Muskeln im Vergleich zu Kontrollen hindeuteten (Morosetti et al. 2012). Diese konnten zeigen, dass eine Inhibition dieser Faktoren die Differenzierung in Muskelgewebe verbesserte. Eine ebenfalls aus dem Jahr 2012 stammende Studie untersuchte die Expression regenerationsassoziierter Faktoren an Biopsien von betroffenen Muskeln. Es zeigte sich ein erhöhtes Auftreten Pax7+und Myogenin+-Zellen bzw. Muskelfasern, während die Zahl der MyoD+-Fasern vermindert war. MyoD ist in der Myoneogenese an der Aktivierung von Pax7beteiligt, die Ergebnisse ließen sich sowohl mit dem Auffinden ständiger Regeneration in IBM-Muskeln als auch dessen Ineffektivität vereinbaren (Wanschitz et al. 2012).
In dem multifaktoriellen Modell der Pathogenese der IBM sind degenerative Aspekte, Entzündungsreaktionen und eventuell Verminderungen der regenerativen Kapazität aber nicht als getrennte Bereiche zu sehen. Viel mehr wurden bereits Interaktionen zwischen der Expression des proinflammatorischem Zytokin Interleukin-1β und dem Auftreten degenerativer Amyloidablagerungen beschrieben (Schmidt et al. 2008).
Über eine Veränderung der Proteasomaktivität lassen sich auch Beziehungen zwischen Amyloidablagerungen und der Aktivität der Glykogensynthase-Kinase 3-β in der Literatur finden (Terracciano et al. 2010), was eine mögliche Verbindung zwischen degenerativen Aspekten und Veränderung der Regenerationsabläufe bzw.
der regenerativen Kapazität sein könnte. Weiterhin finden sich Arbeiten, die eine veränderte Reaktion auf Zellstressmechanismen in Zellkulturen von IBM- Muskelzellen beschreiben. So konnte gezeigt werden, dass bei Exposition mit IL-1β und Interferon-γ eine erhöhte Expression von zellstressassoziierten Proteinen gleichbedeutend mit einer vermehrten Akkumulation von Amyloidstrukturen zu finden
Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre sprechen für eine Verminderung der regenerativen Kapazität als dritte Komponente in der Pathogenese der IBM. Neben Degeneration und Entzündung könnte eine anhaltende Verminderung der Regenerationskapazität bzw. frustrane Regeneration Teil der Erklärung für die Entstehung dieser Erkrankung sein, dies bildet die Grundlage der vorliegenden Arbeit.
Neben der beschriebenen Form der Erkrankung ist eine hereditäre Einschluss- körpermyositis (hIBM) mit ähnlichen, allerdings früher beginnenden familiär gehäuften Verläufen bekannt, welche allerdings in dieser Arbeit nicht eingehender betrachtet werden soll.
Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass es sich bei der IBM um eine seltene entzündliche Myopathie handelt, die vor allem bei älteren Patienten auftritt. Eine Behandlung konnte bis heute nicht entwickelt werden. Die Pathogenese ist nur in Teilen geklärt. Es finden sich aber Beschreibungen von degenerativen und entzündlichen Aspekten, hier wird vorallem Interleukin-1β als Einflussfaktor beschrieben. Weiterhin finden sich Auffälligkeiten bei regenerationsassoziierten Faktoren wie Myogenin, MyoD und Pax7. Die Regenerationsprozesse in IBM- Muskeln sind Gegenstand aktueller Forschung. Bisher wurden aber keinerlei in vivo- Daten aus einem Tiermodell veröffentlicht, die sich mit der Skelettmuskel- regeneration beschäftigen. Hieraus leitet sich die zentrale Fragestellung dieser Arbeit ab.
1.2 Tiermodell: IBM-Maus
Die IBM-Maus stellt ein hinreichend etabliertes Tiermodell für die IBM da, welches 2006 durch die Arbeitsgruppe von Masashi Kitazawa eingeführt wurde. IBM-Mäuse sind doppelt transgen für die menschlichen Gene für das Amyloid-Precursor-Protein (APP) in der schwedischen Mutation und für das Protein Präsenilin (Kitazawa et al.
2006;2008). Beide Mutationen werden durch den Promotor für die Kreatinkinase co- dominiert, woraus sich eine Spezifität für Muskelzellen ergibt. Die Kombination der Mutationen führt zum einen zu einer IBM-typischen Ablagerung von Proteinen in den Muskelzellen. Zum anderen zu histopathologischen Veränderungen, die sich typischerweise auch in Biopsien von IBM-Patienten finden lassen, wie eine
und eine vermehrte Invasion durch inflammatorische Zellen (Kitazawa et al.
2006;2008). Auch eine Veränderung bzw. Erhöhung der Aktivität der GSK 3-β würde für die IBM-Mäuse beschrieben (Kitazawa et al. 2008).
Betrachtet man die Studienlage und das Fehlen von in vivo-Daten im Hinblick auf Untersuchung der Regeneration bietet sich dieses Tiermodell für entsprechende Untersuchungen an.
1.3 Notexin
Notexin ist eine aus dem Gift der australischen Tigerschlange (Notechis scutatus scutatus) gewonnene Phospholipase vom A2-Typ, die zwei bekannten Isoformen sind in ihrer Wirkung völlig identisch (Chwetzoff et al. 1989).
Die toxische Wirkung kommt über eine Entleerung der Acetylcholinspeicher, mit darauf folgender Kontraktion der Muskulatur und anschließendem Untergang der Synapsen zustande (Merbs, D. 2004). Weiterhin führt Notexin zu einem lokalen Gewebsuntergang, der, wie Dixon und Harris 1996 zeigen konnten, auf einer direkt myotoxischen Wirkung durch Zerstörung der Zellmembranen basiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine Toxizität bezogen auf Satellitenzellen oder eine Beeinflussung der Basallamina und der Mikrozirkulation durch Notexin auszu- schließen ist (Harris 1992). Satellitenzellen, Basallamina und Mikrozirkulation sind besonders relevant für die Neubildung von Muskelfasern. Die Induktion von Nekrose - ohne die genannten drei Komponenten zu stören - ist daher eine optimale Wirkweise für die Untersuchung der Skelettmuskelregeneration.
Vom Zeitpunkt der Injektion bis zum Zeitpunkt der maximalen Muskelschädigung vergehen laut Literatur 12 - 24 Stunden (Harris et al. 2000), allerdings sind bereits nach 48 Stunden die ersten Anzeichen für Regenerationsprozesse gezeigt worden (Harris et al. 2000). Eine vollständige Regeneration im Sinne einer „Restitutio ad integrum“ wurde für Ratten nach einem Zeitraum von 21 - 28 Tagen beschrieben (Harris et al. 2000).
Aufgrund dieser Eigenschaften kam Notexin in den im folgenden dargestellten Versuchen zum Einsatz um einen kontrollierten und reproduzierbaren Muskel- schaden zu induzieren. Notexin zeigt eine schwankende Bioaktivität, daher war es
notwendig chargenbetreffend zunächst eine Titration durchzuführen und die geeignete Giftmenge zur Injektion für die Versuche zu etablieren.
1.4 Versuchsablauf
Ein Versuchsablauf, der die Möglichkeit zur adäquaten Untersuchung und Beurteilung der Regeneration gewährleistet, muss zum einen eine reproduzierbare Schädigung der Muskulatur beinhalten. Zum anderen muss eine klinische Beurteilung an entsprechend praktikablen und hinreichend beurteilbaren Verlaufs- parametern, sowie eine beurteilbare und genügend sensitive weitere Untersuchung der den Tieren entnommenen Geweben und Blutproben möglich sein. Hierbei kamen neben histologischen Untersuchungen auch Analysen der Genexpression zum Einsatz.
Die direkte Injektion von Notexin in Skelettmuskeln zur Nekroseinduktion mit folgender Beobachtung und Untersuchung gilt als etabliertes Modell zum Studium von Skelettmuskelregeneration (Chiu et al. 2009).
Weitere Spezifika werden im Folgenden im Unterpunkt 2.3 Versuchsablauf dargestellt werden.
1.5 Evans Blue
Evans Blue-Lösung ist ein bläulicher Farbstoff, für den gezeigt worden ist, dass er sich in (geschädigten) Muskelfasern mit erhöhter Membranpermabilität anreichert und dort sowohl makroskopisch durch die bläuliche Färbung, als auch mikroskopisch über eine, im Rotbereich liegende, Fluoreszenz nachweisen lässt (Matsuda et al.
1995). Nach intravenöser und intraperitonealer Injektion kam es gleichermaßen zu Anreicherungen in geschädigten Muskelfasern von mdx-Mäusen (Hamer et al. 2002).
In den Versuchen, welche der vorliegenden Arbeit zugrunde liegen, wurde 1%ige Evans Blue-Lösung zusammen mit dem Schlangengift injiziert, um eine Kontrolle der Verteilung desselbigen und dem Schädigungsausmaß zu ermöglichen.
1.6 Klinische Verlaufsparameter
Um die Regeneration der Muskulatur klinisch kontinuierlich beobachten zu können erfolgte die regelmässige Erhebung verschiedener klinischer Verlaufsparameter.
Täglich wurde das Laufbild der Mäuse anhand einer selbstentwickelten 5-Punkte-
Bewertungstabelle eingestuft, welche auf die Bedingungen des Versuches angepasst war. Alle 48 Stunden wurde die Griffkraft der Tiere mittels eines Grip-Strengh-Meters (TSE Systems, Bad Homburg) ermittelt, zusätzlich wurde an diesen Tagen das Gewicht der Tiere gemessen um die Griffkraft relativieren zu können.
1.7 Expression entzündungsassoziierter Gene
Die Untersuchung der Genexpression auf Ebene der Transkription gilt als gute Möglichkeit, die Aktivität verschiedener Gewebe, in diesem Fall der Skelett- muskulatur, und den Ablauf verschiedener Kaskaden zu betrachten. Neben Genen, die für regenerative Prozesse relevant sind, werden in der vorliegenden Arbeit auch entzündungsassoziierte Gene untersucht. Die untersuchten Gene sind übliche Entzündungsmarker, vor allem Interleukin-1β (Schmidt et al. 2008; Muth et al. 2009) ist in anderen Arbeiten bereits eine mögliche Rolle in der Pathogenese der IBM zugesprochen worden.
1.7.1 CXCL9
Das Gen des CXC-Ligand 9 (CXCL9) kodiert für ein Protein, welches, zusammen mit Proteinen wie dem CXC-Ligand 10, in eine Gruppe homologer, entzündungs- assoziierter Chemokine zu klassifizieren ist. Exprimiert und sezerniert wird dieses überwiegend von Makrophagen. Es ist als entzündungsfördernder Botenstoff zu bezeichnen und findet sich dementsprechend häufig überexprimiert in entzündlich veränderten Geweben. CXCL9 bindet an den CXCR3-Rezeptor, der auf Zellen der Immunabwehr präsentiert werden und kann über diesen Mechanismus eine chemotaktische Wirkung erzielt (Agostini et al. 2001).
1.7.2 β-2-Mikroglobulin
Das β-2-Mikroglobulin (β2M), kodiert durch das gleichnamige Gen, ist Teil des MHC I (Major histocompatibility complex), der von allen kernhaltigen Zellen auf der Oberfläche präsentiert wird. Eine Überexpression ist ebenfalls entzündungsassoziiert (Pérarnau et al. 1990).
1.7.3 Interleukin-6
Interleukin-6 (IL-6) gehört in die Gruppe der proinflammatorischen Zytokine. Es wird in einer Vielzahl von Zellen und Geweben synthetisiert, unter anderem Makro- phagen, Fibroblasten und Endothelzellen. IL-6 nimmt eine zentrale Position in der Immunabwehr und den Entzündungsreaktion von Säugetieren ein und vermittelt dabei zwischen angeborener und erworbener Immunabwehr. Dementsprechend ist eine erhöhte Expression bei Entzündungsreaktionen zu erwarten (Jones 2005).
1.7.4 Interleukin-1β
Interleukin-1β (IL-1β) ist ebenfalls in die Gruppe der proinflammatorisch relevanten Zytokine zu klassifizieren und wird hauptsächlich durch Monozyten synthetisiert. Die Funktion besteht vorrangig in der Aktivierung von T-Zellen (Gery et al. 1972).
1.8 Expression degenerationsassoziierte Gene 1.8.1 MURF1
MURF1, durch das gleichnamige Gen kodiert, ist ein so genanntes Zink-Finger Protein, welches an Titin-Proteine in der M-Line von Skelettmuskeln binden kann.
(Centner et al. 2001). Eine Überexpression wurde vor allem im Kontext von Muskelschädigung im Sinne von Degeneration und Atrophie beschrieben.
1.9 Expression regenerationsassoziierte Gene
Im Folgenden werden die Gene beschrieben, welche als Regenerationsmarker analysiert wurden. In der Literatur lassen sich für alle untersuchten Gene Bezüge zur IBM finden, vor allem aber die Expression von MyoD, Pax7 und Myogenin war mehrfach Ziel von Untersuchungen auf verschiedenen Ebenen der Expression (Morosetti et al. 2006; 2012; Wanschitz et al. 2012). Abbildung 1 zeigt eine Darstellung, die unter anderem die Aktivierung und Wirkung der untersuchten Gene bei der Induktion von Myoneogenese darstellt.
Abbildung 1: Regenerationsassozierte Gene im Zeitverlauf (Abbildung entnommen aus: LeGrand und Rudnicki, 2007)
1.9.1 Myogenin
Myogenin ist ein zentraler Transkriptionsfaktor und induziert seinerseits die Synthese weiterer für die Muskelregeneration relevanter Faktoren. Eine erhöhte Expression findet sich besonders häufig in regenerierenden oder wachsenden Muskelzell- verbänden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine Ähnlichkeit als auch eine Beziehung zwischen der „Myogenetic-differentiation-protein-Familie“ und Myogenin besteht (Edmondson und Olson 1989). Ausserdem zeigten die Autoren in der gleichen Arbeit, dass Myogenin die Differenzierung von pluripotenten Zellen in eine myogene Zellreihe induzieren kann. Während MyoD als einer der ersten Marker für regenerative Prozesse in Skelettmuskulatur bzw. der Differenzierung in eine myogene Zellreihe gilt wird Myogenin eher am Ende dieser Kaskade gesehen (Edmondson und Olson 1989).
1.9.2 MyoD
Das Myogenetic differentiation protein-Gen (MyoD) kodiert für ein Protein, welches in eine Gruppe mit Myogenin und Myf5 zu zählen ist, und gehört ebenfalls zu den Faktoren, deren Wirkung zu erhöhtem Muskelzellwachstum bzw. erhöhter Muskelregenration führen. Es wird von Satellitenzellen synthetisiert und gehört zu den frühsten messbaren Markern für muskellzelluläre Regeneration. Es wurde gezeigt, dass die Expression von MyoD elementarer Bestandteil der Induktion einer myogenen Zelllinienentwicklung ist und dabei für eben diese Gewebe spezifisch ist
(Weintraub et al. 1991), dabei besteht eine direkte Interaktion mit Myogenin (Edmondson und Olson 1989).
1.9.3 Myf5
Das Gen Myf5 wird, wie bereits erwähnt, in eine Gruppe mit Myogenin und MyoD klassifiziert. Es handelt sich auch in diesem Fall um einen Transkriptionsfaktor. Eine zentrale Funktion nimmt Myf5 ebenfalls in der Differenzierung von Fibroblasten in Myoblasten und der Induktion kontraktiler Elemente ein (Charles P. Emerson Jr 1993).
1.9.4 MYH8
MYH8 kodiert für die Myosin-schwere-Kette (engl. Myosin heavy chain), in seiner perinatalen Isoform, ein Protein in Skelettmuskelzellen, welches für die Umsetzung von Energie aus Adenosin-Triphosphat-Molekülen in Bewegungsenergie notwendig ist (Weiss 1996). Eine Mehrexpression in diesem Fall spricht somit ebenfalls für ein vermehrtes Wachstum bzw. Regeneration von Skelettmuskelzellen, da die schwere Myosinkette elementarer Bestandteil dieser Zellverbände ist. Im zeitlichen Verlauf ist eine Überexpression eher am Ende der untersuchten Gene zu erwarten.
1.9.5 Pax7
Pax7 ist die Bezeichnung eines Proteins, welches ebenfalls eine zentrale Rolle in der Regeneration bzw. Differenzierung von Muskelzellen, aber auch anderen Gewebeverbänden wie z.B. Nerven, spielt. Seine Funktion wird im Bereich der Aktivierung von Satellitenzellen gesehen, die diesen Transkriptionsfaktor auch selbst prozessieren. Auch ein direkter Effekt auf die Expression von MyoD konnte gezeigt werden (Zammit et al. 2006). Andere Arbeiten zeigten eine Aktivierung von Pax7+- Myoblasten durch MyoD-Expression. Eine Überexpression ist also zeitlich nah zu MyoD zu erwarten. Die Gesamtheit der Effekte von Pax7 konnte bisher nicht endgültig geklärt werden.
1.10 Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit ist es, an Hand eines geeigneten Mausmodells nachzuvollziehen, in wieweit die regenerative Kapazität der Skelettmuskulatur bei der IBM beeinträchtigt ist und somit erste in vivo-Daten aus einem Tiermodell zu dieser Fragestellung zu generieren. Hierzu soll zunächst ein geeigneter Versuchsaufbau entwickelt und etabliert werden. In der Durchführung der Versuche soll neben der Betrachtung der klinischen/phänotypischen Regeneration, im Verlauf nach einer definierten Muskelschädigung, auch die histologische Beurteilung und eine Untersuchung der Expression einiger geeigneter, weitestgehend muskelspezifischer, entzündungs- sowie regenerations-assoziierter Gene durch quantitative Polymeraseketten- reaktionen (qPCR) zur Beurteilung herangezogen werden. Hier sind vor allem IL-1β auf Seiten der Entzündung, sowie Myogenin, MyoD und Pax7 auf Seiten der Regeneration zu nennen, da sich in der Literatur bereits auffällige Untersuchungen an der IBM zu diesen Genen finden. Die übrigen Marker sollen die Untersuchung von Regeneration und Entzündung auf Transkriptionsebene komplettieren. Für die histologischen und klinischen Beurteilungen sollen Bewertungsschemata aufgestellt und etabliert werden, die sich zum Einsatz in diesem Modell eignen.
2. Material und Methoden
2.1 Tiere
Die Versuche wurden an IBM- sowie B6J-Mäusen durchgeführt, wobei die B6J-Tiere als Wildtyp/Kontrolle dienten. Alle Tiere wurden in Plastikkäfigen gehalten und erhielten das in der zentralen tierexperimentellen Einrichtung der UMG übliche Nagerfutter und gewöhnliches Wasser. Die Experimente waren von den zuständigen Veterinärbehörden genehmigt. Bei ihrer Durchführung wurden die Bestimmungen der Bezirksregierung Braunschweig, Niedersachen eingehalten.
2.1.1 IBM
Bei den IBM-Mäusen handelt es sich um doppelt transgene Mäuse für die humanen APP-, in der schwedischen Mutation, und Präsenilin-Gene unter dem Kreatinkinase- Promotor. Sie entstammen einer eigenen Züchtung, die nötigen Zuchttiere hierfür wurden freundlicherweise von Herrn Kitazawa, University of California, Irvine, USA bereitgestellt.
2.1.2. B6J
Die B6J-Tiere entstammen einer Züchtung der zentralen Tierexperimentellen Einrichtung der Universitätsmedizin Göttingen.
2.2 Notexin
Das eingesetzte Notexin ist ein Produkt von Latoxan, Valence, Frankreich. Die Reinheit wurde mit 93 % und die Toxizität mit einer minimalen LD 50 von 25 µg/kg Maus bei intravenöser Injektion angegeben.
2.3 Versuchsablauf
IBM- und B6J/Wildtyp-Tiere wurden in gleich große Gruppen von 12 Tieren mit Individuen vergleichbaren Alters aufgeteilt. Hierbei wurde darauf geachtet bei nicht verhinderbaren Altersunterschieden die Wildtypmäuse im Zweifel älter zu wählen, um eine schlechtere Regeneration aufgrund von Alterseffekten in der untersuchten Gruppe der IBM-Tiere zu verhindern. Vor den Injektionen wurden alle Mäuse auf Auffälligkeiten im Laufbild beobachtet und diese Tiere gegebenenfalls gegen unauffällige Tiere ausgetauscht. Ausserdem erfolgte bei allen Tieren eine Griffkraft-
und eine Gewichtsmessung um einen relativierten Ausgangswert generieren zu können.
Am Tag 0/Tag der Schädigung erfolgte die intramuskuläre Injektion von 0,5 µg Notexin in 100 µl 0,9 %iger NaCl-Lösung mittels einer U-100 Insulin-Spritze (BD Micro-Fine+, BD Medical - Diabetis Care, Heidelberg, Deutschland) in den rechten Musculus tibialis anterior aller Mäuse. Zusätzlich wurden 100 µl 0,9 %ige NaCl- Lösung in den linken Musculus tibialis anterior injiziert, dieser diente als endogene Kontrolle, um rein traumatische Effekte der Injektionsnadel und der mechanischen Traumatisierung nachvollziehen zu können.
Es folgte eine Regenerationsphase von insgesamt 14 Tagen (im Folgenden als Tag 1 bis Tag 14 bezeichnet), während derer die Tiere täglich bezüglich ihres klinischen Zustandes und Laufbildes untersucht wurden. In 48 Stundenintervallen (Tag 2, Tag 4, ff.) fanden zusätzlich Messungen bezüglich Griffkraft und Gewicht der Tiere statt.
An den Versuchstagen 4, 10 und 14, in der schematischen Darstellung bezeichnet als Präparationstag 1, 2 und 3, wurden jeweils Teilgruppen von 4 Mäusen aus beiden Versuchsgruppen durch eine letale CO2-Konzentration getötet und präpariert. Hierbei wurden, wie im Folgenden beschrieben, Proben der betreffenden Muskeln gewonnen und diese sowohl zur histologischen Untersuchung und Beurteilung sowie zur Untersuchung mittels qPCR aufgearbeitet.
Außerdem wurde den Tieren über eine intracardial eingeführte Kanüle Blut entnommen und dieses zur Gewinnung von Serum zentrifugiert.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs
2.4 Klinischer Grad
Um das Laufbild der Tiere nach Injektion und dem klinisch/phänotypischen Verlauf der Schädigung bzw. der Regeneration beurteilen zu können und in eine berechenbare Form zu überführen, wurde eine selbst entwickelte ordinalskalierte Gradeinteilung (vgl. Tab. 1) verwandt. Zur Bewertung wurden die Mäuse täglich, separat, auf der gleichen, zunächst ebenen Unterlage laufen gelassen und ihr Bewegungsablauf beobachtet. Sobald kein auffälliges Laufverhalten - im Sinne einer Ataxie - mehr zu erheben war, wurde der ebene Untergrund gegen einen Unebenen ausgetauscht, um auch feinere Unterschiede noch protokollieren zu können. Als unebener Untergrund diente der Boden eines PVC-Käfigs mit dem für die Tiere gewohnten Einstreu.
Bei der statistischen Auswertung bezüglich des Tages nach Injektion, an dem die Tiere ein unauffälliges Laufbild präsentierten, wurde den Tieren, welche am Ende des Experimentes am Tag 14 noch Auffälligkeiten zeigten, der numerische Wert 15 zugeordnet.
Gradeinteilung für die Bewertung des klinisch/phänotypischen Laufbildes
Tabelle 1: Klinische Bewertungstabelle
Klinisches Laufbild Grad
Keine Auffäligkeiten 0
(Leichte) Gangataxie auf unebenem Untergrund bei normalem Laufbild auf ebenem Untergrund
1
Leichte Gangataxie auf ebenem Untergrund 2 Deutliche Gangataxie/Ausgleichsbewegungen 3 Teilweise Lähmung eines Hinterlaufs 4 Komplette Lähmung eines Hinterlaufes 5
2.5 Kraftmessung
Zur Ermittlung der individuellen Griffkraft erfolgte eine Messung mittels eines Grip- Strengh-Meter (TSE Systems, Bad Homburg). Die Maus hält hierbei mit allen 4 Läufen eine Strebe einer leicht geneigten Gitterplatte. Übersteigt die Kraft des gleichmäßig vom Messpunkt wegziehenden Untersuchers diejenige der Maus, lässt diese los. Die kontinuierliche Darstellung auf einer digitalen Anzeige erlaubt das Ablesen und Dokumentieren. Diese Messungen wurden nach Injektion alle 48 Stunden durchgeführt. Für jede Maus wurden pro Messung drei Messwerte ermittelt.
In der Folge wurden diese gemittelt und zu den zugehörigen Gewichtswerten in Beziehung gesetzt.
Abbildung 3: IBM-Maus bei der Griffkraftmessung
2.6 RotaRod
Die RotaRod-Messung diente ebenfalls der Ermittlung des klinisch/phänotypischen Status der Mäuse. Die Messung erfolgte hierbei auf einer sich um die eigene Achse drehende Walze, auf welcher die Mäuse sitzen. Um nicht herunter zu fallen, müssen die Mäuse kontinuierlich ihre Position auf dieser Walze ausgleichen. Die Rotationsgeschwindigkeit der Walze wird durch das Gerät (RotaRod, TSE Systems, Bad Homburg) zunehmend gesteigert.
Das Ende der Messung war durch das Hinunterfallen der Maus oder den Ablauf von 400 Sekunden definiert.
2.7 Gewebeaufbereitung
An den durch den Versuchsablauf determinierten Präparationstagen wurden Teilgruppen des Versuchskollektivs, jeweils 4 Tiere pro Gruppe, durch eine letale CO2-Narkose getötet und der Musculus tibialis anterior sowohl der Notexin- sowie der mit Kochsalzlösung injizierten Seite entnommen. Dieser wurde jeweils durch scharfen Schnitt quer in vier Muskelsektionen geteilt. Das distale und das proximale Segment wurden nativ bei -80 °C in einem 1,5 ml-Eppendorfgefäß eingefroren und bis zur späteren RNA-Extraktion gelagert. Die beiden mittigen Fragmente wurden mit ihrer zueinander zeigenden Schnittfläche auf eine Korkplatte aufgebracht um in der folgenden histologischen Beurteilung Querschnitte vorliegen zu haben, mit Tissue Tek (Sakura, Niederlande) überschichtet und in, mittels flüssigen Stickstoffs auf -159,9 °C gekühltem, n-Methylbutan (C.Roth, Karlsruhe) eingefroren. In der Folge wurden auch diese Proben bis zur weiteren Aufbereitung zur Histologie bei -80°C gelagert.
2.8 Histologie
Es wurden 10 µm dicke Querschnitte der vorbereiteten Muskelproben an einem Cryo-Mikrotom (Leica CM3050 S, Leica Mikrosysteme, Wetzler) angefertigt und auf Adhäsions-Objektträger (LabSolute, Th. Geyer Gruppe, Renningen) zur Mikroskopie aufgebracht. Alle Schnitte wurden, nach ausreichendem, wenigstens aber 2 stündigem, Trocknen und gegebenenfalls zwischenzeitlicher Lagerung bei -80 °C mit Hämatoxilin (H&E, Mayers Hämalaunlösung, Merck, Darmstadt/Eosin G, Merck, Darmstadt) nach standardisierten laborüblichen Verfahrensabläufen gefärbt. Die histologischen Schnitte wurden mit einem Mikroskop der Firma Zeiss mikroskopiert und fotografiert.
2.9 Auswertung der Gewebeschnitte
Zur Auswertung wurden pro Muskel wenigstens 3 Querschnitte mikroskopiert und der Anteil des geschädigten bzw. nekrotischen und des im regenerativen Prozess befindlichen Muskels mittels eines selbst entwickelten semiquantitativen Auswert- ungsschemas (Tab. 2) beurteilt. Nekrotische Areale waren dabei determiniert durch untergehende, vermehrt eosinophile Muskelfasern mit häufig internalisierten Zellkernen. Zusätzlich fanden sich in diesen Arealen entzündungsassoziierte
Infiltrate, die sich durch eine Anhäufung basophiler Zellen auszeichneten. Auch eine Infiltration der Muskelfasern mit solchen Zellen ließ sich beobachten.
Regenerationsareale hingegen zeichneten sich durch eine organisierte Ansammlung von Muskelfasern aus, welche über den Zeitverlauf an Größe zunahmen. Diese Muskelfasern waren zumeist rund oder polyklonal und zeigten zentralisierte Zellkerne, welche im späteren Verlauf eine Tendenz zur Randständigkeit zeigten. Die Mikroskopie erfolgte verblindet.
Semiquantitative Gradeinteilung für regenerative und nekrotische Anteile
Tabelle 2: Bewertungstabelle für die Histologie
2.10 RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
Die RNA-Extraktion wurde unter zur Hilfenahme des Qiagen-RNeasy Kit (Qiagen Hamburg GmbH, Hamburg, Deutschland) gemäß Herstellerangaben durchgeführt.
Zunächst wurden allerdings die, in der Präparation dafür vorgesehen, Muskelanteile in speziellen Säulen mit enthaltenen Keramikkügelchen und unter Überschichtung mit 900 µl TRIZOL durch zyklische Vibrationsphasen in eine Suspension überführt.
Dazu kam ein 3 zyklisches Verfahren mit 45 Sekunden Homogenisation und jeweils 15 Sekunden Pause zwischen den Zyklen zur Anwendung.
Im letzten Schritt der Extraktion wurde die RNA in 30 µl RNase-freiem Wasser gelöst und anschließend direkt weiterverarbeitet oder bei -80°C gelagert.
Prozentsatz Grad
< 1% 0
1% - 10% 1
10% - 30% 2
30% - 50% 3
50% - 70% 4
> 70% 5
Zur Bestimmung der Konzentration und Reinheit der isolierten RNA wurde ein Nanodrop Spektralphotometer (NanoDrop 2000, NanoDrop Products, Wilmington, USA) genutzt.
Um im Folgenden die zur mRNA komplementäre cDNA (complementary DNA) zu synthetisieren wurde das SuperScriptTMII Kit (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) den Herstellerangaben entsprechend eingesetzt. Als Primer wurde dabei ein Oligo-dT-Nukleotid (10-15 Desoxythymidine), welches komplementär zum Poly-A-Schwanz der eukaryotischen mRNA ist, eingesetzt um als Startpunkt für die RNA-abhängige DNA-Polymerase zu dienen. Weiterhin wurde über einen dNTP Mix und die reverse Transkriptase der komplementäre cDNA-Strang vervollständigt. In der sich anschließenden Reaktion wurde eine doppelsträngige cDNA gebildet. Die Lagerung selbiger erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei -20°C.
2.11 Quantitative PCR
Die quantitative (real-time) PCR (qPCR) dient der Untersuchung der Expression expliziter Gene. Hierzu wird die in der Polymerasekettenreaktion stattfindende Vermehrung der cDNA durch fluoreszenztechnische Möglichkeiten während der Amplifikation gemessen. Die nötigen Oligonucleotid-Primer und ein Universal qPCR Master Mix wurden von der Firma Solaris bezogen und kamen entsprechend der Herstellerangaben zum Einsatz. Durchgeführt wurden die Amplifikationen mittels eines real-time-PCR-System-ABI 7900 (Applied Biosystems, Darmstadt). Hierbei enthielt jeder Ansatz 20 µl, davon jeweils 1 µl cDNA.
Es kam folgendes Zeit-Temperatur-Programm zur Anwendung:
Zu Beginn diente ein Phase von 2 Minuten bei 50°C zur Dekontaminierung, diesem folgend ein erster 15-minütiger Denaturierungsschritt bei 95°C. Anschließend wurde ein Zyklus aus einem 15-sekündigem Denaturierungsschritt bei ebenfalls 95 °C und einem 60-sekündigem Amplifizierungsschritt, bei 60°C, 40 Durchgänge lang wiederholt. Es erfolgte eine regelmässige Messung der Reaktionsprodukte.
Als Kontrolle, um Ergebnisverfälschungen durch z.B. verschiedene Menge und
aldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) ebenfalls amplifiziert und gemessen.
Dieses Gen wird von allen Muskelzellen der Mäuse üblicherweise exprimiert und konnte somit als sogenanntes „Housekepping-Gen“ verwendet werden. Die Daten aller Messungen für nekrose- und regenerationsassoziierte Gene wurden zu der entsprechenden GAPDH-Messung in Bezug gesetzt. Die Errechnung der jeweiligen mRNA-Expression erfolgte nach der 2-dCt-Methode.
2.12 CK-Messungen
Die Messung der Kreatinkinase-Spiegel wurde in der Abteilung für Klinische Chemie der Universitätsmedizin Göttingen aus Serum der präparierten Mäuse durchgeführt.
2.13 Statistik
Die statistische Auswertung aller erhobenen Daten erfolgte mittels t-Teststatistik für den Vergleich von zwei Gruppen bzw. ANOVA für den Vergleich mehrerer Gruppen mittels Excel 2010, bzw. GraphPad Prism 6.0, GraphPad Software, Inc. Weiterhin wurden die klinischen Daten durch eine lineare Regression verglichen, ebenfalls mittels GraphPad Prism 6.0.
3. Ergebnisse
3.1 Etablierung des Versuchsmodells
Ein entsprechendes Tiermodell zur Untersuchung der regenerativen Kapazität bei der IBM ist bisher weder beschrieben noch etabliert worden. Zunächst war es daher notwendig, Versuche durchzuführen, welche dazu dienten das selbstentwickelte Versuchsmodell in seiner Anwendbarkeit und Funktionalität zu überprüfen. Die Ergebnisse dieser Versuche werden im Folgenden dargestellt.
Für alle untersuchten Parameter konnten Daten eines weiteren Projekts aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigen, dass es zwischen 12-monatigen IBM- und B6J-Tieren keine wesentlichen morphologischen Unterschiede gibt (Voigt et al. 2011). Nach der Injektion zu findende Unterschiede sind also auf die Schädigung durch die Injektion und darauf folgende Entzündung und Regeneration zurückzuführen.
3.1.1 Klinischer Verlauf nach Injektion in den Musculus soleus
Die folgenden Daten entstammen einem Versuch, in dem jeweils 10 Tiere, aufgeteilt in eine IBM- und eine B6J/Wildtyp-Gruppe, verglichen wurden. Dieser Versuch diente vor allem der Überprüfung der selbstentwickelten Bewertungstabelle für den klinischen Verlauf und der Beantwortung der Frage, ob der Musculus soleus sich zur Untersuchung eignet. Sämtliche Tiere hatten ein Alter von etwa 24 Monaten. Die Injektionen erfolgten in den M. soleus der hinteren Extremität, wie oben beschrieben Notexin rechtsseitig sowie NaCl, als Kontrolle, linksseitig. Im weiteren Verliefen die Injektionen und der Versuch wie bereits unter 2.3 Versuchsablauf beschrieben.
Einzige Abweichung: Die Präparationen wurden an Tag 7, 10 und 14 durchgeführt und die Muskeln für Längsschnitte in der Histologie vorbereitet.
Vor Injektion zeigten alle Tiere ein unauffälliges Laufbild. Auf eine Beurteilung des Laufverhaltens direkt nach der Injektion wurde verzichtet.
Erste klinische Auffälligkeiten, im Sinne einer Schädigung der Fußsenkerfunktion des rechten Hinterlaufes, ließen sich bereits am ersten Tag nach den Injektionen beobachten. An diesem Tag zeigten die IBM-Tiere im Mittel einen klinischen Grad von 4,2 ±0,4, die B6J-Tiere einen Grad von 3,9 ±0,54. Das klinische Laufbild besserte sich im Folgenden zusehens. Am Tag 4 war noch ein Grad von 2,8 ±0,4, in
Woche Regeneration, an Tag 7, lagen die mittleren Werte bei 2,25 ±0,34 (IBM) und 1,8 ±0,24 (B6J) (p<0,05). Zum zweiten Präparationstag, Tag 10, war für die IBM- Tiere ein mittlerer Grad von 2 ±0,38 im Gegensatz zu 1,43 ±0,17 für die B6J-Mäuse zu erheben (p<0,05). Zum Ende des Experimentes waren noch Auffälligkeiten im Sinne eines Grades von 0,38 ±0,4 in der IBM-Gruppe und keine Auffälligkeiten im Gangbild der Kontrolltiere mehr zu beobachten.
In Abbildung 4 ist eine graphische Darstellung dieser Daten abgebildet. Unter diesen Daten zeigen die Unterschiede an Tag 5 bis 10 und Tag 12 jeweils eine statistische Signifikanz (p<0,05).
Abbildung 4: Klinischer Grad der Versuche am Musculus soleus(Tag 1-4: n=12, T 5-10: n=8, T 10-14:
n=4)
Zum Ende des Experimentes zeigten die IBM-Tiere zum überwiegenden Teil noch Auffälligkeiten im Laufbild während die Wildtyp-Tiere im Durchschnitt nach 13 Tagen ein normales Laufbild wiedererlangt hatten. Auch dieser Unterschied ist statistisch betrachtet signifikant (p<0,05). Es zeigte sich also in diesem Experiment, dass die selbstentwickelte Bewertungstabelle Unterschiede im Laufbild der Tiere detektieren kann und sich zur Anwendung in einem Modell zur Charakterisierung der Regeneration eignet. Ausserdem zeigten sich bereits in diesem Versuch erste signifikante Unterschiede zwischen IBM- und B6J-Mäusen.
3.1.2 CK-Serumspiegel
Verschiedene Studien haben für die IBM und andere Muskelerkrankungen eine Erhöhung der Serum-CK-Spiegel gezeigt, daher war es interessant diese auch im
*
*
* p<0,05
** p<0,01
*** p<0,001 Die Signifikanzwerte beziehen sich auf alle einzelnen Tage innerhalb des jeweils angegebenen Bereiches
hier beschriebenen Modell zu untersuchen. Die Messung der Serumspiegel der Kreatinkinase (CK) wurde an Proben durchgeführt, welche aus Blut gewonnen wurde, das den Tieren des oben dargestellten Versuchs im Rahmen der Präparationen entnommen wurde. Am Tag 7 ergab ich ein Serum-CK-Spiegel von 238,67 U/l im Mittel der Proben der IBM-Mäuse und 522,67 U/l in den Proben der B6J-Mäuse. Am Tag 10 fand sich ein Spiegel von 427,67 U/l in den Proben der IBM- Tiere im Vergleich zu 334,67 U/l bei den B6J-Tieren. Zum Ende des Experiments, am Tag 14, lagen die Messwerte bei 410 U/l in IBM-Serum und 169,5 U/l in B6J-Serum.
Signifikante Unterschiede ließen sich allerdings nicht erheben.
Abbildung 5: Kreatinkinasespiegel im Serum (Versuche am M. soleus; n=4) 3.1.3 Histologie des Musculus soleus
Parallel zur Überprüfung der klinischen Bewertungstabelle war es ebenso Ziel dieses Versuchs zu untersuchen, ob auf die Injektion von Notexin in den M. soleus eine Nekrose und Regeneration der Muskulatur folgt und ob diese sich durch den modifizierten Bewertungsgrad klassifizieren lässt.
Ohne vorangegangene Injektion präparierte bzw. nach Injektion mit NaCL-Lösung präparierte Musculi soleii zeigen im Längsschnitt keine Unterschieden zwischen solchen der IBM-Gruppe verglichen mit jenen der B6J-Gruppe.
Am Tag 7 nach Injektion präparierte Muskeln von beiden Gruppen zeigen einen deutlichen nekrotischer Schaden. In späteren Präparationen von Tag 10 und Tag 14 nimmt dieser aber in Schnitten aus der IBM-Gruppe deutlich langsamer ab, verglichen mit Schnitten der Wildtyp-Individuen. Die folgenden Abbildungen zeigen Schnitte von beiden Gruppen sowohl ohne Injektion von Notexin (Abb. 6), als auch der Tage 7, 10 und 14 nach Injektion mit Notexin (Abb. 7).
Kreatinkinase im Serum
Tag der Präparation
Serumspiegel in U/l
7 10 14
0 500 1000 1500
B6J IBM
Der Versuch konnte also zeigen, dass die Injektion von Notexin in den M. soleus sowohl Nekrose als auch Regeneration der Muskulatur von IBM- und B6J-Tieren zur Folge hat. Allerdings machte die Tatsache, dass es sich um Längsschnitte handelt, eine Auswertung im Sinne der unter Abschnitt 2.9 Auswertung der Gewebeschnitte beschriebenen Methode unmöglich.
Abbildung 6: Histologische Kontrollschnitte vom M. soleus (20 fach vergrößert)
Kontrolle
B6J IBM
Abbildung 7: Histologische Schnitte vom M. soleus nach Injektion von Notexin (Tag 7 und 14: 10fach vergrößert; Tag 10: 20fach)
3.1.4 Evans-Blue gestützte Kontrolle der Injektionstechnik nach Injektion in den Musculus tibialis anterior
Notexin hat nach seiner Injektion in Skelettmuskulatur eine myotoxische Wirkung.
Um zu überprüfen, ob sich das Schlangengift nur im Zielmuskel oder darüber hinaus verteilt und ob der Zielmuskel überhaupt sicher injiziert werden kann, erfolgte die Co- Injektion von einprozentiger Evans Blue-Lösung. Diese Versuche wurden am M.
Tag 7Tag 10Tag 14
B6J IBM
aufgrund seiner Größe, die die Injizierbarkeit verbesserte und die Menge des pro Probe gewonnenen Untersuchungsmaterials erhöhte. Weiterhin sicherte eine kräftigen Faszie um den Muskel eine selektivere Verteilung des Notexin.
Die Abbildung 8 zeigt die Darstellung von Gewebeschnitten eines Versuches bei dem neben dem Notexin ebenfalls einprozentige Evans Blue-Lösung injiziert wurde. Wie sich auf den Schnitten eindeutig, Anhand von Hell- und Fluoreszenzmikroskopie, beobachten lässt entspricht das Areal in dem sich das Evans Blue verteilt den geschädigten/nekrotischen Regionen. Nicht geschädigte Muskelfasern zeigen kein erhöhtes Signal (vgl. Abb. 8), wohin gegen nekrotische Gebiete ein deutliches Färbemuster aufwiesen. Es ist davon auszugehen, dass das Verteilungsgebiet des Evans Blue auch dem des Notexin entspricht. Auf den Verlauf des klinischen Grades hatte die Mitinjektion von Evans Blue-Lösung keinerlei Einfluss.
Abbildung 8: Evans-Blue gestützte Kontrolle der Injektionstechnik (5fach vergrößert)
Tag 4
Hellfeld Fluoreszenz
Kontrolle (NaCl + EB)
3.1.5 RotaRod-Daten Musculus tibialis anterior
Im Rahmen des unter 3.2 Versuche Musculus tibialis anterior dargestellten Experimente wurden ebenfalls Versuche mit dem RotaRod durchgeführt um die erhobenen klinischen Parameter noch zu erweitern. Allerdings ergab es sich, dass sich sowohl die Tiere aus der IBM-, als auch jene aus der B6J-Gruppe, vor sowie nach der Injektion die Zeit von 400 Sekunden bis zum Abbruch der Messung auf der rotierenden Walze halten konnten. Ein vorzeitiger Abbruch im Sinne des Herunterfallens eines Tieres kam zwar vor, verteilte sich aber unspezifisch über alle Gruppen und Messzeitpunkte. In der Regel war dies nach sehr wenigen oder nach wenigstens 300 Sekunden zu beobachten. Die RotaRod-Messung eignete sich also als klinischer Verlaufsparameter nicht.
3.2 Charakterisierung der regenerativen Kapazität
Im Folgenden werden die Ergebnisse zweier Versuchsdurchläufe exemplarisch dargestellt. Die erhobenen Daten dieser Versuche wurden gebündelt, um eine validere statistische Auswertung zu ermöglichen. Nachdem in den schon beschrieben Versuchen das Modell etabliert wurde und aufgrund der Eigenschaften die Wahl auf den M. tibialis anterior als Zielmuskel fiel, dienten diese Versuche der Charakterisierung der Regeneration bei der IBM. Es kamen die etablierten Verlaufsparameter zum Einsatz. Desweiteren konnten die Nekrose- und Regenerationsgradeeinteilung in Vorversuchen genauer etabliert werden, so dass auch diese zur Anwendung kamen. Zusätzlich erlaubte der M. tibialis anterior, aufgrund seiner Größe, neben der Histologie, eine Extraktion von mRNA und folgende qPCR-Versuche aus dem selben Muskel. Die Daten sind repräsentativ und wurden wenigstens in einer Wiederholung des Experimentes bestätigt. Aus- genommen sind Daten zur Messung der Serumspiegel der Kreatinkinase, die aus einem analog durchgeführten Versuch entstammen. Alle Tiere dieser Versuche hatten ein Alter von etwa einem Jahr.
3.2.1 Klinischer Verlauf Die Injektion von Notexin führte bei den Tieren zu einer Fußheberparese bzw. - lähmung. Verglichen zu der Fußsenkerschädigung bei Injektion in den M. soleus vereinfachte dies die klinische Bewertung.
Vor Injektion zeigten alle Tiere ein unauffälliges Laufbild. Auf eine Beurteilung des Laufverhaltens direkt nach der Injektion wurde verzichtet.
Bereits am Tag 1 (nach den Injektionen) ließ sich ein charakteristisches Hinken mit vornehmlich schlaffer Lähmung bzw. Kraftdefiziten der Fußhebermuskulatur des notexininjizierten Beines aller Versuchstiere beobachten. Diese Auffälligkeit im Laufbild wurde mit dem oben beschriebenen Bewertungsschema beurteilt. Der Tag 1 war gleichzeitig auch der Tag, an dem sich die größten Auffälligkeiten erheben ließen. Der durchschnittliche klinischer Grad am Tag 1 betrug 3,6875 ±0,25 in der Gruppe der IBM Tiere und 3,625 ±0,33 in der Gruppe der Kontrolltiere.
In der Folge besserte sich das Laufbild kontinuierlich. Eine graphische Darstellung zeigt Abbildung 9. Zunächst besserten sich die Lähmungserscheinungen zu Gunsten eines sich zunehmend bessernden Ausgleichshinkens, folgend stellte sich eine schrittweise Normalisierung des Laufbildes ein.
Zum ersten Präparationstag, Tag 4, ergab sich ein Grad von 2,84375 ±0,42 für die IBM-Tiere und 2,4375 ±0,32 für die B6J-Tiere (p<0,01). Nach Abschluss der ersten Woche des Regenerationszeitraumes (Tag 7) hatte sich der Grad auf 2,15625 ±0,46 (IBM) und 1,34375 ±0,18 (B6J) reduziert (p<0,001). Zum Präparationstag 2, Tag 10, war der Grad der IBM-Mäuse noch bei 1,3125 ±0,25 während sich die B6J-Mäuse bereits auf 0,25 ±0,28 gebessert hatten (p<0,001). Bereits am Tag 11 waren keine Auffälligkeiten im Laufbild der B6J-Tiere mehr zu erkennen, im Gegensatz zu den IBM-Tieren deren klinischer Grad an diesem Tag im Mittel 1,0625 ±0,125 betrug (p<0,01).
Ein unauffälliges Laufbild erreichten die B6J-Tiere im Mittel nach 10,1 Tagen, während fünf der im letzten Beobachtungszeitraum noch lebenden IBM-Tiere am Tag 14, bei Abschluss des Experiments, weiterhin klinisch auffällig waren, der Grad der IBM-Tiere an diesem Tag betrug 0,25 ±0,29 (p<0,01).
Die statistische Auswertung zeigt, dass die Unterschiede zwischen den Gruppen von Tag 5 bis Tag 13 des Experimentes jeweils hochsignifikant (p<0,001) und an Tag 14 signifikant (p<0,05) sind.
Abbildung 9: Klinischer Verlauf (Versuche am M. tibialis anterior; Tag 1-4: n=24, T 5-10: n=16, T 10-14: n=8)
Um neben den Unterschieden der klinischen Bilder an den einzelnen Tagen auch den Verlauf über die Dauer des Versuches fokussiert zu betrachten kamen zwei Modelle zum Einsatz: Zum einen eine Ausgleichsgrade mittels linearer Regression, jeweils separat für die B6J- und IBM-Tiere. Zum anderen wurde, ähnlich der Betrachtung des Zeitraums bis zum Entwickeln eines unauffälligen Laufbildes jeweils der Zeitraum betrachtet, den die Tiere brauchten um einen Grad von 4, 3, 2 und 1 zu erreichen und diese Daten graphisch aufgetragen.
Dabei ergab sich die in Abbildung 10 gezeigte Graphik. Die IBM-Tiere brauchten im Mittel 2,91 ±0,22 Tage, um bis zu einem klinischen Grad von 3 zu regenerieren. In der Gruppe der B6J-Tiere war dieser nach 2,71 ±0,16 Tagen erreicht. Für die Regeneration bis Grad 2 brauchten die IBM Tiere 7,25 ±0,28 Tage. Die Kontrolltiere hingegen nur 5,38 ±0,22 Tage (p<0,001). Für die Regenerationszeit bis zu Grad 1 finden sich Werte von 10,44 ±0,34 für IBM-Tiere und 7,75 ±0,14 für B6J-Mäuse (p<0,001). Die klinisch abgeschlossene Regeneration (Grad 0) fand sich, wie bereits beschrieben, im Fall der Kontrollen nach 10,1 ±0,35 Tagen, der erhobene Mittelwert für die IBM-Gruppe betrug 14,63 ±0,18 (p<0,001). Da es IBM-Tiere gab, die zum Ende des Versuchs nicht vollständig normal liefen, wurde diesen der Wert 15 zugewiesen. Es ist also davon auszugehen, dass der reelle Mittelwert der IBM-Tiere ohne Präparation am Versuchsende noch höher ausgefallen wäre.
*
* *
*** *
* p<0,05
** p<0,01
*** p<0,001 Die Signifikanzwerte beziehen sich auf alle einzelnen Tage innerhalb des jeweils angegebenen Bereiches
Regenerationszeiträume
Abbildung 10: Regenerationszeiträume (Versuche am M. tibialis anterior) entsprechend der Daten aus Abbildung 9
Die lineare Regression für diese Daten ergab die in Abbildung 11 dargestellte Graphik. Für die IBM-Tiere zeigte sich eine Steigung von -0,2596 ±0,006 im Vergleich zu -0,3312 ±0,007 für die Kontrollen. Die berechneten Schnittpunkte mit der X-Achse, und damit der theoretische Zeitraum bis zur klinischen Voll- regeneration, lagen bei 15,16 Tagen für die IBM-Tiere und 11,63 Tagen für die Kontrollen. Der Unterschied im Verlauf dieser beiden Ausgleichsgeraden für die Regression der klinischen Grade der IBM- und B6J-Tiere ist statistisch hochgradig signifikant (p<0,001), d.h. die Verminderung des klinischen Grades der IBM-Tiere, als Maß für die phänotypische Regeneration, verläuft insgesamt signifikant langsamer im Vergleich zu altersgleichen Kontrolltieren.
*** *** ***
Abbildung 11: Lineare Regression (Versuche am M. tibialis anterior) entsprechend der Daten aus Abbildung 9
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der klinische Grad einen zu den unter 3.1.1. Klinischer Verlauf nach Injektion in den Musculus soleus dargestellten Daten vergleichbaren Verlauf zeigt. Die IBM-Tiere weisen eine klinisch langsamere Regeneration auf mit einem zum Ende des Versuchs persistierend pathologischem Laufbild.
Folgendes zeigt sich im Hinblick auf die Griffkraftmessungen: Vor Injektion lag die Griffkraft der IBM-Tiere im Mittel bei 46,3 mN/g im Gegensatz zu 56,7 mN/g (p<0,001) bei den B6J-Mäusen. Nach den Injektionen, an Tag 2, zeigten beide Gruppen einen Verlust an Griffkraft, in der IBM-Gruppe auf 33,1 mN/g im Vergleich zu 40,7 mN/g (p<0,001) in der B6J-Gruppe. In der Folge besserte sich die Kraft in beiden Gruppen wieder. Die IBM-Mäuse zeigten einen Verlauf über 36,3 lb./g an Tag 4, 37,6 mN/g an Tag 6 und 40,9 mN/g an Tag 8, bis auf 45,9 mN/g und 45,0 mN/g, und damit das Ausgangsniveau, an Tag 10 und Tag 12.
Im Vergleich stellte sich der Verlauf in der Gruppe der Wildtyp-Tiere wie folgt da: Von 49,6 mN/g an Tag 4 über 50,1 mN/g an Tag 6 auf das Ausgangsniveau 56,1 mN/g bereits an Tag 8. An Tag 10 zeigten sie ein Kraftniveau von 58,2 mN/g, und 60,3 mN/
g an Tag 12. Die IBM-Mäuse erreichten also das Ausgangsniveau erst an Tag 10, die B6J-Tiere hingegen bereits an Tag 8. Die Unterschiede an den jeweiligen Tagen waren alle statistisch hoch signifikant (p<0,001). In Abbildung 12 findet sich eine graphische Darstellung. Eine lineare Regression für den Verlauf nach Injektion, also
ab Tag 2, ergab einen signifikanten Unterschied (p<0,05) im Vergleich der Steigung der beiden Ausgleichsgeraden.
Abbildung 12: Absolute Griffkraft im Verlauf (Tag 1-4: n=24, T 5-10: n=16, T 10-14: n=8)
Setzt man die Messdaten der Tage nach Injektion in Bezug zu den Werten vor Injektion kommt zur Darstellung, dass sowohl die IBM- als auch die B6J-Tiere am Tag 2 auf 72,3 % bzw. 71,6 % des Ausgangswertes abfallen. Die IBM-Tiere regenerieren über 80,3 % an Tag 4 und 83,4 % an Tag 6 auf 90,3 % an Tag 8 und schließlich 96,9 % und 92,8 % an Tag 10 und 12. Die Wildtyp-Tiere erreichen bereits an Tag 4 86,3% des Ausgangswertes und bessern sich im Verlauf auf 86,9 % an Tag 6 und 96,9 % bereits an Tag 8. An Tag 10 und Tag 12 ließen sich 101,0 % und 104,5% des Ausgangswertes berechnen. Dies ist graphisch in Abbildung 13 dargestellt. Auch hier ergab eine lineare Regression für den Verlauf nach Injektion einen hochsignifikanten Unterschied (p<0,01) im Vergleich der Steigung der beiden Ausgleichsgeraden.
*** **** p<0,05
** p<0,01
*** p<0,001 Die Signifikanzwerte beziehen sich auf alle einzelnen Tage innerhalb des jeweils angegebenen Bereiches
***
* p<0,05
** p<0,01
*** p<0,001 Die Signifikanzwerte beziehen sich auf alle einzelnen Tage innerhalb des jeweils angegebenen Bereiches
Abbildung 13: Relative Griffkraft im Verlauf (Tag 1-4: n=24, T 5-10: n=16, T 10-14: n=8)
Die Griffkraftdaten verhielten sich zu den Beobachtungen des Laufbildes passend.
Die Schädigung fiel in beiden Gruppen in etwa gleich aus, die Regeneration der Kraft verlief aber signifikant langsamer bei den IBM-Tieren und diese erreichen ihr Ausgangsniveau erst verzögert. Weiterhin sind die IBM-Tiere absolut betrachtet signifikant schwächer.
Die Gesamtheit der klinischen Daten zeigt also eindeutig eine statistisch signifikant verzögerte Regeneration im Muskel von IBM-Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren.
3.2.2 CK-Serumspiegel
Die Messung der Serumspiegel der CK an Blutproben von Tag 4 ergab einen Spiegel von 1642 U/l für die IBM-Tiere und 508 U/l für die B6J-Tiere. Blutproben von Tag 10 zeigten einen Serumspiegel von 776,75 U/l in IBM-Proben und 1609 U/l in B6J- Proben. Zum Ende des Experiments fand sich ein Serumspiegel von 581U/l und 676,25 U/l in den Serumproben von IBM und B6J.
Kreatinkinase im Serum
Tag der Präparation
Serumspiegel in U/l
4 10 14
0 1000 2000 3000 4000 5000
B6J IBM
3.2.3 Histologische Untersuchungen
Die Präparation des M. soleus führte aufgrund der Anatomie des Muskels zu Längsschnitten, welche die Bewertung durch die beschriebenen Bewertungstabellen einschränkte. Dies gehört zu den Gründen für den Wechsel des Zielmuskels. Bei Präparation des M. tibialis anterior bot sich die Anfertigung von Querschnitten an.
Hierdurch ergab sich eine deutliche Steigerung der Beurteilbarkeit und der Möglichkeit zur semiquantitativen Analyse der histologisch nachweisbaren Nekrose und Regeneration.
Ohne Injektion präparierte bzw. als Kontrolle mit NaCl-injizierte Muskeln beider Gruppen unterschieden sich nicht wesentlich voneinander, wie in Abbildung 16 gezeigt. Insbesondere finden sich in beiden Gruppen nur wenige oder keine Areale von Nekrose oder Muskelfasern mit zentralisierten Kernen.
In der Mikroskopie der Schnitte der Muskeln, welche am Tag 4 präpariert wurden, fallen in beiden Gruppen große nekrotische Bereich auf, ohne dass vermehrte Areale von Regeneration zu beobachten wären. Diese Nekrosezonen sind in den Muskeln, die bis zum Tag 10 oder gar 14 regenerierten, deutlich geringer ausgeprägt bzw.
nicht mehr vorhanden (vgl. Abb. 15). Dieser Rückgang gestaltet sich bei IBM-Tieren langsamer als in der B6J-Gruppe.
Gegensätzlich verhält sich die Entwicklung der regenerativen Zonen. Diese nehmen an Tag 10 deutlich zu, allerdings in den Schnitten der IBM-Tiere deutlich weniger als in denen der Wildtyp-Gruppe. An Tag 14 sind etwa vergleichbar viele dieser Areale in beiden Gruppen zu beobachten, was für die IBM-Tiere eine Zunahme der Regenerationsgebiete bedeutet, während es für die B6J Tiere eine Abnahme bedeutet. Betrachtet man die Kaliber der Muskelfasern in diesen Bereichen, fällt auf, dass Fasern der IBM-Mäuse kleiner sind als Fasern der B6J-Mäuse (vgl. Abb. 17).
Abbildung 15: Histologische Schnitte im Verlauf nach Notexin-Injektion in den M. tibialis anterior
Kontrolle
B6J IBM
Tag 14Tag 4Tag 10
Nach Auswertung der Mikroskopie mittels der unter 2.9 Auswertung der Gewebe- schnitte beschriebenen semiquantitativen Gradeinteilung ergibt sich folgendes Bild:
Die Gruppe der IBM-Tiere zeigte am Tag 4 im Mittel einen Nekrosegrad von 3 während ihr Regenerationsgrad 0,125 betrug. Im Gegensatz dazu lagen die B6J- Mäuse im Durchschnitt bei 2,5 (Nekrose) und 0,375 (Regeneration).
In den an Tag 10 präparierten Muskeln fand sich in Bezug auf Nekrose in den IBM- Muskeln noch ein Grad von 2,5 vs. 1,625 in der B6J-Gruppe, in Bezug auf Regeneration fand sich ein Grad von 1,875 vs. 3,375 (p<0,01).
In den Muskeln der Mäuse, die bis zum Ende des Experiments regenerieren konnten, war ein Nekrosegrad von 0,875 vs. 0 (IBM vs. B6J;p<0,01) und ein Regenerationsgrad von 2,75 in der IBM-Gruppe und 3,125 in der B6J-Gruppe zu erheben.
Eine graphische Darstellung der Nekrose- und Regenerationsgrade ist in Abbildung 17 zu finden. Eine statistische Signifikanz findet sich sowohl bei den Unterschieden im Nekrosegrad an Tag 10 und 14 (p<0,01) als auch in der semiquantitativen Betrachtung der Regeneration an Tag 10 (p<0,05).
Aufgrund der wenigen Präparationstage und des Verlaufs bot sich leider eine lineare Regression zur Betrachtung des Verlaufs nicht an.
Abbildung 16: Graphische Darstellung der semiquantitativen Nekrose- und Regenerationsgrade (n=8)
* p<0,05
** p<0,01
*** p<0,001
