Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

(1)

Dr. rer. nat. Stephan Rust

Allgem. Pädiatrie, Klin. Kinder- u. Jug.-med., Stoffwechsellabor Prof. Marquardt

48149 Münster Tel.: 0251 83-55182 rusts@uni-muenster.de stephan.rust@ukmuenster.de

Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Vorlesung: Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen

Wintersemester 2021/22

(2)

Rust 6/04 -6

Tangier Krankheit

uvula bifida

(3)

Neue Gene - Warum?

Das menschliche Genom ist doch komplett bekannt?

• Fast – aber seine Funktion noch lange nicht.

• Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen

„Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen“

(4)

Volkskrankheiten

Differenzierung von Ursachen und damit bessere Vorhersage und gezieltere Therapie

soll überhaupt therapiert werden und WER

Stoffwechsel verstehen, alle Gene im Pathway WIE kennen, um Angriffspunkte für Therapie zu

definieren.

seltene Krankheiten

pränatale Diagnose, und evtl. auch Ideen für Therapie (klassiches Beispiel PKU)

(5)

21.4

0 5 10 15 20 25

21,4 78,6

0 20 4060 80 100

I II III IV V

Der PROCAM Algorithmus

0.6 2.1 2.8

7.6 Herzinfarkte (%) in 10 Jahren

325 tödliche und nicht-tödliche Herzinfarkte bei 4818 Männern im Alter von 35-65 Jahren

Unabhängige Parameter: Alter, systolischer Blutdruck, LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeride, Diabetes, Rauchen, familiäre Belastung

Quintile des PROCAM Score

Procamquintile n

Rust 6/04 -3

Skala >

78,6

(6)

Technik:

Vererbung in Familien und in großen Case-Control Studien

mit SNP ^s

(single nucleotide polymorphisms)

Rust 6/04 -27

(7)

Prinzip bei Illumina: Synthese

A

T

G

C

2 Allele, „A“ und „B“

100 %

0 %

AA BB AB

B-Allel-Anteil

(8)

1. Grobe Lokalisation

... mit Illumina SNP-Chips

Identifikation der ursächlichen Gene bei rezessiven Erbkrankheiten

BB AB AA

Jeder blaue Punkt

= ein SNP-Genotyp:

AA (nahe bei 0.00))

AB (im mittleren Bereich) BB (max. Signal B)

(9)

Tangier Krankheit

- 9 - vergrößerte Tonsillen

(10)

Tangier Krankheit

• Tonsillen

• Schaumzellen auch bei Heterozygoten in Mukosa des Intestinums und Dickdarms

• Hepatosplenomegalie

• Periphere Neuropathie

• Thrombozytopenie

• Erhöhte Wahrscheinlichkeit für

koronare Herzkrankheit

• HDL-Defizienz

(11)

HDL / LDL -Cholesterin

Der HDL-Cholesterinspiegel ist teils

• genetisch bedingt (Geschlecht, Zwillingsstudien),

• durch Verhalten (Rauchen , Sport ) beeinflußt Mittelwerte Deutschland

Frauen: 55 mg/dl Männer: 45 mg/dl

Niedriges HDL höheres Infarktrisiko

LDL im Überschuss wird von Makrophagen aufgenommen, ... => Arteriosklerose

HDL kann Cholesterin zur Leber zurückführen^.

(12)

Symbols:

female

male, deceased heterozygous female homozygous female

Pedigree of a Tangier disease family (1640 - today) G. Assmann et al. J. Clin. Inv. 60, 1025-35 ('77)

Rust 6/04 -15

Tangierpedigree

(13)

Identifikation des Tangiergens

ABCA1

9q31

Rust 6/04 -18

(14)

Unterschiedliche ABCA1 Defekte unterschiedlicher Effekt

Asn935Ser c.1823delG : Leu608Leu; L608fsX635

TD1 (CAD -) TD2 (CAD + )

(15)

6 1

H2N

NBF

7 12

COOH

M640 E662

L681

I703

V717 L739 L745

W767 F773 F794

L821

E843 F1348 I1677

P1370 V1655

S1764

F1786 N1800 I1718

M1822

R1873

1946-1953 V2261

EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG

missense; in frame ins or del mutations causing premature stop polymorphic missense mutations NBF

L1740

N1852

Structure of ABCA1 - Mutations in Tangier Disease

Rust 6/04 -19

N935S

933-940

fs*635

(16)

..fs*635: vorzeitiger Abbruch, RNA wird weitgehend abgebaut (-> nonsense mediated decay), keinerlei Funktion mehr,

HDL-Defizienz

Oxysterole im Blut,

Arteriosklerose, Herzinfarkt Asn935Ser: ABCA1 - NBF1 ist defekt

HDL-Defizienz

ABER: Oxysterol-Transport noch möglich KEINE Arteriosklerose

=> das Wissen über die konkrete Mutation ist beim ABCA1 wichtiger als der Effekt auf das HDL-Cholesterindas Wissen über die konkrete Mutation ist beim ABCA1

wichtiger als der Effekt auf das HDL-Cholesterin

Effekt der Mutationen im ABCA1:

(17)

Hepatocyte like cells

Patientenspezifische Zellkulturmodelle

- Beweis der funktionellen Relevanz von Mutanten und nach Korrektur als Therapiemethode

Dalgetty DM, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009 (review) HCLs:

Rashid ST, et al. J Clin Invest. 2010 25 days Song Z. et al. Cell Res. 2009 21 days Gay H., et al. Differentiation. 2010 25 days

Mutagenese durch Talen oder

CRISPR/Cas9 Direkter:

Zielzelltyp (z.B. HepG2-Zellen)

(18)

SNPs – auch geeignet für große Case-Control Studien

„GWAS“

(genome wide association study)

- auch geeignet, wenn kein meßbarer Phänotyp außer Endpunktereignis;

geeignet besonders für häufige

Variante mit schwachem Effekt

(19)

Ergebnisse Mai-Juni

2007:

Rust 6/04 -29

Wellcome Trust case control consortium:

14 000 cases,

3000 controls

(20)

9q-Deletion in der Chip-Analyse:

(21)

Conrad DF et al. Nat Genet. 2006 Jan;38(1):75-81

... we estimate that typical individuals are

hemizygous for roughly 30-50 deletions larger than 5 kb, totaling around 550-750 kb of

euchromatic sequence across their genomes.

The detected deletions span a total of 267

known and predicted genes.

(22)

Tangier Krankheit

Rust 6/04 -6

uvula bifida

Schwerpunkt Glykoproteine

(23)

1 Kernmembran 2 Kernpore

3 Rauhes ER 4 Glattes ER 5 Ribosom 6 Proteine in

Vesikel

7 Transportvesikel 8 Golgi

9 Cis-Golgi 10 Trans-Golgi 11 Zisternen

(24)

II _Golgi

C

65 43 21 0 CD

G I CD I-IIG

4

Isoelectric focusing (IEF)

2 1

Number of(sialicacids)

Endoplasmic reticulum (ER)

Ribosome

I

Dolichol-anchor for glycane precursor in ER membrane.

N-acetylglucosamine, mannose, glucose, galactose, sialic acid

(25)

ER-lumen Golgi

OST

CDG-I || CDG-II

Glukose Mannose Galaktose Sialinsäure

N-Acetyl-Glucosamin Dolichol-Phosphat

(26)

Glykoproteine, N-Glykosylierung:

Serum Transferrin: 679 Aminosäuren, 2 Glykosylierungsstellen:

... Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn ...

N-Glycosylierung am Asn in

... - Asn – X – Ser - ... oder ... - Asn – X – Thr - ... X : nicht Pro

... Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys ... _O ^C _NH CH2

C

H

H O C

NH N C

O

C H

X

NH O C

- -

N im Transferrin:

}

^„Glykan“

(27)

Isolektrische Fokussierung (IEF)

Die Ladung eines Proteins in Lösung wird durch den pH bestimmt

- im sauren Bereich: R-COOH, R-NH3+

- im basischen Bereich: R-COO- _{, R-NH}₂

Aminosäuren mit potentiell geladene Seitenketten:

Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin

Cystein, Tyrosin (geben bei basischen pH Proton ab) Außerdem: Sialinsäuren am Ende der Glykane

(28)

Prinzip isolelektrische Fokussierung in pH-Gradient

IPisoelektrischer Punkt

= pH bei dem Gesamtladung des Proteins = 0 ist

- -

HH ++

(29)

Transferrin-Glykosylierung

Sialinsäure, neg. Ladung

- -

Ko Ia AAy

43 21 0

CD GI

DC GII

Asn

Galactose IEF:

=> Isoelektrische Fokussierung des Transferrins

wird genutzt zur Diagnose von Glykosylierungsstörungen

(30)

Stammbaum einer Familie mit CDGx

? ? ?

1. Homozygotiemapping

2. Next Generation Sequenzierung

(31)

(PGM1-CDG:) In der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Transferrin zeigte sich eine Mischform

CDG-I / II

Ko MAy AAy

Tetrasialo- Disialo- Asialo- Trisialo- Monosialo-

Trans- ferrin

(32)

centromer PGM1

Basepairs Chromosome 1

Lodscore

Zusätzlich zu blaue-Punkt-Bildern:

Linkage analysis mit „Merlin“, hier Chromosom 1

In total: 87.37 MB in 12 regions of the genome

(33)

Anreicherung und Sequenzierung von interessanter Region oder Komplettsequenzierung von

Patientengenom

Agilent SureSelect

(34)

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Was können wir erwarten vom

„whole EXOME sequencing“ ?

Good news ...

(35)

PGM1 GALE

GCNT6 AKR7L

LRRC40 PAPOLG OFCC1

HPSE2 PDZD8 NextGenSeq: > 200 homoz. Mutationen in

autosomaler Kandidatenregion, davon nur 8 nicht als SNP bekannt Homoz. - Mapping: > 1600

Datenbankeinträge, darin u.a. GALE (Galaktoseepimerase)

Homozygote Kandidatenregion 86,7 Mbp autosomal

(36)

PGM1 – Struktur, Funktion, Mutationen

19 38 62 115 121 263 291 330 377 404 499

503 517 516 41

III I

IV

II

(37)

Phosphoglucomutase 1

Gluc-1P

Gluc-6P Gluc-1,6 BP

(38)

-1-P

UDP GYS

glycogen UDP-

PYG UGP

GALE

UDP-

-1-P

P

-6-P glycosylation

lactose -> galactose

glucose

energy, fatty acids PGM1

carbohydrates

GALT

Normal function of PGM1

(39)

-1-P

UDP GYS

glycogen UDP-

PYG UGP

GALE

UDP-

-1-P

P

-6-P glycosylation

galactose

glucose

lactate complex

carbohydrates

GALT

Two disease classes:

(40)

Nahrungsergänzung auf beiden Seiten

der PGM1-Reaktion

(41)

-1-P

UDP GYS

glycogen UDP-

PYG UGP

GALE

UDP-

-1-P

P

-6-P glycosylation

galactose

glucose

lactate complex

carbohydrates

GALT

(42)

A

B

77351.87

79556.44

2

3 4

79556.58 4

3

0 1 2

2

1 0

65 43 21 0

IEF

Number of(sialicacids)Number of(sialicacids)

65 43 21 0

IEF

Mass Spectroscopy

Transferrin- backbone

(43)

Galactose treatment of PGM1-deficiency tends to correct CDG:

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00

-20,00 -10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00

Tetrasialo-Tf (%) Hyposialo-TF (%) Gal (g/day)

(44)

UDP- UDP-

1P-

PGM1-Defect

GALT

GALE

1P- Glykane

UGP

UTP

-6-P glucose

PGM1

(45)

-1-P

UDP GYS

glycogen UDP-

PYG UGP

GALE

UDP-

-1-P

P

-6-P glycosylation

galactose

glucose

lactate complex

carbohydrates

GALT

Therapeutic options:

Circumvent the PGM1-block

Uridine

(46)

Symtoms of PGM1-deficiency

(47)

3 x cardiac arrest

(48)

ZASP-

binding region

(49)

Arimura T et al.

2009. For permissions please email: journals.permissions@oxfordjournals.org.

Fluorescence images of transiently expressed GFP-tagged PGM1

(in rat cardiomyocytes)

(50)

Dilatative Kardiomyopathie - ZASP

Z band alternately spliced PDZ-containing protein

- ZASP Defekt → keine Bindung von PGM1 → DCM

Arimura T, Cardiovasc Res (2009) 83, pp 80-8

ZASP

PGM1

(51)

Effekt wird sichtbar bei Entzug von Serum in der Zellkultur

Sichtbar nach 3 Tagen, evtl. durch Verbrauch der Fettsäuren, Umschalten auf Energie aus Glucose Mögliche Therapie: Stabilisierung der Glucose und Lipide, Vermeidung von Glucose Bolus

Komplexe Kohlenhydrate

(52)

FS (%)

Metildigoxin Captopril

L-Thyroxine Enalapril Metoprolol Hydrocortisone

Somatropin

40 50 60 70 80 90 100 110 120

-20%

-10%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

FS %

LVIDD (mm)

age (years)40

-20% 00 55 1010 1515 25

30 35 40 45 50 55 60

Age (years)

(53)

Therapeutic options

I: Circumvent the PGM1-block

Normalization of glucose & glycosylation:

galactose & uridine

complex carbohydrates II: Myopathy, DCM

improved fatty acid use:

training below aerobic threshold to improve oxidative capacity

MCT, heptanoic acid, citrate

=> Newborn screening

(54)

Aufspüren des ursächlichen Gens – wenn keine Konsanguinität vorliegt

Exom-Sequenzierung:

350 000 Mutationen Allelfreq

<=2 % (5300)

451 relevante Mutationen

in 35 Genen35 Gene

genesymbol #Mut

ADAMTSL4 2

AGAP3 1

ATP5A1 1

BCLAF1 2

CDC27 2

CTDSP2 2

DAAM2 2

FAM131C 2

FAT2 2

FAT4 2

GFI1 1

GGA1 2

HIP1R 1

KCNT1 2

KIAA0319 1

KIR2DL3 2

LRP12 2

LSMD1 1

MSLNL 2

NCOA7 1

ND5 1

PIEZO1 2

PIK3C2G 2

PKHD1L1 1

POU2F3 2

RBFOX3 2

SH3BP4 2

SLC39A8 2

TBP 3

TEKT4 8

TLN2 2

USP48 2

WDR74 3

ZNF138 2

ZNF423 2

Genedestiller, Brain-

storming ► Stand seit ca. 2017: fast immer Triom-Analyse =>

Neumutationen bei Kind erkennbar

(55)

Effizientes SNP-Chip basiertes Mapping und

„next generation sequencing“, oft Triom beschleunigen die Aufklärung der

„molecular basis of inherited disease“

(56)

Konsequenzen:

Pränatale und

prä-Implantations-Diagnostik möglich Gezielte Therapie oft möglich

(Enzymersatztherapie, einfache Nahrungsergänzung oder ...

(57)

Stephan Rust, Tel. 83 - 5 5182 rusts@uni-muenster.de

Laura Tegtmeier Janine Reunert Julien Park

Thorsten Marquardt Volker Debus

Anja Seehöfer Stephan Rust

Universitätsklinikum Münster Klinik für Kinder- und

Jugendmedizin

Marianne Jansen-Rust Tanja Seehafer

Anika Sietmann

Melanie Bach

Michaela Schreiner Michaela Tirre

LIFA (geschlossen)

Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Tangier Krankheit

uvula bifida

Neue Gene - Warum?

Das menschliche Genom ist doch komplett bekannt?

• Fast – aber seine Funktion noch lange nicht.

• Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen

Volkskrankheiten

Differenzierung von Ursachen und damit bessere Vorhersage und gezieltere Therapie

soll überhaupt therapiert werden und WER

Stoffwechsel verstehen, alle Gene im Pathway WIE kennen, um Angriffspunkte für Therapie zu

definieren.

seltene Krankheiten

21,4 78,6

Der PROCAM Algorithmus

78,6

Technik:

Vererbung in Familien und in großen Case-Control Studien

mit SNP s

(single nucleotide polymorphisms)

Prinzip bei Illumina: Synthese

A

T

G

C

Tangier Krankheit

Tangier Krankheit

koronare Herzkrankheit

• HDL-Defizienz

HDL / LDL -Cholesterin

Identifikation des Tangiergens

ABCA1

Unterschiedliche ABCA1 Defekte unterschiedlicher Effekt

Effekt der Mutationen im ABCA1:

SNPs – auch geeignet für große Case-Control Studien

„GWAS“

(genome wide association study)

- auch geeignet, wenn kein meßbarer Phänotyp außer Endpunktereignis;

geeignet besonders für häufige

Variante mit schwachem Effekt

Ergebnisse Mai-Juni

2007:

Wellcome Trust case control consortium:

14 000 cases,

3000 controls

9q-Deletion in der Chip-Analyse:

... we estimate that typical individuals are

hemizygous for roughly 30-50 deletions larger than 5 kb, totaling around 550-750 kb of

euchromatic sequence across their genomes.

The detected deletions span a total of 267

known and predicted genes.

Tangier Krankheit

uvula bifida

Glykoproteine, N-Glykosylierung:

- -

}

Isolektrische Fokussierung (IEF)

Prinzip isolelektrische Fokussierung in pH-Gradient

- -

Transferrin-Glykosylierung

Stammbaum einer Familie mit CDGx

(PGM1-CDG:) In der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Transferrin zeigte sich eine Mischform

CDG-I / II

Good news ...

Was können wir erwarten vom

„whole EXOME sequencing“ ?

Phosphoglucomutase 1

Nahrungsergänzung auf beiden Seiten

der PGM1-Reaktion

PGM1-Defect

Stephan Rust, Tel. 83 - 5 5182 rusts@uni-muenster.de

mit SNP ^s