Für meine Familie
Aus dem Institut für Klinische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover
Modulation des Immunsystems durch Faktoren im Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
ANJA HENKEL-KLENE, geb. HENKEL aus Ostercappeln
Hannover, 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.09.2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen/ Dr. Christopher Sachse Referent: Prof. Dr. med. Oliver Pabst
Koreferent: Prof. Dr. med. Hans-Oliver Rennekampff
Tag der mündlichen Prüfung: 10.09.2009
Promotionsausschlussmitglieder:
Prof. Dr. Johannes Wilhelm Bigalke Prof. Dr. Gerhard Schumann
Prof Dr. Michael Gebel
Abkürzungsverzeichnis 1
Abkürzungsverzeichnis
CD Cluster of Differentiation CRP C-reaktives Protein
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FACS fluoreszenzaktivierter Zellsorter FITC Fluorescein Isothiocyanat FSC Vorwärtsstreulicht
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor HLA-DR Humanes Leukozyten Antigen-DR
IFN Interferon
IL Interleukin
kDa Kilodalton
MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1 MHC Majorhistokompatibilitätscomplex
PBS phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung)
PC5 kovalent an Cyanin 5.1 gebundenes R-Phycoerythrin
PE R-Phycoerythrin
SCC Seitwärtsstreulicht
SIRS Systemisches Inflammatorisches Response Syndrom TGF Tumor-Growth-Faktor
TNF Tumor-Nekrose-Faktor VKOF Verbrannte Körperoberfläche
Inhaltverzeichnis 5
1 EINLEITUNG 8
1.1 Epidemiologie 8
1.2 Definitionen und Grundlagen 8
1.2.1 Das Verbrennungstrauma 8
1.2.2 Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) 10
1.2.3 Sepsis und septischer Schock 11
1.2.4 Multiorganversagen 12
1.2.5 Das Immunsystem 12
1.3 Pathophysiologie der Verbrennung 17
1.3.1 Allgemeines 17
1.3.2 Immunologische Reaktion nach Verbrennung 18
1.3.3 Einfluss auf die MHC-ll-Expression 21
1.4 Untersuchte Parameter 22
1.4.1 Interleukin-10 22
1.4.2 Interleukin-4 23
1.4.3 Interferon-gamma 24
2 FRAGESTELLUNG 26
3 MATERIAL UND METHODEN 27
3.1 Allgemeines 27
3.2 Beschreibung der Kontrollpersonen 27
3.3 Beschreibung der Patienten 28
3.4 Auswahl der Interleukine 28
3.5 Versuchsaufbau 29
3.5.1 Verwendete Monozyten 29
3.5.2 Verwendete Poolseren 30
3.5.3 Reagenzien 31
3.5.4 Angaben zur Zellkultur 33
Inhaltverzeichnis 6
3.5.5 Messmethode 34
3.5.6 Analytische Auswertung 36
3.6 Vorversuche 40
3.6.1 Darstellung des Effekts des Serums von Patienten mit schweren
Verbrennungen 40
3.6.2 Versuchsdauer 41
3.6.3 Kontrollfärbungen 43
3.7 Versuche mit der etablierten Methode 44
3.7.1 Versuche mit einem Anteil von 20 % Poolserum von gesunden
Normalpersonen im Kulturmedium 44
3.7.2 Versuche mit einem Anteil von 20 % Poolserum von Patienten mit
schweren Verbrennungen im Kulturmedium 45
3.7.3 Versuche mit Einzelseren von Verbrennungspatienten 46
3.8 Statistische Auswertung 47
3.8.1 Varianzanalyse 48
3.8.2 Korrelationskoeffizient r nach Pearson und Spearmanscher Rang-
Korrelationskoeffizient rs 48
3.8.3 Graphische Darstellung 49
4 ERGEBNISSE 50
4.1 Einfluss der Interleukine im Kultursystem 50
4.1.1 Einfluss von Interleukin-10 50
4.1.2 Einfluss von Interleukin-4 51
4.1.3 Einfluss von IFN-gamma 52
4.2 Einfluss der Zytokine im Ansatz mit Serumfaktoren von Patienten mit
schweren Verbrennungen 54
4.2.1 Einfluss von Interleukin-10 54
4.2.2 Einfluss von Interleukin-4 55
4.2.3 Einfluss von IFN-gamma 56
4.3 Versuche mit neutralisierenden Antikörpern 58
4.3.1 Einfluss von neutralisierendem Antikörper gegen Interleukin-10 59
Inhaltverzeichnis 7 4.3.2 Einfluss von neutralisierendem Antikörper gegen Interleukin-4 60 4.3.3 Einfluss von neutralisierendem Antikörper gegen IFN-gamma 61 4.4 Vergleich der ex vivo-Werte der MHC-II-Expression von
Verbrennungspatienten mit in vitro-Werten 61
5 DISKUSSION 64
5.1 Effekt von Serumfaktoren und untersuchten Interleukinen 65 5.1.1 Effekt von Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen 65
5.1.2 Effekt von Interleukin-10 66
5.1.3 Effekt von Interleukin-4 68
5.1.4 Effekt von IFN-gamma 69
5.2 Neutralisierung der Effekte durch monoklonale Antikörper 71 5.2.1 Neutralisierung des Effekts von Interleukin-10 71 5.2.2 Neutralisierung des Effekts von Interleukin-4 72 5.2.3 Neutralisierung des Effekts von Interferon-gamma 74 5.3 Vergleich der ex vivo- und in vitro-Messungen 75
5.4 Ausblick 76
6 ZUSAMMENFASSUNG 77
7 LITERATURVERZEICHNIS 78
8 ANHANG 87
1 Einleitung 8
1 Einleitung
1.1 Epidemiologie
Verbrennungen sind sehr häufig, so zieht sich etwa jeder fünfte Mensch im Laufe seines Lebens eine solche Verletzung zu (Zellweger 1995). Die kassenärztliche Bundesvereinigung schätzt, dass jährlich rund 350.000 Verbrennungspatienten von niedergelassenen Ärzten behandelt werden. Eine für das Jahr 2001 erhobene Statistik der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsmedizin ergab, dass bundesweit in 13 Schwerstverbranntenzentren 1008 Patienten behandelt wurden. Die häufigsten Ursachen für Verbrennungen sind häusliche Unfälle (65 %), Arbeitsunfälle (15- 25 %) und Suizide (10 %) (Vogt et al. 2001).
Das Ausmaß der verbrannten Körperoberfläche lag im Durchschnitt bei 27 %.
Durch die langen Behandlungs- und Rehabilitationszeiten erlangen ausgedehnte Brandverletzungen oder verbrennungsähnliche Unfälle (Verätzungen, Starkstromverletzungen und Erfrierungen) eine große volkswirtschaftliche Bedeutung (Venet et al 2007, De Roche 2002).
1.2 Definitionen und Grundlagen 1.2.1 Das Verbrennungstrauma
Der Hauptauslöser für systemische und lokale Reaktionen ist die Brandwunde selbst (Mileski 1996). Die Schädigung einer Zelle durch Hitzeeinwirkung zeigt sich bei Temperaturen über 65°C in einer Koagulationsnekrose durch Denaturierung der Struktur- und Enzymproteine. Anschließend lösen die Zerstörung des Gefäßnetzes der Endstrombahn und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren sowie toxischen Eiweißen einen exsudativen Entzündungsprozess und fortschreitenden Zellschaden aus (Riede und Schaefer 1993, Vogt et al 2001, Warden 1993).
Das Ausmaß des Gewebeschadens wird bestimmt durch
1 Einleitung 9
• die Intensität und Dauer der Einwirkung,
• die Temperatur,
• den Aggregatzustand und
• die Art des einwirkenden Mediums.
Wasser, Wasserdampf und heiße Flüssigkeiten führen zu Verbrühungen;
Wärmestrahlen, heiße Gase, offene Flammen sowie feste und flüssige Körper führen zu Verbrennungen. Dabei führen Flammen, Explosionen, heißes Metall und Fett zu tiefen Gewebeschäden, während Wasser oder Wasserdampf eher zweitgradige Verbrennungen mit Blasen hervorrufen. Verbrennungswunden findet man an der Haut und am Respirationstrakt (Ioannovich 1996, Vogt et al 2001).
Für die Beurteilung der Größenordnung einer Verbrennungsverletzung der Haut sind die Gesamtfläche der verbrannten Köperoberfläche (VKOF) und die Tiefe der Wunden entscheidend.
Eine schnelle Orientierung über die Ausdehnung der VKOF erhält man mit Hilfe der Neuner-Regel (Vogt et al 2001, Kremer 1993). Die Körperoberfläche eines Erwachsenen wird in Einzelregionen zu je 9 % der Gesamtoberfläche eingeteilt.
Kopf und obere Extremität entsprechen je 9 %, Rumpf vorne und hinten je zweimal 9 %, untere Extremität je zweimal 9 %. Bei Kindern ist diese Regel wegen der anderen Körperproportionen nicht gültig. Eine weitere Einteilung ist mittels der Handfläche des Patienten möglich, sie entspricht etwa 1 % seiner Körperoberfläche.
Die Abschätzung der Wundtiefe erfolgt nach klinisch-pathologischem Erscheinungsbild:
Tiefengrad Betroffene Schichten Klinisches Erscheinungsbild
1 Epidermis Erythem, Ödem, Juckreiz
1 Einleitung 10
2a Epidermis,
papilläre Anteile der Dermis
Dünne, wässrige Blasen
2b Epidermis,
retikuläre Anteile der Dermis
Dickwandige Blasen mit weißlichem Wundgrund
3 Gesamte Haut und
ihre Anhangsgebilde
Brandschorf (Koagulationsnekrose)
4 Gesamte Haut und
tiefere Strukturen (Muskel, Sehnen, Knochen)
Verkohlung
1.2.2 Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)
Der Begriff „systemic inflammatory response syndrome“ (Systemisches Inflammatorisches Response Syndrom, SIRS) bezeichnet eine systemische entzündliche Reaktion, die bei Patienten als Folge eines Traumas oder einer Erkrankung auftreten kann. Die Symptome gleichen denen einer Sepsis.
Ursachen können z.B. Verbrennung, Ischämie, Polytrauma oder Pankreatitis sein. Der entscheidende Unterschied zur Sepsis besteht darin, dass keine Bakteriämie oder Endotoxinämie festgestellt werden muss (Bone et al 1992, Goris 1993, Bone 1996).
Das SIRS dann liegt vor, wenn mindestens zwei der folgenden Kriterien erfüllt sind (Abraham et al 2000, Bone et al 1992):
• Körpertemperatur > 38º oder < 36 ºC
• Herzfrequenz > 90/min
• Tachypnoe mit Atemfrequenz > 20/min oder PaCO2 < 32 mmHg
• Leukozytenzahl > 12.000/!l oder < 4.000/!l oder > 10% unreife Granulozyten (Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten) im Differentialblutbild.
1 Einleitung 11 Allerdings ist im Gespräch, die Kriterien für das Vorliegen eines SIRS bei Verbrennungspatienten unter Zuhilfenahme von biochemischen Entzündungsmarkern und Zytokinmustern genauer zu definieren (Greenhalg et al. 2007).
1.2.3 Sepsis und septischer Schock
Sepsis ist mit mehr als 50 % Anteil immer noch die Hauptursache für Morbidität und Mortalität nach einem Verbrennungstrauma (Palmer et al 2006, Yeh et al 2000, Schinkel et al 1998, Vogt et al 2001).
Als Sepsis wird nach der klassischen Definition von Schottmüller eine lebensbedrohliche Infektion bezeichnet, bei der von einem lokalen Infektionsherd ausgehend kontinuierlich oder in Schüben Bakterien in die Blutbahn eingeschwemmt werden. Es kommt zu schweren Allgemeinsymptomen und im Rahmen der hämatogenen Streuung zu metastatischer Absiedlung der Erreger in andere Organe. Diese Definition gilt heute als überholt, da auch andere Erreger oder Ursachen (z.B. Pilze oder bakterielle Toxine) zu einem septischen Krankheitsbild führen können (Shah 1998, Hampel 1995).
Der Begriff Sepsis wird nicht angewandt bei systemischen Infektionen durch Viren und Rickettsien oder „zellgebundene “ Bakteriämien, bei denen die Erreger innerhalb der Blutmonozyten auftreten ohne eine Sepsissymptomatik hervorzurufen (Riede 1993).
Nach neuer Definition liegt klinisch dann eine Sepsis vor, wenn zwei oder mehr der Kriterien für ein SIRS durch eine Infektion hervorgerufen werden (Abraham et al 2000).
Immunologisch ist die erste Phase der Sepsis charakterisiert durch die systemische Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen wie dem Tumor- Nekrose-Faktor-alpha, Interleukin-1 und Interleukin-8 sowie die Aktivierung des Komplementsystems. Die zweite Phase geht mit einer Freisetzung von anti- inflammatorischen Mediatoren (Transforming-growth-Faktor-ß, Interleukin-10 und Prostaglandin E2) einher und ist durch eine verminderte MHC-ll-Expression auf Monozyten gekennzeichnet (Haveman et al 1999, Finnerty et al 2006). Letzteres
1 Einleitung 12 wird von Bone (Bone 1996) in Anlehnung an den Begriff SIRS als compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS) bezeichnet.
Ein septischer Schock besteht, wenn trotz adäquater Flüssigkeitszufuhr eine sepsisbedingte Hypotension auftritt oder eine Therapie mit Vasopressoren zur Aufrechterhaltung eines suffizienten Blutdrucks erforderlich ist (Bone 1991).
Folge ist eine Minderperfusion, die sich z.B. durch eine Lactatazidose, eine Oligurie oder eine akute Änderung des Bewusstseinsstatus bemerkbar machen kann (Abraham, Matthay et al 2000).
Trotz umfassender Therapiekonzepte liegt die Sterblichkeit bei Sepsis und septischem Schock mit im Mittel 40 bis 60 % noch ähnlich hoch wie 1909, als erstmals das klinische Erscheinungsbild einer gramnegativen Sepsis von Jacob beschrieben wurde (Witthaut und Werdan 1996).
Das Risiko für die Entstehung einer Infektion nach einem Verbrennungstrauma ist von der Größe der Verbrennungsverletzung sowie von der Art und Tiefe der Verletzung abhängig. Eine besonders hohe Gefährdung besteht bei über 40 % verbrannter Körperoberfläche. Verbrennungen durch offene Flammen und Inhalationstraumata haben ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen (Toliver-Kinsky et al 2002), verglichen mit anderen Verbrennungsverletzungen.
1.2.4 Multiorganversagen
Das Multiorganversagen ist eine häufige Begleiterscheinung bei schweren Verbrennungen oder anderen schweren Verletzungen (Goodwin 1990). Es wird definiert als aufeinanderfolgendes Versagen von zwei oder mehr Organsystemen bei Patienten mit klinischen Zeichen einer Sepsis (Baue 1975). Betroffen sein können das respiratorische, kardiovaskuläre, hepatische, renale, hämatologische, gastrointestinale und nervöse System.
1.2.5 Das Immunsystem 1.2.5.1 Allgemeines
Das Immunsystem ist die Gesamtheit aller Abwehrmechanismen eines Organismus. Neben mechanischen Barrieren (Haut und Schleimhaut)
1 Einleitung 13 unterscheidet man zwischen adaptiver, erworbener und nichtadaptiver, angeborener Immunität (Janeway 2002, Huston 1997).
Die angeborenen Abwehrsysteme beruhen auf unveränderlichen Rezeptoren, die allgemein vorkommende Merkmale von Krankheitserregern erkennen.
Hauptbestandteile sind Phagozyten (neutrophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen), natürliche Killerzellen und das Komplementsystem. Die kennzeichnende Eigenschaft der erworbenen Immunität ist dagegen die klonale Selektion von Lymphozyten mit antigenspezifischen Rezeptoren (Janeway 2002, Alam 1998).
Die Komponenten des Immunsystems selbst unterteilt man in zelluläre und humorale Bestandteile. Zu den humoralen zählen das Komplementsystem, die Immunglobuline sowie die Zytokine, zu den zellulären Bestandteilen zählen Granulozyten, Makrophagen sowie Lymphozyten. Bei Letzteren wird zwischen B- und T-Lymphozyten unterschieden.
Die B-Lymphozyten differenzieren sich nach ihrer Aktivierung zu Plasmazellen und setzen Antikörper, die sogenannten Immunglobuline, frei. Hauptaufgaben der Immunglobuline sind die Antigenbindung und die Aktivierung der Phagozyten, der Killerzellen und des Komplementsystems (Alam 1998).
Die T-Lymphozyten unterteilt man in zwei Klassen. Eine Gruppe wird nach Aktivierung zu CD-8-positiven zytotoxischen T-Zellen, die virusinfizierte Zellen abtöten. Die andere Klasse differenziert zu CD-4-positiven T-Helferzellen, die zu einer Aktivierung von B-Zellen und Makrophagen führen (Janeway 2002).
Anhand der sezernierten Zytokine kann man die T-Helferzellen weiter unterteilen.
TH1-Zellen produzieren Interleukin-2 und Inferferon-gamma, TH2-Zellen produzieren Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-10 und Interleukin-13 (Spits und de Waal-Malefyt 1992, Alam 1998, Huston 1997).
TH1-Zellen sind in die Immunabwehr von intrazellulären Pathogenen eingebunden (Viren, Listerien, Mykobakterien), während TH2-Zellen bei der Abwehr von extrazellulären Pathogenen (Bakterien) eine Rolle spielen (Alam 1998, Katakura et al 2004).
1 Einleitung 14 Monozyten und Makrophagen spielen eine zentrale Rolle in der Immunabwehr gegen Mikroorganismen. Ihre Aufgabe ist die Phagozytose und Abtötung von Bakterien. Die Aktivierung der Makrophagen selbst erfolgt über Zytokine wie Interferon-gamma oder Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (Janeway 2002, Ertel und Faist 1993).
Die Granulozyten haben eine ähnliche Aufgabe; sie werden über Interleukin-8- Ausschüttung aus den Makrophagen gesteuert (Ertel und Faist 1993).
Das Komplementsystem ist zu Beginn einer Infektion einer der wichtigsten Mechanismen zur Pathogenerkennung. Es gehört zur angeborenen Immunität und besteht aus einem System von 20 Serumglykoproteinen. Diese werden direkt durch Krankheitserreger oder indirekt durch an Pathogene gebundene Antikörper aktiviert (Alam 1998, Parkin und Cohen 2001). Dadurch kommt es zu einer Folge von Spaltungsreaktionen, die u.a. zur Bildung der aktiven Komponente C3b führen. Die Bindung von C3b an das Pathogen ist das zentrale Ereignis der Komplementaktivierung. Durch die Spaltprodukte von C3, C4 und C5 werden Phagozyten aktiviert und an den Infektionsherd gelockt, wo es zur Aufnahme und Zerstörung des mit C3b besetzten Pathogens kommt. So bewirken die Komplementproteine die Lyse des Pathogens und die Aktivierung von Leukozyten und Mastzellen. Außerdem wirken sie an der Regulation der Antikörperproduktion von B-Zellen mit (Janeway 2002, Alam 1998, Huston 1997).
Zytokine sind endogene Proteine von geringem Molekulargewicht, die von Zellen gebildet werden. Sie fungieren als Botenmoleküle, um eine Funktionsänderung der eigenen oder einer anderen Zelle zu bewirken. Typische Effekte sind Zellaktivierung, Zellteilung, Apoptose oder Migration (Parkin und Cohen 2001, Harris et al 1995). Die Signalübertragung erfolgt über spezifische Rezeptoren an der Zelloberfläche.
1.2.5.2 Das MHC-System
Als Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC- Komplex) wird eine Gruppe von Genen bezeichnet, die beim Menschen auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 lokalisiert ist und für eine Gruppe von Membranglykoproteinen kodiert. Diese körpereigenen Antigene befinden sich auf den Zellmembranen kernhaltiger Zellen und ermöglichen die immunologische
1 Einleitung 15 Unterscheidung von körpereigen und körperfremd. Die T-Lymphozyten verfügen über einen Rezeptor, der den Komplex aus körperfremdem Peptidfragment und MHC-Molekül erkennt.
Man unterscheidet zwei Klassen von MHC-Molekülen, Klasse I und Klasse II.
MHC-Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer alpha-Kette und beta2-Mikroglobulin.
Sie werden von allen kernhaltigen Zellen exprimiert und präsentieren für zytotoxische CD8-positive T-Zellen Peptide von Fremdproteinen, z.B.
Tumorproteinen oder Fragmenten von viralen Proteinen, die im Zytosol gebildet werden. Die Folge der zytotoxischen T-Zellen-Aktivierung ist oft der Zelltod der präsentierenden Zelle selbst (Janeway 2002, Parkin und Cohen 2001, Huston 1997).
Die MHC-Klasse-II-Moleküle bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Sie befinden sich hauptsächlich auf B-Lymphozyten, aktivierten T-Lymphozyten und Makrophagen. Sie binden Peptide von körperfremden Proteinen, z.B.
bakteriellen, die insbesondere durch Phagozytose in zytosolische Vesikel aufgenommen werden (Parkin und Cohen 2001, Cheadle 1993). Der Komplex von körperfremdem Peptid und körpereigenem MHC-Klasse-ll-Molekül kann von CD4-positiven T-Zellen erkannt werden. Es kommt zur Aktivierung von Makrophagen und B-Lymphozyten sowie zur Zytokinfreisetzung (Alam 1998, Ertel und Faist 1993, Ayala et al 1996).
Das Human Leucocyte Antigen-System (HLA-System) ist die genetische Bezeichnung für den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex. Die Genloki werden durch Großbuchstaben, die Allele durch Zahlen gekennzeichnet.
Bei MHC-ll-Molekülen findet man hautpsächlich HLA-DR, DQ und DP (Gardiner et al 1994, Alam 1998, Huston 1997).
Die Fähigkeit von Zellen zur Expression von MHC-ll-Molekülen und die daran gebundene Antigenpräsentation ist ein wichtiger Schritt zur Auslösung einer adäquaten zellgebundenen oder humoralen Immunantwort. Einer der Hauptaktivatoren der MHC-ll-Expression ist Interferon-gamma (Schinkel et al 1998, Ayala et al 1996).
1 Einleitung 16 Schwere Traumata, Verbrennungsverletzungen oder andere Erkrankungen mit Gewebszerstörung (z.B. Pankreatitis oder aktive Colitis ulcerosa) führen zu einer erheblichen Reduzierung der HLA-DR-Expression auf Monozyten (Ayala et al 1996, Rinderknecht 1994, Gardiner et al 1994, Wakefield et al 1993). Bei Verbrennungsverletzungen scheint das Ausmaß der Reduzierung von der Größe der Verbrennung abhängig zu sein (Hultman et al 1995).
Die HLA-DR-Expression auf Monozyten scheint einer der wichtigsten prognostischen Parameter bei Patienten mit Sepsis zu sein (Volk et al 1991, Haveman et al 1999); eine verminderte HLA-DR-Expression korreliert mit einer schlechten Prognose (Venet et al 2007, Dries et al1996, Schinkel et al 1998) 1.2.5.3 Identifizierung von Monozyten anhand von Oberflächenantigenen
Monozyten stammen von myelomonozytären Stammzellen aus dem Knochenmark. Diese entwickeln sich zu Monoblasten, aus denen dann die Monozyten entstehen. Die Monozyten zirkulieren 1 bis 3 Tage im Blut, um dann in die verschiedenen Gewebe einzuwandern. Ab diesem Zeitpunkt werden sie als Makrophagen bezeichnet.
Die im Blut zirkulierenden Monozyten haben typische morphologische Merkmale, die einem erfahrenen Hämatologen die optische Identifizierung erlauben. Da es jedoch vor allem unter pathologischen Bedingungen zu Verwechslungen mit aktivierten Lymphozyten kommen kann, ist die Identifizierung mittels Durchflusszytometrie vorzuziehen (Ziegler-Heitbrock 2000). Da jedoch ein Teil der Monozyten im Lymphozytenfenster des Durchflusszytometers dargestellt wird und sich im Monozytenfenster auch Lymphozyten (aktivierte T-Zellen) befinden, sollte zusätzlich die Identifizierung mittels fluoreszierender monoklonaler Antikörper erfolgen.
Die Klassifizierung der monoklonalen Antikörper erfolgt über die sogenannte CD-Nomenklatur. CD steht für clusters of differentiation und bezeichnet Gruppen monoklonaler Antikörper, die dasselbe Antigen erkennen und die die gleiche Reaktion mit Gewebe und Zelllinien zeigen (Erber 1990, Zola und Swart 2005).
Man bezeichnet sie mit den Buchstaben CD und einer Zahl.
1 Einleitung 17 In dieser Arbeit werden zur Identifizierung der Monozyten CD14 und CD33 verwendet. Beide Merkmale sind charakteristisch für reife Monozyten (Janeway 2002, Almeida et al 2001).
CD 14 ist ein etablierter Oberflächenmarker und wird zur Identifizierung von humanen peripheren Blutmonozyten eingesetzt. Durch den Zusatz von CD14 kann die große Population der CD14++CD16--Monozyten und der kleinere Teil der CD14+CD16+-Monozyten identifiziert werden (Ziegler-Heitbrock 2000, Chlanchy et al 2006).
CD33 wird von myeloiden Vorläuferzellen und Monozyten exprimiert (Chlanchy et al 2006, Robinson et al 1999, Erber 1990).
1.3 Pathophysiologie der Verbrennung 1.3.1 Allgemeines
Nach einer Verbrennungsverletzung gehen von der Brandwunde pathophysiologische Vorgänge aus; es bestehen Beeinträchtigungen von lokalen und systemischen Funktionen (Harris und Gefand1995, Mileski 1996, Hettich et al 1978). Es kommt zu Störungen der Schutzfunktion der Haut und damit verbunden zu Störungen des Flüssigkeits-, Eiweiß- und Elektrolythaushalts, der Thermoregulation sowie der somatoviszeralen Sensibilität. Außerdem wird die immunologische Funktion der Haut und nachfolgend die des gesamten Organismus gestört (Nemsmann 2001, Ayala 1996, Heidemann und Bengtsson 1992).
Ein entscheidender Pathomechanismus ist das Entstehen von Leckagen in der kapillären Strombahn. Durch verschiedene Mediatoren (z.B. Histamin, Prostaglandin E2 und Komplementfakoren) kommt es zu gesteigerter Gefäßpermeabilität und einer Zunahme des mikrovaskulären hydrostatischen Drucks. Dies führt zur Entstehung von massiven Ödemen nach einer Verbrennung (Ward and Till 1990). Durch die Verbrennungsverletzung selbst kommt es durch Nekrose zur Obliteration von Blutgefäßen und in den umgebenden Geweben zu Hyperämie und Vasodilatation mit nachfolgender
1 Einleitung 18 Hämostase. Das führt zu einer Hämokonzentration durch den Verlust von Plasmavolumen. Die maximale Ödembildung wird nach 12 bis 24 Stunden erreicht (Lund et al 1992, Warden 1992).
Durch die zusätzliche posttraumatische entzündliche Gewebsreaktion kommt es zur weiteren Steigerung der Gefäßpermeabilität. Das führt zusammen mit Gefäßwandveränderungen zu Mikrozirkulationsstörungen und folglich zu einer Störung der Blutgerinnung (Hettich et al 1978, Lund et al 1992).
1.3.2 Immunologische Reaktion nach Verbrennung
Nach einem Verbrennungstrauma kommt es zu Veränderungen des spezifischen und unspezifischen Immunsystems, die zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen führen (Schlüter et al 1998). Betroffen sind sowohl humorale als auch zelluläre Bestandteile des Immunsystems.
Zu den Veränderungen gehören eine verminderte Funktion von neutrophilen Granulozyten und von T- und B-Zellen, verminderte Konzentrationen von IgG, IgA, und IgM sowie Änderungen in der Freisetzung von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen (Ayala et al 1996, Wassermann et al 1998, Pinsky 2001). Der Grad der Immunsuppression hängt von der VKOF und der Tiefe der Verbrennung ab. Ab einer VKOF von 20 % kann regelmäßig von einer generalisierten Störung des Immunsystems ausgegangen werden (Griswold 1993). Vor allem ab der zweiten Woche nach einer Verbrennungsverletzung werden die immunologischen Veränderungen deutlich (Allgöwer et al 1995).
1.3.2.1 Das Komplementsystem
Das Komplementsystem wird nach einem Verbrennungstrauma durch Lipopolysaccharide, Zellfragmente und C-reaktives Protein aktiviert (Nemsmann 2001). Die Folge ist die Bildung von biologisch aktiven Bruchstücken der Komplementfaktoren, die eine Aktivierung immunkompetenter Zellen bewirken.
Diese führen zu einer Migration, Margination und Aktivierung neutrophiler Granulozyten, was eine Schädigung von Endothelzellen und des Bindegewebes zur Folge hat (Heidemann und Bengtsson 1992, Pallua und von Bülow 2002).
Besonders C3a und C5a spielen eine große Rolle bei der lokalen Aktivierung des Immunsystems (Griswold 1993, Ward and Till 1990).
1 Einleitung 19 1.3.2.2 Zytokinkaskade
Speziell in der Frühphase nach einer Verbrennung kommt es zur Freisetzung von verschiedenen Interleukinen, darunter Interleukin-1, Interleukin-6 und TNF- alpha; diese Zytokine haben eine proinflammatorische Wirkung (Alexander 1990, Yeh et al 2000, Pruitt et al1996, Vindenes et al 1998).
Interleukin-1 wird von aktivierten Makrophagen und Monozyten produziert und ist durch die Induktion der Interleukin-2-Produktion und der Expression des Interleukin-2-Rezeptors ein wichtiges Stimulanz der T-Zell-Funktion (Youn et al 1992). Es führt zu einer Proliferation von T-Zellklonen, steigert die Produktion von Interferon-gamma und fördert die Zytotoxizität von NK-Zellen. Daneben hat Interleukin-1 auch systemische Wirkungen wie Hypotension, gesteigerte Bildung von Akut-Phase-Proteinen, erhöhter Aminosäurestoffwechsel und zentrale Fieberauslösung (Pruitt et al 1996, Vindenes et al 1998). Zusätzlich induziert Interleukin-1 über den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierenden- Faktor (GM-CSF) die Bildung von neutrophilen Granulozyten im Knochenmark.
Es besteht eine wechselseitige Regulation mit dem TNF-alpha, dessen Erhöhung die Interleukin-1-Sekretion steigert. Es besteht allerdings keine eindeutige Korrelation zwischen der Interleukin-1-Serumkonzentration und der Prognose bei Sepsis (Fraunberger et al 1996, Pinsky 2001).
TNF-alpha wird hauptsächlich von Monozyten gebildet und ist unmittelbar nach dem Verbrennungstrauma erhöht. Es aktiviert neutrophile Granulozyten, Monozyten sowie Makrophagen und führt zu einer vermehrten Produktion von Interleukin-1 und Interleukin-6. Zusätzlich wird die Freisetzung von Sauerstoffmetaboliten gesteigert. TNF-alpha regt zudem die Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten und Fibroblasten an, was eine vermehrte Produktion von Kollagenase und Prostaglandin E2 zur Folge hat. Die metabolische Wirkung von TNF-alpha ist durch Katabolismus, die Bildung von Akut-Phase-Proteinen und eine vermehrte periphere Lipolyse gekennzeichnet.
Außerdem führt TNF-alpha zu verstärkter Endothelpermeabilität und wirkt prokoagulatorisch (Köller und König 1991, Youn et al 1992). In einigen Studien konnte ein Zusammenhang zwischen erhöhten TNF-alpha-Werten und einer ungünstigen Prognose bei Sepsis hergestellt werden, andere Veröffentlichungen zeigten dagegen keine Korrelation. Begründet in der großen Variation der TNF-
1 Einleitung 20 alpha-Werte erscheint dieser Parameter wenig geeignet, um eine Prognose hinsichtlich des Verlaufs einer Sepsis abzugeben (Fraunberger et al 1996, Vindenes et al 1998).
Interleukin-6 ist eines der wirkungsstärksten proinflammatorischen Zytokine. Es wird hauptsächlich von Makrophagen und T-Lymphozyten produziert. Maxima der Serumkonzentration bestehen am dritten und am sechsten Tag nach dem auslösenden Trauma (Pallua und von Bülow 2002). Interleukin-6 induziert die Bildung von Akut-Phase-Proteinen und führt zu einer Differenzierung von B-Lymphozyten (Parkin und Cohen 2001, Ertel und Faist 1993, Youn et al 1992, Struzyna 1995). Der Serumspiegel von Interleukin-6 korreliert mit der Mortalität von Patienten mit schweren Verbrennungen und hat prognostische Aussagekraft in der Beurteilung einer Sepsis (Fraunberger et al 1996, Ertel und Faist 1993).
Nach einer schweren Verletzung oder Verbrennung kommt es zu einer Abnahme von TH1-abhängigen Zytokinen wie Interferon-gamma und Interleukin-2 bei gleichzeitiger Zunahme von TH2-abhängigen Zytokinen wie Interleukin-4 und Interleukin-10 (Lyons et al 1997), welche beide die Aktivität der TH1-Zellen inhibieren (Toliver-Kinsky et al 2002).
Die Wirkung und Funktion der in dieser Arbeit untersuchten Interleukine Interleukin-4, Interleukin-10 und Interferon-gamma wird unter Punkt 1.4 ausführlich besprochen.
1.3.2.3 Makrophagen
Auf der Ebene des zellulären Immunsystems ist der wichtigste Schritt zu einer suffizienten Reaktion des adaptiven Immunsystems die Antigenpräsentation durch Makrophagen (Ayala et al 1996, Griswold 1993, Ertel und Faist 1993).
Nach einem Verbrennungstrauma kommt es durch die verminderte Expression von HLA-DR und fehlende Interleukinproduktion zu Störungen in der Interaktion mit anderen Zellen des Immunsystems (Pallua und von Bülow 2002).
1.3.2.4 T-Zell-Populationen
Nach Verbrennung sind charakteristische Veränderungen in den T-Zell- Populationen zu beobachten (Köller und König 1991, Barlow 1994, Griswold 1993, Zapata-Sirvent und Hansbroughh 1993). In der frühen Phase kommt es zu
1 Einleitung 21 einer Verminderung der Gesamtzahl an T-Lymphozyten und einer quantitativen Verschiebung zugunsten der zytotoxischen T-Zellen, was von einigen Autoren als Übergang zur Immunsuppression interpretiert wird (Ertel und Faist 1993, Pallua und von Bülow 2002). Typische Veränderungen im Zytokinmuster sind die verminderte Produktion von Interleukin-2 und Interferon-gamma durch TH1- Helferzellen und die vermehrte Produktion von Interleukin-4 und Interleukin-10 durch TH2-Helferzellen (Kelly et al 1997, Katakura et al 2002). Ein Übergewicht von durch TH2-Lymphozyten produzierten Zytokinen scheint mit einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen zu korrelieren (Toliver-Kinsky et al 2002).
1.3.2.5 Granulozyten
In der Population der neutrophilen Granulozyten kommt es nach anfänglicher Aktivierung in der zweiten Woche nach einer Verbrennung zu einem Abfall der Zellzahl sowie zu einer Verminderung der Phagozytoseleistung, der Reaktivität auf chemotaktische Reize und der intrazellulären Abtötung von Bakterien (Köller und König 1991, Heidemann und Bengtsson 1992, Griswold 1993, Solomkin 1990, Schlüter et al 1998).
1.3.3 Einfluss auf die MHC-ll-Expression
Viele Studien haben gezeigt, dass der Anteil von HLA-DR-positiven Monozyten nach einem schweren Trauma, einer Verbrennungsverletzung oder einem großen chirurgischen Eingriff abnimmt (Venet et al 2007, Wakefield et al 1993, Ertel und Faist 1993). Es besteht eine Korrelation zwischen der Abnahme der HLA-DR-Expression und dem Auftreten einer posttraumatischen Infektion. Auch die Schwere einer Sepsis steht in Zusammenhang mit dem Ausmaß der HLA- DR-Suppression (Schinkel et al 1998). Dabei korreliert eine erhöhte Konzentration von Interleukin-10 mit der reduzierten Expression von HLA-DR (Lin et al 1994). Einen negativen Effekt auf die MHC-ll-Expression haben in vitro zusätzlich TGF-beta, Prostaglandin E2 und bakterielles Endotoxin (Volk et al 1991, Yeh et al 2000, Sachse et al 1999).
Interleukin-4, das nach einem Verbrennungstrauma vermehrt von TH2-Zellen produziert wird, hat einen positiven Einfluss auf die MHC-ll-Expression.
Interferon-gamma zeigt ebenfalls einen positiven Effekt. (Volk et al 1991, Flad und Gemsa 1997, Sachse et al 1999).
1 Einleitung 22 Außerdem bestehen Korrelationen zwischen der bei Sepsis verminderten HLA- DR-Expression sowie den erhöhten Konzentrationen von Interleukin-6 und Interleukin-8, wobei die Konzentration von Interleukin-8 zwar mit der Schwere der Erkrankung und der ungünstigen Prognose korreliert, die Monozytenfunktion dabei aber nicht zu beeinträchtigen scheint (Toliver-Kinsky et al 2002, Lin et al 1994).
1.4 Untersuchte Parameter 1.4.1 Interleukin-10
Interleukin-10, das auch als cytokine synthesis inhibitor factor bezeichnet wird, ist ein Polypeptid von 18 kDa Molekulargewicht. Das zugehörige Gen ist auf Chromosom 1 lokalisiert (Flad und Gemsa 1997, Spits und de Waal-Malefyt 1992, van der Poll et al 1995).
Interleukin-10 wird von CD4-positiven TH2-Zellen, CD8-positiven T-Zellen, Monozyten, Keratinozyten, aktivierten B-Zellen und Epstein-Barr-Virus (EBV)- transformierten B-Zellen gebildet (Janeway 2002, Spits und de Waal-Malefyt 1992, deVries 1995). Im Vergleich zu anderen Zytokinen wird es nach Aktivierung von T-Zellen und Monozyten sehr spät freigesetzt (Flad und Gemsa 1997, Spits und de Waal-Malefyt 1992). Im Zellkulturversuch wurde die maximale Interleukin-10-Konzentration 24 bis 48 Stunden nach Monozytenaktivierung gemessen (de Waal Malefyt 1991). Interleukin-10 ist neben dem TGF-beta das wichtigste antiinflammatorische Zytokin (Grütz 2005). Es zeigt seine Eigenschaften durch Modulation der Funktion von immunkompetenten Zellen und kann als Suppressor der Immunantwort betrachtet werden (Sachse et al 1999, deVries 1995, Haveman et al 1999).
Interleukin-10 hemmt die Synthese von wichtigen proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-alpha, Interleulin-1, Interleukin-6 und GM-CSF sowie zusätzlich die Synthese der TH1-abhängigen Zytokine Interleukin-12 und Interleukin-18 (Grütz 2005). Auch unterdrückt Interleukin-10 die T-Zell- Aktivierung durch Hemmung der Expression von MHC-ll-Molekülen (Parkin und Cohen 2001, Flad und Gemsa 1997, Spits und de Waal-Malefyt 1992, Pruitt et
1 Einleitung 23 al 1996, Haveman et al 1999). Bezüglich der natürlichen Killerzellen sind gegensätzliche Effekte beschrieben (Grütz 2005). In Anwesenheit von antigenpräsentierenden Zellen hemmt Interleukin-10 die Produktion von Interferon-gamma durch natürliche Killerzellen; werden diese Zellen jedoch mit Interleukin-12 stimuliert, so führt Interleukin-10 zu einer Zunahme der Interferon- gamma-Produktion.
Die Produktion von Interleukin-10 wird durch Interleukin-4 und Interferon-gamma gehemmt (Flad und Gemsa 1997, Toliver-Kinsky et al 2002, de Waal Malefyt 1991). Allerdings führt auch Interleukin-10 selbst zu einer Verminderung der eigenen mRNA-Bildung in aktivierten Monozyten, was einem autoregulativen negativen Feedbackmechanismus entspricht (deVries 1995).
Die Konzentration von Interleukin-10 im Serum ist nach einem Verbrennungstrauma erhöht (Lyons et al 1997, Yeh et al 2000, Yeh et al 2000, Sachse et al 1999). Es wird angenommen, dass es eine große Rolle bei der Unterdrückung der Immunantwort spielt (Lin et al 1994).
1.4.2 Interleukin-4
Interleukin-4, früher als B-Zellen-stimulierender Faktor BSF-1 bezeichnet, gehört zur Familie der Hämatopoetine. Das Interleukin-4-Gen liegt auf Chromosom 5 in enger Nachbarschaft zu den Genen für GM-CSF, M-CSF, Interleukin-3 und Interleukin-5.
Interleukin-4 hat ein Molekulargewicht von 20 kDa und wird hauptsächlich von T-Zellen und Mastzellen gebildet (Flad und Gemsa 1997, Janeway 2002). Seine Wirkungen bestehen in einer B-Zell-Aktivierung, einer Steigerung der Expression von MHC-ll-Antigenen und einer Hemmung der TH1-Zellen (Katakura et al 2004, Janeway 2002). Außerdem steigert Interleukin-4 die Expression des FcE-ll- Rezeptors für IgE auf B-Zellen, Monozyten und Keratinozyten, stimuliert das Wachstum von Mastzellen und aktiviert Makrophagen (Parkin und Cohen 2001, Ruppert et al 1991). Synergistisch mit G-CSF fördert Interleukin-4 die Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen und die Differenzierung von basophilen Neutrophilen. Als Wachstumsfaktor für T-Zellen hat es eine synergistische Wirkung mit Interleukin-2. Es hemmt jedoch die durch Interleukin-
1 Einleitung 24 2 induzierte Aktivierung von NK-Zellen und die Proliferation von humanen B- Zellen (Flad und Gemsa 1997). Interleikin-4 hemmt die monozytenabhängige Bildung von Interleukin-1, Interleukin-6, Interleukin-8, GM-CSF, TNF-alpha und Interleukin-10 (Obiri et al 1993, Hart et al 1995, Janeway 2002).
Die Serumkonzentration von Interleukin-4 ist nach einem Verbrennungstrauma erhöht, im Serum von gesunden Personen ist es jedoch kaum nachweisbar (Struzyna 1995).
1.4.3 Interferon-gamma
Interferone wurden 1957 von Isaacs und Lindenmann als löslicher Faktor aus virusinfiziertem Gewebe isoliert. Die Wirkung der Interferone kann als antiviral, antiproliferativ und immunmodulierend zusammengefasst werden (Vindenes et al 1998, Ioannovich 1996). Hinsichtlich der immunmodulierenden Wirkung hat sich das Interferon-gamma als bedeutsam erwiesen. Es existiert in zwei biologisch aktiven Formen von 20 bzw. 25 kDa, die sich in ihrer Glykosylierung unterscheiden. Das zugehörige Gen liegt auf Chromosom 12 (Flad und Gemsa 1997, Gennari et al 1994).
Interferon-gamma wird von CD4- und CD8-positiven T-Zellen und natürlichen Killerzellen gebildet. Die Aktivierung der Zellen erfolgt durch Antigene, Mitogene und Zytokine, hauptsächlich Interleukin-2, Interleukin-12, Interleukin-15 und Interleukin-18 (Janeway 2002, Toliver-Kinsky et al 2002, Griswold 1993). Es ist ein starkes Stimulans der antimikrobiellen Abwehr und fördert die Entwicklung von TH-1 Zellen (Alam 1998). Außerdem führt es zu einer Aktivierung der Makrophagen, einer erhöhten Expression von MHC-Molekülen, einem Ig- Klassenwechsel und einer Hemmung der durch TH2-Zellen gebildeten Zytokine, vor allem Interleukin-10 (Janeway 2002, Toliver-Kinsky et al 2002, Wassermann 1998, Gennari et al 1994). Von einigen Autoren wird Interferon-gamma als Hauptaktivator der HLA-DR-Expression angesehen (Schinkel et al 1998). Es induziert die monozytenabhängige Produktion von TNF-alpha sowie Interleukin-1 und supprimiert die Freisetzung von Prostaglandin E2 (Kox et al 1997).
1 Einleitung 25
Die Serumkonzentration von Interferon-gamma ist nach einem Verbrennungstrauma vermindert (Madihally et al 2002, Toliver-Kinsky et al 2002, Wassermann 1998).
2 Fragestellung 26
2 Fragestellung
Inhalt der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss von Serumfaktoren aus dem Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen auf die MHC-ll-Expression von Monozyten gesunder Spender darzustellen sowie Möglichkeiten zu untersuchen, diesen Effekt zu neutralisieren. Dies geschieht durch Tests mit ausgewählten Interleukinen, deren Konzentration im Serum von Schwerstverbrannten verändert ist und deren Effekt auf die MHC-ll-Expression in vitro in der Literatur beschrieben ist.
Daraus ergeben sich folgende Fragestellungen:
• Sind im Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen Faktoren enthalten, die einen Einfluss auf die MHC-ll-Expression von gesunden Monozyten nehmen?
• Können die in der Literatur beschriebenen Effekte von Interleukin-10, Interleukin-4 und Interferon-gamma in dieser Versuchsreihe bestätigt werden?
• Kann der Effekt der Serumfaktoren durch den Zusatz der Interleukine beeinflusst werden?
• Kann der Effekt des Serums von Patienten mit schweren Verbrennungen durch spezifische Antikörper gegen die genannten Interleukine neutralisiert werden?
Ziel ist ein besseres Verständnis der komplexen immunologischen Veränderungen nach einem Verbrennungstrauma.
3 Material und Methoden 27
3 Material und Methoden
3.1 Allgemeines
Nachfolgend werden Monozytenkulturen eingesetzt, um die Effekte verschiedener Faktoren auf die MHC-II-Expression von Blutmonozyten darzustellen. Dazu werden Monozyten gesunder Probanden kultiviert. Zunächst werden Vorversuche durchgeführt, um die Versuchsbedingungen, die Kulturdauer und den Typ der Kontrollfärbungen festzulegen (siehe 3.6). Im nächsten Schritt wird der Effekt von Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen dargestellt, indem der Monozytenkultur ein Poolserum von Patienten mit schweren Verbrennungen zugesetzt wird (siehe auch 3.3.5.2).
Danach werden weitere Versuchsreihen mit Zusatz von Interleukin-4, Interleukin-10 und Interferon-gamma sowie entsprechenden neutralisierenden Antikörpern durchgeführt (siehe 3.7.1 und 3.7.2). Abschließend werden Einzelseren von Patienten untersucht und die nach Kultur gemessene MHC-II- Expression mit der MHC-II-Expression ex vivo verglichen (siehe 3.7.3).
3.2 Beschreibung der Kontrollpersonen
Bei den Kontrollpersonen handelt es sich um gesunde Freiwillige (8 weibliche und 8 männliche) im Alter von 19 bis 51 Jahren mit den Blutgruppen 0, A und AB.
Die Blutentnahme erfolgt morgens zwischen 7.30 und 9.00 Uhr durch Punktion einer peripheren Vene mit 2,7 ml Monovetten der Firma Sarstedt mit Zusatz von 1,6 mg EDTA/ml Blut. Für einen Teil der Vorversuche werden Buffy Coats, d.h.
eine dünne weißlich-gelbe Schicht weißer Blutzellen, die sich nach dem Zentrifugieren des Blutes auf den roten Blutkörperchen ablagert, der Blutgruppe 0 aus der Blutbank der Medizinischen Hochschule Hannover verwendet.
3 Material und Methoden 28
3.3 Beschreibung der Patienten
Das verwendete Serum stammt von Patienten, die während der Zeit vom 21.12.1994 bis zum 27.10.1995 auf der Intensivstation für Schwerverbrannte der Klinik für Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover im Oststadtkrankenhaus Hannover aufgenommen und behandelt wurden.
Untersucht wurden 19 Patienten (7 weiblich, 12 männlich) im Alter von 15 bis 79 Jahren (Mittelwert ± Standardabweichung: 41±17 Jahre). Der Anteil der Körperoberfläche mit zweit- und drittgradigen Verbrennungen betrug im Mittel 33 % (Spannbreite von 6% bis 75%), die entsprechende Standardabweichung 21 %.
Die Blutentnahme erfolgte im Rahmen einer Studie (Woltering 1998) innerhalb der ersten 48 Stunden nach Aufnahme des Patienten sowie während der folgenden 14 Tage dreimal pro Woche. Das Blut wurde den Patienten morgens um 8.00 Uhr aus einem zentralen Venenkatheter abgenommen. Dabei handelte es sich ausschließlich um Blutentnahmen, die vom behandelnden Arzt im Rahmen der Routinediagnostik als notwendig erachtet wurden. Im Rahmen der genannten Studie wurden lediglich die verbleibenden Restblutmengen eingesetzt. Angesichts des geringen Blutbedarfs der durchgeführten Untersuchungen verblieben Restmengen von Serum, die zur weiteren Verwendung katalogisiert und bei -70ºC tiefgefroren wurden.
Die Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover für diese Vorgehensweise liegt schriftlich vor.
3.4 Auswahl der Interleukine
Nach schwerem Verbrennungstrauma kommt es zu typischen Veränderungen der T-Zell-Population und charakteristischen Zytokinmustern (Köller und König 1991, Barlow 1994, Griswold 1993). Die Serumkonzentrationen von Interleukin-1, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-8, Interleukin-10 und TNF-alpha sind nach einem Verbrennungstrauma erhöht (Toliver-Kinsky et al 2002, Yeh et al
3 Material und Methoden 29 2002, Yeh et al 2000, Vindenes et al 1998, Ertel und Faist 1993), die Konzentrationen von Interferon-gamma, Interleukin-2 und Interleukin-12 sind dagegen erniedrigt (Toliver-Kinsky et al 2002, Ertel und Faist 1993). Interferon- gamma, Interleukin-4 und Interleukin-6 führen zu einer Zunahme der MHC-ll- Expression auf Monozyten, Interleukin-10 jedoch zu einer Abnahme, wie in Kap. 1.3.3 und 1.4 beschrieben.
Interleukin-10 wird ausgewählt, da seine Konzentration im Serum nach einer schweren Verbrennung erhöht ist und angenommen wird, dass es eine große Rolle bei der Suppression der Immunantwort spielt (siehe auch Kap. 1.4.1).
Interleukin-4 wird ausgewählt, da es zu einer Zunahme der MHC-ll-Expression auf Monozyten führt und seine Serumkonzentration nach Verbrennungstrauma ebenfalls erhöht ist.
Interferon-gamma hat einem positiven Einfluss auf die MHC-ll-Expression, ist jedoch nach Verbrennungstrauma erniedrigt. Es wird ausgewählt, um zu überprüfen, ob durch Interferon-gamma der Effekt der Serumfaktoren von Schwerstverbrannten neutralisiert werden kann.
3.5 Versuchsaufbau 3.5.1 Verwendete Monozyten
Die Vorversuche zur Ermittlung der Kulturdauer werden mit Frischblut von gesunden freiwilligen Spendern durchgeführt. Die Blutgruppe bleibt zunächst unberücksichtigt. Die Kultivierung erfolgt im eigenen Spenderserum.
Für die folgenden Versuche mit Poolseren von gesunden Kontrollpersonen bzw.
von Patienten mit schweren Verbrennungen (s.u.) werden Buffy Coats der Blutgruppe 0 aus der Blutbank der Medizinischen Hochschule Hannover oder Frischblutspenden von gesunden Freiwilligen, ebenfalls Blutgruppe 0, verwendet.
3 Material und Methoden 30 3.5.2 Verwendete Poolseren
3.5.2.1 Auswahl der Seren
Wie unter 3.1 erwähnt, soll der Effekt von Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen auf die MHC-II-Expression gezeigt werden. Dazu wird ein Poolserum aus den oben erwähnten, bei -70°C tiefgefrorenen Serumrestmengen von 4 Patienten mit schweren Verbrennungen erstellt. Auswahlkriterien für die Patienten sind eine niedrige MHC-II-Expression bei ex-vivo-Messung und eine ausreichende zur Verfügung stehende Serummenge. Die niedrige MHC-II- Expression ex vivo lässt vermuten, dass im Patientenserum enthaltene Faktoren einen supprimierenden Einfluss auf die MHC-II-Expression haben. Die Serummenge ist ein Auswahlkriterium, da sie nicht für alle stationär behandelten Patienten ausreichend zur Verfügung steht (vgl. 3.3).
Zu Vergleichszwecken wird ein Poolserum aus dem Serum von fünf gesunden freiwilligen Spendern hergestellt. Diese Serumproben werden vor der Weiterverarbeitung für mindestens 48 Stunden bei -20°C tiefgefroren.
3.5.2.2 Aufarbeitung der Poolseren
Die bei -70°C tiefgefrorenen Serumproben der Patienten werden im Wasserbad bei 37°Celsius aufgetaut. Anschließend werden die Proben unter sterilen Bedingungen geöffnet, in ein ebenfalls steriles Gefäß gegeben und durch vorsichtiges Schwenken gemischt. Aus diesem Gemisch werden jeweils 2 ml entnommen und durch Einmalfilter (Milley-HV, 25 mm, Porengröße 0,45 !m) steril filtriert. Das sterile Poolserum wird in 1 ml-Portionen in 1,5 ml- Schraubgefäßen der Firma Sarstedt erneut bei -70° C tiefgefroren.
Die Herstellung des Kontrollserums erfolgt analog.
3 Material und Methoden 31 3.5.3 Reagenzien
3.5.3.1 Verwendete Reagenzien
Folgende Reagenzien fanden Verwendung:
• Pufferlösung: phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung) PBS, pH: 7,4, Kat.-Nr. 21300, Gibco BRL Life Technologies GmbH, Karlsruhe
• Ficoll, Dichte 1,077, c.c.pro GmbH, Neustadt/W
• Medium RPMI 1640 Medium, pH: 7,6, Kat.-Nr. 13018, Gibco BRL Life Technologies GmbH, Karlsruhe
• OptiLyse B, Lot 13, Kat.-Nr. 1400, Immunotech, Marseille, Frankreich
• Normales Maus-Serum, Lot Nr. 42952, Dianova, Hamburg
• CD14-FITC (Fluorescein Isothiocyanat), Clone RMO52, Coulter/Immunotech, Marseille, Frankreich
• CD33-PC5 (kovalent an Cyanin 5.1 gebundenes R-Phycoerythrin), Clone D3HL60.251, Coulter/Immunotech, Marseille, Frankreich
• Maus IgG1-PE (R-Phycoerythrin), Clone 679.1Mc7, Coulter/Immunotech, Marseille, Frankreich
• Anti-HLA-DR-PE (R-Phycoerythrin), Clone Immu-357, Coulter/Immunotech, Marseille, Frankreich
• Interleukin-10, Kat.-Nr. PHC0105, Biosource, Camarillo, CA 93012, USA
• Interferon-gamma, Kat.-Nr. PHC4834, Biosource, Camarillo, CA 93012, USA
• Interleukin-4, Kat.-Nr. PHC0044, Biosource, Camarillo, CA 93012, USA
• monoklonales Ratten-Anti-Human Interleukin-10, Clone JES3-9D7, Biosource , Camarillo, CA 93012, USA
3 Material und Methoden 32
• Polyklonales Kaninchen-Anti-Human Interleukin-4, Lot 8791-01S, Biosource , Camarillo, CA 93012, USA
• Polyklonales Kaninchen-Anti-Human Interferon-gamma, Lot 4691-04R, Biosource , Camarillo, CA 93012, USA
3.5.3.2 Reagenzienvorbereitung Interleukine
Das lyophilisierte Interleukin-10 wird mit sterilem H2O in Lösung gebracht (Konzentration: 100 U/!l) und in Portionen von 12,5 !l in 1,5 ml-Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -20ºC tiefgefroren.
Das lyophilisierte Interleukin-4 wird mit sterilem H2O in Lösung gebracht (Konzentration: 100 ng/!l) und in Portionen von 2 !l in 1,5 ml-Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -20ºC tiefgefroren.
Das gelöste Interferon-gamma wird mit RPMI 1640 + 0,1 % Kontrollserum verdünnt (Konzentration: 1000 U/!l) und in Portionen von 2 !l in 1,5 ml- Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -70ºC tiefgefroren.
Antikörper gegen Interleukine
Das gebrauchsfertige monoklonale Ratten-Anti-Human-Interleukin-10 mit einer Konzentration von 0,5 mg/0,5 ml wird in Portionen von 55 !l in 1,5 ml- Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -20ºC tiefgefroren.
Das gebrauchsfertige polyklonale Kaninchen-Anti-Human-Interleukin-4 mit einer Konzentration von 1 mg/ml wird in Portionen von 55 !l in 1,5 ml-Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -20ºC tiefgefroren.
Das polyklonale Kaninchen-Anti-Human-Interferon-gamma mit einer Konzentration von 1 x 105 U/ml wird im Verhältnis 1:20 mit RPMI + 0,1 % Poolserum von gesunden Kontrollpersonen verdünnt und in Portionen von 55 !l in sterilen 1,5 ml-Schraubgefäßen (Sarstedt, Langenhagen) bei -20ºC tiefgefroren.
Die übrigen Reagenzien sind gebrauchsfertig.
3 Material und Methoden 33 3.5.4 Angaben zur Zellkultur
3.5.4.1 Isolierung der Monozyten
Die Isolierung der Blutmonozyten findet unter sterilen Bedingungen statt. Das EDTA-Blut bzw. der Buffy Coat wird in 50 ml Schraubgefäße mit konischem Boden (Fa. Sarstedt, Langenhagen) gegeben und im Verhältnis 1:2 (EDTA-Blut) bzw. 1:6 (Buffy Coat) mit PBS verdünnt. Anschließend wird das verdünnte Blut im Verhältnis 1 Teil Ficoll zu 1,5 Teilen Blut über Ficoll geschichtet und 10 min bei 1000 g (2350 Upm) zentrifugiert (Beckmann GPR, Beckmann Instruments GmbH, München). Der entstandene Lymphozytenring wird abgenommen und es folgen zwei Waschzyklen mit 40 ml PBS und Zentrifugation bei 300 g.
Anschließend werden die Zellen nach dem Absaugen der überschüssigen Pufferlösung mit 5 ml Pufferlösung überschichtet und mit einem Vortex (Heidolph Reax 2000) aufgeschüttelt. Aus dieser Suspension werden 500 !l zur Zellzählung entnommen (Sysmex K1000, TOA Medical Electronics (Europe) GmbH, Hamburg). Die übrige Zellsuspension wird mit Medium (RPMI 1640) auf 40 ml aufgefüllt und 10 min bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend abgesaugt.
3.5.4.2 Anlegen der Zellkultur
Die Anlage der Zellkultur erfolgt in 24 Kavitäten-Gewebekulturplatten (Cellstar®, 24 Kav., TC, steril, Greiner). Als Kulturmedium wird ein Gemisch aus 80 % Medium RPMI 1640 und 20 % humanem Serum verwendet (Ruppert et al 1991, Volk et al 1991).
Anhand der durch die Zellzählung ermittelten Werte wird die Zellzahl durch die Zugabe der entsprechenden Menge an Kulturmedium auf 2,0 x 106 Zellen/ml eingestellt (Landmann et al 1988). Anschließend wird die Zellsuspension in Portionen von 500 !l/Kav. in die Gewebekulturplatten gegeben. Ein Ansatz entspricht 2 Portionen zu 500 !l. Je nach Versuch werden nun die entsprechenden Interleukine bzw. Antikörper zugesetzt. Bei jedem Versuch wird eine Leerwertkontrolle ohne Zusatz belassen. Die folgende Kultivierung findet bei 37ºC im Brutschrank unter Begasung mit 5 % CO2 statt. Die Kulturdauer beträgt 24 bis 96 Stunden.
3 Material und Methoden 34 3.5.4.3 Entnahme der Kulturzellen und weitere Aufarbeitung
Die Kulturplatten werden aus dem Brutschrank genommen und die Zellkulturen unter dem Mikroskop betrachtet. Wenn keine Anzeichen für eine mikrobielle Kontamination zu erkennen sind, werden die Zellen entnommen und in 1,5 ml- Eppendorfgefäße gegeben. Es erfolgt eine Zellzählung jedes einzelnen Ansatzes. Diesem Ergebnis entsprechend wird eine Menge entnommen, welche 2 x 105 Zellen enthält. Aus jedem Kulturansatz werden zweimal 2 x 105 Zellen für Kontroll- und Probemessung verwendet und in getrennten Röhrchen weiter verarbeitet. Die Zellen werden in 5 ml-FACS-Röhrchen gegeben und nach Zusatz von 2 ml Cellwash 10 min. bei 300 g zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wird 50 !l Cellwash auf die Zellen gegeben, und es wird sorgfältig mit dem Vortex aufgerüttelt.
Anschließend werden die Zellen für die Messung mit dem Durchflusszytometer (FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg) vorbereitet.
Zuerst werden 10 !l Mausserum auf den Ansatz gegeben, sofort vermischt und die Zellen 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgt die Markierung der Zellen mit fluoreszenzfarbstoffmarkierten monoklonalen Antikörpern (MAK). Zur Identifizierung der Monozyten werden zu jedem Ansatz 10 !l CD14-FITC und 5 !l CD33-PC5 gegeben. Anschließend wird in die erste Probe jedes Kulturansatzes zur Erstellung einer Kontrollprobe 10 !l Maus-IgG1-PE zur Quantifizierung der unspezifischen Antikörper-Bindungen pipettiert. In die andere Probe wird 10 !l Anti-Human-MHC-II-PE gegeben. Nach Zugabe der Antikörper werden die Proben sofort gemischt und anschließend 15 min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wird jeder Probe 50 !l OptiLyse B zugegeben und wieder bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 min.
inkubiert. Abschließend folgen der Zusatz von 250 !l Aqua dest. zu jeder Probe und eine nochmalige Inkubation von 15 min. bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3.5.5 Messmethode
Nach Abschluss der Inkubation erfolgt die Messung der MHC-ll-Expression auf Blutmonozyten am Durchflusszytometer FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg). Die Monozyten werden durch Färbung mit Antikörpern gegen die
3 Material und Methoden 35 Antigene CD14 und CD33 identifiziert. Anschließend werden die MHC-II- Rezeptoren durch den Zusatz von spezifischen Antikörpern gekennzeichnet, die unspezifische Antikörperbindung zur Kontrolle durch Maus-IgG dargestellt. Die Daten werden mit der Software Lysis II Version 1.1 (Becton Dickinson, Heidelberg) aufgenommen und ausgewertet. Während der Datenaufnahme werden die Geräteeinstellungen durch das Anzeigen eines FSC (Vorwärtsstreulicht)-/ SSC (Seitwärtsstreulicht)-Dotplots, eines Fl 1 (Fluoreszenz 1)/- Fl 2 (Fluoreszenz 2)-Dotplots, eines Fl 1-/ Fl 3 (Fluoreszenz 3)-Dotplots und eines Fl2-Histogramms kontrolliert. Im folgenden werden die Geräteeinstellungen beschrieben.
Einstellung der Verstärkung
FSC und SSC werden linear, die Fluoreszenzsignale werden logarithmisch verstärkt.
Einstellung der Detektoren
Die Photozelle für den FSC wird auf die Empfindlichkeit E 00(=1) eingestellt.
Für die Messung der Frischblutprobe wird die Spannung im Photomultiplier (Verstärker) zur Detektion des SSC so gewählt, dass die Neutrophilen- und Monozytenpopulationen im FSC/-SSC-Dotplot gut vom oberen und rechten Rand abgrenzbar sind.
Für die Messung der Kulturzellen wird eine Spannung gewählt, die ebenfalls eine Abgrenzung der Monozyten am oberen und rechten Rand ermöglicht.
Entsprechend werden die Spannungen des Fluoreszenz-1-Photomultipliers und des Fluoreszenz-3-Photomultipliers so eingestellt, dass die Monozytenpopulation vom oberen und rechten Rand gut abgrenzbar ist.
Die Spannung des Fluoreszenz-2-Multipliers wird so gewählt, dass sich die Zellpopulation der Kontrollprobe (Ansatz mit Maus-IgG-PE) in der zweiten Dekade des Fl2-Histogramms befindet.
3 Material und Methoden 37 Für die Auswertung werden ein FSC/SSC-Dotplot, ein Fl1/Fl3-Dotplot und ein Fl2-Histogramm benötigt.
Im FSC/SSC-Dotplot wird die Region R1 genau um den Bereich der Monozytenpopulation definiert (s. Abb.2).
Abb 2. FSC/SCC-Dotplot mit Region 1
Ebenso wird im Fl1/Fl3-Dotplot die Region R2 (CD14- und CD33-positive Zellen) definiert (Abb.3).
3 Material und Methoden 38
Abb 3. Fl1/Fl3-Dotplot mit Region 2
Die Schnittmenge dieser beiden Regionen R1 und R2 definiert die zur Auswertung bestimmten Monozyten.
Im Fl2-Histogramm erscheinen die Monozyten mit ausschließlich unspezifischen Bindungen im linken, die MHC-II-positiven Zellen im rechten Teil des Diagramms. Im Fl2-Histogramms des Kontrollansatzes wird die Region R3 definiert, die vom rechten Rand des Diagramms bis an den rechten Rand der Zellpopulation reicht, um die Zellen mit unspezifischen Bindungen aus der Region R3 auszuschließen (s. Abb. 4). Die so definierte Region R3 wird in das Fl2-Histrogrammm des Probeansatzes übernommen (s. Abb.5).
3 Material und Methoden 39
Abb 4. Fl2-Histogramm des Kontrollansatzes (Vorversuch Buffy Coat mit Poolserumvon gesunden Probanden, 48 h Kulturdauer)
Abb 5. Fl2-Histogramm des Probeansatz (Vorversuch Buffy Coat mit Poolserum von gesunden Probanden, 48 h Kulturdauer)
3 Material und Methoden 40 Das für die rechnerische Auswertung notwendige Gate 4 (G4) wird definiert als Schnittmenge von R1+R2+R3 und umfasst somit alle MHC-ll exprimierenden Monozyten. Gate 5 (G5) wird definiert als Schnittmenge von R1+R2 und umfasst alle gemessenen Monozyten.
Der prozentuale Anteil der MHC-II-positiven Monozytenpopulation wird anhand des Quotienten aus G4/G5 von Kontroll- und Probeansatz berechnet:
(G4/G5 (Probe)-G4/G5(Kontrolle))!100.
3.6 Vorversuche
3.6.1 Darstellung des Effekts des Serums von Patienten mit schweren Verbrennungen
Um zu demonstrieren, dass nach 48 Stunden das Serum von Patienten mit schweren Verbrennungen einen Effekt auf die MHC-II-Expression von gesunden Blutmonozyten hat, wird ein Parallelversuch durchgeführt. Es werden 6 Buffy Coats verwendet, und diesen wird eine ausreichende Menge an Zellen für zwei Ansätze entnommen. Einem Ansatz wird das oben genannte Poolserum von gesunden Spendern, dem anderen Ansatz das Poolserum von Patienten mit schweren Verbrennungen zugesetzt. Die übrigen Versuchsbedingungen sind identisch. Die MHC-ll-Expression wird nach 24 und 48 Stunden gemessen.
Nach 24 Stunden Kulturdauer ist kein Effekt nachweisbar (p " 0,05). Die Expression liegt bei 90,9 ± 9,3% (Normalserum) und 88,3 ± 5,6% (Serum von Verbrennungspatienten).
Nach 48 Stunden Kulturdauer zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der MHC-ll-Expression der beiden Ansätze. In dem Ansatz mit dem Serum der Verbrennungspatienten reduziert sich die MHC-ll-Expression signifikant (p # 0,01) auf 54,8 % ± 16,5 %, während die MHC-ll-Expression im Kontrollansatz mit dem Poolserum von gesunden Spendern 94,9 ± 4,1 % beträgt.
3 Material und Methoden 41
Abb 6. Darstellung des Effekts vom Serum der Verbrennungspatienten nach 24 h und 48 h verglichen mit der Kontrollgruppe
Die MHC-ll-Expression im Kontrollansatz hat sich durch die Kultur nicht geändert (p " 0,05).
Es kann also von einem Serumeffekt durch das Serum von Verbrennungspatienten nach 48 Stunden Kulturdauer ausgegangen werden.
3.6.2 Versuchsdauer
Die Kriterien zur Festlegung der Versuchsdauer sind die Stabilität der MHC-II- Expression der Monozytenpopulation nach einer bestimmten Dauer, weiterhin der Zeitpunkt bis zum sicheren Eintreten eines Effekts der zugesetzten Interleukine auf die MHC-II-Expression, der Effekt des Serums von Patienten mit schweren Verbrennungen sowie die Überlebensfähigkeit der Monozyten in der Zellkultur.
3 Material und Methoden 42 Anhand von in der Literatur beschriebenen Effekten in Versuchen mit Blutmonozyten und zugesetzten Interleukinen kann von einem ausreichenden Effekt nach 24 bis 72 Stunden Kulturdauer ausgegangen werden (Landmann et al 1988, Thommsen et al 1995). Es gibt keinen Hinweis darauf, dass die Vitalität der Monozyten innerhalb dieser Zeitspanne durch die Kulturbedingungen vermindert wird (Landmann et al 1988). Um die Stabilität der MHC-II-Expression zu überprüfen, werden sechs Monozytenkulturen ohne Zusatz von Interleukinen angelegt und die MHC-II-Expressionen im Frischblut direkt nach Aufarbeitung der Zellen und nach 24, 48, 72 und 96 Stunden Kulturdauer gemessen. Eine längere Kulturdauer erscheint nicht notwendig, da der zu untersuchende Effekt der Interleukine nach spätestens 72 Stunden auftritt (s.o.).
Sofort nach Aufarbeitung kommt es verglichen mit der Frischblutmessung zu einer verminderten MCH-ll-Expression. Sie beträgt 44,2 % ± 20,5 % verglichen mit 83,4 % ± 9,7 % in der Frischblutfärbung. Auch ist die Standardabweichung sehr groß. Nach 24 Stunden Kulturdauer beträgt die MHC-ll-Expression 86,1 % ± 8,2 %, die Standardabweichung ist damit deutlich geringer. Nach 48 Stunden Kulturdauer ist die Standardabweichung ebenfalls relativ gering mit ± 9,1 %, die mittlere MHC-ll-Expression jedoch wieder vermindert bei 58,0 % im Vergleich zur Frischblutfärbung.
Mit der Zunahme der Kulturdauer kommt es zu einer deutlichen Zunahme der Standardabweichung: So beträgt die MHC-ll-Expression nach 72 Stunden Kulturdauer 57,3 % ± 28,5 % und nach 96 Stunden 52,6 % ± 21,6 %. Die Standardabweichung der Kulturdauer ist nach 24 und 48 Stunden am geringsten mit 8,2% und 9,2%, so dass unter dem Aspekt der stabilen MHC-II-Expression eine Kulturdauer zwischen 24 und 48 Stunden geeignet erscheint.
Anhand der festgelegten Kriterien erscheint eine Kulturdauer von 48 Stunden sinnvoll, da zu diesem Zeitpunkt die MHC-II-Expression stabil und ein sicherer Effekt sowohl durch die Interleukine als auch durch die Serumfaktoren der Patienten mit schweren Verbrennungen (vgl. Kapitel 3.6.1) gewährleistet ist.
3 Material und Methoden 43
Abb 7. Darstellung der MHC-ll-Expression nach 0h, 24h, 48h, 72h und 96h
3.6.3 Kontrollfärbungen
Von jedem Ansatz wird zunächst eine Frischblutfärbung durchgeführt, um die individuelle Monozytenpopulation hinsichtlich ihrer Darstellung in der durchflusszytometrischen Messung (dargestellt im FSC/SSC-Dotplot und Fl1/Fl3- Dotplot) zu überprüfen. Als nach 20 Ansätzen keine bedeutsame Abweichung festgestellt werden kann bei einer MCH-ll-Expression von 80,8 % ± 7,9 %, wird nachfolgend auf die Frischblutfärbung verzichtet.
Zusätzlich zur Frischblutfärbung werden bei den ersten Ansätzen die MHC-II- Expressionen der Monozyten direkt nach der Aufarbeitung gemessen (vgl.
Messung nach 0 h, Abb. 7), um eine mögliche Veränderung der Zellen durch die Bearbeitung zu erkennen. Es zeigt sich im Vergleich zur Frischblutfärbung eine verminderte MHC-ll-Expression von 44,2 % ± 20,5 %. Das übrige Verhalten der Zellen während der Messung zeigt jedoch keine Abweichung, so dass im Folgenden auf diese Messung verzichtet wird.
3 Material und Methoden 44
3.7 Versuche mit der etablierten Methode
3.7.1 Versuche mit einem Anteil von 20 % Poolserum von gesunden Normalpersonen im Kulturmedium
3.7.1.1 Allgemeines
Zunächst soll der Einfluss der ausgewählten Interleukine auf die MHC-II- Expression der Blutmonozyten und der neutralisierende Effekt der entsprechenden Antikörper gezeigt werden. Dazu werden die Monozyten im Poolserum von gesunden Normalpersonen kultiviert und die entsprechenden Interleukine in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Für jeden Ansatz wird eine Leerprobe ohne Zusatz von Reagenzien belassen. Die Aufarbeitung der Zellen erfolgt wie unter 3.5.4.1 bis 3.5.4.3 beschrieben. Die Messung der MHC-ll- Expression erfolgt nach 48 Stunden Kulturdauer.
3.7.1.2 Zusatz von Interleukin-10
Das bei -20°C tiefgefrorene Interleukin-10 wird im Wasserbad langsam aufgetaut. Nachdem die Zellen für die Zellkultur vorbereitet und die Zellsuspensionen in Portionen von 500 !l/Kav. in die Gewebekulturplatten gegeben wurden, erfolgt der Zusatz von Interleukin-10 in abfallender Konzentration. Es wird je ein Ansatz mit 100 U/!l, 10 U/!l und 1 U/!l sowie ein Kontrollansatz nur mit Zusatz von RPMI durchgeführt. Die Verdünnung des Interleukin-10 erfolgt mit RPMI + 1 %-Poolserum von gesunden Normalpersonen.
3.7.1.3 Zusatz von Interleukin-4
Das bei -20°C tiefgefrorene Interleukin-4 wird im Wasserbad langsam aufgetaut.
Nachdem die Zellen für die Zellkultur vorbereitet und die Zellsuspensionen in Portionen von 500 !l/Kav. in die Gewebekulturplatten gegeben wurden, erfolgt der Zusatz von Interleukin-4 in abfallender Konzentration. Es wird je ein Ansatz mit 100 U/!l, 10 U/!l und 1 U/!l Interleukin-4 sowie ein Kontrollansatz ausschließlich mit Zusatz von RPMI durchgeführt. Die Verdünnung des Interleukins-4 erfolgt mit RPMI + 0,1 %-Poolserum von gesunden Normalpersonen.
