ZUR REGULATION DER IN VITRO SYNTHESE DER ISOLEUCYL-TRNA-SYNTHETASE

(1)

UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION DER IN VITRO SYNTHESE

DER ISOLEUCYL-TRNA-SYNTHETASE UND

DES RIBOSOMALEN PROTEINS S20 AUS ESCHERICHIA COLI

DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)

DER FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG

VORGELEGT VON

REINHARD WIRTH

AUS REGENSBURG

- REGENSBURG 1980 -

(2)

2 3 d / t y F ~ SlOö. I V ?

P r o m o t i o n s g e s u c h e i n g e r e i c h t am:

D i e A r b e i t wurde a n g e l e i t e t v o n : P r o f . D r . A. B ö c k

P r ü f u n g s a u s s c h u ß : P r o f . D r . W . T a n n e r P r o f . D r . A . B ö c k P r o f . D r . R . S c h m i t t P r o f . D r . M . S u m p e r

io 4 -Iii

(3)

A B K Ü R Z U N G E N

CGSC C o l i G e n e t i c S t o c k C e n t e r DHPR D i h y d r o d i p i c o l i n s ä u r e r e d u k t a s e DNA D e s o x y r i b o n u c l e i n s ä u r e

EDTA Ä t h y l e n d i a m i n o t e t r a e s s i g s ä u r e IRS I s o l e u c y l - t R N A - S y n t h e s e t a s e mRNA m e s s e n g e r R i b o n u c l e i n s ä u r e A

X

o p t i s c h e D i c h t e b e i x nm W e l l e n l ä n g e PEG P o l y ä t h y l e n g l y c o l

ppGpp G u a n o s i n 5 ' d i p h o s p h a t 3 ' d i p h o s p h a t pppGpp G u a n o s i n 51t r i p h o s p h a t 3 ' d i p h o s p h a t PPO D i p h e n y l o x a z o l

p s i p o u n d s p r o i n c h2

r - r i b o s o m a l -

RNAP DNA a b h ä n g i g e RNA P o l y m e r a s e SDS N a t r i u m d o d e c y l s u l f a t

S20 r i b o s o m a l e s P r o t e i n S20

S30 U b e r s t a n d e i n e r 30.000 g Z e n t r i f u g a t i o n S100 U b e r s t a n d e i n e r 100.000 g Z e n t r i f u g a t i o n TCA T r i c h l o r e s s i g s ä u r e

T r i s T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n tRNA T r a n s f e r R i b o n u c l e i n s ä u r e

Zur B e z e i c h n u n g v o n r i b o s o m a l e n P r o t e i n e n wurde d i e v o n W i t t mann e t a l . [1] v o r g e s c h l a g e n e N o m e n k l a t u r v e r w e n d e t (S: P r o t e i n i n d e r k l e i n e n , L : P r o t e i n d e r g r o ß e n U n t e r e i n h e i t ) .

(4)

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INHALTSVERZEICHNIS

S e i t e

1 . EINLEITUNG 1

2. MATERIAL UND METHODEN 7

2.1. V e r w e n d e t e B a k t e r i e n s t ä m m e und Phagen 7 2.2. A n z u c h t b e d i n g u n g e n für B a k t e r i e n und V e r m e h r u n g

d e r X Phagen 8 2.3. P r ä p a r a t i o n e n v o n Z e l l e x t r a k t e n 9

2.3.1. P r ä p a r a t i o n v o n E x t r a k t e n f ü r d a s i n v i t r o S y s t e m 9 2.3.2. A n d e r e P r ä p a r a t i o n s m e t h o d e n für Z e l l e x t r a k t e 10

2.4. P r ä p a r a t i o n v o n N u c l e i n s ä u r e n 10

2.4.1. P r ä p a r a t i o n v o n X DNA 10 2.4.2. P r ä p a r a t i o n v o n p L C 19-3 DNA 11

2.4.3. P r ä p a r a t i o n v o n rRNA 11 2.5. B e r e i t u n g d e s R e a k t i o n s m i x e s für d a s i n v i t r o

S y s t e m 12 2.6. E l e k t r o p h o r e t i s c h e M e t h o d e n und A u t o r a d i o g r a p h i e 13

2.6.1. Z w e i d i m e n s i o n a l e E l e k t r o p h o r e s e n z u r A u f t r e n n u n g v o n r - P r o t e i n e n 1 3 2.6.2. Z w e i d i m e n s i o n a l e E l e k t r o p h o r e s e n a c h O ' F a r r e l l 13 2.6.3. E i n d i m e n s i o n a l e E l e k t r o p h o r e s e n a c h Laemmli 14 2.6.4. E i n d i m e n s i o n a l e E l e k t r o p h o r e s e z u r A u f t r e n n u n g

v o n rRNA 14 2.6.5. F l u o r o g r a p h i e und A u t o r a d i o g r a p h i e 14

2.7. I m m u n o l o g i s c h e M e t h o d e n 15

(6)

2.7.1. A n t i s e r u m p r ä p a r a t i o n 15 2.7.2. D o p p e l i m m u n p r ä z i p i t a t i o n v o n IRS 15

2.7.3. E i n f a c h i m m u n p r ä z i p i t a t i o n 16 2.8. Bestimmung d e r IRS A k t i v i t ä t m i t t e l s A m i n o -

a c y l i e r u n g s t e s t s 16 2.9. P r ä p a r a t i o n d e s r i b o s o m a l e n P r o t e i n s S20 17

2.10. P r ä p a r a t i o n v o n ppGpp und I d e n t i f i z i e r u n g s -

m e t h o d e n für N u c l e o t i d e 17 2.11. R a d i o a k t i v i t ä t s b e s t i m m u n g e n 17 2.11.1 Bestimmung d e r G e s a m t i n k o r p o r a t i o n v o n A m i n o -

s ä u r e n i m i n v i t r o S y s t e m 17 3 14

2.11.2. R a d i o a k t i v i t ä t s b e s t i m m u n g H/ C d o p p e l m a r k i e r t e r

P r o b e n 18 3 32 35

2.11.3. Bestimmung v o n H, P, S i n P o l y a c r y l a m i d -

G e l e n 19 2.12. K o n z e n t r a t i o n s b e S t i m m u n g e n 19

2.12.1. K o n z e n t r a t i o n s b e S t i m m u n g e n v o n N u k l e i n s ä u r e n 1 9

2.12.2. P r o t e i n b e s t i m m u n g e n 20 2.12.3. K o n z e n t r a t i o n s b e s t i m m u n g v o n ppGpp 20

2.13. C h e m i k a l i e n 20 3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 21

3.1. B e s t a n d t e i l e d e s i n v i t r o S y s t e m s 21 3.2. I d e n t i f i z i e r u n g d e r i n v i t r o s y n t h e t i s i e r t e n

G e n p r o d u k t e 22 3.2.1. S t r a t e g i e z u r I d e n t i f i z i e r u n g d e r i n v i t r o

s y n t h e t i s i e r t e n P r o d u k t e 22

(7)

3.2.2. I d e n t i f i z i e r u n g v o n IRS 24 3.2.3. I d e n t i f i z i e r u n g d e s r - P r o t e i n s S20 28

3.2.4. I d e n t i f i z i e r u n g d e s dapB G e n p r o d u k t s 29 3.2.5. I d e n t i f i z i e r u n g d e r c a r A und c a r B G e n p r o d u k t e 30

3.3. A b h ä n g i g k e i t d e r i n v i t r o S y n t h e s e a k t i v i t ä t d e s g e k o p p e l t e n T r a n s k r i p t i o n s - / T r a n s l a t i o n s - S y s t e m s

v o n v e r s c h i e d e n e n F a k t o r e n 32 3.3.1. Z e i t a b h ä n g i g k e i t d e r S y n t h e s e a k t i v i t ä t 32

3.3.2. A b h ä n g i g k e i t d e r S y n t h e s e v o n d e r DNA und d e r

S30 E x t r a k t K o n z e n t r a t i o n 35 3.3.3. T e m p e r a t u r - und t R N A - A b h ä n g i g k e i t d e r i n v i t r o

S y n t h e s e 37 3.3.4. A b h ä n g i g k e i t d e r i n v i t r o S y n t h e s e v o n a n d e r e n

F a k t o r e n 39 3.4. C h a r a k t e r i s i e r u n g d e s e n t k o p p e l t e n i n v i t r o

S y s t e m s 41 3.5. R e g u l a t i o n d e r i n v i t r o S y n t h e s e d u r c h u n ü b l i c h e

N u c l e o t i d e 44 3.5.1. E i n f l u ß v o n ppGpp a u f d i e i n v i t r o S y n t h e s e 44

3.5.2. E i n f l u ß v o n cAMP a u f d i e i n v i t r o S y n t h e s e 48 3.5.3. E i n f l u ß v o n cGMP a u f d i e i n v i t r o S y n t h e s e 50 3.6. V e r s u c h e , e i n e m ö g l i c h e A u t o r e g u l a t i o n d e r S y n -

t h e s e v o n IRS i n v i t r o n a c h z u w e i s e n 50 3.6.1. B i s h e r g e f u n d e n e P h ä n o m e n e z u r R e g u l a t i o n v o n

A m i n o a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n 50 3.6.2. Z u s a t z v o n IRS zum g e k o p p e l t e n i n v i t r o S y s t e m 51

3.6.3. L i m i t i e r u n g d e s i n v i t r o S y s t e m s an IRS d u r c h Zu-

g a b e v o n A n t i IRS A n t i s e r u m 53

(8)

3.6.4. A b b a u u n d S y n t h e s e v o n ppGpp i m i n v i t r o S y s t e m 56 3.6.5. E r z e u g u n g e i n e r s t r i n g e n t K o n t r o l l s i t u a t i o n i m

i n v i t r o S y s t e m 59 3.7. V e r s u c h e z u r A u t o r e g u l a t i o n d e s r - P r o t e i n s S20 60

3.7.1. H i n w e i s e a u s f r ü h e r e n A r b e i t e n a u f e i n e m ö g l i c h e

A u t o r e g u l a t i o n v o n r - P r o t e i n e n 60 3.7.2. Z u s a t z v o n g e r e i n i g t e m r - P r o t e i n S20 zum g e -

k o p p e l t e n i n v i t r o S y s t e m 61 3.7.3. Z u s a t z v o n rRNA zum g e k o p p e l t e n i n v i t r o S y s t e m 63

3.7.4. A b b a u r a t e v o n IRS u n d S20 i m g e k o p p e l t e n i n v i t r o

S y s t e m 66 3.7.5. K o m p l e x i e r u n g v o n i n v i t r o s y n t h e t i s i e r t e m

r - P r o t e i n S20 a n z u g e s e t z t e 16S rRNA 68 3.7.6. D e r e p r e s s i o n d e r S20 S y n t h e s e d u r c h 16S rRNA i m

g e t r e n n t e n T r a n s k r i p t i o n s - u n d T r a n s l a t i o n s - S y s t e m 70 3.7.7. S t a b i l i t ä t v o n f r e i e r rRNA im g e k o p p e l t e n i n v i t r o

S y s t e m 71 3.7.8. S y n t h e s e r a t e n v o n S20 i n G e g e n w a r t v o n 16S rRNA 74

3.7.9. S y n t h e s e v o n S 2 0 b e i g l e i c h z e i t i g e r rRNA S y n t h e s e 76

3.8. B e r e c h n u n g e n 78

4. SCHLUSSFOLGERUNGEN 79

4.1. V o r a u s s e t z u n g 79 4.2. W i r k u n g v o n cAMP 80 4.3. W i r k u n g v o n ppGpp 80 4.4. R e g u l a t i o n v o n A m i n o a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n 81

4.5. R e g u l a t i o n d e r S y n t h e s e v o n r - P r o t e i n e n 83

(9)

ZUSAMMENFASSUNG 88

6. LITERATURVERZEICHNIS 90

(10)

(11)

1. EINLEITUNG

I n e i n e r s c h n e l l w a c h s e n d e n B a k t e r i e n z e l l e w e r d e n etwa 80 % d e s b e n ö t i g e n K o h l e n s t o f f s und d e r E n e r g i e für d i e P r o t e i n b i o s y n - t h e s e v e r b r a u c h t . Nachdem z u m i n d e s t für m i t t l e r e und hohe Wachs- t u m s r a t e n (n) d i e Z a h l d e r R i b o s o m e n p r o p o r t i o n a l z u u i s t [ 2 ] , w u r d e 1969 v o n M a a l 0 e [3] g e f o r d e r t , d a ß d i e v o r h a n d e n e n R i b o - somen s t e t s m i t m a x i m a l e r K a p a z i t ä t a r b e i t e n ; e s i s t deswegen m ö g l i c h , d a ß d i e W a c h s t u m s r a t e e i n e r B a k t e r i e n z e l l e ü b e r d i e S y n - t h e s e r a t e d e r Ribosomen b e s t i m m t w i r d . D e r R e g u l a t i o n d e s P r o - t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s kommt d a m i t w a h r s c h e i n l i c h e i n e z e n t r a l e B e d e u t u n g für d i e R e g u l a t i o n d e s B a k t e r i e n w a c h s t u m s z u .

D e r P r o t e i n s y n t h e s e a p p a r a t s e l b s t i s t k o m p l e x a u f g e b a u t ; n a c h e i n e r D e f i n i t i o n v o n Maaltfe [4] b e s t e h t a l l e i n s e i n " c o r e " a u s f o l g e n d e n B e s t a n d t e i l e n : d e n R i b o s o m e n , tRNA, D N A - a b h ä n g i g e r RNA P o l y m e r a s e , A m i n o a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n s o w i e a l l e n F a k t o r e n , d i e für I n i t i a t i o n , E l o n g a t i o n , T e r m i n a t i o n und P r o c e s s i n g d e r T r a n s - k r i p t i o n s - und T r a n s l a t i o n s p r o d u k t e n ö t i g s i n d , e i n s c h l i e ß l i c h d e r P r o t e i n e , d i e im M e t a b o l i s m u s v o n ppGpp e i n e R o l l e s p i e l e n . Da d i e e i n z e l n e n B e s t a n d t e i l e d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s i n e i n e m g e w i s s e n s t ö c h i o m e t r i s c h e n V e r h ä l t n i s z u e i n a n d e r v o r l i e g e n m ü s s e n , um d i e d u r c h d i e ä u ß e r e n B e d i n g u n g e n ( z . B . Zusammenset- z u n g d e s Mediums) g e g e b e n e p o t e n t i e l l e P r o t e i n b i o s y n t h e s e k a p a z i - tät v o l l a u s z u n ü t z e n , i s t z u e r w a r t e n , d a ß d i e S y n t h e s e d i e s e r B e s t a n d t e i l e e i n e r k o m p l e x e n R e g u l a t i o n u n t e r l i e g t .

D i e s i s t a l l e i n s c h o n d e s h a l b z u f o r d e r n , w e i l k e i n Zusammenhang b e s t e h t z w i s c h e n d e r Z a h l d e r e n t s p r e c h e n d e n Gene p r o Genom und

(12)

dem z a h l e n m ä ß i g e n A n t e i l d e r j e w e i l i g e n G e n p r o d u k t e im P r o t e i n - b i o s y n t h e s e a p p a r a t :

J e w e i l s n u r e i n e G e n k o p i e e x i s t i e r t f ü r d i e v e r s c h i e d e n e n tRNA- S p e z i e s , d i e e i n z e l n e n A m i n o a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n , d i e U n t e r e i n - h e i t e n d e r RNAP, d i e r - P r o t e i n e und d i e r i b o s o m a l e n F a k t o r e n

(mit Ausnahme v o n E F T u , für d e n z w e i G e n k o p i e n e x i s t i e r e n [ 5 ] ) . F ü r rRNA wurde d a g e g e n d i e E x i s t e n z v o n s i e b e n G e n k o p i e n n a c h - g e w i e s e n [6, 7] .

I n s R i b o s o m e i n g e b a u t w e r d e n j e w e i l s e i n e K o p i e d e r 5S, 16S u n d 23S rRNA s o w i e j e w e i l s e i n M o l e k ü l a l l e r r - P r o t e i n e ( m i t A u s - nahme v o n L 7 / 1 2 , v o n d e n e n v i e r P r o t e i n e e i n g e b a u t w e r d e n [ 8 ] ) . Das s t ö c h i o m e t r i s c h e V e r h ä l t n i s v o n E F T s und E F G z u R i b o s o m e n i s t b e i v e r s c h i e d e n e n W a c h s t u m s r a t e n g l e i c h 1:1 [ 9 ] , w ä h r e n d d i e s e s V e r h ä l t n i s f ü r E F T u z w i s c h e n 8 b i s 14 s c h w a n k e n k a n n [ 1 0 ] , u n d d a m i t i m g l e i c h e n B e r e i c h w i e d a s f ü r tRNA l i e g t [ 1 1 3 . N a c h M e s s u n g e n v o n N e i d h a r d t e t a l . [12] w i r d für v e r s c h i e d e n e Wachs- t u m s r a t e n e i n k o n s t a n t e s V e r h ä l t n i s v o n e t w a 1:100:100 f ü r d i e r e l a t i v e n Mengen a n A m i n o a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n : t R N A : E F T u a u f - r e c h t e r h a l t e n . D i e R e g u l a t i o n v o n RNAP i s t n a c h B l u m e n t h a l u n d D e n n i s [13] s e h r k o m p l e x , b e i " n o r m a l e n W a c h s t u m s b e d i n g u n g e n "

w i r d e i n V e r h ä l t n i s v o n 5:1 für R i b o s o m e n z u RNAP e i n g e s t e l l t .

F ü r e i n z e l n e Komponenten d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s w u r d e n b i s h e r z w e i ü b e r g r e i f e n d e R e g u l a t i o n s p h ä n o m e n e b e s c h r i e b e n :

1) " m e t a b o l i c c o n t r o l " - D i e s e A r t d e r R e g u l a t i o n i s t d a d u r c h d e f i n i e r t , d a ß d e r r e l a t i v e G e h a l t e i n e s u n t e r m e t a b o l i s c h e r

(13)

K o n t r o l l e s t e h e n d e n M o l e k ü l s l i n e a r a b h ä n g i g i s t v o n d e r W a c h s t u m s r a t e \x [ 1 4 ] . A u f G r u n d d e r o b e n a n g e f ü h r t e n D a t e n s t e h e n a l l e Komponenten d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s u n t e r d i e s e r K o n t r o l l e , j e d o c h z u e i n e m u n t e r s c h i e d l i c h e n A u s m a ß .

2) " s t r i n g e n t c o n t r o l " - D i e s e r A r t d e r R e g u l a t i o n i s t d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a ß b e i E n t z u g e i n e r A m i n o s ä u r e d i e RNA- S y n t h e s e s o f o r t i n h i b i e r t w i r d [ 1 5 ] ; d e r A u s d r u c k " s t r i n g e n t "

K o n t r o l l e wurde 1961 g e p r ä g t [ 1 6 ] . F o l g e n d e Komponenten d e s P r o t e i n s y n t h e s e a p p a r a t s u n t e r l i e g e n d i e s e m R e g u l a t i o n s m e c h a - n i s m u s : s t a b i l e RNA, und d a m i t a l s o rRNA und tRNA [ 1 7 ] ; r - P r o t e i n e [ 1 8 ] ; E F T u , EFG und E F T s [19, 20, 2 1 ] . F ü r d i e Amino- a c y l - t R N A - S y n t h e t a s e n wurde b i s h e r e i n e s c h w a c h e (wenn ü b e r - h a u p t v o r h a n d e n e ) " s t r i n g e n t " K o n t r o l l e n a c h g e w i e s e n [20, 2 1 ] ; d i e e i n z e l n e n U n t e r e i n h e i t e n d e r RNAP s c h e i n e n d a g e g e n v e r - s c h i e d e n e n R e g u l a t i o n s a r t e n z u u n t e r s t e h e n [20, 2 1 ] .

U b e r w e l c h e n Mechanismus m e t a b o l i s c h e K o n t r o l l e i n d e r Z e l l e a b - l ä u f t , i s t b i s h e r n i c h t b e k a n n t . F ü r d i e " s t r i n g e n t " K o n t r o l l e wurde 1969 n a c h g e w i e s e n [ 2 2 ] , d a ß d i e S y n t h e s e v o n pppGpp und ppGpp i h r z e i t l i c h v o r a u s g e h t . Gute H i n w e i s e , d a ß d i e s e u n ü b - l i c h e n N u c l e o t i d e an d e r " s t r i n g e n t " K o n t r o l l e m a ß g e b l i c h b e - t e i l i g t s i n d , stammen aus i n v i t r o A r b e i t e n [23, 2 4 ] . D a n a c h k a n n am 70S R i b o s o m b e i V o r h a n d e n s e i n v o n mRNA und tRNA ppGpp b e - z i e h u n g s w e i s e pppGpp a u s ATP und GDP b e z i e h u n g s w e i s e GTP g e b i l d e t werden, wenn u n b e l a d e n e , j e d o c h c o d o n s p e z i f i s c h e tRNA i n d e r A - s i t e d e s R i b o s o m s g e b u n d e n i s t . A u c h i n d i e s e m F a l l i s t j e d o c h n i c h t s ü b e r d e n M e c h a n i s m u s d e r ppGpp W i r k u n g b e k a n n t . D i s k u t i e r t

(14)

w e r d e n i n d i e s e m Zusammenhang v o r a l l e m z w e i H y p o t h e s e n , wo- n a c h e i n m a l ppGpp e i n e A n g l e i c h u n g v o n v e r s c h i e d e n e n k o n f o r m a - t i v e n Z u s t ä n d e n d e r RNAP b e w i r k e n s o l l [25, 26] o d e r zum a n d e r e n ü b e r e i n ppGpp R e z e p t o r m o l e k ü l v e r s c h i e d e n e W e c h s e l w i r k u n g e n z w i s c h e n DNA und RNAP Zustandekommen s o l l e n [ 2 7 ] . E i n d e f i n i t i v e r N a c h w e i s , d a ß ppGpp d e r e i g e n t l i c h e E f f e k t o r f ü r d i e " s t r i n g e n t "

K o n t r o l l e i s t , s t e h t b i s h e u t e n o c h a u s .

S e h r v i e l e d e r b i s h e r g e m a c h t e n A u s s a g e n w u r d e n a u f G r u n d v o n E r g e b n i s s e n a u s i n v i v o V e r s u c h e n g e m a c h t . Da d a b e i d i e R e g u l a - t i o n v o n Z e l l k o m p o n e n t e n u n t e r s u c h t w i r d , d i e f ü r d a s Wachstum d e r Z e l l e n u n e n t b e h r l i c h s i n d , s i n d s o l c h e V e r s u c h e a p r i o r i l i m i t i e r t .

D i e f o l g e n d e n V e r s u c h s a n s t e l l u n g e n w u r d e n v e r w e n d e t , um d a s kom- p l e x e N e t z w e r k v o n i n e i n a n d e r g r e i f e n d e n R e g u l a t i o n s m e c h a n i s m e n i n v i v o z u a n a l y s i e r e n :

- Man k a n n d a s Wachstum u n d d i e R e g u l a t i o n d e r S y n t h e s e ( v o r a l l e m d e s z e l l u l ä r e n A n t e i l s ) d e s P r o t e i n s y n t h e s e a p p a r a t s u n t e r

" s t e a d y S t a t e " B e d i n g u n g e n , zum B e i s p i e l d u r c h K u l t u r a u f v e r - s c h i e d e n e n C - Q u e l l e n u n t e r s u c h e n .

- E i n e w e i t e r e M ö g l i c h k e i t b e s t e h t d a r i n , d i e W a c h s t u m s b e d i n - g u n g e n i n s o g e n a n n t e n " s h i f t " E x p e r i m e n t e n p l ö t z l i c h z u v e r - ä n d e r n u n d d i e A n p a s s u n g a n e i n e n n e u e n G l e i c h g e w i c h t s z u s t a n d z u s t u d i e r e n . H ä u f i g v e r w e n d e t e V e r s u c h s a n s ä t z e b e s t e h e n i n dem E n t z u g e i n e r e s s e n t i e l l e n A m i n o s ä u r e o d e r i n d e r U b e r f ü h r u n g i n e i n Medium, d a s r a s c h e r e s ( s h i f t - u p ) o d e r l a n g s a m e r e s

(15)

( s h i f t - d o w n ) Wachstum e r l a u b t .

- A l s a u ß e r o r d e n t l i c h n ü t z l i c h für R e g u l a t i o n s s t u d i e n h a b e n s i c h a u c h k o n d i t i o n a l e M u t a n t e n e r w i e s e n , i n d e n e n d i e S y n - t h e s e , o d e r a u c h d i e R e g u l a t i o n d e r S y n t h e s e , e i n e r Komponente d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s u n t e r r e s t r i k t i v e n B e d i n g u n g e n - m e i s t Wachstum b e i n i e d r i g e r o d e r h o h e r T e m p e r a t u r - g e - s t ö r t i s t .

- A n t i b i o t i k a o d e r A m i n o s ä u r e n a n a l o g a k ö n n e n e i n g e s e t z t w e r d e n , um e i n z e l n e R e a k t i o n s s c h r i t t e d e r P r o t e i n b i o s y n t h e s e s p e z i f i s c h z u hemmen,und um d i e A u s w i r k u n g d i e s e s E i n g r i f f s a u f d i e S y n - t h e s e d e s G e s a m t s y s t e m s z u a n a l y s i e r e n .

- E i n e l e t z t e M ö g l i c h k e i t s c h l i e ß l i c h s t e l l t d i e U n t e r s u c h u n g v o n Z e l l e n d a r , b e i d e n e n d i e K o p i e z a h l e i n z e l n e r G e n e ^ o d e r v o n G r u p p e n v o n G e n e n , d u r c h d i e E i n f ü h r u n g v o n F ' - E p i s o m e n o d e r v o n m u l t i - c o p y P l a s m i d e n v e r g r ö ß e r t w i r d .

A l l e b i s h e r g e n a n n t e n V e r s u c h s a n s ä t z e h a b e n d i e g r u n d l e g e n d e S c h w i e r i g k e i t , d a ß ü b e r d i e I n t e r a k t i o n v o n v e r s c h i e d e n e n R e g u - l a t i o n s m e c h a n i s m e n s e h r h ä u f i g p l e i o t r o p e E f f e k t e b e o b a c h t e t w e r - d e n . E i n e M ö g l i c h k e i t , d i e s e k o m p l e x e S i t u a t i o n z u umgehen, b i e - t e n i n v i t r o V e r s u c h e . M i t e i n e m s o l c h e n A n s a t z i s t e s m ö g l i c h , d i e R e g u l a t i o n d e r E x p r e s s i o n v o n d e f i n i e r t e n G e n o m b e r e i c h e n , s p e z i e l l v o n e i n z e l n e n Genen, z u u n t e r s u c h e n .

I n d e r v o r l i e g e n d e n A r b e i t s o l l t e d i e R e g u l a t i o n d e r S y n t h e s e v o n z w e i Komponenten d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s i n v i t r o u n t e r -

(16)

s u c h t w e r d e n . D i e s e z w e i Komponenten, d i e I s o l e u c y l - t R N A - S y n - t h e t a s e und d a s r i b o s o m a l e P r o t e i n S20, g e h ö r e n u n t e r s c h i e d - l i c h e n K l a s s e n v o n B e s t a n d t e i l e n d e s P r o t e i n b i o s y n t h e s e a p p a r a t s a n . Da d i e S t r u k t u r g e n e für d i e s e b e i d e n P r o t e i n e e n g b e n a c h b a r t a u f dem E . c o l i Chromosom l i e g e n [ 2 8 ] , und d a i n f r ü h e r e n A r - b e i t e n i n d i e s e m L a b o r A Phagen i s o l i e r t w u r d e n , d i e b e i d e Gene z u g l e i c h s p e z i f i s c h t r a n s d u z i e r e n [ 2 9 ] , war d i e M ö g l i c h k e i t ge- g e b e n , d i e R e g u l a t i o n d e r S y n t h e s e b e i d e r P r o t e i n e i n e i n e m g e - meinsamen A n s a t z z u u n t e r s u c h e n .

Da z u B e g i n n d i e s e r A r b e i t b e r e i t s b e k a n n t w a r , d a ß d e r P o o l a n f r e i e n r - P r o t e i n e n i n d e r Z e l l e s e h r k l e i n i s t [30 - 32] und G e n d o s i s e f f e k t e f ü r r - P r o t e i n e ( m i t w e n i g e n Ausnahmen) [33, 34]

n i c h t b e o b a c h t b a r s i n d [ 3 3 ] , s o l l t e d i e R e g u l a t i o n s o w o h l a u f d e r T r a n s k r i p t i o n s - a l s a u c h d e r T r a n s l a t i o n s e b e n e u n t e r s u c h t w e r d e n .

Das h i e r v e r w e n d e t e i n v i t r o S y s t e m e n t s p r i c h t im w e s e n t l i c h e n dem von Zubay 1973 b e s c h r i e b e n e n A n s a t z [ 3 5 ] . E s w u r d e v o r a l l e m a u s z w e i G r ü n d e n g e w ä h l t :

1) Es b e s i t z t d i e h ö c h s t e A k t i v i t ä t v o n a l l e n b i s h e r b e s c h r i e b e - nen i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e s y s t e m e n .

2) Es e n t s p r i c h t den i n v i v o V e r h ä l t n i s s e n am b e s t e n , d a d e r h i e r v e r w e n d e t e E . c o l i Z e l l e x t r a k t n i c h t w i e i n a n d e r e n S y s t e m e n t e i l w e i s e [36] o d e r v o l l s t ä n d i g [37] f r a k t i o n i e r t w i r d , s e i n e r e l a t i v e Zusammensetzung demnach d e r i n d e r Z e l l e v o r h a n d e n e n nahekommt.

(17)

2. MATERIAL UND METHODEN

2.1. V e r w e n d e t e B a k t e r i e n s t ä m m e und Phagen

D i e i n d i e s e r A r b e i t v e r w e n d e t e n B a k t e r i e n s t ä m m e und Phagen s i n d i n T a b e l l e 1 z u s a m m e n g e s t e l l t . Wenn n i c h t a n d e r s v e r m e r k t , wurde im i n v i t r o S y s t e m S30 E x t r a k t a u s E . c o l i KL19 und DNA aus A d d a p B 2 4 8 v e r w e n d e t .

Tabelle 1: Verwendete E. coli Stämme und Phagen

Stamm bzw. Itoge

Genotyp Herkunft

bzw. Referenz

KL19 prototroph A+ [38]

A19 met, r n a Laborstamm

CP78 t h i - 1 , t h r - 1 , leu-6, his-65, arg-46, gal-3, [39]

x y l - 7 , malA1, mtl-2, ara-13, tonA2?, supE44?, A R

CP79 wie CP78, zusätzlich r e l - 2 [39]

NF161 metB1, argA52, spoT1, A R? , A " [40]

NF162 metB1, argA52, r e l A 1 , spoT1, AR? , A ~ CGSC

64-2 alaS3, pheA, pyr, r e l - 1 , A + , tonA22, T2 R, s u pO O Q [41]

64-2 dap wie 64-2 jedoch zusätzlich dapB17 [29]

64-2 c a r wie 64-2 jedoch zusätzlich pyrA53 [29]

A "WT" CI857 S7 [29]

AddapB119 CI857 S7 s p e z i f i s c h transduzierend rpsT, i l e S , dapB, pyrA

[29]

A ddapB257 CI857 S7 s p e z i f i s c h transduzierend dapB [29]

AddapB265 CI857 S7 s p e z i f i s c h transduzierend dapB,pyrA [29]

(18)

2.2. A n z u c h t b e d i n g u n g e n f ü r B a k t e r i e n u n d V e r m e h r u n g d e r A.

Phagen

F ü r d i e P r ä p a r a t i o n v o n S30 E x t r a k t e n f ü r d a s i n v i t r o S y s t e m wurden d i e j e w e i l i g e n S t ä m m e b e i s e h r g u t e r B e l ü f t u n g i n 1 1 E r l e n m e y e r k o l b e n g e z o g e n , d i e j e 250 m l e i n e s Mediums f o l g e n d e r Zusammensetzung e n t h i e l t e n : K H2P 04 5,6 g / 1 ; KoH P 04 29,0 g/1;

H e f e e x t r a k t 10,0 g / 1 ; V i t a m i n B 1 15 mg/1; G l u c o s e 10,0 g / 1 . Das Wachstum e r f o l g t e i m B r u t r a u m b e i 3 4 ° C u n d w u r d e i n d e r e x - p o n e n t i e l l e n P h a s e ( A ^4g = 0,8) d u r c h r a s c h e s A b k ü h l e n a b g e - b r o c h e n . D i e g l e i c h e n B e d i n g u n g e n w u r d e n f ü r d i e P r ä p a r a t i o n v o n n i c h t r a d i o a k t i v m a r k i e r t e m T r ä g e r m a t e r i a l (70S R i b o s o m e n und S100) v e r w e n d e t .

1 4

F ü r d i e P r ä p a r a t i o n v o n C m a r k i e r t e m S100 E x t r a k t b e z i e h u n g s - w e i s e v o n 70S R i b o s o m e n w u r d e A19 i n M i n i m a l m e d i u m ( N a2H P 04

8,9 g/1; K H2P 04 13,6 g / 1 ; C a C l2 0,014 g / 1 ; M g S 04 0,25 g/1;

( N H4)2S 04 2,0 g/1) ,das 4 g G l u c o s e und 40 mg L - M e t h i o n i n / 1 e n t - h i e l t , b i s z u e i n e r v o n 0,4 b e i 3 7 ° C a n g e z o g e n . A n s c h l i e ß e n d

1 4

wurde 0,2 ixCi C-L L y s i n / m l z u g e g e b e n u n d b i s z u e i n e r 1,2 w e i t e r i n k u b i e r t .

Z u r A n a l y s e v o n G a n z z e l l e x t r a k t e n a u f dem z w e i d i m e n s i o n a l e n G e l - s y s t e m n a c h O ' F a r r e l l w u r d e n d i e v o n B l o c h e t a l . [42] b e s c h r i e - b e n e n A n z u c h t - u n d M a r k i e r u n g s b e d i n g u n g e n v e r w e n d e t .

Z u r H i t z e i n d u k t i o n v o n X Phagen wurden d i e e n t s p r e c h e n d e n W i r t s - s t ä m m e b e i 30°C u n t e r s t a r k e r B e l ü f t u n g i n e i n e m G y r o t o r y W a s s e r - b a d s c h ü t t l e r G 76 i n 1 1 E r l e n m e y e r k o l b e n , d i e j e 200 m l LB Me- d i u m (10 g T r y p t o n / 1 ; 5 g H e f e e x t r a k t / 1 ; 5 g N a C l / 1 ) e n t h i e l t e n , a n g e z o g e n . B e i e i n e r A,-4 6 v o n 0,7 w u r d e n d i e K o l b e n f ü r 30 min

(19)

b e i 4 2 ° C , u n d a n s c h l i e ß e n d 150 m i n b e i 3 7 ° C w e i t e r g e s c h ü t t e l t .

2.3. P r ä p a r a t i o n e n v o n Z e l l e x t r a k t e n

D i e P r ä p a r a t i o n v o n S30 E x t r a k t e n w u r d e w i e i n d e r R e f e r e n z [35]

b e s c h r i e b e n d u r c h g e f ü h r t , j e d o c h m i t f o l g e n d e n M o d i f i k a t i o n e n : a) d e r A u f s c h l u ß d e r Z e l l e n e r f o l g t e ü b e r z w e i m a l i g e P a s s a g e

d u r c h e i n e F r e n c h P r e s s Z e l l e b e i 2600 p s i ;

b) d i e a n s c h l i e ß e n d e D i a l y s e w u r d e n u r 4 h l a n g d u r c h g e f ü h r t . D e r S30 E x t r a k t w u r d e i n k l e i n e n Mengen p o r t i o n i e r t , i n f l ü s s i g e m S t i c k s t o f f e i n g e f r o r e n und b e i - 7 0 ° C a u f b e w a h r t .

Z u r P r ä p a r a t i o n v o n S100 E x t r a k t w u r d e d e r S30 E x t r a k t n a c h d e r D i a l y s e 2 h b e i 100 000 g z e n t r i f u g i e r t , d i e o b e r e n d r e i V i e r t e l d e s Ü b e r s t a n d e s a b g e z o g e n , p o r t i o n i e r t u n d i n g l e i c h e r W e i s e e i n - g e f r o r e n und g e l a g e r t .

F ü r d i e P r ä p a r a t i o n v o n 70S R i b o s o m e n w u r d e d i e b r ä u n l i c h e D e c k - s c h i c h t d e s N i e d e r s c h l a g s d e r 1 0 0%0 0 0 g Z e n t r i f u g a t i o n e n t f e r n t u n d d e r v e r b l e i b e n d e N i e d e r s c h l a g i n 0,5 V o l u m e n (des S30 E x t r a k t V o l u m e n s ) S30 D i a l y s e p u f f e r b e i 4 ° C s u s p e n d i e r t . A n s c h l i e ß e n d wurde e r n e u t 2 h b e i 100 000 g z e n t r i f u g i e r t und d e r N i e d e r s c h l a g i n 0,1 V o l u m e n ( d e s S30 E x t r a k t V o l u m e n s ) S30 D i a l y s e p u f f e r s u s - p e n d i e r t . E i n g e f r o r e n und a u f b e w a h r t w u r d e d i e s e R i b o s o m e n p r ä p a - r a t i o n i n g l e i c h e r W e i s e w i e d e r S30 E x t r a k t .

(20)

1 4

Z u r P r ä p a r a t i o n v o n u n m a r k i e r t e m und C m a r k i e r t e m S100 E x t r a k t b e z i e h u n g s w e i s e 70S R i b o s o m e n wurden d i e Z e l l e n i n 0,1 V o l u m e n

(des A n z u c h t v o l u m e n s ) P u f f e r A (10 mM T r i s - C l pH 7.5; 10 mM Mg A c e t a t ; 6 mM ß - M e r c a p t o ä t h a n o l ; 100 mM NH^Cl) g e w a s c h e n , u n d a n - s c h l i e ß e n d i n 0,01 V o l u m e n (des A n z u c h t v o l u m e n s ) P u f f e r A s u s - p e n d i e r t , d e r 5 jig DNase ( R e i n h e i t s g r a d I I ) / m l e n t h i e l t . N a c h z w e i m a l i g e r P a s s a g e d u r c h d i e F r e n c h P r e s s Z e l l e b e i 8000 p s i wurde d a s Z e l l d e b r i s d u r c h e i n e 3 0 - m i n ü t i g e Z e n t r i f u g a t i o n b e i 30 000 g e n t f e r n t u n d d e r U b e r s t a n d e i n e r 2 - s t ü n d i g e n Z e n t r i f u - g a t i o n b e i 100 000 g u n t e r w o r f e n . D e r ü b e r s t a n d d i e s e r Z e n t r i f u - g a t i o n (S100 E x t r a k t ) wurde b e i - 7 0 ° C e i n g e f r o r e n , d e r N i e d e r - s c h l a g (70S R i b o s o m e n ) i n 0,001 V o l u m e n (des A n z u c h t v o l u m e n s ) P u f f e r A b e i 4°C s u s p e n d i e r t und e b e n f a l l s b e i - 7 0 ° C e i n g e f r o r e n .

2.4. P r ä p a r a t i o n v o n N u c l e i n s ä u r e n

2i4i1i_ P r ä 2 a r a t i o n _>v o n X DNA

N a c h H i t z e i n d u k t i o n d e r l y s o g e n e n S t ä m m e wurden d i e Z e l l e n g e - e r n t e t und p r o 1 A n z u c h t m e d i u m i n 25 m l L y s e p u f f e r (10 mM T r i s - C l pH 7.5; 100 mM K C l ; 0,1 mM EDTA) s u s p e n d i e r t . N a c h z w e i f a c h e m E i n f r i e r e n (-20°C) und A u f t a u e n wurde d a s L y s a t a u f 10 mM M g C l2

g e b r a c h t , 5 ng DNase/ml z u g e g e b e n und 15 m i n b e i 3 7 ° C i n k u b i e r t . Z e l l d e b r i s w u r d e d u r c h z w e i m a l i g e Z e n t r i f u g a t i o n (10 m i n b e i 20 000 g) e n t f e r n t und d a s L y s a t a u f C s C l B l o c k g r a d i e n t e n i n

(21)

N i t r o z e l l u l o s e b e c h e r n für Beckman SW 27 R o t o r e n a u f g e l a g e r t . Der B l o c k g r a d i e n t b e s t a n d a u s j e 2 ml e i n e r C s C l L ö s u n g i n L y s e - p u f f e r d e r s p e z i f i s c h e n D i c h t e 1,7; 1,5 und 1,3. N a c h 2 - s t ü n - d i g e r Z e n t r i f u g a t i o n b e i 24000 rpm wurden d i e k o n z e n t r i e r t e n P h a g e n m i t t e l s S p r i t z e und K a n ü l e a b g e s a u g t und a n s c h l i e ß e n d m i n d e s t e n s z w e i m a l e i n e r G l e i c h g e w i c h t s z e n t r i f u g a t i o n ( j e 18 h im SW 56 R o t o r ) i n C s C l d e r s p e z i f i s c h e n D i c h t e 1,5 u n t e r w o r f e n . DNA w u r d e a u s den g e r e i n i g t e n Phagen e n t w e d e r d u r c h m e h r f a c h e P h e n o l e x t r a k t i o n o d e r d u r c h SDS E x t r a k t i o n i s o l i e r t . Z u r SDS E x - t r a k t i o n w u r d e d i e P h a g e n s u s p e n s i o n a u f 0,5 % SDS g e b r a c h t , 5 min b e i 6 5 ° C i n k u b i e r t und a n s c h l i e ß e n d a u f 0,4 M K C l e i n g e s t e l l t . N a c h 2 0 - m i n ü t i g e r Z e n t r i f u g a t i o n b e i 18 000 g wurde d e r DNA ü b e r - s t a n d a b g e s a u g t und e b e n s o w i e P h e n o l e x t r a h i e r t e DNA, s t e r i l 12 h g e g e n 10 mM T r i s - A z e t a t pH 8.2 d i a l y s i e r t . D i e A u f b e w a h r u n g e r - f o l g t e s t e r i l ü b e r e i n e m T r o p f e n C h l o r o f o r m .

2 ^ i ^ 2i_ P r ä p a r a t i o n _ v o n _ p L C _ 2 9 - 3 _ P l

D i e s e P r ä p a r a t i o n w u r d e , g e n a u w i e i n R e f e r e n z [43] b e s c h r i e b e n / d u r c h g e f ü h r t .

Zur P r ä p a r a t i o n v o n n i c h t r a d i o a k t i v m a r k i e r t e r rRNA wurden 70S R i b o s o m e n ,wie i n 2.3.2. b e s c h r i e b e n , i s o l i e r t und d a r a u s , w i e i n R e f e r e n z [44] a n g e g e b e n , d i e rRNA e x t r a h i e r t .

D i e g l e i c h e E x t r a k t i o n s - und A u f t r e n n m e t h o d e wurde z u r I s o l i e -

(22)

r u n g v o n P m a r k i e r t e r rRNA v e r w e n d e t , j e d o c h w u r d e h i e r E . c o l i A19 i n MOPS Medium [45] a n g e z o g e n , d a s e i n Z e h n t e l d e r

32 3-

n o r m a l e n K2H P 04 K o n z e n t r a t i o n und 1 n C i PO^ p r o m l Medium s o w i e 40 ng L - M e t h i o n i n p r o ml e n t h i e l t .

2.5. B e r e i t u n g d e s R e a k t i o n s m i x e s f ü r d a s i n v i t r o S y s t e m

Wie a u s T a b e l l e 2 ( s i e h e 3.1.) e r s i c h t l i c h i s t , w u r d e d a s Reak- t i o n s g e m i s c h für d a s i n v i t r o S y s t e m f ü n f f a c h k o n z e n t r i e r t b e - r e i t e t . D i e e i n z e l n e n Komponenten d e s G e m i s c h e s w u r d e n b e i - 2 0 ° C a u f b e w a h r t u n d w a r e n m i t Ausnahme v o n P h o s p h o e n o l p y r u v a t und PEG 6000, d i e a l s F e s t s u b s t a n z e n z u g e g e b e n w u r d e n , u n d dem Amino- s ä u r e n g e m i s c h , d a s a l s S u s p e n s i o n v o r l a g , f i l t e r s t e r i l i s i e r t . Im f o l g e n d e n i s t a n g e g e b e n d i e R e i h e n f o l g e d e r Z u g a b e d e r Kompo- n e n t e n zum R e a k t i o n s m i x und d i e j e w e i l i g e E n d k o n z e n t r a t i o n im i n v i t r o S y s t e m : T r i s - A c e t a t pH 8.2 40 mM; K - A C e t a t 55 mM, D i t h i o - t h r e i t o l 1,4 mM; Ammoniumacetat 27 mM; M a g n e s i u m a c e t a t 15 mM;

G e m i s c h a u s 19 L - A m i n o s ä u r e n (ohne L - M e t h i o n i n bzw. L - L y s i n ) j e 0,25 mM; f e h l e n d e A m i n o s ä u r e 0,025 mM; E . c o l i tRNA 50 ug/ml;

F o l s ä u r e , FAD, NADP, P y r i d o x i n j e 27 ng/ml; p - A m i n o b e n z o e s ä u r e 11 n g / m l ; CTP, UTP, GTP j e 0,6 mM; ATP 2,2 mM; P h o s p h o e n o l p y r u - v a t • Na^ 21 mM; C a C l2 7 mM; PEG 6000 16 mg/ml. D i e s e Komponen- t e n w u r d e n b e i 0 ° C n a c h e i n a n d e r z u g e g e b e n und j e w e i l s v e r m i s c h t , w o b e i n a c h Z u g a b e v o n P h o s p h o e n o l p y r u v a t etwa 10 m i n b i s zum v o l l s t ä n d i g e n L ö s e n d i e s e r S u b s t a n z g e w a r t e t w u r d e . PEG 6000 b e - n ö t i g t e etwa 45 b i s 60 m i n zum v o l l s t ä n d i g e n L ö s e n . D i e w e i t e r e V e r w e n d u n g d e s R e a k t i o n s m i x e s im i n v i t r o S y s t e m i s t a u s T a b e l l e

(23)

2 e r s i c h t l i c h .

2.6. E l e k t r o p h o r e t i s c h e M e t h o d e n und A u t o r a d i o g r a p h i e

? i § ^ l ^ _ 2 w e i d i m e n s i o n a l e _ E l e k

H i e r z u w u r d e n P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s m i t P u f f e r B (10 mM T r i s - C l pH 7.5; 10 mM M g - A z e t a t ; 6 mM EtSH) a u f 1 ml a u f g e f ü l l t und 70S T r ä g e r - R i b o s o m e n z u g e g e b e n . D i e w e i t e r e P r ä p a r a t i o n d e r P r o b e n e r f o l g t e n a c h [ 4 6 ] . Wurden d i e P r o b e n e i n e r z w e i d i m e n s i o - n a l e n E l e k t r o p h o r e s e n a c h K a l t s c h m i d t und W i t t m a n n [47] u n t e r - w o r f e n , s o w u r d e n v o r d e r E x t r a k t i o n d e r r - P r o t e i n e 3 mg 70S T r ä g e r - R i b o s o m e n z u g e g e b e n ; für d i e n a c h I s o n o e t a l . [48] m o d i - f i z i e r t e M e t h o d e war d i e s e Menge a u f 0,5 mg r e d u z i e r t .

? ^ § ^ 2 ^ _ Z w e i d i m e n s i o n a l e _ E l

H i e r z u w u r d e n P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s a u f 0,2 ml m i t P u f f e r B a u f g e f ü l l t ; e s w u r d e n 5 \il RNase/DNase L ö s u n g [49] z u g e g e b e n und 10 min b e i 3 7 ° C i n k u b i e r t . N a c h Zugabe v o n 0,5 m l A z e t o n w u r d e n d i e P r o b e n 60 m i n b e i 0 ° C b e l a s s e n und 5 min b e i 3 000 g z e n t r i - f u g i e r t . D e r N i e d e r s c h l a g wurde im Vakuum g e t r o c k n e t . A n s c h l i e ß e n d wurden d i e P r o b e n i n 30 [il L y s i s p u f f e r [49] aufgenommen und a u f d e r z w e i d i m e n s i o n a l e n E q u i l i b r i u m o d e r N o n e q u i l i b r i u m G e l e l e k t r o - p h o r e s e n a c h O ' F a r r e l l [50] a u f g e t r e n n t .

(24)

2 ^ 6 ^ 3 ^ ^ E i n d i m e n s i o n a l e _ E l e k

P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s wurden m i t dem z w e i f a c h e n V o l u m e n d e s SDS e n t h a l t e n d e n P r o b e n p u f f e r [51] v e r s e t z t u n d 60 m i n b e i 6 0 ° C i n k u b i e r t . D i e E l e k t r o p h o r e s e e r f o l g t e w i e i n [52] b e - s c h r i e b e n .

^ ö ^ ^ ^ E i n d i m e n s i o n a l e ^ E l e k

D i e s e M e t h o d e w u r d e , w i e v o n G e g e n h e i m e r e t a l . [53] b e s c h r i e b e n , v e r w e n d e t .

2i § i 5 i _ F l u o r o g r a g h i e _ u n d ^

S o l l t e n v o n G e l e n , a u f d e n e n 3H L y s i n m a r k i e r t e P r o b e n a u f g e - t r e n n t w a r e n , A u t o r a d i o g r a m m e h e r g e s t e l l t w e r d e n , s o w u r d e n d i e s e G e l e , um d i e E x p o n a t i o n s z e i t z u v e r k ü r z e n , a l t e r n a t i v n a c h z w e i v e r s c h i e d e n e n M e t h o d e n v o r b e h a n d e l t . E n t w e d e r w u r d e d i e v o n L a s - k e y und M i t a r b e i t e r n [54, 55] b e s c h r i e b e n e F l u o r o g r a p h i e u n t e r V e r w e n d u n g v o n PPO d u r c h g e f ü h r t o d e r e s wurde a l s S z i n t i l l a t o r S a l i z y l s ä u r e v e r w e n d e t . Z u r S a l i c y l s ä u r e b e h a n d l u n g wurde d a s g e - f ä r b t e G e l z w e i m a l 30 min g e w ä s s e r t ( j e 500 ml) u n d a n s c h l i e ß e n d 30 m i n i n 300 m l e i n e r L ö s u n g g e s c h ü t t e l t , d i e 1 M an N a t r i u m - s a l i c y l a t w a r , u n d d u r c h Zugabe v o n S a l i c y l s ä u r e i n F e s t s u b s t a n z a u f pH 5.5 g e b r a c h t w u r d e . S o f o r t n a c h d i e s e r B e h a n d l u n g w u r d e n d i e G e l e g e t r o c k n e t , w o b e i d i e T r o c k e n z e i t im V e r g l e i c h z u u n b e - h a n d e l t e n G e l e n um e i n e n F a k t o r 1,5 v e r l ä n g e r t war.

(25)

A u t o r a d i o g r a p h i e wurde a u f Kodak X Ornat XR5 R ö n t g e n f i l m e n d u r c h - g e f ü h r t , w o b e i u n b e h a n d e l t e G e l e b e i R a u m t e m p e r a t u r , f l u o r o g r a - p h i s c h b e h a n d e l t e G e l e b e i - 7 0 ° C e x p o n i e r t w u r d e n .

2.7. I m m u n o l o g i s c h e M e t h o d e n

- ^ Z i l i . A n t i s e r u m g r ä g a r a t i o n

D i e I m m u n i s i e r u n g v o n K a n i n c h e n g e g e n g e r e i n i g t e IRS wurde, w i e i n [56] b e s c h r i e b e n , d u r c h g e f ü h r t ; d i e P r ä p a r a t i o n v o n A n t i - I R S A n t i s e r u m a u s dem B l u t s o l c h e r T i e r e e r f o l g t e n a c h d e n i n R e f e - r e n z [57] a u f g e f ü h r t e n A n g a b e n .

Z u r D o p p e l i m m u n p r ä z i p i t a t i o n wurde z u 50 u l P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s e i n e Menge a n A n t i - I R S A n t i s e r u m a u s K a n i n c h e n z u g e g e - b e n , d i e d i e A k t i v i t ä t v o n 1,25 ug IRS im A m i n o a c y l i e r u n g s t e s t z u 50 % hemmt. Nach 6 0 - m i n ü t i g e r I n k u b a t i o n b e i 0 ° C w u r d e d i e - j e n i g e Menge A n t i - K a n i n c h e n - I m m u n g l o b u l i n A n t i s e r u m a u s Z i e g e n z u g e g e b e n , d i e n a c h 15 h I n k u b a t i o n b e i 0 ° C o p t i m a l e P r ä z i p i - t a t i o n e r z e u g t e . D i e h i e r z u n ö t i g e Menge a n Z i e g e n A n t i s e r u m wurde i n V o r v e r s u c h e n m i t t e l s e i n e r M i n i - D o p p e l i m m u n d i f f u s i o n s - methode n a c h O u c h t e r l o n y [58] b e s t i m m t . D e r N i e d e r s c h l a g vmrde d r e i m a l , w i e i n [59] b e s c h r i e b e n , g e w a s c h e n und a u f SDS A c r y l - a m i d g e l e n a u f g e t r e n n t .

(26)

H i e r z u w u r d e n P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s m i t P u f f e r C (50 mM T r i s - C l pH 7.5; 1 % T r i t o n X100; 0,4 M K C l ) a u f 0,5 m l a u f g e - füllt und, w i e i n 3.2.2. b e s c h r i e b e n , IRS z u g e g e b e n . A n s c h l i e - ßend e r f o l g t e e i n e z w e i m a l i g e U l t r a s c h a l l b e h a n d l u n g ( j e 5 s e c m i t d e r M i c r o s p i t z e e i n e s B r a n s o n B12 S o n i f i e r s ; 70W A u s g a n g ) und Zugabe v o n 50 ulI A n t i IRS A n t i s e r u m a u s K a n i n c h e n . N a c h 1 2 - s t ü n d i g e r I n k u b a t i o n b e i 4°C wurde d e r N i e d e r s c h l a g d u r c h Z e n t r i f u g a t i o n (5 m i n b e i 3 000 g) g e s a m m e l t u n d d r e i m a l i n j e 0,25 m l P u f f e r D (50 mM T r i s - C l pH 7.5; 1 % T r i t o n X100; 1 M K C l ) s o w i e e i n m a l i n 0,25 m l P u f f e r E (50 mM T r i s - C l pH 7.5;

0,1 M N a C l ) g e w a s c h e n . P u f f e r E wurde q u a n t i t a t i v a b g e s a u g t u n d d e r N i e d e r s c h l a g i n 50 \il d e s i n 2.6.3 b e s c h r i e b e n e n P u f f e r s aufgenommen. D i e w e i t e r e B e h a n d l u n g e r f o l g t e n a c h d e n i n 2.6.3.

g e m a c h t e n A n g a b e n .

2.8. B e s t i m m u n g d e r IRS A k t i v i t ä t m i t t e l s A m i n o a c y l i e r u n g s t e s t s

D e r A k t i v i t ä t s t e s t für IRS w u r d e , w i e i n [60] b e s c h r i e b e n , d u r c h - g e f ü h r t , j e d o c h i n e i n e m E n d v o l u m e n v o n 0,25 m l . . D i e K o n z e n t r a - t i o n d e r B e s t a n d t e i l e d e s I n k u b a t i o n s a n s a t z e s w a r : T r i s - C l pH 7.5 100 mM; M g C l2 10 mM; K C l 10 mM; E t S H 6 mM; ATP 2 mM, E . c o l i Roh-tRNA 400 ng/0,25 m l ; L -1 4C I s o l e u c i n 20 uM (10 n C i / n M ) ; v a r i i e r e n d e Menge g e r e i n i g t e r I R S .

(27)

2.9. P r ä p a r a t i o n d e s r i b o s o m a l e n P r o t e i n s S20

D i e R e i n i g u n g d e s r - P r o t e i n s S20 e r f o l g t e w i e i n [61] b e s c h r i e - b e n . Wie e i n e A n a l y s e a u f e i n e m e i n d i m e n s i o n a l e n SDS G e l (15 % i n b e z u g a u f A c r y l a m i d ) z e i g t e , war d i e s e s P r o d u k t z u über 95 % r e i n .

2.1Q. P r ä p a r a t i o n v o n ppGpp und I d e n t i f i z i e r u n g s m e t h o d e n für N u c l e o t i d e

32

D i e P r ä p a r a t i o n v o n P m a r k i e r t e m und n i c h t r a d i o a k t i v m a r k i e r - tem ppGpp e r f o l g t e n a c h d e n A n g a b e n v o n C a s h e l [ 6 2 ] . I d e n t i f i - z i e r t w u r d e n N u c l e o t i d e d u r c h i h r L a u f v e r h a l t e n a u f P o l y ä t h y l e n - i m i n D ü n n s c h i c h t - P l a t t e n ( P o l y g r a m C E L 3 0 0 P E I F e r t i g f o l i e n v o n M a c h e r y + N a g e l ) i m V e r g l e i c h m i t a u t h e n t i s c h e n N u c l e o t i d e n . V e r w e n d e t wurde e i n e i n d i m e n s i o n a l e s L a u f S y s t e m [63] und d a s i n R e f e r e n z [64] a n g e g e b e n e z w e i d i m e n s i o n a l e L a u f S y s t e m A.

2.11. R a d i o a k t i v i t ä t s b e s t i m m u n g e n

2 ^ 1 1 j : l ^ _ § § s t i m m u n 2 _ d e r _ G e s a m t

Zur B e s t i m m u n g d e r G e s a m t s y n t h e s e (TCA f ä l l b a r e s M a t e r i a l ) wur- den n a c h dem E i n f r i e r e n (3.1.) g e r i n g e Mengen (2 b i s 5 a u s d e n P r o b e n entnommen u n d i n 1 ml R i n d e r s e r u m a l b u m i n l ö s u n g (1 mg/

ml) p i p e t t i e r t . N a c h M i s c h e n wurden 2 m l 1 0 % i g e TCA L ö s u n g z u g e -

(28)

geben und 10 m i n b e i 0 ° C i n k u b i e r t . A n s c h l i e ß e n d wurde 20 min b e i 10Q°c i n k u b i e r t , 10 m i n l a n g b e i 0 ° C a b g e k ü h l t und d e r N i e - d e r s c h l a g ü b e r G l a s f i b e r f i l t e r a b g e n u t s c h t . D i e F i l t e r wurden z w e i m a l m i t j e 10 m l k a l t e r 1 0 % i g e r TCA L ö s u n g und e i n m a l m i t 5 ml 7o%igem Ä t h a n o l g e w a s c h e n und g e t r o c k n e t . D i e R a d i o a k t i v i - t ä t d i e s e r P r o b e n wurde i n 15 ml 0, 5% i g e r P P O / T o l u o l L ö s u n g i n e i n e m B e t a s z i n t BF 5000 F l ü s s i g k e i t s s z i n t i l l a t i o n s z ä h l e r b e - s t i m m t .

2 ^ I l i 2 ^ _ R a d i o a k t i v i t ä t s b e s t i

E n t h i e l t e n P r o b e n d i e I s o t o p e n 3H u n d 1 4C gemeinsam, s o w u r d e n s i e i n e i n e m T r i C a r b Sample O x i d i z e r 306 ( P a c k a r d I n s t r u m e n t s )

zu **^H2°^{u n c}*^{1 4 c o}2 ^o^xⁱd i e r t . P r o b e n a u s u n g e t r o c k n e t e n G e l e n w u r - d e n h i e r z u a u s g e s c h n i t t e n und i n F i l t e r p a p i e r ( c a . 5 x 10 cm) m e h r e r e S t u n d e n b e i 7 0 °C g e t r o c k n e t . P r o b e n a u s g e t r o c k n e t e n P r o - b e n w u r d e n e b e n f a l l s i n F i l t e r p a p i e r g e w i c k e l t u n d s o f o r t v e r - b r a n n t . Das d a b e i e n t s t a n d e n e 3H20 und 1 4C 02 wurde a n d i e e n t - s p r e c h e n d e n T r ä g e r - u n d S z i n t i l l a t i o n s f l ü s s i g k e i t e n a b s o r b i e r t und d i e r a d i o a k t i v e n Z e r f ä l l e im B e t a s z i n t BF 5000 F l ü s s i g k e i t s - s z i n t i l l a t i o n s z ä h l e r b e s t i m m t .

2 i i l i ä i _ § e s t i m m u n 2 _ v o n Hx PL S _ i n _ P o l Y a c r Y l a m i d - G e l e n

H i e r z u w u r d e n a u s g e t r o c k n e t e n G e l e n d i e e n t s p r e c h e n d e n B e r e i c h e a u s g e s c h n i t t e n und i n 0,2 ml H20 m i n d e s t e n s 5 h l a n g g e q u o l l e n . Zum w e i t e r e n Q u e l l e n d e r G e l e w u r d e n 8 m l e i n e s G e m i s c h e s a u s

(29)

L i p o l u m a : L u m a s o l v e = 10:1 (Lumac AG) z u g e g e b e n und d a s G e m i s c h m i n d e s t e n s d r e i T a g e w e i t e r i n k u b i e r t . D i e Z ä h l u n g d e r r a d i o - a k t i v e n Z e r f ä l l e e r f o l g t e im F l ü s s i g k e i t s s z i n t i l l a t i o n s s p e k t r o - m e t e r BF 5000, s i e wurde n a c h w e i t e r e r z w e i t ä g i g e r I n k u b a t i o n b e i R a u m t e m p e r a t u r w i e d e r h o l t .

32

2 ^ 1 _ 2 ^ 4 ^ _ R a d i o a k t i v i t ä t s b e s t i m ^ E _m§ £ l S i £ £ t e m _ p g G p B

D i e W a n d e r u n g s p o s i t i o n v o n 3 2P m a r k i e r t e m ppGpp a u f P o l y ä t h y l e n - i m i n D ü n n s c h i c h t f o l i e n wurde d u r c h A u t o r a d i o g r a p h i e e r m i t t e l t u n d d i e e n t s p r e c h e n d e n B e r e i c h e d e r F o l i e n m i t t e l s e i n e s S p a t e l s a b g e s c h a b t . D i e s e s M a t e r i a l wurde m i t 5 ml A q u a l u m a (Lumac AG) v e r s e t z t und d i e P r o b e n v o r d e r Z ä h l u n g m i n d e s t e n s 5 h im dunk-

l e n F l ü s s i g k e i t s s z i n t i l l a t i o n s z ä h l e r b e l a s s e n .

2.12. K o n z e n t r a t i o n s b e S t i m m u n g e n

^ l ^ l ^ . K o n z e n t r a t i o n s b e s t i

Z u r K o n z e n t r a t i o n s b e s t i m m u n g v o n N u c l e i n s ä u r e n w u r d e i h r e s p e - z i f i s c h e A b s o r p t i o n b e i 260 nm v e r w e n d e t . D i e L ö s u n g e n wurden m i t W a s s e r s o v e r d ü n n t , d a ß i h r e A26Q z w i s c h e n 0,1 b i s 0,3 l a g . F ü r DNA K o n z e n t r a t i o n s b e s t i m m u n g e n wurde e i n W e r t v o n 50 ng/ml p r o 1 A26Q z u g r u n d e g e l e g t , für RNA K o n z e n t r a t i o n s b e s t i m m u n g e n e i n Wert v o n 4 2 ng/ml.

(30)

2 ^ 1 ? ^ 2 ^ _ P r o t e i n b e s t i m m u n 2 e n

P r o t e i n k o n z e n t r a t i o n e n w u r d e n n a c h d e r Methode v o n L o w r y e t a l . [65] b e s t i m m t , w o b e i a l s S t a n d a r d R i n d e r s e r u m a l b u m i n v e r w e n d e t wurde.

? i . I 2 ^ 3 ^ _ K o n z e n t r a t i o n s b e s t i m m u

H i e r z u wurde d i e s p e z i f i s c h e A b s o r p t i o n v o n ppGpp b e i 253 nm b e n u t z t [ 6 3 ] ; e i n e A253 v o n 12 700 für e i n e 1 M L ö s u n g [63]

wurde v e r w e n d e t .

2.13. C h e m i k a l i e n u n d B e z u g s q u e l l e n

3 2P 04 3~ , L - [3 5S ] - M e t h i o n i n , L - [ U -1 4C ] - L y s i n und L - [ 4 , 53H ] L y s i n w a r e n v o n R a d i o c h e m i c a l C e n t r e , Amersham. V o n B o e h r i n g e r Mann- h e i m w u r d e n b e z o g e n : RNAP, R i f a m p i c i n , FAD u n d NADP. A l l e N u c l e o - t i d e , T r i s - B a s e , E . c o l i tRNA u n d D i t h i o t h r e i t o l w u r d e n b e i Sigma g e k a u f t . D i e B e z u g s q u e l l e für P y r i d o x i n , F o l s ä u r e u n d P h o s p h o e n o l - p y r u v a t • Na^ war C a l b i o c h e m . A l l e a n d e r e n v e r w e n d e t e n C h e m i - k a l i e n w a r e n vom R e i n h e i t s g r a d p.A.

(31)

3. E R G E B N I S S E UND DISKUSSION

3.1. B e s t a n d t e i l e d e s i n v i t r o S y s t e m s

I n T a b e l l e 2 i s t d e r A n s a t z e i n e r P r o b e für d a s g e k o p p e l t e T r a n s k r i p t i o n s - / T r a n s l a t i o n s - S y s t e m a n g e g e b e n . I n k u b a t i o n i n m i t C h r o m s c h w e f e l s ä u r e g e w a s c h e n e n G l ä s c h e n o d e r i n u n b e n u t z t e n E p p e n d o r f P l a s t i k r e a k t i o n s g e f ä ß e n (1,5 m l I n h a l t ) e r g a b k e i n e U n t e r s c h i e d e d e r S y n t h e s e a k t i v i t ä t i n v i t r o . B e e n d e t wurde d i e

Tabelle 2:

Ansatz einer 50 jui Probe des gekoppelten in vitro Systems.

In Versuchsserien wurden jeweils die entsprechenden Mengen der einzelnen Bestandteile in alle Proben gegeben, bevor der nächste Bestandteil zugegeben wurde. Nach Zugabe des S30 Extrakts wur- den die Proben durch 5maliges Aufziehen und Auspipettieren von 25 ul mit Hilfe der 25 ul Kapillarpipette "Capillettor" durch- mischt und die Inkubation aller Proben gleichzeitig durch Stel-

len in ein Wasserbad der entsprechenden Inkubationstemperatur gestartet.

P i p e t t i e r - r e i h e n f o l g e

B e s t a n d t e i l Menge

1.

2.

3.

4.

5.

H20

Reaktionsmix

r a d i o a k t i v e Aminosäure

DNA

zu testende Substanz S30 Extrakt

auf 50 u l Endvolumen 10 u l

entweder 5 nCi 3 5S L-Methionin ( ~ 900 Ci/mmol) oder 10 \iCi 3h L-Lysin ( ~ 80 Ci/mmol) 5 ng

siehe einzelne Versuche 300 ng

(32)

S y n t h e s e d u r c h A b k ü h l e n d e r P r o b e n a u f 0 ° C (5 m i n ) , a n s c h l i e - ß e n d e s s t a r k e s S c h ü t t e l n für 3 m i n und E i n f r i e r e n b e i - 2 0 ° C . So b e h a n d e l t e P r o b e n z e i g t e n k e i n e S y n t h e s e a k t i v i t ä t mehr. D i e von Chu [66] b e n u t z t e M e t h o d e zum A b b r u c h d e r S y n t h e s e , n ä m l i c h Z u s a t z von R i b o n u k l e a s e und a n s c h l i e ß e n d e Z e n t r i f u g a t i o n , h a t im V e r g l e i c h z u d e r h i e r v e r w e n d e t e n z w e i N a c h t e i l e : a) e s w e r - d e n n u r 50 % d e s i n v i t r o s y n t h e t i s i e r t e n M a t e r i a l s e r f a ß t ; b) e i n e e v e n t u e l l v o r h a n d e n e ü n g l e i c h v e r t e i l u n g e i n e s i n v i t r o P r o d u k t s z w i s c h e n U b e r s t a n d u n d N i e d e r s c h l a g b l e i b t u n b e r ü c k - s i c h t i g t .

3.2. I d e n t i f i z i e r u n g d e r i n v i t r o s y n t h e t i s i e r t e n G e n p r o d u k t e

3 i 2i2 i _ § t r a t e 2 i e _ z u r _ I d e n t i f i z

§ i 2 £ t e n _ P r ^ d u k t e

Von P. B u c k e l [29] w u r d e e i n S a t z v o n X P h a g e n i s o l i e r t , d i e a l l e s p e z i f i s c h dapB u n d v e r s c h i e d e n e , a n d i e s e n G e n o r t a n - s c h l i e ß e n d e R e g i o n e n d e s E . c o l i Chromosoms t r a n s d u z i e r e n . I n A b b i l d u n g 1F s i n d d i e G e n o m s e g m e n t e , d i e e i n i g e d i e s e r X Phagen ü b e r t r a g e n k ö n n e n , a n g e g e b e n ( n a c h B u c k e l [ 2 9 ] ) . . D i e s e E r g e b - n i s s e stammen aus i n v i v o K o m p l e m e n t a t i o n s v e r s u c h e n . D i e i n v i t r o b e i Verwendung v o n v e r s c h i e d e n e n DNA M a t r i z e n s y n t h e t i - s i e r t e n G e n p r o d u k t e l i e ß e n s i c h ü b e r e i n e n V e r g l e i c h d e s Spek- t r u m s d e r i n v i t r o P r o d u k t e m i t d e n K o m p l e m e n t a t i o n s d a t e n i d e n - t i f i z i e r e n . E i n e e i n d i m e n s i o n a l e A u f t r e n n u n g i m SDS S l a b g e l

(10 % i n b e z u g a u f A c r y l a m i d ) n a c h L a e m m l i [51] war j e d o c h i n

(33)

Abbildung 1:

Identifizierung der in vitro mit Hilfe verschiedener X DNA als Matrize synthetisierten Genprodukte.

Folgende X DNA wurde in den verschiedenen Proben als Matrize verwendet: (A) X Wildtyp DNA; (B und E)

\ddapB248 DNA; (C)\ ddapB257 DNA; (D)\ ddapB265 DNA. Die Zahlen bezeichnen folgende Proteine: (1) dapB Genprodukt; (2) IRS; (3) carA Genprodukt; (4) S20; (5) carB Genprodukt. Der unterbrochene Kreis in IE zeigt die Position eines Proteins an, das in Extrakten von E. coli 64-2 dap im Vergleich zu E.

coli 64-2 fehlt; der geschlossene Kreis in IE zeigt die Position von gereinigter IRS an. A - E zei- gen Autoradiogramme von entsprechenden Gelen, wobei A - D im Nonequilibrium, E hingegen im Equili- brium Gelsystem nach O'Farrell aufgetrennt wurden. F gibt die Region des E. coli Chromosoms an, die die verschiedenen X Phagen spezifisch transduzieren.

(34)

e i n i g e n G e l b e r e i c h e n n i c h t e i n d e u t i g g e n u g . Z u r I d e n t i f i z i e - r u n g und Messung d e r Menge d e r i n v i t r o s y n t h e t i s i e r t e n Gen- p r o d u k t e wurden d e s h a l b a n d e r e M e t h o d e n v e r w e n d e t .

3 i 2 ^ 2 ^ _ I d e n t i f i z i e r u n 2 _ v o n _ I R S

Z u r I d e n t i f i z i e r u n g v o n IRS w u r d e n z w e i I r a m u n p r ä z i p i t a t i o n s - methoden und das z w e i d i m e n s i o n a l e G e l e l e k t r o p h o r e s e s y s t e m n a c h O ' F a r r e l l [49] v e r w e n d e t .

Wie A b b i l d u n g 2 z e i g t , w a r e n im N i e d e r s c h l a g d e r D o p p e l i m m u n - p r ä z i p i t a t i o n zwar m e h r e r e P r o t e i n e n e b e n d e r IRS v o r h a n d e n ,

a b

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Abbildung 2:

Doppelimmunpräzipitation von in vitro synthetisierter IRS.

a) A u s s c h n i t t d e s g e f ä r b t e n 10-20 % Gradientengels b) A u t o - r a d i o g r a m m von a). Die Proben 2 und 4 enthalten je 0,4 ug ge- reinigte IRS. Die Proben 1, 3 und 5 zeigen die Immunpräzipi- tate (ohne Zusatz von^{1 4}C markierter IRS) aus in vitro Proben, bei denen als DNA Matrize verwendet wurde: (1) X Wildtyp DNA;

(3) X ddapB254 DNA; (5) wie 3,jedoch mit 0,5 mM ppGpp im In- kubationsansatz. Die Pfeile in b) bezeichnen von unten nach oben die Position folgender Proteine: leichte Kette der Anti- körper; schwere Kette der Antikörper; IRS.

(35)

r a d i o a k t i v m a r k i e r t war j e d o c h n u r IRS. D i e T a t s a c h e , daß b e i V e r w e n d u n g v o n X W i l d t y p DNA (Abb. 2) , X ddapB257 ( n i c h t d a r - g e s t e l l t ) o d e r X d d a p B 2 6 5 DNA ( n i c h t d a r g e s t e l l t ) a l s M a t r i z e d e s i n v i t r o S y s t e m s k e i n e R a d i o a k t i v i t ä t im I m m u n p r ä z i p i t a t f e s t s t e l l b a r i s t , b e w e i s t d i e S p e z i f i t ä t d i e s e r M e t h o d e . V o r

1 4 d e r Z u g a b e d e s s p e z i f i s c h e n A n t i s e r u m s wurde d e n P r o b e n C

1 4

m a r k i e r t e IRS i n Form v o n C m a r k i e r t e m S100 E x t r a k t z u g e - s e t z t , um e i n e B e s t i m m u n g d e r V e r l u s t e w ä h r e n d a l l e r A r b e i t s - s c h r i t t e b e i d e r D o p p e l i m m u n p r ä z i p i t a t i o n z u e r m ö g l i c h e n . Es e r g a b s i c h , d a ß d i e V e r l u s t e b i s z u 30 % b e t r u g e n . D i e D o p p e l - i m m u n p r ä z i p i t a t i o n s m e t h o d e h a t d e n N a c h t e i l , d a ß - w i e s c h o n d e r Name s a g t - z w e i v e r s c h i e d e n e A n t i k ö r p e r v e r w e n d e t w e r d e n , v o n d e n e n d e r e i n e n i c h t i n u n s e r e m L a b o r i s o l i e r t werden k o n n t e . S o l c h e A n t i K a n i n c h e n - I m m u n g l o b u l i n Z i e g e n - A n t i k ö r p e r s i n d zwar k ä u f l i c h z u e r h a l t e n , j e d o c h für V e r w e n d u n g i n S e r i e n v o n Ex- p e r i m e n t e n z u t e u e r .

Z u r A u s f ä l l u n g v o n IRS aus i n v i t r o P r o b e n m i t t e l s d e r E i n f a c h - i m m u n p r ä z i p i t a t i o n s m e t h o d e m u ß t e IRS e n t w e d e r i n r e i n e r Form

(1 ng/50 ul P r o b e ) o d e r a l s S100 (200 ug S100 P r o t e i n / 5 0 u l P r o b e ) z u g e s e t z t w e r d e n , um e i n e g e n ü g e n d e Menge a n I m m u n p r ä z i - p i t a t z u e r h a l t e n . A u c h d i e s e Methode e r f o r d e r t e d e n Z u s a t z v o n

m a r k i e r t e r IRS z u r Bestimmung v o n V e r l u s t e n , d i e w i e d e r b i s zu 30 % b e t r u g e n . A b b i l d u n g 3 z e i g t , d a ß m i t d i e s e r Methode IRS s e h r s p e z i f i s c h a u s g e f ä l l t w e r d e n k o n n t e . Das r a d i o a k t i v mar- k i e r t e M a t e r i a l i n d e n G e l b e r e i c h e n , d i e d i e U n t e r e i n h e i t e n d e r A n t i k ö r p e r e n t h a l t e n , i s t w a h r s c h e i n l i c h a u f u n s p e z i f i s c h e Ad-

(36)

Wanderungsrichtung

Abbildung 3:

Einfachimmunpräzipitation von in vitro synthetisierter IRS.

Die Proben 1 und 2 zeigen einen Ausschnitt aus dem gefärbten 7,5 % Gel. Probe 1 enthält 0,4 \ig gereinigte IRS, Probe 2 das Immunpräzipitat, wobei kein^{i 4}C markierter SlOO Extrakt zuge- setzt war. Nach Trocknen des Gels wurde Probe 2 in 2 mm breite Gelstücke zerschnitten und die Radioaktivität dieser Fraktionen durch Verbrennen zu ^Ü20 bestimmt. Die Kurve zeigt die erhal-

tenen Werte. Die Pfeile geben von links nach rechts an: IRS;

schwere Kette der Antikörper; leichte Kette der Antikörper.

s o r p t i o n a n d a s P r ä z i p i t a t z u r ü c k z u f ü h r e n [ 6 7 , 6 8 ] . E i n w e i t e - r e r B e w e i s f ü r d i e S p e z i f i t ä t d e r E i n f a c h i m m u n p r ä z i p i a t i o n l i e g t i n f o l g e n d e m E r g e b n i s : W i r d n a c h d e r I n k u b a t i o n . e i n U b e r s c h u ß a n n i c h t r a d i o a k t i v m a r k i e r t e r , g e r e i n i g t e r u n d a k t i v e r IRS z u d e n P r o b e n d e s i n v i t r o S y s t e m s z u g e s e t z t , k a n n d i e Menge d e r a u s g e f ä l l t e n r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n IRS a u s t i t r i e r t w e r d e n ; d i e M e n g e n a n g a b e n f ü r d i e s e s E x p e r i m e n t s i n d a u s T a b e l l e 3 e r s i c h t -

l i c h .