Die extrazellulären Serinproteasen von
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis - Versuche zur
Reinigung, Aktivität und ihrer Funktion
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Universität Bielefeld
vorgelegt von
Kerstin Mayer
Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen.
Albert Einstein, 14.03.1879-18.04.1955 Deutscher Physiker und Nobelpreisträger
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ... 1
Einleitung ... 3
1. Das Tomatenpathogen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 3
CelA und Pat-1- die bekannten Virulenzdeterminanten von Cmm382 ... 6
Die chromosomale Pathogenitätsregion chp/tomA-Region ... 7
2. Proteasen – Klassifizierung und Funktion ... 9
3. Peptidasen von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 14
4. Funktionen von Peptidasen in der Pathogenese ... 17
5. Pathogen induzierte Pflanzenabwehr ... 20
Die inkompatible Interaktion ... 21
Die kompatible Interaktion ... 25
Zielsetzung ... 28
Material und Methoden ... 29
I Material ... 29
1. Bakterienstämme ... 29
2. Plasmide und Vektoren ... 30
3. Enzyme und Chemikalien ... 31
3.1 Enzyme ... 31
3.2 Restriktionsendonukleasen und dazugehörige Puffer ... 31
3.3 Chemikalien und Kits ... 32
3. 4 Oligonukleotidprimer für PCR ... 33 3.4.1 Oligonukleotidprimer für celA/pat-1 PCR ... 34 4. Nährmedien ... 35 4 .1 Zusätze zu Nährmedien ... 36 4.1.1 Antibiotika ... 36 4.1.2 Zusätze zu Nährmedien ... 36
5. Puffer und Lösungen ... 37
5.1 Puffer und Lösungen zur DNA -Isolierung ... 37
5.2 Puffer und Lösungen für Agarosegelelektrophorese ... 37
5.3 Lösungen zur Behandlung von Agarosegelen für Southern Blot ... 38
5.4 Puffer und Lösungen für Southern Hybridisierungen ... 38
5.5 Puffer und Lösungen für proteinbiochemische Methoden ... 39
5.5.2 Reinigung Polyhistidin-getaggter Proteine ... 39
5.5.3 Phenolextraktion ... 40
5.5.4 Dialyse des E. coli- und Cmm382-Kulturüberstandes und gereinigter rekombinanter Proteine ... 40
5.5.5 Dot-Blot-Affinitätsreinigung von Antikörpern ... 41
5.5.6 Kopplung von Antikörpern an CnBr-aktivierte Sepharose ... 41
5.5.7 Immunpräzipitation ... 42
5.5.8 Puffer zum Ansetzen chromogener Substrate ... 42
5.6 Lösungen für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 42
5.6.1 Puffer und Lösungen für MALDI kompatible-Silberfärbung von Acrylamidgelen ... 43
5.7 Lösungen für die 2-D-Gelelektrophorese ... 43
5.8 Lösungen für Westernblot ... 44
5.9 Lösung zur Konservierung von Zellen ... 45
6. Geräte ... 45
7. Pflanzensamen ... 45
8. Software ... 45
II Methoden ... 46
1. Kultivierung von Bakterienstämmen ... 46
1.1 Kultivierung von Escherichia coli ... 46
1.2 Kultivierung von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 46
1.3 Konservierung von Bakterienkulturen (Glycerinkultur) ... 46
1.4 Titerbestimmung von Bakterien in Flüssigkultur ... 47
2. DNA -Isolierung... 47
2.1 Isolierung von Gesamt-DNA aus Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 47
2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli ... 47
2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit ... 47
2.2.2 HB-Lyse zur Isolierung von Plasmid-DNA (Klonanalyse) ... 48
3. DNA -Reinigung und -Denaturierung... 48
3.1 Sephadex-Behandlung ... 48
3.2 Reinigung von PCR-Produkten mit dem NucleoSpin Extract II Kit ... 49
3.3 Alkalische Denaturierung von Plasmid-DNA ... 49
4. Techniken zur Charakterisierung von DNA-Molekülen ... 49
4.1 Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen ... 49
4.1.1 Hydrolyse von Plasmid-DNA ... 50
4.2 Agarosegelelektrophorese ... 50
4.3 Bestimmung des Molekulargewichts von DNA ... 51
4.4 Konzentrationsbestimmung von DNA mittels Nanodrop ... 52
5. Klonierung von DNA-Fragmenten ... 53
5.1 DNA-Restriktionsfragmentisolierung aus Agarosegelen mit dem NucleoSpin Extrakt II Kit ... 53
5.2 5´-Dephosphorylierung von DNA mit alkalischer Phosphatase ... 53
5.3 Ligation von DNA-Restriktionsfragmenten ... 53
5.4 Shotgun-Klonierung ... 54
6. DNA-Transfer ... 54
6.1 Transformation von E. coli nach der CaCl2-Methode ... 54
6.1.1 Präparation kompetenter E .coli-Zellen ... 54
6.1.2 Transformation kompetenter E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA ... 54
6.2 Elektroporation von Escherichia coli ... 55
6.2.1 Präparation kompetenter E. coli-Zellen ... 55
6.2.2 Elektroporation kompetenter E. coli-Zellen ... 55
6.3. Elektroporation von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 56
6.3.1 Herstellung kompetenter Cmm-Zellen ... 56
6.3.2 Elektroporation kompetenter Cmm-Zellen mit Plasmid-DNA ... 56
7. DNA-DNA-Hybridisierung ... 57
7.1 Markierung der Hybridisierungssonde ... 57
7.2 Überprüfung der Markierungsreaktion (Dot Blot) ... 57
7.3 Transfer auf eine Membran... 57
7.3.1 Transfer der DNA durch Passiv Blot ... 57
7.4 Prähybridisierung und Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ... 58
7.5 Immunologische Nachweisreaktion unter stringenten Bedingungen ... 58
8. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 59
8.1 PCR mit Gesamt-DNA oder Plasmid-DNA als Template ... 59
8.2 PCR mit ganzen Zellen als Template-DNA ... 60
8.2.1 celA/pat-1-PCR zur Überprüfung des Plasmidstatus ... 61
8.2.2 Nachweis des chpG-Gens in der Komplementante ... 61
9. Proteinbiochemische Methoden ... 62
9.1 Gewinnung von intrazellulären Proteinen mit der French Press ... 62
9.2 Methoden zur Gewinnung und Reinigung intrazellulärer rekombinanter Proteine ... 62
9.2.2 Zellschnellaufschluss für SDS-PAGE ... 63
9.2.3 Ammoniumsulfat-Präzipitation von E. coli-Kulturüberständen ... 63
9.2.4 Kompartimenttest ... 64
9.2.5 Reinigung Polyhistidin-getaggter Proteine mittels Ni²+-Affinitätschromatographie .... 64
9.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 65
9.3.1 Silber-Färbung kompatibel mit PMF-Analysen ... 66
9.4 Bestimmung des Molekulargewichtes von Proteinen ... 66
9.5 Westernblot ... 67
9.6 Ponceaufärbung und Immunologischer Nachweis ... 67
9.7 Proteinisolierung aus dem Kulturüberstand von Cmm382 ... 68
9.7.1 Kultivierung von Bakterien ... 68
9.7.2 Konzentrierung des Überstandes (für Westernblot- Analysen) ... 68
9.7.3 Konzentrierung des Überstandes (für Immunpräzipitation) ... 69
9.7.4 Konzentrierung des Überstandes (für Enzymtests) ... 69
9.7.5 Protein-Konzentrationsbestimmung ... 69
9.8 Enzymtest mit Azoprotein-Substraten (Azocasein/Azoalbumin) ... 70
9.9 Enzymtest mit S2288 ... 71
9.10 Berechnung der Enzymaktivität ... 71
9.11 Xylemsaftgewinnung aus Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum) ... 72
9.11.1 Proteingewinnung aus Xylemsaft für die 2-D Gelelektrophorese ... 73
9.11.2 Enzymtest des Cmm-Sekretom und dem Xylemsaft der Tomate als Substrat ... 73
9.12 2-D-Geleletrophorese ... 73
9.13 Tryptischer Verdau ... 75
9.13.1 Tryptischer Verdau der Serinpeptidase ChpG ... 75
9.14 Proteinidentifizierung über MALDI-TOF-MS und MASCOT ... 76
10. Herstellung polyklonaler Antikörper gegen ChpC, ChpG, Pat-1 und PpaC... 76
10.1 Antigengewinnung und Erzeugung des polyklonalen Antikörpers ... 76
10.2 Analytische Dot-blot-Affinitätsreinigung von Antikörpern ... 77
10.3 Kopplung von Antikörpern an CNBr-aktivierte Sepharose 4B ... 77
10. 4 Immunpräzipitation ... 77
11. Analyse des Pathogenitätsverhaltens von Cmm ... 78
11.1 Wurzelinfektion ... 78
11.2 Ermittlung des Welkeindex und des Welkeverlaufs ... 78
11.3 Gewichts- und Größenbestimmung der Pflanzen ... 78
11.5 Test zur Auslösung der hypersensitiven Reaktion (HR) bei
Mirabilis jalapa (gelbblühend) und Nicotiana benthamiana ... 79
Kapitel I. Aktivitätsnachweis der extrazellulären Proteasen von Cmm382 ... 81
Enzymaktivität der Proteasen aus verschiedenen Cmm-Kulturüberstanden ... 83
Das Proteasesubstrat S2288 ... 87
Diskussion ... 90
Kapitel II. Die putativen Serinproteasen ChpC, ChpG, Pat-1 und PpaC ... 93
Überexpression und Reinigung der Serinproteasen ... 93
Amplifizierung und Klonierung ... 94
Expressionsstamm und Genexpression ... 98
Konzentrierung der E. coli-Kulturüberstände zum Nachweis sekretierter Proteine ... 100
Intrazelluläre Expression der Serinpeptidasen in E. coli ... 101
Kompartimenttest ... 102
Reinigung durch Affinitätschromatographie ... 103
Expression und Reinigung der Serinpeptidasen ... 103
Expression unter osmotischen Stress ... 108
Reinigung der Serinpeptidasen unter denaturierenden Bedingungen ... 111
Expression der Serinpeptidasen im E. coli-Expressionsstamm ArcticExpress ... 113
Identifizierung der His-getaggten Proteine über Westernblot ... 117
Diskussion ... 118
Kapitel III. Aktivitätstests mit den rekombinanten Proteine ChpC, ChpG, Pat-1 und PpaC ... 120
Enzymassays mit Azocasein als chromogenem Substrat ... 120
Enzymassay mit Azoalbumin als chromogenem Substrat ... 123
Enzymassay mit dem chromogenen Substrat S2288 ... 127
Diskussion ... 127
Kapitel IV. Immunpräzipitation der Serinpeptidasen aus dem Cmm-Kulturüberstand ... 131
Herstellung und Gewinnung der Antikörper ... 132
Funktionalität der Antikörper (Westernblot) ... 133
Reinigung der Proteasen aus Cmm382-Kulturüberstand ... 134
Diskussion ... 138
Kapitel V. Das ChpG-Protein von Cmm NCPPB382 ... 140
Komplementation der Mutante CMM101chpGβ ... 140
Untersuchung der hypersensitiven Reaktion auf der Nicht-Wirtspflanze Mirabilis jalapa ... 142
Auslösung der hypersensitiven Reaktion auf der Solanacee Nicotiana benthamiana ... 144
Kapitel VI. Die Subtilasen von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... 149
Erzeugung von Mutanten durch Insertionsmutagenese im Chromosom von Cmm382 ... 150
Konstruktion von Mutageneseplasmiden zur Inaktivierung der Gene sbtA, sbtB und sbtC von Cmm382 ... 151
Die Inaktivierung des Gens sbtA durch Insertionsmutagenese... 153
Inaktivierung des Gens sbtB durch Insertionsmutagenese ... 156
Inaktivierung des sbtC-Gens durch Insertionsmutagenese ... 157
Überprüfung des Plasmidstatus der Mutanten durch PCR ... 159
Phänotypische Analyse der Subtilase-Mutanten von Cmm im Pflanzentest ... 161
Die kompatible Interaktion mit Solanum lycopersicum ... 161
Phänotypische Analyse von CMM101sbtA ... 162
Phänotypische Analyse von CMM101sbtB ... 164
Die inkompatible Interaktion- die hypersensitve Reaktion (HR) bei Mirabilis jalapa ... 168
Diskussion ... 169
Fazit und Ausblick ... 173
Anhang ... 175
Abkürzungsverzeichnis ... 175
Plasmidkarten ... 177
Eichgeraden ... 186
Daten zur Enzymaktivität ... 189
Immunpräzipitation ... 199
Daten zum Pflanzentest mit den Subtilasen-Mutanten ... 199
Auslösung der HR auf Mirabilis jalapa ... 201
Auslösung der HR auf Nicotiana benthamiana ... 203
Proteinalignments ... 204
Zusammenfassung
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 verursacht bei der Wirtspflanze Solanum lycopersicum (Tomate) die bakterielle Welkekrankheit. Entscheidend für die Ausprägung der Welkesymptome ist neben den beiden plasmidkodierten Pathogenitätsfaktoren CelA (Cellulase; pCM1) und Pat-1 (Serinprotease; pCM2) die chromosomale chp/tomA- (chromosomal homology of pat-1) Region. Diese Region zeichnet sich durch das Vorkommen zahlreicher, wahrscheinlich extrazellulärer Proteasen aus, die aufgrund der konservierten Aminosäuren des katalytischen Zentrums den Serinpeptidasen zugeordnet werden. Sie werden aufgrund ihrer Sequenzverwandtschaft in die Chp-, die Ppa- und die Subtilase-Familie unterteilt. Über Sekretom-Analysen ist bereits gezeigt, dass es sich bei diesen Serinproteasen um extrazelluläre Proteine handelt. Da in Plattentests z. B. mit Casein keine proteolytische Aktivität von Cmm NCPPB382 gezeigt werden konnte, sollten die Peptidasen keine reine Ernährungsfunktion besitzen. Das Substrat für diese Proteasen, das wahrscheinlich im Xylem der Tomate vorkommt, war unbekannt.
In dieser Arbeit konnte im Sekretom von Cmm NCPPB382, mit Hilfe des chromogenen Substrats Azocasein, erstmals eine proteolytische Aktivität, die ein pH-Optimum von 6,0 aufwies, nachgewiesen werden. Die Deletionsmutante CMM101β30-18, die eine Deletion der chp/tomA-Region aufweist, zeigte eine um 74,63 % reduzierte Proteaseaktivität. Der Hauptanteil der proteolytischen Aktivität von NCPPB382 konnte somit den Serinproteasen, die von den Genen dieser Region kodiert werden, zugeordnet werden. Durch Anwendung eines für Serinproteasen spezifischen Substrates (S2288) konnte zusätzlich eine Arginin-spezifische Enzymaktivität identifiziert werden.
Zur Überprüfung, welche Serinproteasen der chp-Region für die proteolytische Aktivität zuständig sind, wurden einige in einem E. coli-Expressionssystem überexprimiert und biochemisch charakterisiert. Ausgewählt wurden, neben dem auf pCM2 lokalisierten pat-1, die Gene chpC, chpG und ppaC, da eine Beteiligung dieser Gene an der Bakterien-Pflanzen-Interaktion bereits gezeigt war. Für alle in dieser Arbeit untersuchten Serinproteasen konnte eine Proteaseaktivität nachgewiesen werden, die sich allerdings von den nativen Serinproteasen des Cmm-Sekretoms in Bezug auf Substratspezifität und des pH-Optimums
unterschieden. Dies kann vermutlich auf die heterologe Expression in einem E. coli-System, in dem die Proteine nicht sekretiert wurden und somit auf die fehlende Prozessierung und Ausbildung von Disulfidbrücken der cysteinreichen Serinproteasen zurückgeführt werden. Bei der Nicht-Wirtspflanze Mirabilis jalapa löst Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis eine hypersensitive Reaktion (HR) aus, eine Abwehrreaktion der Pflanze, die die Ausbreitung eines Pathogens verhindert. Eine chpG-Knock out-Mutante führte dagegen nicht zu einer HR. Durch Infiltration des löslichen rekombinanten ChpG-Proteins in die Blätter der Nicht-Wirtspflanze konnte nachgewiesen werden, dass diese Serinprotease als alleiniger Elicitor der HR ausreicht. Im Gegensatz dazu wurde Nicotiana benthamiana, die ebenso wie die Tomate zur Familie der Solanaceae gehört, bei Infiltration aller heterolog exprimierter Serinproteasen (ChpC, ChpG, Pat-1 und PpaC) die Auslösung der Abwehrreaktion weiterhin beobachtet. Damit konnten mehrere Serinproteasen als Elicitor der HR identifiziert werden.
Die dritte Gruppe der extrazellulären Serinproteasen von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis bilden die Subtilasen SbtA, SbtB und SbtC. Die Inaktivierung der kodierenden Gene hatte keinen Einfluss auf die HR-Auslösung bei Mirabilis jalapa und Nicotiana benthamiana. Im Pflanzentest mit Solanum lycopersicum (Tomate) zeigten die sbtA- und sbtB-Mutanten jeweils eine leicht verminderte Virulenz. Allerdings fehlen für eine statistisch abgesicherte Auswertung weitere Datensätze, sodass zum jetzigen Zeitpunkt eine Beteiligung an der kompatiblen Interaktion nicht ausgeschlossen werden kann.
Einleitung
1. Das Tomatenpathogen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Die Gattung Clavibacter umfasst Gram-positive, aerobe, nicht sporenbildene Bakterien (Davis et al., 1984). Aufgrund von 16SrRNA-Analysen und des Zellwandaufbaus wird Clavibacter der Familie der Microbacteriaceae (Ordnung Actinomycetales) zugeordnet (Stackebrandt et al., 1997). Es gehört zu der kleinen Gruppe phytopathogener Aktinomyceten.
Der Gattung Clavibacter enthält nur eine Art, der bislang fünf Clavibacter michiganensis-Subspezies zugeordnet werden, die alle phytopathogen sind (Tab. 1). Alle michiganensis-Subspezies haben gemein, dass sie systemische Infektionen auslösen und das vaskuläre System ihrer jeweiligen Wirtspflanze besiedeln (Vidaver, 1982). Die folgende Tabelle bietet einen Überblick der verschiedenen Subspezies, ihrer Wirtspflanzen, und der charakteristischen Krankheitssymptome, die sie auslösen (Shirakawa et al., 1991).
Cm-Subspezies Wirtspflanze Krankheitsbild Quelle
C. m. subsp.
insidiosus
Luzerne
(versch. Leguminosen) bakterielle Welke McCulloch, 1925
C. m. subsp. michiganensis
Tomate, Paprika
(versch. Solanaceen) bakterielle Welke Smith, 1910; Strider, 1969
C. m. subsp.
nebraskensis Mais Blatt- und Stängelfäule
Vidaver & Mandel 1974; Schuster, 1975
C. m. subsp.
sepedonicus Kartoffel; Aubergine Bakterienringfäule Manzer & Genereux, 1981
C. m. subsp.
tessellarius Weizen Blattfleckung Carlson & Vidaver, 1982
Tabelle 1: Wirtspflanzen und charakteristische Krankheitssymptome nach Befall mit den verschiedenen Clavibacter michiganensis-Unterarten.
Die Unterart Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) verursacht die bakterielle Welke der Tomatenpflanze (Solanum lycopersicum) (Davis et al., 1984). Sowohl über kontaminiertes Saatgut als auch über äußere Verletzungen im Wurzel- und
Sprossbereich der Pflanze kann eine Infektion erfolgen. Eine (späte) Infektion der Tomatenpflanze durch Cmm kann zu einer latenten Infektion führen, bei der Cmm in den Samen eindringt und somit an die nächste Generation weitergegeben wird. Kontaminiertes Saatgut ist somit wohl einer der Hauptgründe für Ausbrüche, der von Cmm verursachten Welkekrankheit in der Landwirtschaft (Tsiantos, 1987). Gelangt das Bakterium ins Erdreich, kann es dort über mehrere Jahre persistieren, aber nur wenn es mit abgestorbenem Pflanzenmaterial assoziiert ist (Fatmi et al., 2002). Durch Cmm werden enorme Ernteverluste im kommerziellen Tomatenanbau verursacht.
Nach erfolgreicher Infektion breitet sich Cmm als Endophyt der Tomate innerhalb des pflanzlichen Gefäßsystems, dem Xylem, systemisch über die gesamte Pflanze aus (Strider, 1969; Abb. 1).
Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Xylemgefäßes der Tomate, das von Cmm besiedelt ist, im Querschnitt (Aufnahme: Tom Trapphoff, Universität Bielefeld).
Die Kolonisation der Tomatenpflanze geht einher mit der Erschließung von Nährstoffquellen aus dem sauren (pH 5,0-5,5), relativ nährstoffarmen Xylemsaft. Der Xylemsaft der Tomate enthält nur geringe Zuckerkonzentrationen, hat jedoch einen relativ hohen Gehalt an Carbonsäuren wie zum Beispiel Malat, Citrat, Fumarat und Succinat (Bialczyk et al., 2004). Nach der erfolgreichen Besiedlung der Wirtspflanze erfolgt das Stadium der Krankheitsausprägung. Die Infektion führt zunächst zu einer Wachstumsretardierung, gefolgt von einer unifacialen Blattwelke (Abb. 2A). Die unifaciale Blattwelke ist ein typisches Symptom der Erkrankung und ist durch ein tütenförmiges Einrollen und Verwelken der Fiederblätter auf einer Seite des Blattes charakterisiert, während auf der gegenüberliegenden Seite die Fiederblätter zunächst noch voll turgeszent sind (Strider,
1969). Im weiteren Krankheitsverlauf nimmt die Intensität der Welke zu und es kommt einseitig zum Aufreißen des Sprosses. Diese charakteristische Ausbildung von Sprossläsionen (cankers, Abb. 2B) kann die Standfestigkeit der Pflanze so stark beeinträchtigen, dass es zum Abknicken und somit zum Absterben der Pflanze führt (Wallis, 1977).
Abbildung 2: Durch Cmm382 hervorgerufene Krankheitssymptome der Tomate vier Wochen nach Infektion. A: unifaciale Fiederblattwelke, B: Sprossläsion (Aufnahme: Holger Jahr, Universität Bielefeld).
Im Spätstadium der Infektion können in der Pflanze Bakterientiter von bis zu 1 x 109 Bakterien pro Gramm Frischgewicht erreicht werden (Bermpohl, 1990).
Das Genom von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 besteht aus dem 3,3 Mb großen zirkulären Chromosom, das einen hohen GC-Gehalt von 72,6 % besitzt (Gartemann et al., 2008). Zusätzlich enthält der Wildtyp CmmNCPPB382 die beiden nativen Plasmide pCM1 und pCM2 (Meletzus et al., 1993), auf denen zwei essentielle Virulenzdeterminanten, celA (pCM1) und pat-1 (pCM2), lokalisiert sind. Die beiden Plasmide bleiben bei der Kultivierung von Cmm bei einer Temperatur von 26-28° C in der Zelle stabil erhalten, können aber bei Temperaturerhöhung auf 32° C verloren gehen. So wurden (teilweise) Plasmid-freie Curingderivate des Wildtyps NCPPB382 erzeugt (Meletzus et al., 1993). Das Curing-Derivat CMM100 zeichnet sich dadurch aus, dass es die Tomatenpflanze noch effektiv kolonisieren kann, aber keine Welkesymptome hervorruft, also avirulent ist. Die Curing-Derivate CMM101 und CMM102 besitzen nur das Plasmid pCM1 bzw. pCM2 und zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine abgeschwächte Virulenz. Die Auslösung der Welkesymptome verzögert sich nach Infektion mit einem dieser beiden Stämme um 4-6
Tage (Meletzus et al., 1993). Die für die Virulenz benötigten Gene sind also plasmidkodiert, während die Gene, die für die Kolonisation der Pflanze notwendig sind, auf der chromosomalen DNA liegen.
CelA und Pat-1- die bekannten Virulenzdeterminanten von Cmm382
Auf dem 27,4 kb großen Plasmid pCM1 befindet sich das Gen celA, das eine 78 kDa große β-1,4-Endoglucanase (Cellulase) kodiert (Jahr et al., 2000). Dieses Protein besteht aus 746 Aminosäuren, besitzt ein Signalpeptid, und setzt sich aus drei Domänen zusammen: der N-terminalen katalytischen Hydrolase-Domäne, einer Cellulose-bindenden Domäne und einer C-terminalen Domäne, die Homologie zu pflanzlichen Expansinen besitzt. Fehlt CelA die α-Expansin-ähnliche Domäne, geht die katalytische Aktivität für den Abbau hochmolekularer kristalliner Cellulose verloren, allerdings ist die Degradierung löslicher Cellulose weiterhin möglich (Jahr et al., 2000). Expansine bewirken vermutlich durch die Auflösung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Polysacchariden der Zellwand eine Auflockerung des Cellulosepolymers und ermöglichen damit das Wachstum der Pflanzenzelle (Shcherban et al., 1995; Cosgrove, 1998). Dies könnte den Angriff der Cellulose auf die native Cellulose der pflanzlichen Zellwand erleichtern.
Das 69,9 kb große Plasmid pCM2 trägt das Gen pat-1 (Dreier et al., 1997). Dieses Gen kodiert
ein 29,7 kDa großes Protein, das aus 280 Aminosäuren besteht und aufgrund eines N-terminalen Signalpeptids wahrscheinlich sekretiert wird (Dreier et al., 1997). Es ist eine
Serinpeptidase, deren typische Serin- und Histidinmotive identifiziert wurden (Dreier, 1995; Burger et al., 2005). Innerhalb der Serinpeptidasen gehört Pat-1 in die Unterfamilie S1A, der z. B. auch Chymotrypsin angehört.
Sequenzvergleiche zeigten, dass das Pat-1-Protein Mitglied einer ganzen Familie von Serinpeptidasen ist, die in Cmm (10 Proteine) und Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms, 11 Proteine) vorkommen. Die Familie wurde Chp-Familie (chromosomal
homology of pat-1) genannt. Der Austausch von Aminosäuren des aktiven Zentrums in Pat-1
führte zum Verlust der Virulenz (Niermann, 1997; Burger et al., 2005), so dass eine funktionell aktive Serinpeptidase angenommen werden kann. Eine proteolytische Aktivität von Pat-1 konnte bislang nicht gezeigt werden. Wird aber das Serin-Kodon aus der potentiellen katalytischen Triade von pat-1 gegen ein Threonin-Kodon ausgetauscht, sind die
resultierenden Cmm-Stämme (pCM1) avirulent. Folglich ist die über Sequenzanalyse identifizierte katalytische Domäne essentiell für die Aktivität von Pat-1 und damit auch essentiell für die Virulenz (Niermann, 1997; Burger et al., 2005). Eine Infektionsphasen- abhängige Expression von pat-1 wurde von Chalupowicz et al. (2010) gezeigt. 24 Stunden nach Infektion der Tomatenpflanze wurde das höchste Transkriptionslevel (Expression um das 170-fache erhöht) verzeichnet.
Die genaue Funktion dieses Proteins, vor allem in der Pathogenese, ist aber bislang unbekannt.
Die chromosomale Pathogenitätsregion chp/tomA-Region
Über das gesamte Chromosom verteilt besitzt Cmm382 ungefähr zwanzig Regionen, deren GC-Gehalt deutlich niedriger ist, als der des restlichen Genoms (72,6 %). Diese Regionen sind spezifisch für Cmm382 und treten in Cms nicht auf (Gartemann et al., 2008). Die größte dieser Regionen (etwa 129 kb; Position 38000 bis 167000) ist die sogenannte chp/tomA-Region. Diese Region kann unterteilt werden in die chp-Subregion (79 kb; GC-Gehalt: 64,8 %) (Abb. 3) und die tomA-Subregion (50 kb; GC-Gehalt: 66,8 %). Die chp-Region enthält neben den sieben chp-Genen (chromosomal homology of pat-1) (chpA-chpG) (s. Kapitel 3, Einleitung) Gene für weitere extrazelluläre Enzyme, die möglicherweise an der Pathogenität beteiligt sind. Dazu gehören weitere Proteasen: sechs Mitglieder der Ppa-Familie (protease
pathogenicity) (ppaA-ppaE) und eine Subtilase (SbtA). Weitere Exoenzyme aus der
chp-Region sind die Pektat-Lyasen PelA1 und PelA2. Diese Proteine sind Zellwand-degradierende Enzyme, die bei manchen Bakterien essentiell für die Pflanzeninfektion sind (Hayashi et al., 1997). Pektin ist Hauptbestandteil der pflanzlichen Mittellamelle, die benachbarte Zellen in der Zellwand voneinander trennt (Collmer et al., 1988). Pektinasen (Pektat- und Pektin-Lyasen) degradieren die Pektinfraktion und erleichtern somit einem Pathogen die Penetration und Kolonisation in der Wirtspflanze. Diese Enzyme können Mazeration des Pflanzengewebes hervorrufen und die Zellwandstruktur modifizieren (Collmer et al., 1988).
Abbildung 3: Physikalische Karte der chp/tomA-Genregion. Die 1,9 kb großen direct repeats, die die Region flankieren, sind als blaue Boxen dargestellt. Grün: Gene, die für Serinproteasen kodieren, Orange: Gene, die für Transporter kodieren, Violett: Gene, die für Glykosidasen kodieren. Pseudogene sind unterstrichen.
Die tomA-Subregion kodiert u.a. zwölf Glykosidasen, ein Cytochrom P450 und eine Tomatinase, die das α-Tomatin, ein Wachstum-inhibierendes Alkaloid der Tomatenpflanze, entgiftet (Kaup et al., 2005). Darüber hinaus sind in der Region Gene lokalisiert, deren Produkte vermutlich im Kohlenhydrat-Metabolismus involviert sind oder Zuckertransporter und Regulatoren sind.
Dass diese Region eine Rolle in der Pathogenität spielt, zeigt eine Deletionsmutante (CMM101β30-18), die trotz des Vorhandenseins der Pathogenitätsdeterminante celA, keine Welkesymptome ausbildet und die Tomatenpflanze nicht effektiv kolonisieren kann (Titer: 2,8 x 104 Bakterien/g Pflanzenhomogenat) (Kirchner, 2003). In CMM101β30-18 ist das zur Mutagenese verwendete Transposon Tn1409β (Gartemann & Eichenlaub, 2001) in den offenen Leserahmen CMM_0135 inseriert. Die Komplementation der Mutante durch Einbringen eines intakten Gens durch den Shuttlevektor pDM302 führte nicht zur Wiederherstellung des Phänotyps von CMM101. Dieses Ergebnis machte deutlich, dass der beobachtete Effekt auf einer weiteren Mutation beruhen musste (Abt, 2003). Durch Pulsfeldgelektrophorese wurde nachgewiesen, dass die Mutante eine Deletion von ca. 130 kb enthält, die fast die komplette chp/tomA-Region umfasst. Vermutlich ist die Deletion durch homologe Rekombination zwischen den 1,9 kb großen direct repeats (DR1a/DR1b) erfolgt, die die chp/tomA-Region eingrenzen (Schott, 2004). Eine Entsprechung zur
chp/tomA-Region findet sich in dem ebenfalls sequenzierten Kartoffelpathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms)-Stamm nicht (Bentley et al., 2008).
Aufgrund des Phänotyps der Deletionsmutante CMM101β30-18 konnte der chp/tomA-Region eine entscheidende Bedeutung für die effektive Kolonisation der Wirtspflanze und für die Ausbildung von Krankheitssymptomen zugewiesen werden. TomA scheint dabei keine wesentliche Bedeutung an der Interaktion mit Kulturtomaten zu besitzen, da die entsprechende Mutante ebenso virulent war wie der Kontrollstamm (Kaup, 2005). In avirulenten Cmm-Isolaten von infizierten Tomatenpflanzen aus Israel und den Niederlanden fehlten die chp-Gene. Diese avirulenten Stämme erreichten einen deutlich geringeren Titer als NCPPB382 (1 x 106 bis 5 x 107 /g Pflanzenhomogenat), obwohl die Gene celA und pat-1 vorhanden waren. Durch Southern Hybridisierung und/oder PCR-Analysen konnten in diesen Stämmen nur maximal ein chp-Gen nachgewiesen werden, während in virulenten Stämmen, alle sieben chp-Gene detektiert wurden (Steingröver, 2003; Gräfen, 2005; Kleitman et al., 2008).
Die gezielte Inaktivierung einzelner Gene (chpC, ppaA und ppaC) führte zu einer verringerten Kolonisationsrate der jeweiligen Mutanten, während die chpG-Mutante nicht mehr zur Auslösung der HR auf Mirabilis jalapa befähigt war (Stork et al., 2008; Schott, 2004). Auch hier ist die genaue Funktion und vor allem das Substrat der Serinpeptidasen in der Pathogenese bisher unbekannt.
2. Proteasen – Klassifizierung und Funktion
Eine umfangreiche Enzymklasse stellen die proteolytischen Enzyme dar. Proteasen sind Enzyme, die Proteine und Peptide durch Hydrolyse der Peptidbindungen spalten. Aufgrund des eigentlichen Substrats (der Peptidbindung) wurde der Begriff der Peptidasen eingeführt (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/). Aufgrund ihrer funktionellen Diversität und der Tatsache, dass etwa 2 % aller Genprodukte Peptidasen sind (Barret et al., 1998) machen sie eine der größten Enzymgruppen aus.
Peptidasen werden nach ihrem Wirkungsort in der Polypeptidkette in zwei Gruppen unterteilt, die Exopeptidasen und die Endopeptidasen. Desweiteren werden die Peptidasen hinsichtlich der Aminosäuren des aktiven Zentrums unterschieden (aufgelistet in der MEROPS- Datenbank (http://merops.sanger.ac.uk/; Rawlings et al., 2006).
Exopeptidasen hydrolysieren Peptidbindungen am Amino- oder am Carboxyl-Terminus des Proteins. Sie spalten Peptidbindungen nicht weiter als 3 Aminosäurereste vom entsprechenden Terminus entfernt. Diese werden weiter unterteilt in Aminopeptidasen (EC3.4.11), Di- bzw. Tripeptidyl-Peptidasen (EC3.4.14), Carboxylpeptidasen, Peptidyl-Dipeptidasen (EC3.4.15) und Peptidyl-Dipeptidasen (EC3.4.13). Eine Ausnahme stellen die Omega-Peptidasen (EC3.4.19) dar, die bestimmte modifizierte terminale Reste freisetzten können. Endopeptidasen spalten enzymatisch Peptidbindungen innerhalb des Proteins, wenigstens 3 Aminosäurereste von den Termini entfernt. Dazu zählen humane Verdauungsproteasen wie Trypsin oder Chymotrypsin. Die Spezifität der Hydrolysestelle wird durch die Aminosäure-Abfolge des Substrates rund um die Hydrolyseposition bestimmt. So hydrolysiert Trypsin Proteine C-Terminal der Aminosäuren Lysin und Arginin (Brown & Wold 1973), während die Spaltungsspezifität von Peptidbindungen bei Chymotrypsin auf den Carbonylgruppen beruht, die von aromatischen Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan) stammen (Hedstrom et al., 1992).
Je nach ihrem Wirkungsort in einem Organismus werden Proteasen als intrazelluläre oder extrazelluläre Peptidase bezeichnet. Intrazelluläre Proteasen regulieren eine Vielzahl von zellulären Abläufen. Sie spielen eine zentrale Rolle in zellulären Prozessen wie Proteinexport und Sekretion und Stressresistenz (Visick & Clarke, 1995; Gottesman, 1996; Gottesman et al., 1997). Eine wichtige Aufgabe der Proteolyse in der Zelle ist die Eliminierung von defekten oder fremdartigen Polypeptiden und Proteinen (Strauch et al., 1989). Spezifische Proteasen sind aber auch in der Lage, Enzyme spezifisch zu inaktivieren oder Präproproteine zu prozessieren und somit eine Vielzahl von zellulären Abläufen zu regulieren. Damit sind Proteasen wahrscheinlich direkt oder indirekt an fast allen Prozessen innerhalb einer Zelle beteiligt (Callis, 1995; Schaller, 2004).
Extrazelluläre Proteasen üben nach Sekretion ihre katalytische Aktivität außerhalb der Zelle aus. Die Sekretion geschieht dabei unter Mitwirkung N-terminaler Signalsequenzen. Die durchschnittliche Länge der Signalpeptide bei Exportproteinen Gram-negativer Bakterien beträgt 24 Aminosäuren und ist somit deutlich geringer als die der Signalpeptide von Proteinen aus Gram-positiven Bakterien, welche im Durchschnitt 30 Aminosäuren beträgt. Bei der Translokation erfolgt deren Abspaltung durch Signalpeptidasen, wobei die Proteasen dann oft noch als inaktive Vorstufen (Zymogene) vorliegen. Erst durch Abspaltung der Prosequenz, die einerseits als Chaperon während der Faltung (Eder & Fersht, 1995),
andererseits als Inhibitor (Kessler & Safrin, 1994; O'Donohue & Beaumont, 1996; Wiederanders et al., 2003) wirken kann, erhalten die Proteasen ihre enzymatisch aktive Form. Die proteolytische Spaltung kann dabei autoproteolytisch (z. B. bei Trypsin und Plasmin) oder durch andere Proteasen (z. B. bei Chymotrypsin) erfolgen. Trypsin und Chymotrypsin sind die beiden Hauptproteasen des Pankreas (Northrop et al., 1939). Diese Proteine werden vom Pankreas in Form der inaktiven Zymogene Trypsinogen und Chymotrypsinogen ins Duodenum sekretiert. Die Enteropeptidase des Dünndarmepithels aktiviert einen Teil der Enzymmenge durch Spaltung des Trypsinogens zu Trypsin. Das entstehende Trypsin kann sich autokatalytisch die vollständig sekretierte Menge des Enzyms aktivieren (positive Rückkopplung). Das enzymatisch aktive Trypsin ist in der Lage das Proenzym Chymotrypsinogen (inaktive Vorstufe von Chymotrypsin), durch hydrolytische Spaltung zwischen Arg15 und Ile16, zu π Chymotrypsin zu aktivieren. Dies ist zwar voll aktiv, jedoch instabil. Durch autoproteolytische Abspaltung der Dipeptide Ser14 und Arg15 sowie Thr147 und Asp148 entsteht die stabile Form, das α-Chymotrypsin (Rehner, 2010).
Nach der Sekretion von Peptidasen in den periplasmatischen Raum oder ins Medium können diese als extrazelluläre Enzyme unterschiedliche Proteine hydrolysieren. Bei vielen Bakterien sind neben Amylasen (Boyer & Ingle, 1972) und Pektinasen (Jauneau et al., 1986) auch extrazelluläre Proteasen an der unspezifischen Zerlegung von Proteinen in ihre Grundbausteine beteiligt, deren freigesetzten Aminosäuren für die Energiegewinnung und für das Wachstum zur Verfügung stehen. Durch Proteasen, die α-Casein hydrolysieren, wie die Serinproteasen PrtH von Lactobacillus helveticus (Pederson et al., 1999) und PrtS von Streptococcus thermophilus (Fernandez-Espla et al., 2000) werden wichtige essentielle Aminosäuren gewonnen, die von den Bakterien nicht selbst synthetisiert werden können. In Bezug auf die Substratspezifität sind diese Proteasen eher als unspezifisch zu bezeichnen, da diese im Rahmen der Nährstoffversorgung verschiedenste Proteine abbauen. Extrazelluläre Proteasen aus pathogenen Organismen sind von besonderem Interesse, da diese für den Abbau des Bindegewebes des Wirtes (Borg von Zepelin et al., 1999; Carlile et al., 2000) und der Deregulation von Proteinkaskaden oder Inhibitorsystemen notwendig sein können (Hotson et al., 2003; Block et al., 2011; López-Solanilla et al., 2004) und damit entscheidende Virulenzfaktoren darstellen können. Diese Proteasen sind hochspezifisch, da zur Überwindung der physiologischen Barrieren und Unterdrückung der Immunantwort durch Einwirken in Signaltransduktionswegen nur ein spezifisches wirtseigenes Substrat
hydrolysiert wird. Extrazelluläre Proteasen können aber auch in basalen metabolischen Funktionen involviert sein (Di Pietro et al., 2001).
Entscheidend für die katalytische Aktivität von Proteasen ist die Aminosäuresequenz des aktiven Zentrums. Anhand der chemischen Beschaffenheit des aktiven Zentrums werden Proteasen in der MEROPS-Datenbank (http://merops.sanger.ac.uk) in fünf Hauptgruppen klassifiziert (Tab. 2).
funktionelle Gruppe bzw.
aktives Zentrum Peptidasen Beispiel
Aspartat Aspartylpeptidasen Pepsin, Cathepsine D, E
Cystein Cysteinpeptidasen Cathepsine B, H, L, Caspasen
meistens Zn2+ Metallopeptidasen Thermolysin, Collagenase
Serin Serinpeptidasen Chymotrypsin, Trypsin, Plasmin
Threonin Threoninpeptidasen Proteasom
Tabelle 2: Klassifizierung der Peptidasen anhand der MEROPS-Datenbank.
Die Serinpeptidasen werden aufgrund ihrer Aminosäuresequenz in etwa 50 Familien differenziert. Unterschiede in der Tertiärstruktur und der Reihenfolge der Aminosäure-Reste im katalytischen Zentrum ermöglichen eine Unterteilung dieser Familien in neun Clans (Rawlings & Barrett; 1994; Barrett & Rawlings, 1995).
Alle proteolytischen Enzyme aus dem Subclan PA(S) sind Endopeptidasen mit einer katalytischen Triade bestehend aus den Aminosäuren Histidin, Asparaginsäure und Serin
(HDS). Die Tertiärstruktur dieser Proteine hat eine Zwei-Domänen-Struktur aus zwei β-Faltblättern (parallel und antiparallel) und einer α-Helix. Die größte Familie des Subclans
ist die Familie S1, die weiter in fünf Subfamilien unterteilt wird (S1A bis S1E). Zur Subfamilie S1A gehören u.a. Chymotrypsin und Trypsin, die Hauptproteasen des Pankreas (Northrop et al., 1939). α- und β-Chymotrypsin bestehen aus drei Polypeptidketten, die durch limitierte Proteolyse aus Chymotrypsinogen entstehen, und über Disulfidbrücken verknüpft sind. Chymotrypsin dient seit vielen Jahren als Modellsystem zur Untersuchung enzymatischer Aspekte wie der Substrat-spezifischen Katalyse (Perona & Craik, 1995).
Der Clan SB beinhaltet u.a. die Serinpeptidasefamilie S8, die auch als Subtilase-Familie bezeichnet wird. Sie hat ihren Namen von Subtilisin, einer relativ unspezifischen, alkalischen
extrazellulären Protease aus Bacillus subtilis. Die katalytische Triade unterscheidet sich durch die Anordnung der Aminosäuren Asparaginsäure, Histidin und Serin von der der Familie S1. Die Familie S8 enthält neben einer Exopeptidase, der Tripeptidyl-Peptidase II, ausschließlich Endopeptidasen. Bei allen untersuchten Subtilasen erfolgt die Aktivierung dieser Enzyme durch Autoproteolyse. Lange Zeit wurde angenommen, dass Subtilasen nur in Prokaryoten vorzufinden sind, aber mit der Entdeckung der Subtilisin-ähnlichen Kex2p-Protease (Kexin) der Hefe Saccharaomyces cerevisiae erfolgte erstmals die Identifizierung von Subtilasen in Eukaryoten, die mittlerweile in nahezu allen Organismen entdeckt wurden (Julius et al., 1984; Thorner, 1985). Basierend auf Sequenzvergleichen werden die Subtilasen in sechs Familien unterteilt: Subtilisin, Thermitase, Kexin, Pyrolysin, Proteinase K und Lantibiotische Peptidasen (Siezen & Leunissen, 1997). Die Subfamilie S8A beinhaltet die Subtilisin-ähnlichen Serinpeptidasen, die sowohl in Bakterien, Pilzen und höheren Eukaryonten auftreten (Siezen et al., 1991). Die erste tierische Subtilase, das Furin, konnte aufgrund hoher Sequenzähnlichkeit zum katalytischen Zentrum des Kexins identifiziert werden (Fuller et al., 1989). Weitere tierische Subtilasen sind die dem Kexin homologen Proprotein-Konvertasen (PC). Die PC-Familie wird in drei Gruppen untergliedert: (i) die Membran-gebundenen Konvertasen, (ii) die sekretorischen Konvertasen und die (iii) die regulatorischen Konvertasen, die in Säugern für die Reifung von Peptidhormonen, Neuropeptiden, Wachstumsfaktoren und Rezeptorproteinen verantwortlich sind (Barr, 1991; Seidah et al., 2003). In vielen Eukaryonten, aber auch Bakterien, sind die Subtilasen hochspezifische extrazelluläre Proteine, die in Abwehrprozessen involviert, am Zellwachstum beteiligt sind oder auch direkt als Virulenzfaktor fungieren. Auf der Seite der prokaryotischen Subtilasen ist besonders die Subtilase Cytotoxin ABS (SubAB) zu erwähnen, die von bestimmten
Toxin-bildenden E. coli-Stämmen produziert wird und ein hoch wirksames Zellgift darstellt (Paton et al., 2004). In Pflanzen weisen die Subtilasen eine Multidomänen-Struktur auf (die Prä-, Pro-, katalytische und Protease-assoziierte (PA)-Domäne) und werden durch Proteolyse zur aktiven Protease prozessiert (Beers et al., 2004), wo sie dann spezifische Aufgaben in physiologischen Abläufen übernehmen. Die SDD1-Subtilase (stomatal density and
distribution 1) von Arabidopsis wird vermutlich in den Apoplasten der Zellen sekretiert, wo
sie an der Prozessierung der für die Kontrolle der Stomatadichte verantwortlichen Proteine beteiligt sein könnte (von Groll et al., 2002). Die Subtilisin-ähnliche Serinprotease ALE1
(abnormal leaf shape 1) ist während der Embryonalentwicklung von Arabidopsis thaliana erforderlich bei der Differenzierung der Epidermis (Tanaka et al., 2001).
In der Tomate (Solanum lycopersicum) sind bisher 15 Subtilasen aus fünf Subfamilien identifiziert (je ein Gen der Subfamilien SBT1, SBT2 und tmp, fünf Gene der SBT3/4 und sechs Gene der P69-Subfamilie) (Meichtry et al., 1999). Die Tomatensubtilasen weisen eine Multidomänen-Struktur mit einem N-terminalen Signalpeptid auf, das für die Ausschleusung des Proteins über das Sekretionssystem notwendig ist. Das Signalpeptid wird gefolgt von einem Propeptid, das bei der Faltung des Proteins hilft und/oder als intramolekularer Inhibitor der Enzymaktivität wirkt (Ujwal & Masayori, 1996; Siezen et al., 1995). Die genaue Funktion fast aller Subtilasen der Tomate ist noch unbekannt. P69A und P69D spielen vermutlich eine Rolle in der Pflanzenentwicklung, da das Expressionsprofil gewebespezifisch und entwicklungsabhängig ist (Jordá et al., 1999). Die Funktion von P69E und P69F ist unbekannt, ihre Expression erfolgt nur in Wurzeln bzw. Hydathoden (Jordá et al., 2000). Demgegenüber scheinen P69B und P69C in der Wund- und Pathogen-Abwehr involviert zu sein. Expressionsanalysen auf mRNA-Ebene zeigten eine Induzierbarkeit durch Pathogenbefall bzw. nach Behandlung mit Salicylsäure oder dem Pilztoxin Fusicoccin, wodurch sie in der Pathogenantwort involviert sein könnten (Jordá et al., 1999; Jordá & Vera, 2000; Schaller et al., 2000).
3. Peptidasen von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Im Genom von Cmm sind wie bereits erwähnt eine Vielzahl von Genen annotiert worden, die für extrazelluläre Peptidasen codieren. Insgesamt gibt es 28 Serinpeptidasen, die drei verschiedenen Familien zugeordnet werden können (Gartemann et al., 2008). Neben dem Pathogenitätsfaktor Pat-1 werden neun weitere Peptidasen zur Chp-Familie (chromosomal
homology of pat-1) zusammengefasst. Die Mitglieder der Familie sind etwa 280 AS groß
(ungefähr 30 kDa). Alle Mitglieder besitzen eine katalytische Triade aus den Aminosäuren Histidin, Asparaginsäure und Serin und gehören zur Serinprotease-Familie S1A. Charakteristisch für die Peptidasegene ist der niedrige GC-Gehalt (zwischen 52 und 65%). Drei der zehn chp-Gene befinden sich auf dem Plasmid pCM2 (pat-1, phpA und phpB), während die restlichen sieben Serinproteasegene (chpA bis chpG) in der chromosomalen chp-Region liegen. Drei der sieben chromosomalen chp-Genen sind Pseudogene (chpA, chpB
und chpD), da sie innerhalb der ORFs Leserasterschübe und/ oder in-frame Stopcodons enthalten. In Cms treten 11 Mitglieder der Chp-Familie auf (Bentley et al., 2008). Homologe Gene fehlen in der die Monokotyle Mais befallenden Subspezies Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (Cmn) (Eichenlaub & Gartemann, 2011). Damit könnten diese Gene spezifisch für Wirtspflanzen der Familie Solanaceae oder für dikotyle Pflanzen sein. Außer für pat-1 in Cmm ist auch für das chp7-Gen aus Cms eine Beteiligung an der Virulenz (bakteriellen Ringfäule der Kartoffel) gezeigt (Nissinen et al., 2009). Chp-7 spielt zusätzlich auch eine Rolle in der Auslösung der HR bei der Nicht-Wirtspflanze Nicotiana tabacum cv. Samsun (Tabak). In Cmm übernimmt ChpG eine derartige Funktion in der HR-Auslösung (Stork et al., 2008). Dagegen ist für ChpC und ChpE eine Beteiligung an der Kolonisierung der Tomate gezeigt, entsprechende Mutanten weisen einen reduzierten bakteriellen in planta-Titer auf (Stork et al., 2008; Barash, pers. Mitteilung). Die Inaktivierung von chpF durch Insertion einer Antibiotika-Resistenzkassette hatte allerdings keinen Effekt auf die Kolonisation. Lediglich die Fähigkeit zur Ausbildung von Sprossläsionen bei infizierten Tomaten war in der chpF-Mutante vermindert. Durch Komplementation der Mutante durch das Wildtyp-Allel konnte die volle Virulenz wiederhergestellt werden (Barash, pers. Mitteilung). Homologe sind auch in Leifsonia xyli subsp. xyli und pflanzenpathogenen Proteobakterien (Xanthomonas-Arten) zu finden (Nissinen et al., 2009).
Für alle Mitglieder der Chp-Familie sind Signalpeptide vorhergesagt, sie sollten also sekretiert werden. In Exoproteomstudien sind bisher ChpC, ChpE, ChpF, ChpG und Pat-1 im Xylemsaft Cmm382-infizierter Tomaten nachgewiesen worden (Savidor et al., 2012; Tews, 2012). Auf RNA-Ebene ist die Induktion der chp-Gene in planta 10 Tage nach Infektion reprimiert. Die Repression dieser Gene war auch in vitro 13 Stunden nach Supplementierung des M9-Minimalmediums mit Tomatenblatthomogenat nicht-infizierter Pflanzen zu beobachten (Flügel et al., 2012).
Für alle bisher untersuchten Mitglieder der Chp-Familie ist nur mit genetischen Methoden eine Beteiligung an der Pflanzeninteraktion gezeigt, allerdings sind die entsprechenden Proteine bisher nicht gereinigt und dementsprechend keine Untersuchungen zur genauen Funktion der Chp-Serinproteasen oder ihren Substraten durchgeführt worden.
Die zweite Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinpeptidasen stellt die ppa-Genfamilie (protease pathogenicity) dar, die in Cmm 11 Mitglieder beinhaltet. Diese Proteine umfassen in etwa 330 AS (ungefähr 35 kDa). Während das Gen ppaJ auf dem Plasmid pCM1 lokalisiert
ist, sind vier weitere Gene (ppaF, G, H und ppaI) auf dem Chromosom, außerhalb der chp-Region, zu finden. Die restlichen sechs Gene (ppaA bis ppaE) sind in der chp-Genregion lokalisiert. Alle Peptidasen besitzen ein Signalpeptid und die für Serinpeptidasen spezifische katalytische Triade (HDS). Mit Hilfe der MEROPS-Datenbank wurden die Peptidasen aus der Ppa-Familie den Serinpeptidasen der Subfamilie S1X zugeordnet. Für zwei Gene, ppaA und ppaC, ist über Konstruktion von knock out-Mutanten eine Beteiligung an der Bakterien-Pflanzen-Interaktion gezeigt, die Inaktivierung hatte eine leichte Reduzierung der Welkesymptome und des Titers in planta zur Folge (Eichenlaub, unveröffentlicht). Homologe wurden in Cms (8 Mitglieder), Cmn (1 Mitglied) und verschiedenen pflanzenpathogenen Proteobakterien wie Xylella fastidiosa, Acidovorax und Xanthomonas gefunden. In Sekretomanalysen von Cmm382 konnten alle Mitglieder der Ppa-Familie identifiziert werden (Tews, 2012). Alle ppa-Gene waren auf RNA-Ebene sowohl in planta (10 Tage nach Infektion) als auch in vitro (13 Stunden nach Zugabe des Tomatenblatthomogenats zum M9-Medium) reprimiert (Flügel et al., 2012).
Auch in diesen Fall ist keines der Proteine genauer untersucht und die Funktion/das Substrat der Proteasen bekannt.
Die Cmm382-Gene sbtA, sbtB und sbtC gehören der dritten Familie extrazellulärer Serinpeptidasen, der Subtilase-Familie (S8), an, die Größen von 1000-1200 AS aufweisen. Peptidasen dieser Gruppe zeichnen sich durch eine katalytische Triade aus Aspartat, Histidin und Serin (DHS) aus. Die Gene sbtB und sbtC (CMM_2536 und CMM_2535) befinden sich, im Gegensatz zum sbtA-Gen, nicht in der chp-Subregion, sondern in einem anderen Bereich im Genom, wo sie in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander liegen. Das Alignment der Clavibacter-Subtilasen zeigt neben dem Propeptid und der katalytischen Domäne eine zusätzliche am C-Terminus folgende 200-300 AS große Domäne, deren Funktion unbekannt ist, und die in homologen pflanzlichen Subtilasen (Solanum lycopersicum, Arabidopsis thaliana) nicht vorkommt (s. Alignment, Seite 211). mRNA-Analysen der sbt-Gene zeigten 10 Tage nach Infektion der Pflanzen eine Reprimierung für sbtA und sbtB, während die Induktion von sbtC um das 1,7-fache erhöht war (Flügel et al., 2012).
Es handelt sich um extrazelluläre Subtilasen: Signalpeptide sind vorhergesagt, und SbtA, SbtB und SbtC sind im Sekretom von Cmm nachgewiesen (Savidor et al., 2012; Tews, 2012). Von besonderem Interesse sind diese Gene durch ihre hohe Ähnlichkeit zu den Subtilasen der Tomate SBT1, SBT2 und vor allem den P69-Proteinen (s. Kapitel 5, Einleitung). Bisher liegen
für diese Gene keine Mutanten vor, daher ist auch nichts vom Phänotyp den diese Gene erzeugen bekannt.
4. Funktionen von Peptidasen in der Pathogenese
Peptidasen, die von Organismen synthetisiert werden, können über Gewebsmazeration oder durch Interaktion mit dem Abwehrsystem des Wirts als Virulenzfaktoren fungieren und somit für die Pathogenität essentiell sein. Sie werden im Normalfall über verschiedene Sekretionssysteme ausgeschleust, wobei die bedeutendsten die Signalpeptid-abhängige Sekretion über das Sec- (Pugsley, 1993) bzw. Tat-System (twin-arginine translocation; Berks
et al., 2005) und die Sekretion von Effektoren über das TypIII-Sekretionssystem (T3SS) der Proteobakterien sind (Bonas et al., 1993).
Sowohl Human- als auch pflanzenpathogene Pilze produzieren eine Vielzahl von Peptidasen, die für die Krankheitsausprägung verantwortlich sind. So konnte eine Serinprotease als Virulenzfaktor des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus identifiziert werden (Kolattukudy et al., 1993). Peptidasen könnten an der Degradation von Wirtsstrukturen beteiligt sein, so wie es für die Aspartylprotease des humanpathogenen Pilz Candida albicans (Erreger der Kandidose) beschrieben wurde. Hier erleichtert die Protease den Angriff auf den Wirt, indem sie am Abbau des Cytoskeletts beteiligt ist (Borg von Zepelin et al., 1999). Die Expression einer Subtilisin-ähnlichen Protease (Mp1) von Magnaporthe poae, einem Pilzpathogen der Rasensorte Kentucky Bluegrass, erfolgt in infizierten Wurzeln und korreliert mit der Schwere der Krankheitssymptome (Sreedhar et al, 1999). Stagonospora nodorum, der Erreger der Blatt- und Spelzenbräune beim Weizen, exprimiert eine alkalische Trypsin-ähnliche Protease (SPN1). Die Protease ist an der Freisetzung von Hydroxyprolin (α-Aminosäure) aus der pflanzlichen Zellwand beteiligt und wird in planta während der frühen Phase der Interaktion exprimiert. Es wird vermutet, dass SNP1 an der Degradation der Wirtszelle während der Infektion beteiligt ist (Carlile et al., 2000). Eine extrazelluläre Serinprotease von Colletotrichum coccodes, die die Anthracnose der Tomate hervorruft, ist für die Pathogenität und Virulenz des Pilzes verantwortlich, denn eine Eliminierung der Proteaseaktivität verwandelt das Pathogen in einen nicht-pathogenen Endophyten (Redman & Rodriguez, 2002). Diese Protease hat somit einen ähnlichen Phänotyp wie die Serinprotease Pat-1 von Cmm382.
Peptidasen als Virulenzfaktoren wurden auch bei human- und pflanzenpathogenen Bakterien identifiziert. Das Gram-negative humanpathogene Bakterium Serratia marcescens produziert eine Serinprotease, die in der Pathogenität involviert ist (Molia et al., 1986). Für Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, ein Gram-negatives Bakterium, das verschiedene Fäulniskrankheiten auslöst, ist eine extrazelluläre Metalloprotease identifiziert worden, die in vitro in der Lage war, das Kartoffellektin, ein Hydroxyprolin-reiches Glykoprotein, das in der Pathogenabwehr involviert ist, zu degradieren (Heilbronn et al.,
1995). Eine weitere sekretierte Protease wird durch das prtW-Gen kodiert. Bei prtW-Deletions-Mutanten war die Fähigkeit zur Gewebsmazeration um 40 % reduziert.
Damit ist die Protease zwar nicht essentiell für die Pathogenität, doch sie erhöht die Intensität der Krankheitsentwicklung während des Infektionsprozesses (Marits et al., 1999). In Xanthomonas campestris pv. campestris (Erreger der Adernschwärze bei Kohlgewächsen) sind eine Metalloprotease (PRT2) und eine Serinprotease (PRT1) identifiziert worden. Eine Mutante, der beide Proteaseaktivitäten fehlen, zeigte eine deutlich reduzierte Virulenz, wenn die Inokulation über die Wirtsblätter erfolgte (Dow et al., 1990).
In Proteobakterien wird u.a. ein spezialisiertes System, das TypIII Sekretionssytem (T3SS), das mit Ausnahme von Xylella fastidiosa (Simpson et al., 2000) und Agrobacterium tumefaciens (Cornelis & Van Gijsegem, 2000) in allen bisher untersuchten phytopathogenen Proteobakterien identifiziert werden konnte, zur Einschleusung von Virulenz-Effektorproteinen direkt in die Wirtszellen genutzt. Das T3SS durchspannt die innere und äußere Membran, und kann über einen Pilus direkten Kontakt zu Wirtszellen aufnehmen, in die dann Effektorproteine transloziert werden. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), das bei Paprika (Capsicum annuum) und Tomate (Solanum lycopersicum) die bakterielle Fleckenkrankheit auslöst (Bonas et al., 1993), sekretiert über das T3SS Effektorproteine, die in 39 sogenannte Xop-(Xanthomonas outer protein) Gruppen unterteilt werden können, und teilweise direkt in die Wirtszellen transloziert werden (White et al., 2009). Darunter befindet sich u.a. XopD, eine Cysteinprotease aus der Effektorprotein-Familie AvrRxv/YopJ, die das SUMO-Protein (small ubiquitin like modifier) der Tomate spaltet (Hotson et al., 2003). Bei SUMO handelt es sich um ein cytoplasmatisches Protein, das zur Familie der Ubiquitin-ähnlichen Proteine gehört (Hanania et al., 1999). In vivo konnte die Hydrolyse SUMO-konjugierter Proteine durch XopD nachgewiesen werden. Vermutlich imitiert XopD die endogene SUMO-Isopeptidase, um in die Regulierung der Wirtsproteine,
während der Xcv-Infektion, störend eingreifen zu können (Hotson et al., 2003) und stellt somit einen Virulenzfaktor dar (Chosed et al., 2007). Der Nachweis des proteolytischen Abbaus von Wirtssubstraten durch Cysteinproteasen offenbart eine wichtige Strategie von Pathogenen die Physiologie von Pflanzen zu verändern (Hotson et al., 2003).
Pseudomonas syringae kann durch die Injektion von TypIII-Effektorproteinen in die Wirtspflanze, die Immunantwort der Pflanze unterdrücken (Block et al., 2011). Dies wird durch Interferenz der Effektorproteine mit pflanzlichen Rezeptoren, Blockierung von RNA-Signalübertragungswegen und der Veränderung von Organellfunktionen vermittelt (Block et al., 2011). Eine besondere Stellung nehmen dabei die Cysteinproteasen als Effektorproteine ein. HopPtoN, ist eine YopT-ähnliche Cysteinprotease (Shao et al., 2002), die die hypersensitive Reaktion, eine lokale Resistenzantwort der Pflanze, in der inkompatiblen Reaktion unterdrückt, indem sie in Signaltransduktionswege der Wirtspflanze eingreift (Lopez-Solanilla et al., 2004). Das Avirulenz-Gen avrRpt2 von Pseudomonas syringae kodiert eine Cysteinprotease, die durch das T3SS in die Pflanzenzelle transloziert wird. Innerhalb der Pflanzenzelle erfährt die Protease eine N-terminale Prozessierung und verursacht die Spaltung des RIN4-Proteins von Arabidopsis (Axtell et al., 2003), wodurch die RPS2-vermittelte Resistenz moduliert wird (Mackey et al., 2003). Dieser Prozess erfordert dabei eine intakte katalytische Triade der Cysteinprotease (Chisholm et al., 2004).
Eine weitere Familie von Pseudomonas syringae TypIII-Effektorproteinen (AvrPphB-Familie) nutzt zur Lokalisierung der Cysteinproteasen in die Plasmamembran der Pflanzenzelle eine Acylierung-abhängige und -unabhängige Strategie, die für die Avirulenzaktivität von AvrPphB erforderlich sind. (Dowen et al., 2009).
Neben Cysteinproteasen können auch andere Peptidasen für die Virulenz essentiell sein. Pseudomonas aeruginosa, ein humanpathogener Krankenhauskeim, synthetisiert eine Metalloprotease, die durch Spaltung von Elastin, Kollagen und Immunoglobin IgG an der Virulenz beteiligt zu sein scheint (Neu, 1983). So spielt eine Aspartatprotease, die nicht über das T3SS sekretiert wird, in Ralstonia solanacearum eine wichtige Rolle bei der Virulenz in Kartoffel (Jeong et al., 2011).
Auch eine erfolgreiche Besiedlung von bakteriellen Symbionten von Pflanzen ist nur dann möglich, wenn die Abwehrreaktionen der Pflanze unterdrückt werden. Symbiontische Bakterien wie Rhizobium verfügen ebenfalls über ein T3SS. Rhizobium sp. NGR234 transloziert als Antwort auf Flavonoide (Ausmees et al., 2004) eine Vielzahl von
Effektorproteinen (z. B. NopL, NopP und NopT), die essentiell für die Nodulation sind (Skorpil et al., 2009). NopT ist eine funktionelle Cysteinpeptidase (CA Clan, Familie C58), die über das T3SS ausgeschleust wird, und Homologien zur YopT-AvrPphB Effektorfamilie aufzeigt (Kambara et al., 2009). NopT ist an der Ausbildung der Knöllchen beteiligt, kann aber auch bei der Expression in Tabakpflanzen eine hypersensitive Reaktion auslösen (Dai et al., 2008). In Aktinomyceten wie Clavibacter ist kein T3SS vorhanden. Ob sekretierte Proteasen eine ähnliche Funktion übernehmen, wie gerade für Gram-negative Pathogene beschrieben, ist bisher unbekannt.
5. Pathogen induzierte Pflanzenabwehr
Pflanzen sind einer Vielzahl von Schädlingen ausgesetzt. Dazu gehören neben Nematoden und Insekten auch Pilze und Bakterien. Obwohl Pflanzen kein Immunsystem besitzen, sind sie dennoch resistent gegenüber vielen pathogenen Organismen. In den meisten Pflanzen-Pathogen-Interaktionen kommt es zu keiner Krankheitsausbildung, da eine Kolonisierung nicht möglich ist (Heath, 2000). Neben einem passiven Schutz durch dauerhaft ausgebildete Strukturen wie Dornen, Behaarung und einer mehrschichtigen, wachsartigen Cuticula (Sitte & Strasburger, 1999), können z. B. konstitutiv synthetisierte antimikrobielle Verbindungen bzw. deren Vorstufen (Osbourn,, 1996; Papadopoulou et al., 1999) freigesetzt werden. Neben diesen Mechanismen haben Pflanzen ein komplexes System entwickelt, um Pathogene über Effektormoleküle (Elicitoren) zu erkennen und dann deren Ausbreitung zu verhindern. Mikrobielle Strukturen, anhand derer die Pflanze die Anwesenheit eines Pathogens erkennt, werden als pathogen-/microbe-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs) bezeichnet. Bei den PAMPs/MAMPs handelt es sich zum Beispiel um Bestandteile der bakteriellen Zelle, wie Lipopolysaccharide (Dow et al., 2000; Zeidler et al., 2004), Flagellin (das Hauptprotein der Geissel) (Felix et al., 1999; Gomez-Gomez & Boller 2002), Harpine (He et al., 1993; Wei et al., 1992) oder Kälteschock-Proteine (Felix & Boller, 2003). Dazu zählen aber auch Pflanzenbestandteile, aus denen durch Bakterien Verbindungen freigesetzt werden, die normalerweise in der Pflanze nicht vorzufinden sind (Klarzynski et al., 2000; Yamaguchi et al., 2000). Werden die PAMPs/MAMPs durch Bindung an äußere Rezeptoren des Wirtes (PRRs: pattern recognition receptors) erkannt, werden weitere Abwehrmechanismen (PTI: PAMP-triggered immunity) induziert (Jones & Dangl,
2006; Bittel & Robatzek, 2007). Zusammen mit den passiven Barrieren werden PAMP-vermittelte Abwehrmechanismen als basale Resistenz bezeichnet (Sanabria et al., 2008; de Wit, 2007). Für viele phytopathogene Proteobakterien ist beschrieben, dass sie Effektormoleküle produzieren, die die Effekte der MAMPs induzierten Abwehrreaktion reduzieren oder unterdrücken (Jones & Dangl, 2006). Ist in diesem Fall das Pathogen in der Lage die basale Abwehrantwort zu überwinden, kommt es zu einer kompatiblen Interaktion. Diese Effektormoleküle werden als Avr-Proteine (Avirulenz) bezeichnet und zusammen mit weiteren bakteriellen Proteinen bei fast allen Gram-negativen phytopathogenen Proteobakterien über das TypIII Sekretionssystem (T3SS) in die Wirtzelle eingeschleust (Bonas & Lahaye, 2002). Dort werden sie durch ein bestimmtes korrespondierendes Produkt eines R-Gens (Resistenz) der Pflanze erkannt und gebunden (Gen-für-Gen-Hypothese; Flor, 1955 und 1971; Mackey et al., 2002). Durch die Bindung des Effektormoleküls wird ein breites Spektrum an Abwehrmolekülen induziert, die vielseitige Abwehrmechanismen aktivieren, und somit der Pflanze eine Resistenz gegenüber dem Pathogen verleihen (ETI:
effector-triggered immunity). Rezeptoren, die in der Plasmamembran oder im Cytosol
lokalisiert sind (Ebel & Scheel, 1997; Hammond-Kosack & Jones, 1997) können in fünf Proteinklassen unterteilt werden, wobei alle R-Proteine eine konservierte Nukleotid-Bindestelle besitzen. Die beschriebene inkompatible Interaktion beinhaltet neben der lokalen Resistenz (hypersensitive response, HR), die systemisch erworbene Resistenz (systemic acquried response, SAR) als auch die induzierte systemische Resistenz (induced
systemic resistance, ISR). Bei entsprechender Kombination von avr-Gen und R-Gen wird die
inkompatible Interaktion, bei Nichterkennung wird die kompatible Interaktion ausgelöst.
Die inkompatible Interaktion
Die Pathogenerkennung löst Signalprozesse aus, die Abwehrantworten auf lokaler und systemischer Ebene aktivieren. Die erste Reaktion der Pflanze auf einen Elicitor besteht in einer Veränderung der Permeabilität der Plasmamenbran und führt zu einem Calcium- und Protoneninflux, während Kalium- und Chloridionen ausströmen (Ebel & Scheel, 1997). Dieser Ionenstrom scheint für eine effiziente Induktion des oxidative burst und der Aktivierung von Abwehrgenen notwendig zu sein (Jabs et al., 1997; Pugin et al., 1997). Calcium-permeable Kanäle in Tomatenprotoplasten, aktiviert durch den Art-spezifischen Elicitor von
Cladosporium fulvum, konnten bereits nachgewiesen werden (Gelli et al., 1997). Die Weiterleitung des Elicitorsignals vom Rezeptor zum Calciumkanal erfolgt dabei über GTP-Bindeproteine und Protein-Phosphorylierung/Dephosphorylierung (Legendre et al., 1992; Xing et al., 1997). Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wie Superoxid-Anionen (O•2), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxylradikalen (•OH) stellen eine zentrale
Komponente in der Pathogenabwehr dar (Lamb & Dixon, 1997; Doke, 1997). ROS können dabei direkt toxisch auf Pathogene wirken (Baker & Orlandi, 1995) oder die Verstärkung der physischen Barrieren katalysieren, z.B. Lignifizierung (Tenhaken et al., 1995). Sie sind aber auch an der Signalweiterleitung späterer Abwehrreaktionen beteiligt, wie zum Beispiel der Aktivierung von Abwehrgenen, dem programmierten Zelltod (Jabs et al., 1996; Levine et al., 1996) als auch dem Schutz des gesunden Gewebes gegen ROS-Schädigungen (Levine et al., 1994). Die ROS-Produktion während des oxidative burst wird dabei von einer Plasmamembran-lokalisierten NAD(P)H Oxidase katalysiert (Pugin et al., 1997; Xing et al., 1997). Superoxid-Radikale stellen die ersten ROS dar und werden vermutlich durch eine extrazelluläre Superoxid-Dismutase zu Wasserstoffperoxid und Sauerstoff umgewandelt (Jabs et al., 1997; Abb. 4).
Abbildung 4: Hypothetisches Schema für eine Elicitor-induzierte Auslösung des oxidative burst (nach Jabs et al., 1997; modifiziert).
Die Akkumulierung von Wasserstoffperoxid führt zum Absterben von infizierten und benachbarten Zellen um die Infektionsstelle (Abb. 5, Position 2 und 4). Der Zelltod um die Infektionsstelle wird als Hypersensitive Reaktion (HR) bezeichnet. Eine Zellwandverstärkung des nekrotischen Gewebes durch eine vermehrte Lignin-oder Kallosesynthese (Thordal-Christensen et al., 1997) verhindert die Ausbreitung des pathogenen Organismus und dient somit dem Schutz der Pflanze.
Abbildung 5: Induktion der hypersensitiven Reaktion durch Infiltration eines Blattes mit verschiedenen Cmm-Stämmen auf Mirabilis jalapa (japanische Wunderblume). Position 1: PS-Puffer (Negativkontrolle), Position 2: Cmm382; Position 3: PS-Puffer, Position 4: CMM101 (Aufnahme: Kerstin Mayer, Universität Bielefeld).
Nach einer erfolgten lokalen Resistenzantwort wird innerhalb mehrerer Tage nach Infektion (Ryals et al., 1996) in den benachbarten, aber nicht unmittelbar befallenen Pflanzenbestandteilen die Resistenz erhöht, um somit die Pflanze vor späteren Angriffen zu schützen. Diese systemisch erworbene Resistenz (SAR) ist gegen ein breites Spektrum an Pathogenen wirksam und benötigt hierfür das phenolische Signalmolekül Salicylsäure (Dempsey et al., 1999). Korrelierend mit der Aktivierung der SAR wird eine Vielzahl von
pathogenesis-related (PR) Proteinen exprimiert, die in vitro eine antimikrobielle Wirkung
besitzen, zum Beispiel in Form von hydrolytischen Aktivitäten an Zellwänden,
Kontakttoxizität (van Loon et al., 2006) oder indem die gesteigerte Expression von PR-Proteinen dem Wirt eine erhöhte Resistenz verleiht (Morrissey & Osbourn, 1999). PR-Proteine werden sowohl durch die Signalmoleküle Salicylsäure als auch durch die Wachstumshormone Jasmonsäure und Ethylen induziert. Alle bisher bekannten PR-Proteine können in 17 Familien (PR-1 bis PR-17) klassifiziert (van Loon et al., 2006) werden (Tab. 3).
Familie Mitglied Funktion Symbol
PR-1 Tabak PR-1a Antifungale Aktivität Ypr1
PR-2 Tabak PR-2 β-1,3-Glucanase Ypr2
PR-3 Tabak P, Q Chitinase Typ I, II, IV,
V, VI, VII Ypr3, Chia
PR-4 Tabak R Chitinase Typ I, II Ypr4, Chid
PR-5 Tabak S Thaumatin-ähnlich Ypr5
PR-6 Tomate, Inhibitor I Proteinase-Inhibitor Ypr6, Pis
PR-7 Tomate P69 Endoproteinase Ypr7
PR-8 Gurke, Chitinase Chitinase Typ III Ypr8, Chib
PR-9 Tabak, Lignin-bildende
Peroxidase Peroxidase Ypr9, Prx
PR-10 Petersilie PR-1 Ribonuclease-ähnlich Ypr10
PR-11 Tabak Klasse V Chitinase Ypr11, Chic
PR-12 Rettich Rs-AFP3 Defensin Ypr12
PR-13 Arabidopsis THI2.1 Thionin Ypr13,Thi
PR-14 Gerste LTP4 Lipid-Transfer Protein Ypr14
PR-15 Gerste OxOa (Germin) Oxalat Oxidase Ypr15
PR-16 Gerste OxOLP Oxalat
Oxidase-ähnlich Ypr16
PR-17 Tabak PRp27 unbekannt Ypr17
Tabelle 3: Bekannte Familien von PR-Proteinen. (van Loon et al., 2006; modifiziert; http://www.bio.uu.nl/~fytopath/PR-families.htm).
Zu den PR-Proteinen gehören β-1,3-Endoglucanasen (PR-2) und Endochitinasen (PR-3, PR-4, PR-8 und PR-11), die pilzliche Zellwände hydrolysieren können und somit das Wachstum und die Ausbreitung des Pathogens limitieren können (Schröder et al., 1992; Hong et al., 2000; Jung & Hwang, 2000). Die kleinen (ca. 5 kDa) basischen cystein-reichen Defensine (PR-12) und Thionine (PR-13) weisen ein breites Spektrum an antibakteriellen und fungiziden Aktivitäten auf (Lay & Anderson, 2005; Thomma et al., 2001; Bohlmann, 1994; Epple et al., 1997). Die PR-9-Proteine sind ein besonderer Peroxidasen-Typ, die die Lignifizierung zur
