Einsatz menschlicher Tumorzellkulturen als Testmodelle bei der Entwicklung von Wirkstoffen für die Krebstherapie
Günther Bernhardt, Thilo Spruß und Helmut Schönenberger
Zusammenfassung: Bei der Entwicklung und P r ü f u n g neuer Arzneistoffe f ü r die Krebstherapie k ö n n e n menschliche Tumorzellen sehr effektiv eingesetzt wer- den. Es wird ein standardisiertes c o m p u t e r g e s t ü t z t e s Zellkulturverfahren zur z u v e r l ä s s i g e n Beurteilung der Wirksamkeit potentieller Antitumormittel vorge- stellt. Die Flexibilität der beschriebenen Methodik er- m ö g l i c h t z u s ä t z l i c h die in vitro Bestimmung pharma- kologisch wichtiger Parameter wie etwaige Substanz- inaktivierung durch Serumbestandteile, die zur A b t ö - tung der Krebszellen erforderliche Dosis und Einwirk- zeit. Die Anzahl der Substanzen die als "weiterverfol- genswert" erscheinen, reduziert sich dadurch erfah- r u n g s g e m ä ß auf ca. 1%. F ü r diese Substanzen m u ß trotz der ausgedehnten in vitro Untersuchungen die Wirksamkeit letztlich im Tierexperiment bestätigt werden. In diesen u n e r l ä ß l i c h e n Tierversuchen wer- den die Belastungen und Leiden der Tiere auf ein Minimum reduziert.
Notwendigkeit und Problematik der Arzneistoffentwicklung für die Krebs- therapie
Es besteht die allgemeine Auffassung, d a ß Fortschritte in der Krebstherapie nur durch E n t w i c k l u n g neuartiger Wirkstoffe zu erreichen sind. E i n wichtiges Z i e l der A r z - neimittelforschung ist deshalb die Bereitstellung v o n stär- ker wirkenden und besser v e r t r ä g l i c h e n Chemotherapeu- tika für die Behandlung v o n Krebserkrankungen, beson- ders von solchen, die sich i n einem fortgeschrittenen Stadium befinden. In derartigen F ä l l e n ist durch das A u f - treten von Metastasen i n den verschiedensten Bereichen des menschlichen K ö r p e r s eine kurative Therapie mit chirurgischen und strahlentherapeutischen M a ß n a h m e n nicht mehr m ö g l i c h .
D i e g r o ß e n E r f o l g e , die i n der Therapie v o n Infek- tionskrankheiten durch Bereitstellung hochwirksamer Arzneimittel (Antibiotika und Chemotherapeutika) be- sonders i n den letzten 60 Jahren erzielt wurden, lassen hoffen, d a ß auch i n der Krebstherapie eine ä h n l i c h e posi- tive Entwicklung m ö g l i c h ist. D i e kurative W i r k u n g che- motherapeutischer M a ß n a h m e n bei einigen Krebserkran-
kungen (akute Lymphoblasten L e u k ä m i e , H o d e n k a r z i - nom, Burkitt L y m p h o n u.a.) s t ü t z e n diese Prognose.
N e b e n d e m D e s i g n neuer Wirkstoffe und ihrer S y n - these ist die wichtigste Aufgabe der Arzneimittelfor- schung die Feststellung der W i r k u n g an M o d e l l e n , die den V e r h ä l t n i s s e n i n der K l i n i k m ö g l i c h s t nahe k o m m e n . N u r so ist eine Ü b e r t r a g b a r k e i t der p r ä k l i n i s c h e n Befunde auf den M e n s c h e n gewährleistet. Seit einigen Jahren stehen i n der Experimentellen Krebsforschung Tierversuchsmo- delle zur Verfügung, bei denen als Transplantate mensch- liche Tumoren eingesetzt werden. D i e M e i n u n g der E x - perten ist, d a ß diese M o d e l l e eher die Voraussage einer W i r k u n g a m M e n s c h e n zulassen als die bisher benutzten Nagertumormodelle.
Krebschemotherapeutika sind nicht an allen T u m o r - modellen (z.B. M a m m a k a r z i n o m , L e u k ä m i e , L u n g e n k a r - zinom) gleich stark wirksam. Sie zeigen häufig eine be- vorzugte W i r k u n g g e g e n ü b e r einem speziellen T u m o r ( z . B . Brustkrebs). Diese Beobachtung hat die A r z n e i m i t - telforschung ermutigt, den Versuch zu unternehmen, C h e - motherapeutika für die Behandlung einer speziellen Krebserkrankung ( z . B . Brustkrebs) zu entwickeln. E n t - sprechend dieser neuen Zielsetzung war eine U m s t e l l u n g i m Aufbau des Testsystems erforderlich. A n s t e l l e eines breiten Spektrums unterschiedlicher Tumorarten ( L e u k ä - m i e n , M a m m a - , Prostata-, L u n g e n - , C o l o n k a r z i n o m u n d andere Tumormodelle) wurde nun ein Spektrum v o n M o - dellen eines speziellen menschlichen Tumortyps, für des- sen Therapie die E n t w i c k l u n g neuer Wirkstoffe geplant war, für das Testprogramm verwendet. D i e i n einem s o l - chen Screening-System benutzten Tumormodelle z e i c h - nen sich durch eine unterschiedliche E m p f i n d l i c h k e i t ge- g e n ü b e r k l i n i s c h etablierten Therapien aus; z . B . i m F a l l e des M a m m a k a r z i n o m s g e g e n ü b e r Steroidhormonantago- nisten, da die i m Screening benutzten M o d e l l e eine unter- schiedliche Ausstattung an Steroidhormonrezeptoren (welche die W i r k u n g vermitteln) aufweisen.
Klassische Testverfahren
D a s National Cancer Institute ( N C I ) , U S A entwickelte als g r ö ß t e Institution auf dem Gebiet der experimentellen
Einsatz menschlicher Tumorzellen 25
Krebstherapie i n den Jahren von 1959 bis heute eine V i e l z a h l v o n Screening - Programmen zur Auffindung antineoplastischer Substanzen (1). Entscheidungsgrund- lage für die Trennung potentiell "brauchbarer" v o n "un- brauchbaren" Substanzen waren bis 1987 a u s s c h l i e ß l i c h die Ergebnisse aus Tierversuchen (2). E i n B e i s p i e l für ein derartiges Testsystem (3) ist nachfolgend dargestellt.
N a c h einem "Vorscreening" an der extrem empfindlichen P 388 L e u k ä m i e der M a u s durchliefen die Substanzen drei weitere murine Tumormodelle (L1210 lymphatische L e u - k ä m i e , B 1 6 M e l a n o m und M 5076 Sarkom). D i e abschlie- ß e n d e vorklinische P r ü f u n g erfolgte a m menschlichen M X - 1 M a m m a k a r z i n o m . Z u diesem Z w e c k wurde dieser T u m o r i n immuninkompetente M ä u s e implantiert.
Alternative Prüfverfahren
I m engeren Sinne versteht man unter Alternativen z u m Tierversuch M e t h o d e n , die geeignet sind, Tierversuche v o l l s t ä n d i g z u ersetzen. Meistens - wie auch i n diesem B e i t r a g - w i r d dieser Begriff jedoch umfassender verstan- den u n d bezeichnet dann alle M a ß n a h m e n und Verfahren, mit deren H i l f e die Z a h l der Versuchstiere e i n g e s c h r ä n k t oder der G r a d ihres Leidens vermindert werden kann.
D i e Weiter- u n d Neuentwicklung v o n Antitumormit- teln stellt e i n besonders prädestiniertes Einsatzgebiet für i n vitro Testverfahren dar, da das W i r k p r i n z i p i n der R e g e l vorgegeben ist. I m C h e m o s e n s i t i v i t ä t s t e s t w i r d i n der Z e l l k u l t u r festgestellt, ob eine Substanz K r e b s z e l l e n i n i h r e m Wachstum z u hemmen oder a b z u t ö t e n vermag.
Arzneistoffe m i t neuem, bisher unbekannten W i r k m e c h a - n i s m e n , welche des Gesamtorganismus b e d ü r f e n , z . B . Immunmodulatoren, werden dabei freilich nicht entdeckt.
Besonders i n den letzten Jahren stieg die Z a h l der P u b l i k a t i o n e n ü b e r die E i n s a t z m ö g l i c h k e i t e n menschli- cher T u m o r z e l l i n i e n bei der Beurteilung der W i r k u n g zytotoxischer Substanzen lawinenartig an.
D i e Hauptunterschiede zwischen den beschriebenen Verfahren betreffen die zu verwendende Kulturtechnik (Suspensionskultur, Monolayerkultur, K u l t u r als S p h ä - r o i d d. h. Zellhaufen) und die Parameter zur Quantifizie- rung der W i r k u n g (Bestimmung der Z e l l z a h l , Einbau v o n radioaktiv markierten Verbindungen, K o l o n i e n b i l d u n g z . B . i n Weichagar, Verwendung unterschiedlicher Farb- stoffe) (4).
In vitro Substanz - Screening und Op- timierung von Dosierplänen
Grundlegende Anforderungen an ein in vitro Testsystem zur A u f f i n d u n g neuer Chemotherapeutika sind:
(I) Reproduzierbare D o s i s - W i r k u n g s a b h ä n g i g k e i t ü b e r einen Konzentrationsbereich, welcher die i n v i v o D o s i s einschließt.
(II) Linearität zwischen dem g e w ä h l t e n Z y t o t o x i z i t ä t s - parameter und der Z e l l z a h l .
(TU) P r ä z i s e Voraussage der i n v i v o Effekte aus den i n vitro Daten.
Standardisierung der in vitro Tumor- modelle
B e i m Einsatz v o n Zellkulturtechniken zur Auffindung neuer antineoplastischer Wirkstoffe liegt ein Hauptpro- blem i n der extremen genetischen Variabilität der Tumor- zellen. D e r starke Selektionsdruck durch h ä u f i g e s Passa- gieren der K u l t u r e n führt zur Entstehung neuer Subklone, die sich s o w o h l genotypisch als auch p h ä n o t y p i s c h v o m Ursprungstumor sehr stark unterscheiden k ö n n e n .
Diese V e r ä n d e r u n g e n betreffen unter anderem auch Wachstumsparameter der kultivierten T u m o r z e l l e n w i e die Dauer der lag- u n d log-Phase, die Generationszeit und Zelldichte i m Plateau. D a die W i r k u n g v o n Tumorhemm- stoffen sehr stark v o n den j e w e i l i g e n Wachstumsparame- tern einer Zellpopulation a b h ä n g e n kann, m u ß zur G e - w ä h r l e i s t u n g der Reproduzierbarkeit die Wachstumskine- tik der T u m o r z e l l e n i n jedem Experiment überprüft wer- den. Z u diesem Z w e c k wurde i n unserer Arbeitsgruppe ein c o m p u t e r g e s t ü t z t e s , colorimetrisches Verfahren zur A u f - nahme v o n Wachstumskurven i n Mikrotiterplatten nach A n f ä r b e n der Z e l l e n mit Kristallviolett entwickelt (5).
Im Gegensatz z u h e r k ö m m l i c h e n M e t h o d e n (graphi- sche A b s c h ä t z u n g der mittleren Verdopplungszeit nach der Z e l l z ä h l u n g ) erlaubt diese Technik nicht nur die exak- te Beschreibung der gesamten Wachstumskurve, sondern auch die p r ä z i s e Zuordnung der Verdopplungszeit zu je- dem Zeitpunkt w ä h r e n d der gesamten Inkubationsdauer.
Eine Auftragung der Verdopplungszeit gegen die Inkuba- tionszeit liefert somit e i n M a x i m u m an Information (6).
Testprinzip der Wirkstoffprüfung in vitro
Zur Wirkstoffprüfung wurde ein i n vitro Chemosensitivi- tätstest i n Mikrotiterplatten eingeführt.
Untersucht w i r d das Wachstumsverhalten der menschlichen K r e b s z e i l e n in Gegenwart und i n A b w e s e n - heit v o n Hemmstoffen.
N a c h unterschiedlich langen Inkubationszeiten wer- den die Kontrollkulturen und die m i t Wirkstoff behandel- ten Z e l l e n mit Glutardialdehyd fixiert, mit P B S (Phosphat gepufferte S a l z l ö s u n g ) ü b e r s c h i c h t e t und bis z u m Aufar- beiten des gesamten Versuchs i m K ü h l s c h r a n k aufbe- wahrt. A m Versuchssende werden alle Platten nach dem
A n f ä r b e n der Z e l l e n mit K r i s t a l l violett bei 578 n m ver- messen. Wachstumskurven werden mit einem hierfür ent- wickelten Computerprogramm aus den optischen Dichten der a n g e f ä r b t e n Tumorzellen bestimmt. E i n Vergleich der Wachstumskurven erlaubt i m Gegensatz zu der i n anderen Arbeitsgruppen ü b l i c h e n Endpunktsbestimmung die B e - urteilung der k o n z e n t r a t i o n s a b h ä n g i g e n H e m m v e r l ä u f e ü b e r den gesamten Inkubationszeitraum. E i n e eventuelle Erholungsphase a n f ä n g l i c h g e s c h ä d i g t e r Z e l l e n bzw. die Entstehung resistenter Subpopulationen w i r d i n einer der- artigen Versuchsanordnung z u s ä t z l i c h erfaßt. D i e be- schriebene Methode e r m ö g l i c h t die Unterscheidung v o n zytostatischen und zytoziden W i r k u n g e n .
S U B S T A N Z E N
100 <
V O R S C R E E N I N G i n vitro 1 0 %
" i n v i t r o P H A R M A K O L O G I E "
Substanzstabilität i m K u l t u r m e d i u m Ermittlung der effektiven E i n w i r k z e i t
Bestimmung des Wirkungsprofils A u s m a ß der Proteinbindung
kritische A N A L Y S E aller i n vitro Daten ca. 15 A P P L I K A T I O N S A R T
D O S I E R U N G A P P L I K A T I O N S S C H E M A
< 1%
T U M O R V E R S U C H i n v i v o
in vitro
Abb. 1: Testschema bei der Entwicklung neuer Antitumormittel
In vitro Pharmakologie
Zur Erstellung eines optimalen Dosierungsschemas für den eventuell a n s c h l i e ß e n d e n Tierversuch werden i n ver- schiedenen Konzentrationen diejenigen E i n w i r k z e i t e n , die zu zytoziden Effekten führen, i m Zellkulturexperi- ment ermittelt.
Z u r Verbesserung der i n vitro - i n v i v o Korrelation werden die Testsubstanzen b e z ü g l i c h konkurrierender In- aktivierungsprozesse ( z . B . B i n d u n g an Serumalbumin, Reaktion mit Bionucleophilen) durch unterschiedlich lan- ge Vorinkubation i m K u l t u r m e d i u m untersucht. D u r c h dieses Vorgehen soll der Einfluß v o n Inaktivierungspro-
zessen, die i m Organismus beim Transport des Wirkstoffs zum T u m o r stattfinden, erfaßt werden.
Unter diesen Voraussetzungen kann festgestellt wer- den, ob eine antineoplastische W i r k u n g i n k l i n i s c h rele- vanten Konzentrationen erreicht w i r d . Applikationsart, E i n w i r k z e i t und Dosierungsintervall werden so i n vitro optimiert.
Z i e l dieses Ansatzes ist das selektive Herausfiltem potentieller Chemotherapeutika mit einer spezifischen W i r k u n g an einer ganz bestimmten Krebsart. Gelingt es nun, i n vitro derartige Wirkstoffe ausfindig zu machen, w i r d die Prüfung i n v i v o am selben Tumormodell i n der Nacktmaus fortgesetzt.
N a c h kritischer A n a l y s e aller vorliegender i n vitro Daten k o m m e n nur noch ca. 1 % (wie i n unserem Arbeits- kreis i n der Substanzklasse der Cisplatin-Analoga) der synthetisierten Substanzen für eine i n v i v o Testung i n Frage. D i e Tierversuche werden dann mit den optimierten T h e r a p i e p l ä n e n unter g e r i n g s t m ö g l i c h e r Belastung der N a c k t m ä u s e durchgeführt. A m B e i s p i e l des i n der K l i n i k am Estrogenrezeptor - positiven M a m m a k a r z i n o m der Frau eingesetzten Antiestrogens Tamoxifen w i r d i n A b b .
Inkubstionsttit th] z^j t
Abb. 2: Gegenüberstellung der in vitro und in vivo Wirkung von Tamoxifen am menschlichen Mammakarzinom ZR-75-1.
2 gezeigt, d a ß bei A n w e n d u n g der oben aufgeführten i n vitro Methode p r ä z i s e Voraussagen der i n v i v o Versuche m ö g l i c h sind. A n dieser Stelle m u ß darauf hingewiesen werden, d a ß Verbindungen, die erst nach Aktivierung i m Organismus ihre W i r k u n g entfalten, b e i m i n vitro Screen- ing nicht erkannt werden. Z u diesen sogenannten P r o - drugs g e h ö r t eines der wichtigsten Krebschemotherapeu- tika, das Cyclophosphamid.
D i e H e m m u n g der hormonsensitiven menschlichen M a m m a k a r z i n o m z e l l i n i e Z R - 7 5 - 1 i n vitro erreicht i n der Langzeitinkubation mit Tamoxifen i n klinisch relevanter Dosierung Werte um 50 %, die Tumorhemmung durch dieses Antiestrogen, das tumortragenden N a c k t m ä u s e n verabreicht wurde, lagen bei A n w e n d u n g des in vitro optimierten Therapieplans ebenfalls i m 50 % - Bereich.
Diese Ergebnisse stimmen a u ß e r d e m sehr gut mit dem Ansprechen dieses Tumortyps auf eine Tamoxifenbe- handlung bei menschlichen Patientinnen ü b e r e i n (7).
Einsatz menschlicher Tumorzeilen 27
Unerläßliche Tierversuche
D i e ausgedehnte i n v i t r o P r ü f u n g potentieller Arzneistof- fe, g e m ä ß der oben geschilderten Vorgehens weise, führt e r f a h r u n g s g e m ä ß zu einer drastischen Reduktion der Ver- suchstierzahlen u m etwa 9 9 % i m Vergleich mit konven- tionellen Teststrategien. D e n n o c h kann auch bei der Ent- w i c k l u n g neuer A r z n e i m i t t e l für die Krebstherapie auf Tierversuche nicht v ö l l i g verzichtet werden. W i e eine Substanz i m K ö r p e r aufgenomen, verteilt, u m - oder abge- baut und ausgeschieden w i r d bzw. wie hoch ihre Toxizität ist, vermag nur die Untersuchung i m Gesamtorganismus zu zeigen.
Tumorpharmakologische Tierexperimente nehmen i n der Arzneistoffentwicklung b e z ü g l i c h der Belastung der Versuchstiere eine Sonderstellung ein. I n diesem Teilbe- r e i c h der Pharmakologie ist eine (wie z . B . in der B l u t h o c h - drucktherapie m ö g l i c h e ) Testung v o n potentiellen A r z n e i - mitteln an gesunden m e n s c h l i c h e n Probanden nicht m ö g - l i c h . E s ist nicht z u verantworten, Testsubstanzen die m ö g l i c h e r w e i s e mutagene oder kanzerogene Eigenschaf- ten haben, einem gesunden Probanden zu verabreichen, der a u ß e r d e m per definitionem keinen Tumor hat, an dem s i c h eine m ö g l i c h e antineoplastische Substanzwirkung feststellen ließe.
D i e experimentelle M e d i z i n m u ß demnach i n der p r ä k l i n i s c h e n E n t w i c k l u n g v o n Antitumormitteln die S i - tuation eines krebskranken Patienten und dessen Therapie m ö g l i c h s t "realistisch" s i m u l i e r e n , da die Tierversuche i n dieser D i s z i p l i n der letzte Schritt v o r dem m ö g l i c h e n Einsatz des M i t t e l s a m schwer erkrankten M e n s c h e n sind.
D i e s bedeutet, d a ß d i e Versuchstiere s o w o h l einen (menschlichen) T u m o r tragen m ü s s e n , als auch mit stark toxischen Substanzen i n hohen Dosierungen therapiert werden m ü s s e n , da nur auf diese Weise m ö g l i c h e Thera- pieerfolge m e ß b a r werden.
Belastungen für die Versuchstiere in der Tumorpharmakologie
M e n s c h l i c h e T u m o r e n m i t i h r e m charakteristischen A n - sprechverhalten a u f Antitumormittel werden i n der T u - morpharmakologie i n der R e g e l i n N a c k t m ä u s e transplan- tiert, die durch eine embryonale Thymusdysgenese nur i n sehr b e s c h r ä n k t e m U m f a n g T-Lymphocyten bilden und so die Xenotransplantate nicht a b s t o ß e n (8). Verbunden mit dieser Eigenschaft der Tiere ist eine Reihe v o n weiteren Defekten, die h ö c h s t e Anforderungen an d i e Pflege und Haltung der Tiere stellen, u m diese "Grundbelastung" der Tiere durch die Erbkrankheit und deren F o l g e n m ö g l i c h s t gering zu halten (9).
Eine deutliche R e d u k t i o n der Z a h l der Versuchstiere sowie die Verminderung der Belastung der Tiere i n der
präklinischen Tumorpharmakologie w i r d i n unserer A r - beitsgruppe durch folgende M a ß n a h m e n erreicht:
(I) N u r Substanzen, für die e i n optimaler Therapieplan (s.o.) i n vitro erstellbar war, werden i m unverzichtba- ren Tierversuch eingesetzt.
(II) Dieser Tierversuch ist so angelegt, d a ß die Gesamtbe- lastung, die s i c h w ä h r e n d des Versuchs entwickelt, m ö g l i c h s t niedrig ist.
Unsere Kriterien zur Beurteilung der Belastungen der Tiere i m Tumorexperiment sollen kurz erläutert werden, da eine einheitliche oder verbindliche M e t h o d i k zur B e l a - s t u n g s a b s c h ä t z u n g n o c h nicht existiert (10).
D i e meisten Empfehlungen z u r E i n s c h ä t z u n g des Grades der Belastung der Versuchstiere geben vier (11) bis fünf Belastungsstufen an. D i e Grade der Belastung wer- den meist angegeben i n "keine - niedrig - mittel - h o c h - sehr hoch".
D i e Zuordnung zu einer der fünf Belastungsstufen erfolgt i n unserer Gruppe weitgehend nach d e m " A n a - logieschluß - P r i n z i p " (12), das den S c h l u ß v o m M e n - schen auf das T i e r voraussetzt und unserer M e i n u n g nach auch auf Tumorexperimente angewendet werden kann.
( A u c h das Tierschutzgesetz (13) folgt z . B . i m § 5 (2) diesem Konzept, indem es vorschreibt, d a ß eine B e t ä u - bung eines w a r m b l ü t i g e n Wirbeltieres nicht erforderlich ist, "wenn bei vergleichbaren Eingriffen a m M e n s c h e n eine B e t ä u b u n g i n der R e g e l unterbleibt").
A b b i l d u n g 3 faßt unsere E i n s c h ä t z u n g der Belastung von N a c k t m ä u s e n i n tumorpharmakologischen E x p e r i - menten zusammen. Diese basieren u.a. auf der B e o b a c h - tung des Allgemeinzustands der Tiere, der K ö r p e r g e - wichtsentwicklung und des Verhaltens ( z . B . gegenseitige K ö r p e r p f l e g e ) .
D i e K u r v e A i n A b b . 3 gibt die Belastungen wieder, die durch den wachsenden T u m o r hervorgerufen werden.
Schnell v o r r ü b e r g e h e n d e , leichte Schmerzreaktionen
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Abb. 3: Belastung von Nacktmäusen in der Tumorpharmakologie
werden am A n f a n g des Experiments durch die s.c. Injek- tion der Tumorzellen verursacht. M i t der G r ö ß e n z u n a h m e des Tumors nimmt die Belastung der Tiere kontinuierlich zu und steigt dann gegen Ende des Experiments rapide an.
Wenn der Tumor eine durch die ä u ß e r e Haut m e ß b a r e 2
F l ä c h e v o n etwa 150 m m erreicht hat, liegt noch eine
"mittelgradige" Belastung vor, da sich der Tumor unter der sehr gut dehnbaren ä u ß e r e n Haut befindet und so vermut- l i c h keine g r ö ß e r e n Schmerzen verursacht.
S p ä t e s t e n s zu diesem Zeitpunkt werden die Versuche abgebrochen, da die i n vitro optimierten T h e r a p i e p l ä n e einen Versuchsaufbau e r m ö g l i c h e n , der die Wirksamkeit einer Substanz bereits dann eindeutig beurteilen läßt.
K u r v e B zeigt die Belastungsabnahme bei Tumorre- mission.
K u r v e C zeigt das Belastungprofil für eine ü b l i c h e Chemotherapie mit drei ( ® © @ ) Behandlungen am tumor- freien Tier. D a b e i m Versuchstier M e ß g r ö ß e n w i e K ö r p e r - gewicht, kinisch-chemische und h ä m a t o l o g i s c h e Daten w ä h r e n d der Chemotherapie i n ä h n l i c h e r Weise wie beim M e n s c h e n v e r ä n d e r t s i n d , kann v o n der Belastung eines Menschen w ä h r e n d dreier aufeinander folgender Thera- piezyklen, w i e z . B . bei der Chemotherapie des M a m m a - karzinoms üblich, auf die Belastung der Tiere geschlossen werden.
W i r d e i n tumorpharmakologisches i n v i v o E x p e r i - ment (Therapiebeginn = Pfeil) m i t einem unwirksamen
"Therapeutikum" oder nach einem unzureichenden D o - sierplan durchgeführt, w i r d angenommen, d a ß sich die Belastungen addieren ( K u r v e D ) .
D i e Belastung der Tiere i m tumorpharmakologischen Experiment bewegt s i c h j e nach Wirksamkeit der Sub- stanz u n d g e w ä h l t e m Applikationsschema i n dem i n A b b . 2 schraffierten B e r e i c h . B e i optimalem Dosierplan mit einem wirksamen Therapeutikum kann die Belastung i m Idealfall, wie i n K u r v e E dargestellt, reduziert werden.
Folgerungen
Tierversuche i n der Tumorpharmakologie lassen sich nach dem heutigen Stand der Wissenschaft nicht vollstän- dig durch Versuche an schmerzfreien Systemen ersetzen.
W i e bereits e r w ä h n t , kommt den i n v i v o Versuchen i n diesem Teilbereich der experimentellen M e d i z i n eine be- sondere Bedeutung z u , da bereits i n der vorklinischen Phase der Arzneistoffentwicklung ü b e r den Einsatz einer
neuen T h e r a p i e m ö g l i c h k e i t an schwer erkrankten M e n - schen entschieden werden m u ß .
E i n H a u p t z i e l der Weiterentwicklung v o n Ersatz- u n d E r g ä n z u n g s m e t h o d e n z u m Tierversuch i n der Tumorphar- makologie ist es deshalb, nicht nur die A n z a h l der Tiere i n den Tumorversuchen, sondern auch deren Belastungen auf ein M i n i m u m zu reduzieren.
D u r c h die hier vorgestellten neu entwickelten i n vitro Methoden kommt m a n unseren Erfahrungen nach diesem Z i e l sehr nahe.
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10) Gruber F. (1989): Vergleich verschiedener Schweregradtabcllen zur Belastung von Versuchstieren; in: Tierlaboratorium 12 1988/89 [Hrsg.: Zentrale Ticrlaboratorien und Institut für Versuchstierkun- de der Freien Universität Berlin], Berlin, (152-166)
11) Allgemeine Verwaltungsvorschrift zur Durchfülirung des Tier- schutzgesetzes vom 1. 7. 1988 (BAnz. Nr. 139a S.3)
12) Militzer K. [Hrsg.], (1986): Wege zur Beurteilung tiergerechter Haltung bei Labor-, Zoo- und Haustieren; Parey, Berlin - Hamburg 13) Tierseluitzgesetzvom24.7.1972 (BGBL. IS. 1277) in der Fassung
der Bekanntmachung vom 18. 8. 1986 (BGBL. I S.1319)
