Eine vereinfachte Modifikation der Hydroxamatmethode zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Blut

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Willgerodt, TheiJe u. Beyreiß: Vereinfachte Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Blut 149

Eine vereinfachte Modifikation der Hydroxamatmethode zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Blut

Von H. WILLGERODT, H. THEILE und K. BEYREISS

Aus der Kinderklinik der Universität Leipzig (Direktor: Prof, Dr. med. S. Liebe)

(Eingegangen am 11. Januar 1968)

Beschreibung einer vereinfachten Modifikation der Hydroxamatmethode zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Serum. Das Verfahren ist zur Anwendung im klinischen Routinebetrieb geeignet. Die erforderliche Serummenge beträgt 25 bzw. 50 /. Als Substrat wird Acetylcholin verwendet. Die Normalwerte bei 50 gesunden Blutspendern betragen 3470 ± 600IU//. Der relative Fehler der Methode beträgt 3,2%. Das Verfahren beruht auf der Bildung eines rötlich-braunen Komplexes aus Fe+++-Ionen und Acetylhydroxamsäure mit einem breiten Absorptionsmaximum bei 490 nm. Zur praktischen Durchführung der Bestimmung sind lediglich ein thermokonstantes Wasserbad von 37° und ein Photometer bzw. Kolorimeter, das Ablesungen bei 490 nm gestattet, notwendig.

A method is described for the determination of serum cholinesterase activity by a simplified modification of the hydroxamate method.

The method is suitable for routine determinations in the clinical laboratory. 25 or 50 of serum are required. Acetyl choline is used as the substrate. The normal value determined in 50 healthy blood donors was 3470 ± 600 To//. The relative error of the method is 3.2%. The method is based on the formation of a red-brown complex (absorption maximum 490 nm) between Fe+++ions and acetyl- hydroxamic acid. A constant temperature water bath at 37° and a photometer or colorimeter for measurements at 490 nm are required.

Im Gegensatz zu der früher häufig geäußerten Zurück- haltung wird die Bedeutung der Cholinesteraseaktivität1) des Serums für die Beurteilung der Leberfunktion und die Diagnostik und Verlaufskontrolle verschiedener Erkrankungen der Leber durch zahlreiche neuere Mit- teilungen (l, 2, 3) unterstrichen. Von besonderem Wert ist die Bestimmung der Cholinesteraseaktivität bei chro- nischen Leberparenchymschäden und degenerativen Erkrankungen der Leber, während die Aktivität der Serumtransaminasen hier von geringer Aussagekraft ist.

Auch für die Feststellung von Vergiftungen mit orga- nischen Phosphorsäureestern, die in zahlreichen moder- nen Pflanzenschutzmitteln enthalten sind, ist die Be- stimmung der Cholinesteraseaktivität des Serums un- erläßlich.

Die zahlreichen Methoden zur Bestimmung cholin- esterspaltender Enzyme lassen sich in zwei große Grup- pen einteilen. Zur ersten Gruppe gehören Methoden wie das manometrische Verfahren von AMMON (4) und die automatische elektrometrische Titration, mit denen die Kinetik der Spaltung gut verfolgt werden kann. Sie sind die empfindlichsten und zugleich exaktesten bisher -bekannten Methoden. Im klinischen Routinebetrieb konnten sich diese Methoden wegen des beträchtlichen zeitlichen und technischen Aufwandes aber nicht durch- setzen.

Bei der zweiten Gruppe von Verfahren handelt es sich im wesentlichen darum, das innerhalb einer bestimmten Zeitspanne nicht umgesetzte Substrat zu bestimmen.

Das kann direkt geschehen durch Messung der nicht gespaltenen Cholinester in Form ihrer Eisenhydroxa- mate oder im Falle des Benzoylcholins, das ein spezifi- sches Absorptionsmaximum bei 240 nm besitzt, spektro- photometrisch nach KALOW (5), wobei die Extinktions- abnahme bei der enzymatischep. Spaltung von Benzoyl- cholin registriert wird. Andere Verfahren verfolgen die bei der Hydrolyse von Acetylcholin freigesetzte Essig- säure durch direkte Messung, der pH-Änderung am Ende

*) Der Trivialname Cholinesterase wird hier gebraucht für das Enzym Acetylcholin-Acetylhydrolase (EC 3.1.1.7).

der Einwirkungszeit des Enzyms, was ein empfindliches pH-Meßgerät voraussetzt, da z. B. bei der von MEINECKE und OETTEL (6) kürzlich publizierten Mikromethode der Normalwert im Serum einer pH-Änderung von nur 0,74 pH-Einheiten/Std. entspricht.

Die auch von uns verwendete Hydroxamatmethode wurde erstmals von HESTRIN (7) zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität verwendet. Es ist das besondere Verdienst von PILZ (8), die genauen analytischen Grund- lagen dieser Methode erarbeitet zu haben, die darauf beruht, daß sich im alkalischen Milieu Carbonsäureester mit Hydroxylamin zu Hydroxamsäuren umsetzen, die mit Fe+++-Ionen rötlich gefärbte Verbindungen liefern.

Die von PILZ (9) angegebene und mehrfach modifizierte Arbeitsvorschrift, deren Anwendung nach Angaben des Autors und anderer Untersucher (2) bei exaktem Ar- beiten sehr genaue Resultate liefert, hat sich aber zu- mindest als Routinemethode in der Klinik nicht durch- setzen können, was offenbar durch den erheblichen Aufwand an Zeit und Arbeit zu erklären ist. Wir haben deshalb versucht, die Hydroxamatmethode weiter zu vereinfachen mit dem Ziel, die Anwendung dieses sehr genauen Verfahrens auch im klinischen Routinelabor zu ermöglichen.

Methodik

Prinzip ·

Hydroxylamin reagiert in alkalischer Lösung mit Acetylcholin unter Bildung von Acetylhydroxamsäure und Cholin. Acetyl- hydroxamsäure bildet mit Fe+++ eine rötlich-braune Verbindung mit einem breiten Absorptionsmaximum bei 490 nm. Zur Be- stimmung der Cholinesteraseaktivität des Serums wird die Substrat- konzentration am Anfang und nach beendeter Inkubation mit Serum oder Plasma gemessen.

Reagentien

1. Tris-PufFer pH 7,4, 0,2M: 24,3 g Tris · HC1 mit bidest. Wasser ad 1000 m/ auffüllen. 25 m/ dieser Stammlösung und 42 m/ O,!N HOl mit bidest. Wasser ad 100 m/auf füllen. Bei 4° mehrere Monate haltbar.

2. 2,5N NaOH: 50 g NaOH p. a. in PläUchenform mit bidest.

Wasser ad 500 m/ auffüllen.

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3. Hydroxylamin-Stammlösung, 7proz.: 35 g Hydroxylamin · HC1 mit dest. Wasser ad 500 m/ auffüllen. Nur 14 Tage haltbar.

4. Alkalische Hydroxylamin-Gebrauchslösung. Unmittelbar vor Benutzung herzustellen: Lösung 2 und Lösung 3 werden zu gleichen Teilen gemischt.

5. 0,6?M FeCl3-Lösung: 188,9 gFeC!3-6H2O, (Union Chimique Beige) in etwa 500 m/ bidest. Wasser lösen und 10 g KNO3 zu- geben. Nach Auflösung des KNO3 mit bidest. Wasser ad 1000 m/

auffüllen. Die Lösung ist mehrere Monate bei Zimmertemperatur haltbar.

6. 2N HC1: 180m/ konz. HCl (D = 1,19) mit dest. Wasser ad 1000 m/ auffüllen.

7. Acetylcholinsubstratlösung, 9,6 : 174,3 mg Acetylcholin- chlorid mit bidest. Wasser ad 100 m/lösen und mit wenigen Trop- fen 2N Essigsäure auf pH 4—5 einstellen. Alle 14 Tage frisch her- stellen.

8. NaCl-Lösung 0,9proz.

Glasgeräte

Blutzuckerpipetten für 50 Serum, 0,5 m/ Vollpipetten, 1,0 m/

Vollpipetten, 1,0 m/ Stabpipetten, 10 m/ Stabpipetten, Reagenz- gläser.

Thermokonstantes Wasserbad von 37°, Photometer z. B. „Spekol"

VEB Carl Zeiß, Jena, oder Kolorimeter.

Arbeitsvorscbrift

Ansetzen eines Reagenzienleervvertes, eines Haupt- und eines Blind wertes. Erforderliche Serum- oder Plasmamenge 50 bzw.

25 /. Die einzelnen Lösungen werden, wie aus dem folgenden Schema ersichtlich ist (Tab. 1), in Reagenzgläser pipettiert.

Tab. l

Arbeitsschema für die Bestimmung der Cholinesteraseaktivität

auf 15 m/ erhöht wird (s. o.). Diese Verdünnung ist bei den An- sätzen zur Farbentwicklung zu berücksichtigen, die deshalb mit der 3 fachen Konzentration an Acetylcholin anzusetzen sind, ver- glichen mit dem endgültigen Ansatz zur Registrierung der Ex- tinktion.

Zur Berechnung der Acetylcholinesteraseaktivität wird die Acetyl- cholinkonzentration des Blindwertes Ea, d. h. die Konzentration vor Beginn der Inkubation, aus der Eichkurve ermittelt und von dieser die Konzentration des Hauptwertes E2, d. h. die nach be- endeter Inkubation noch vorhandene Konzentration in /m!

Acetylcholin subtrahiert. Man erhält so den Umsatz des Substrates als 4uMol/m/. Hieraus kann nach der Formel

/ /· 15000 == IU// (1)

die Acetylcholinesteraseaktivität berechnet werden, wobei eine IU// den Substratumsatz von l ! in einer Minute durch 1000 m/

Serum bei 37° bedeutet.

Ableitung der Formel (1)

AE = E! — E2

4uMol/m/-15-20000

(2) (3)

20 = /m! · 15 000 = IU (4)

Reagenzien-Leerwert Blindwert Hauptwert 1,0 ml Trispuffer 1,0 ml Trispuffer 1,0 ml Trispuffer 2,15 ml 0,9proz. NaCl 1,15 ml 0,9proz. NaCl 1,15 mi 0,9proz. NaCl

— 1,0 ml Acetylcholin- 1,0 ml Acetylcholin- Substratlösung Substratlösung

— — 50 Serum oder Plasma 20 Min. bei 37° im Wasserbad inkubieren, mehrmals vorsichtig um-

schütteln 0,5 ml alkalisches

Hydroxylamin 50 Serum oder

Plasma

0,5 ml alkalisches Hydroxylamin 50 Serum oder

Plasma

0,5 ml alkalisches Hydroxylamin

10 Min. bei Zimmertemperatur stehenlassen 0,3 ml 2N HCl

1,0m/ FeCl3 0,3 ml 2N HCi

1,0m/ FeCl3 0,3 ml 2N HCl 1,0m/ FeCls

30 Min. bei Zimmertemperatur stehenlassen

Anschließend werden zu jedem Röhrchen 10 m/ bidest. Wasser gegeben und vorsichtig durchgeschüttelt (zu starkes Schäumen vermeiden). Die Extinktionen von Hauptwert und Blindwert werden innerhalb der nächsten 2 Stdn. bei 490 nm und l cm Schichtdicke gegen den Reagenzienleerwert abgelesen.

Berechnung

Die Änderungen der Acetylcholinkonzentration werden aus einer Eichkurve abgelesen. Beim Aufstellen der Eichkurve geht man ebenso vor, wie für die Hauptversuche beschrieben, d. h. entsprechende Teile einer Lösung von Acetylcholinchlorid werden mit NaCl, Trispuffer, Hydroxylamin, 2N HCl und FeCl3-Lösung versetzt und die Farbentwicklung abgewartet. Danach gibt man zu jedem der 5,0 m/ betragenden Ansätze 10 m/ bidest. Wasser, schüttelt gut um und mißt die Extinktion bei 490 nm und l cm Schichtdicke in Glasküvetten gegen den Reagenzienleerwert. Für den Routinebetrieb genügt eine Eichkurve im Konzentrations- bereich von 0,08 bis 1,2 ! Acetylcholin pro 1,0 m/ im Meß- ansatz, wobei zu beachten ist, daß das ursprüngliche Volumen von 5,0 m/ vor dem Ablesen der Extinktion, durch Zugabe von Wasser

In Gleichung (4) entsteht der Faktor 15, da von der aus der Eich^

kurve ermittelten Konzentrationsabnähme in ! pro 1,0 m/auf das Gesamtvolumen des Ansatzes von 15 m/ zu beziehen ist, der Faktor 20 000, da 50 Serum verwendet wurden und auf 1000 m/

zu beziehen ist. Mit 20 ist zu dividieren, da die Enzymeinheit auf l Min. bezogen wird.

Für die praktische Durchführung ist es nicht erforderlich, für jede Serumprobe einen eigenen Reagenzienleerwert anzusetzen. Es genügt, einen einzigen Leerwert mit einem beliebigen klaren, durch vorherigen Hydroxylaminzusatz inaktivierten Serum anzusetzen, gegen den alle übrigen Werte abgelesen werden.

Reaktionsbedingungen

Die in Abbildung l dargestellte Eichkurve zeigt einen linearen Verlauf. Für die verwendeten Konzentrationen bis 1,2 ! Acetylcholin/m/ist das LAMBERT-BEERSche Gesetz erfüllt. Die Gerade verläuft durch den Nullpunkt.

Zahlreiche mit verschiedenen Reagenzien angefertigte Eichkurven zeigten eine sehr gute Übereinstimmung.

(Es wurden z. B. FeCl3 der Firmen Riedel de Hae'n, Reanal Budapest und der Union Chimique Beige ge- prüft.) Die von MEINECKE und OETTEL (6) bei dem Ver- fahren von PILZ (9) gefundene Instabilität des Eisen- reagenz wurde dabei von uns nicht beobachtet. Durch Zusatz von Serum nach dem Hydroxylamin entsprechend dem Blindwert wird der Verlauf der Eichkurve nur unwesentlich beeinflußt und bleibt streng linear.

In Abbildung 2 ist der Einfluß der Substratkonzentration auf die Aktivität der Cholinesterase dargestellt. Die Ab- bildung zeigt eine typische Sättigungskinetik entsprechend der Michaelis-Menten-Hypöthese. Bis zu einer

c Substratkonzentration von /m/im Inkubations-·

ansatz tritt keine Hemmung der Acetylcholinesterase- aktivität des Serums auf. Für die angegebene Routine- methode wählten wir eine Substratkonzentration von 3 mM.

Abbildung 3 zeigt die Abhängigkeit des Substratum- satzes von der Enzymmenge. Zur Untersuchung der Beziehung zwischen eingesetzter Enzymmenge und

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 6. Jahrg. 1968 / Heft 3

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, Ofi 0,6 0,8 1fl 1,2 Acety/cholin [ /ml]

Abb. l

Eichkurve für Acetylcholin. Re- aktionsbedingungen: Tris-Puf- fer pH 7,4, Endkonzentration 62 mM, Acetylcholinchlorid entsprechend den in der Abszisse angegebenen Endkonzentratio- nen, 0,9proz. NaCl ad 3,15 m/, 0,5 ml alkalisches Hydroxyl- amin, danach 0,05 ml Serum

0 Z * B 8 10 Acefylcholin [ / ]

Abb. 2

Einfluß der Substratkonzentration auf die Enzymaktivität, l ,0 m/ Tris (pH 7,4), 1,15m/ 0,9proz. NaCl, 0,05 ml Plasma, 1,0 ml Acetylcho- linchlorid von steigender Konzen- tration, so daß die in der Abszisse angegebenen Endkonzentrationen erreicht werden. Ordinate: Extink- tionsabnahme JE (Differenz zwischen Anfangs- und Endwert bei einer Inkubationszeit von 20 Min.)

Substratumsatz wurden 10, 25, 50, 75 und /hepa- rinisiertes Spenderplasma 20 Min. mit Acetylcholin, NaCl und Tris-Puffer pH 7,4 inkubiert und die Spaltung des Substrates als Extinktionsdifferenz zwischen Anfangs- und Endwert angegeben. Die Konzentration an Acetyl- cholin im Inkubationsansatz war 2,5 mM. Aus der Ab- bildung geht hervor, daß bis zu einer Plasmamenge von etwa 70 unter den gewählten Bedingungen eine lineare Zunahme der Substratspaltung mit steigendem Plasma- volumen zu verzeichnen ist. Für die Praxis heißt das, daß auch mit 25 Plasma reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen sind. Wir haben dies an mehreren Seren von Patienten überprüft und mit 25 exakt die Hälfte des mit 50 Serum gefundenen Substratumsatzes erhalten.

Die in der endgültigen Vorschrift angegebene Substrat- konzentration liegt mit 3,0 mM etwas höher als die in der Abbildung verwendete. Es empfiehlt sich aber nicht, mehr als 50 Serum zu verwenden, da sonst bei Zugabe von Hydroxylamin Trübungen auftreten, die regelmäßig zum Filtrieren des Ansatzes zwingen.

In Abbildung 4 ist die Abhängigkeit der Acetylcholin- hydrolyse von der Inkubationsdauer dargestellt. Die Konzentration an Acetylcholin betrug hier ebenfalls nur 2,5 mM. Es wurde mit 50 Serum inkubiert und die - Reaktion durch Zugabe von alkalischem Hydroxylamin

gestoppt. Wie die Abbildung deutlich macht, steigt der Substratumsatz bis zu einer Inkubationsdauer von 40 Min. linear mit der Zeit an. Die für die Routineme- thode gewählte Zeit liegt im linearen Umsatzbereich.

Wie die Abbildung zeigt, biegt die Kurve dann oberhalb von 40 Min. allniählich ab.

Ergebnisse und Diskussion

Bei 50 gesunden männlichen und weiblichen Blutspen- dern wurden Normalwert und Standardabweichung für die angegebene Methode mit Hilfe von Doppelbestim- mungen untersucht. Der Mittelwert aller Untersuchun- gen (x) betrug 3467IU//, die Standardabweichung (s)

± 602. Der Normalbereich (x ± 2 s) liegt demnach bei 2270 bis 4670 IU//, da es für praktische Bedürfnisse aus- reicht, mit einem Mittelwert von 3470 IU// und einer Streuung von ± 600 IU zu rechnen. Diese Werte stim-

20 W 60

Plasma BÖ 100 Abb. 3

Beziehung zwischen Substratspal- tung und eingesetzter Enzymmenge.

Reaktionsbedingungen: 62 mM Tris (pH 7,4), 2,5 mM Acetylcholin. Plas- ma entsprechend den in der Ab- szisse angegebenen Mengen, 0,9proz.

NaCl ad 3,2 ml. 20 Min. Inkubation in Wasserbad bei 37°. Ordinate: Ex- tinktionsabnahme . (vgl. Abb. 2)

0 20 W BÖ 80

Zeif [Min]

Abb. 4

Abhängigkeit des Substratum- satzes von der Inkubationszeit.

Reaktionsbedingungen: 1,0 ml Tris (pH 7,4), 1,15 ml 0,9proz.

NaCl, 0,05 ml Plasma, Acetyl- cholin 2,5 mM. Inkubation der Ansätze zwischen 2,5 und 80 Min. bei 37° im Wasserbad. Be- endigung der Reaktion durch Zugabe von alkalischem Hydro- xylamin. Ordinate: Extink- tionsabnahme JE (Differenz zwischen Anfangs- u. Endwert) zu der auf der Abszisse ange-

gebenen Inkubationszeit

men gut mit den von WEBER (2) an einem größeren Patientengut mit Acetylthiocholinjodid als Substrat und einer anderen Methode ermittelten Normalwerten über- ein.Die beschriebene Methode besitzt trotz ihrer Einfachheit eine gute Zuverlässigkeit. Zu ihrer Überprüfung wurde das Serum eines gesunden Spenders in 10 Parallelbestim- mungen am gleichen Tage untersucht, wobei ein Mittel- wert von 3060 IU// bei einem Variationsko'effizienten (v) von 3,2 % ermittelt wurde. Der Variationskoeffi- zient oder relative Fehler der Methode ist definiert als v = 4 · 100.

Das Verfahren zeichnet sich bei guter Reproduzierbar-, keit der Ergebnisse durch seine große Einfachheit aus, die seine Anwendung auch in jedem kleineren Kranken- haus gestattet, da ein Wasserbad von 37° und ein Photo- meter für den sichtbaren Bereich oder ein Kolorimeter allgemein zur Verfügung stehen dürften. Wie Abbildung 2 zeigt, arbeitet das Verfahren bei optimaler Substrat- konzentration, die bei 3 mM liegt und damit deutlich höher ist als bei der von PILZ (9) angegebenen Methode, die eine Substratkonzentration von 1,235 mM benutzt.

Aus der Abbildung 2 ist weiterhin zu entnehmen, daß durch Substratüberschuß in Übereinstimmung mit Un- tersuchungen von ALLES und Mitarbeitern (10) sowie BREUER und SCHÖNFELDER (11) im Gegensatz zur Acetylcholinesterase der Erythrocyten das Serumenzym nicht gehemmt wird, während PILZ (12) kürzlich über eine Hemmung der Plasmaacetylcholinesterase durch Substratüberschuß berichtete.

Aus den Abbildungen 3 und 4 geht hervor, daß lineare Proportionalität zwischen Enzymmenge bzw. Inkuba- tionszeit besteht. Das gestattet, die verwendete Serum-

• menge auf 25 zu reduzieren. Durch das gleichzeitige Mitführen eines Blindwertes wird die Spontanhydrolyse des Substrates bei der Inkubation miterfaßt und eine gesonderte Berechnung im Gegensatz zu anderen Ver- fahren (4, 6) überflüssig. Allerdings ist bei unserer Me- thode die Spontanhydrolyse des Acetylcholins bei pH 7,4 und 37° ohnehin praktisch bedeutungslos, wovon wir

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uns in Übereinstimmung mit PILZ (13) in Vorversuchen überzeugen konnten.

Im Gegensatz zu dem von PILZ (9) angegebenen Ver- fahren benutzen wir nur einen Puffer in Form des sehr einfach herzustellenden 052M Tris-Puffers. Des weiteren ist als wesentlicher Vorteil anzusehen, daß bei unserem Verfahren eine Enteiweißung entfällt. Die Reaktion wird durch Zugabe von alkalischem Hydroxylamin gestoppt, wobei der pH-Wert des Ansatzes auf über 13 ansteigt. Dabei flockt das Protein aus. Mit der Zugabe von 10m/ bidest. Wasser vor der Ablesung wird ein Gesamtvolumen von 15 m/erreicht, in dem der geringe, 50 / Serum entsprechende Proteinniederschlag bei der Ablesung nicht stört. Dies wurde in zahlreichen Paral- lelbestimmungen einer wäßr. Lösung von Acetylcholin mit und ohne Zusatz von inaktiviertem Serum geprüft.

Bei stark getrübten Seren kann vor der Ablesung eine Filtration notwendig werden.

Von Vorteil gegenüber anderen Methoden ist weiterhin die Tatsache, daß der Zeitpunkt für die Ablesung zwischen 30 und 120 Min. nach der Zugabe der FeQ3- Lösung gewählt werden kann. Auch nach 24 Stdn. kann noch abgelesen werden, die Werte liegen dann 3^5%

unter denen, die man innerhalb der ersten 2 Stdn. erhält, was mit den Erfahrungen von PILZ (13) übereinstimmt.

Die Angabe einer Zeitspanne von 30 Min. nach Zugabe des FeQ3 für die Ablesung stellt ebenfalls nur einen Richtwert dar, da bereits 15 Min. nach FeQ3-Zugabe die Reaktion mit Sicherheit abgeschlossen ist.

Abschließend sei darauf verwiesen, daß trotz zahlreicher experimenteller Untersuchungen und klinischer Arbeiten (l, 2, 3) über den besonderen Wert der Bestimmung der Cholinesteraseaktivität des Serums für die Beurteilung der Leberfunktion nicht nur über die Nomenklatur der Cholinesterasen, sondern auch über ihre physiologische Bedeutung und den Ort ihrer Bildung im menschlichen Organismus erhebliche Unklarheiten bestehen. Dies kommt u. a. in der Tatsache zum Ausdruck, daß in den letzten 20 Jahren zahlreiche sehr unterschiedliche Sub- strate für die Bestimmung der Cholinesteraseaktivität des Serums verwendet wurden, bei denen es sich häufig gar nicht mehr um Cholinester, sondern um andere aliphatische oder aromatische Carbonsäureester handelt (Übersichten bei AUGUSTINSSON (14), HARDEGG (15), PILZ (12)).

Die zahlreichen Substrate und die unterschiedlichen Bezeichnungen für das Serumenzym wie Cholinesterase, Pseudocholinesterase, unspezifische Cholinesterase, da- neben „echte" Cholinesterase oder „wahre" Cholin- esterase legen die Vermutung nahe, daß es sich bei der Spaltung der Cholinester durch menschliches Serum

entweder um die Wirkung eines sehr unspezifischen Enzyms oder um die einer Vielzahl von Enzymen han- deln muß. So ist nach HARDEGG (15) die Verwendung der Bezeichnungen „echte", „wahre", „spezifische"

oder „unspezifische" Cholinesterase und „Pseudo- cholinesterase" auf Grund neuerer Forschungser- gebnisse nicht mehr gerechtfertigt, da sie den Tat- sachen in keiner Weise Rechnung tragen. Vielmehr sollten die Cholinesterasen auch in Übereinstimmung mit anderen Untersuchern (4) in 2 Gruppen einge- teilt werden, von denen die Enzyme der ersten Gruppe Acetylcholin schneller als längerkettige Cholinester spalten. Für diese Gruppe, die vorwiegend im Zentral- nervensystem, in Muskulatur und Erythrocyten ver- breitet ist, wird von der IUB (16) der Trivialname Acetylcholinesterase vorgeschlagen und das Enzym als Acetylcholin-Acetylhydrolase (EC 3.1.1.7) registriert.

Die zweite Gruppe von Enzymen spaltet Butyrylcholin schneller als Acetylcholin und kommt vorwiegend in Leber, Darm und Plasma vor. Dieses Enzym wird von der IUB (16) unter dem Trivialnamen Cholinesterase als Acylcholin-Acylhydrolase (EC 3.1.1.8) registriert.

Allerdings ist auch diese Einteilung willkürlich. Die Übergänge zwischen beiden Gruppen cholinesterspal- iejfder Fermente sind fließend, so daß eine zu strenge Trennung nicht sinnvoll erscheint.

Während früher überwiegend die Meinung vertreten wurde, daß im Serum keine „echte" Acetylcholinesterase existiert, konnte kürzlich PILZ (17) die Existenz von 2 Enzymen im menschlichen Serum nachweisen, die spezifisch Acetylcholin und keine anderen Substrate spalten. Als Ursprungsort der Cholinesterasen des menschlichen Serums wird von den meisten Autoren (2, 3, 18 u. a.) die Leber genannt, wobei jedoch viele diese Meinung von anderen .Untersuchern übernehmen.

Es ist in diesem Zusammenhang interessant, daß es in neueren Untersuchungen (12) nicht gelang, eine Acetyl- cholinspaltung durch Homogenate aus menschlicher Leber nachzuweisen. Neben den bereits erwähnten (3,18) klinischen Beobachtungen und anderen Methoden, die zur Beurteilung der Leberfunktion die Acetylcholin- spaltung des Serums verwenden, sowie eigenen Erfah- rungen bei Patienten mit Leberparenchymschäden, scheinen die gute Korrelation, die von zahlreichen Unter- suchern (18, 19, 20) zwischen dem „Achol"-Test, einem Testpapier, das mit Acetylcholin als Substrat getränkt ist (6, 18), und mit anderen Substraten und Methoden gewonnene Ergebnisse für eine Bildung auch der Acetyl- cholinesterase in der Leber zu sprechen. Auf Grund der vorliegenden methodischen Mitteilung kann zu dieser Frage allerdings nicht Stellung genommen werden.

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Dr. H. Willgerodt X 705 Leipzig Oststtaßc 21—25

Erfahrungen mit einer kolorimetrischen Methode

zur Bestimmung der nicht veresterten Fettsäuren im Serum

¹

)

Von P. DIETERLE, C. WÜLFERT-HELDRICH, J. HENNER und K. SCHWARZ

Ans der II. Medizinischen Klinik der Universität München (Direktor: Prof. Dr. Dr. G. Bodechtel) (Eingegangen am 26. Januar 1968)

Es wird über eigene Erfahrungen mit der kolorimetrischen Bestimmung der NFS nach DÜNCOMBE (6, 7) berichtet. Es besteht eine gute Korrelation beim Vergleich des beschriebenen Verfahrens mit der Titrationsmethode nach DOLE (l, 2). Die Vorteile der Methode werden besprochen.

Studies are reported on the colorimetric determination of nonesterified fatty acids according to DUNCOMBE (6, 7). There is good correlation between the described method and the titration method of DOLE (1, 2). The advantages of the methods are discussed.

Eine in der klinischen Medizin gebräuchliche Be- stimmungsmethode ist die Messung der nicht veresterten Fettsäuren (NFS)²) im Serum mit dem Ti- trationsverfahren nach DOLE bzw. DOLE und MEINERTZ (1,2). Trotz guter Reproduzierbarkeit ist diese Methode nicht ganz frei von Nachteilen. Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der NFS mittels Kolorimetrie hat 1956 AYERS (3) mitgeteilt, das 1959 von IWAYAMA (4) und 1961 von BARRETO und (5) weiter modi- fiziert wurde. Von DUNCOMBE (6, 7) wurde schließlich die Methode in ihrer Empfindlichkeit so verbessert, daß sie sich gut für klinische und biochemische Frage- stellungen eignet. Unsere Erfahrungen mit dieser kolorimetrischen Methode und die Vorteile gegenüber dem Titrationsverfahren sollen in dieser Arbeit an- hand vergleichender Untersuchungsreihen herausge- stellt und beurteilt werden.

Methodik Prinzip

Die NFS werden als Kupfersalze mit Chloroform extrahiert.

Die Kupferseifen werden mit Diäthyldithiocärbaminat in einen Kupferkomplex überführt und kolorimetrisch bestimmt.

Reagenzien

\. Chloroform p. a.

2. Kupferreagenz:

a) Cu(NO³)² - 3 H^?O, 6,45proz. Lösung,

b) 9 Teile IM Triäthanolamin + l Teil IN Essigsäure a) und b) werden im Verhältnis l: l gemischt.

3. Natrium-Diäthyldithiocarbaminat (C⁵H¹⁰N NaS · 3 H²0).

Es wird eine 0,lproz. Lösung in sek. Butanol hergestellt.

Lösung 2 und 3 müssen im Kühlschrank aufbewahrt und jede Woche erneuert werden.

Durchführung

In ein geschliffenes Reagenzglas werden 5m/ Chloroform (bzw.

in 5 m/ gelöster Palmitinsäurestandard), 2,5 m/ Kupferreagenz und 0,5 m/ Serum pipettiert. Nach sorgfältigem Verschluß der Schliffgläser (wir verwenden dafür lipoidunlösliche Kunststoff- stopfen) wird das Gemisch in einer dreidimensionalen Schüttel- apparatur 30 Min. gleichmäßig geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch 15 Min. bei 2000 bis 3000 £ zentrifugiert. Es bilden sich 2 Phasen. Die obere wäßr. Phase mit dem überschüssigen Kupfer- reagenz ist von der unteren Chloroformphase durch eine ausge- fällte Eiweißschicht getrennt. Mit einer an die Wasserstrahl- pumpe angeschlossenen Kapillare wird nun einschließlich der an der Glaswandung haftenden Tropfen die obere Kupferphase und anschließend vorsichtig die Eiweißschicht abgesaugt. Vom Chloroformrückstand werden sofort 3 m/ in ein kleines Schliff- glas abpipettiert. Dabei ist sorgfältig darauf zu achten, daß die Pipette nicht die Glaswandung berührt und damit Kupfer über- trägt. Zur Chloroformphase werden 0,5 ml der Diäthyldithio- carbaminatlösung gegeben und der gelbgefärbte Kupferkomplex bei 436 nrn (Photometer Eppendorf) gegen einen Reagenzien- blindwert, der durch die gesamte Messung mitläuft, innerhalb einer Stunde gemessen.

Die Berechnung erfolgt nach der Formel

^Val//des Standards Extinktion probe ·

Extinktion Standard 10 =^Val NFS//Serum

*) Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

2) bki^r^t^ngen: NFS =. nicht veresterte Fettsäuren.

Diskussion der Methode

Bestimmungen von reinen Palmitinsäurelösungen zei- gen, daß zwischen der Konzentration und der Ex- tinktion strenge Proportionalität besteht (Abb. 1). Es genügt daher im allgemeinen, nur einen Palmitin- säurestandard mitlaufen zu lassen. In weiteren Ver- suchen wurde Natriumpalmitat an Serumalbumin gebunden und anschließend die Wiederfinderate bestimmt. Im Mittel wurden 98% des eingesetzten Palmitat-Standards wiedergefunden. Dies stimmt mit Angaben von ITAYA und Ui (8) überein. Die geringere Wiederfindequote von DUNCOMBE (7) führen wir auf