Isolierung des Proteins VII aus Adenovirus II und Expression in E. coli-Stämmen : Virusproteine als Transfermoleküle für menschliche DNA

Aus der Klinik und Poliklinik für Innere Medizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Direktor: Prof. Dr. H. Greten

Isolierung des Protein VII aus Adenovirus II und Expression in E.coli-Stämmen – Virusproteine als Transfermoleküle für menschliche DNA

D

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von

Raphaela Augustine Barbara Basdekis aus Hamburg

Angenommen von dem Fachbereich Medizin

der Universität Hamburg am: 8. Januar 2002

Tag der mündlichen Prüfung: 26. Februar 2002

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg

Dekan: Prof. Dr. C. Wagener

Referent: Priv. Doz. Dr. D. Ameis

I

A. Einleitung... 4

1. Einführung in die Thematik...4

2. Gentransfer...5

2.1. Bedeutung des Gentransfers...5

2.2. Entwicklung des Gentransfers...5

2.3. Methoden des Gentransfers...6

2.4. Das adenovirale Vektorsystem...8

2.5. Neuere Entwicklung des adenoviralen Vektorsystems ...9

3. Molekularbiologischer Aufbau des Adenovirus ...9

3.1. Chemische und physikalische Eigenschaften der Adenoviren ...10

3.2. Das Virusgenom ...12

4. Das Virus-Kapsid: Gliederung und Zusammensetzung ...13

4.1. Das Hexon...14

4.2. Das Penton ...15

4.3. Weitere mit dem Kapsid verbundene Proteine ...16

4.4. Der Aufbau des Kapsids...17

5. Der Viruskern...18

5.1. Der Beweis für die Existenz einer Kernhülle ...18

5.2. Der Aufbau des DNA-Protein-Komplexes (Nukleokapsid) ...19

5.3. Das Versuchsmodell des Adenovirus-Nukleokapsids...20

6. Das Körpermodell des Adenovirus...25

7. Vektoren...26 7.1. Plasmide ...26 7.2. Bakteriophagen ...27 7.3. pJM17-Aufbau ...27 7.4. pQE30-Aufbau...28 8. Konstruktaufbau pVII-pQE30...29 8.1. Aufbau...29 8.2. Zielvorstellungen ...30 9. Expression in SG13009 und M15...30

10. Fragestellung der vorliegenden Arbeit ...31

B. Material und Methoden... 32

1. Materialien...32

1.1. Chemikalien ...32

1.2. Molekulargewichtsstandards und Proteine ...33

1.3. Puffer, Medien, Agarplatten und Antibiotika...33

1.4. Sonstige Pufferlösungen...34

2. Allgemeine Arbeitsmethoden ...37

2.1. Sterilisation ...37

2.2. Absorptionsmessung...37

3. Präparation des Plasmids pJM17 ...37

3.1. Prinzip ...37

3.2. Durchführung...37

4. Quantifizierung der DNA-Menge durch Spektralphotometrie ...38

4.1. Prinzip ...38

4.2. Durchführung der OD-Messung ...38

5. Schneiden des Plasmids pJM17 und des Vektors pQE30 mit SalI...39

5.1. Prinzip ...39

5.2. Durchführung...39

6. Amplifikation der dsDNA von Protein VII durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...40

6.1. Prinzip ...40

6.2. Verwendete Oligonukleotide ...41

6.3. Vorbereitung des PCR-Reaktions-Mix...44

6.4. Durchführung der PCR...45

6.5. Modifikation der PCR nach dem PCR-Optimization-Kit ...45

7. Analytische Agarosegelelektrophorese ...48

7.1. Prinzip ...48

7.2. Vorbereitung und Beladen des Agarosegels...48

8. Subklonierung des PCR-Produktes...49

8.1. Prinzip ...49

9. Verdau des Protein VII und des Vektors pQE30 mit BamHI und HindIII ...50

9.1. Prinzip ...50

9.2. Vorbereitung ...50

9.3. Durchführung des Verdaus...51

10. Ligation der Verdau-Produkte ...51

10.1. Prinzip ...51

10.2. Vorbereitung ...51

10.3. Durchführung...51

11. Transformation des Ligationsproduktes in XL 1-blue ...52

11.1. Prinzip ...52

11.2. Vorbereitung ...52

11.3. Durchführung...52

12. DNA-Sequenzierung nach Sanger ...53

12.1. Reinigung der PCR-Produkte...53

12.2. Bestimmung der DNA-Sequenz...54

12.3. Auswertung der Sequenzen...55

13. Transformation des Klonierungsproduktes in M15...55

13.1. Vorbereitungen ...55

13.2. Durchführung...56

14. Probe-Expression des Protein VII in M15 (Small-scale Expression)...56

14.3. Durchführung...57

15. Polyacrylamidgele (SDS-PAGE) zur quantitativen Analyse der Expression ...58

15.1. Prinzip ...58

15.2. Vorbereitung ...58

15.3. Durchführung...59

15.4. Coomassie-Blue-Färbung...59

C. Ergebnisse ... 60

1. Klonierung und Subklonierung von Protein VII...60

1.1. Isolierung aus pJM17 durch PCR ...60

1.2. Verdau von pVII und pQE30 mit BamHI und HindIII ...61

1.3. Ligation von pVII und pQE30 ...61

1.4. Transformation des Ligationsproduktes in XL-1BLUE-E.coli-Stämme...62

2. Analyse der Sequenzierung ...63

2.2. Zusammenhang zwischen DNA-Sequenz von Protein VII und Mutation ...64

3. Expressionsversuch...64

3.1. Transformation des Ligationsproduktes in M15 ...65

3.2. Expression des Protein VII...65

3.3. Ergebnis der Expression...66

D. Diskussion ... 67

1. Das adenovirale Vektormodell ...67

2. Probleme des adenoviralen Vektormodells ...68

3. Ein Protein als Transfermolekül für DNA – Modifizierung des adenoviralen Vektormodells ...68

4. Grundlegendes zur Verwendung von Virusproteinen als Transportermoleküle...69

4.1. Ziel dieser Arbeit ...69

4.2. Das Expressionsmodell ...69

4.3. Probleme bei der Proteinexpression...70

5. Vergleich mit anderen Modellen für die Fremdgenexpression...71

5.1. Retrovirale Vektoren ...72

5.2. Adenovirale Vektoren ...72

6. Sicherheit und Ethik...72

E. Zusammenfassung... 74

F. Verzeichnis der Abkürzungen ... 76

G. Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ... 77

A. E

Die vorliegende Arbeit beschreibt die experimentellen Untersuchungen zur Isolierung und Klonierung des Protein VII von Adenovirus Typ 2. Hierbei wurde erstmals versucht, das Protein in kompetenten E. coli Stämmen zu exprimieren. Dieses Protein wird, aufgrund seines hohen Gehaltes an Arginin und Alanin und seiner daraus resultierenden guten Bindungsfähigkeit an DNA, für die künftige Molekularbiologie und so auch für die Medizin von Bedeutung sein. Im Laufe der Klonierung ergaben sich Schwierigkeiten mit der Virus-DNA, die sich in wiederholten Mutationen zeigten.

1. Einführung in die Thematik

Adenoviren sind der häufigste Grund für eine Erkrankung des Menschen und somit verantwortlich für eine ungeheure finanzielle Belastung der Gesellschaft. Hieraus läßt sich erklären, weshalb der Anreiz zur Isolierung des Virus von der Medizin ausging (Rowe et al., 1953; Hilleman und Werner, 1954; Huebner et al.,1954). Als Erreger für Infektionskrankheiten sind sie seit den 50er Jahren bekannt. 1953 wurde die Beobachtung gemacht, daß Zellkulturen aus menschlichen Tonsillen scheinbar spontan lysierten (Rowe et al., 1953). Im folgenden Jahr wurde die Isolation eines ähnlichen Erregers beschrieben, der für fieberhafte Atemwegsinfektionen in einer Kaserne verantwortlich war (Hilleman et al., 1954). 1956 wurde der einheitliche Name „Adenovirus“ für diese Erreger festgelegt (Enders et al., 1956). Adenoviren sind häufig Ursache für fieberhafte Infektionen der Atemwege (Dingle et al., 1968), desweiteren lösen sie auch lokale Infektionen aus, wie die Keratokonjunktivitis epidemica (Jawetz, 1959), Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, wie die Gastroenteritis (Wigand et al., 1983), seltener auch eine akute hämorrhagische Zystitis (Numazaki et al., 1973) oder eine Meningoenzephalitis (Kelsey, 1978). 1962 wurde erstmals entdeckt, daß manche Adenoviren auch eine onkogene Potenz besitzen (Trentin et al., 1962); Adenovirus Typ 2 und 5 hingegen, die als Vektoren für die Gentherapie genutzt werden, besitzen keine Onkogenität (Ali et al., 1994). Seither wurden 41 verschiedene Antigen-Typen gefunden, die sowohl nach ihren physikalischen als auch chemischen Eigenschaften klassifiziert wurden (Matthews, 1982). Eine immunologische Verwandtschaft vereinigt diese Virustypen, die die Säugetiere durch eine kreuzreagierende Antigen-Determinante auf den freien Hexonen infizieren, nämlich das sog. major core protein (Matthews, 1982, Ginsberg, 1979). Der Infektionsweg umschließt eine gut geordnete Serie von Ereignissen, die durch die Verknüpfung eines Adenoviruspartikels mit einer empfänglichen Zelle mit Hilfe seiner Fiberproteine ausgelöst wird und mit einer Ansammlung von nahezu 104 _infektiösen

Virions pro Zelle gipfelt ( entspricht Beobachtungen bei Adenovirus Typ 2 oder 5). Als Folge dieser Infektion können die infizierten Zellen zerstört werden und absterben und so Krankheiten hervorrufen; sie können auch in ihrem Genom verändert werden, so daß sie Tumore induzieren, oder die infizierten Zellen bewirken eine latente

Infektion der Lymphozyten, so wie es bei der ersten Entdeckung der Adenoviren durch Rowe et al., 1953 gezeigt wurde.

2. Gentransfer

2.1. Bedeutung des Gentransfers

Das Verständnis menschlicher Organe war vor Entwicklung moderner biochemischer und molekularbiologischer Methoden in der Grundlagenforschung ein gänzlich anderes: ihnen wurde lediglich eine Reaktionsfähigkeit auf nervale oder hormonelle Signale zugesprochen. Im Gegensatz dazu steht heute ihre Synthese- und Regulationsfähigkeit im Vordergrund. Mit Hilfe der Molekularbiologie gelang die Charakterisierung vieler Gene, die diese Mechanismen steuern. Im gleichen Zuge wurden auch Gene identifiziert, die kausal an Krankheitsprozessen beteiligt sind. Auf dieser Basis ermöglichten es verschiedene molekularbiologische Gentransfer-techniken, unterschiedliche Konzepte zur Analyse und Therapie von Erkrankungen zu entwickeln (von der Leyen et al., 1995).

2.2. Entwicklung des Gentransfers

Das Konzept des Gentransfers und der Gentherapie baut auf den Erkenntnissen der Molekularbiologie, der Biochemie und der Medizin auf (Leiden, 1995; Blau et al., 1995; Haddada et al., 1995).

In den 60er Jahren entdeckte man, daß das Genmaterial der Papovaviren SV 40 und Polyoma während der neoplastischen Umwandlung ihrer Wirtszelle stabil und vererbbar in deren Genom integriert wurde (Sambrook et al., 1968). Hieraus entstand die Idee zur Transformation von Zellen mit Hilfe der Einschleusung von exogenem genetischen Material (Rogers et al., 1968). SV 40 diente dabei als transduzierender Vektor zur Übertragung, zum Einbau und zur Vermehrung von Fremdgenen in Säugetierzellen (Subramani et al., 1983; Jackson et al.,1972). In den 70er Jahren begannen die ersten Versuche von Gentransfer in humane Zellen mit einem therapeutischen Hintergrund, leider ohne Erfolg (Rogers et al., 1973). Erst durch die Entwicklung der Technik der rekombinanten DNA konnten größere Fortschritte erzielt werden; durch sie wurde es möglich, DNA-Sequenzen zu verändern, neu zusammenzusetzen und größere Mengen an DNA, wie sie für den Gentransfer benötigt werden, herzustellen. Grundlegende Voraussetzungen für einen effektiven in vivo Gentransfer waren/sind: klonierte, rekombinante Gene und effiziente Methoden ihrer Übertragung.

Diese Entwicklung im Bereich des Gentransfers und der Technologie der rekombinanten DNA hat zu einer weltweiten experimentellen Anwendung der

Krankheiten mit einer komplexeren Pathogenese, wie zum Beispiel Erkrankungen des kardiovaskulären und hämatopoetischen Systems, hier insbesondere die Leber betreffend, die eine zentrale Rolle bei der Mehrheit der metabolischen Erkrankungen spielt. In folgender Tabelle sind einige mögliche Ziele der Gentherapie zusammengestellt (Strauss, 1994):

Tab. 1: Genetisch bedingte Erkrankungen

Erkrankung Defizientes Genprodukt

Genetisch vererbte Erkrankungen

Familiäre Hypercholesterinämie Low-density-Lipoproteinrezeptor Fettstoffwechselstörungen Apolipoproteine

α1-Antitrypsin-Mangel α1-Antitrypsin

Phenylketonurie Phenylalanin-Hydroxylase Hämophilie A und B Faktor VIII und IX

Lysosomale Speicherkrankheit Verschiedene Ornithin-Transcarbamylase-Mangel OTC

Hereditäre Tyrosinämie Fumaryl-Azetoazetat-Hydroxylase-Mangel Maligne Tumoren

Hepatozelluläres Karzinom Verschiedene

Metastasen Nicht relevant

Infektionskrankheiten

Virus-Hepatitis (A, B, C) Epitope virale Genexpression

Die Methoden sind noch nicht genügend ausgereift, und viele Probleme sind noch zu lösen. Eine Aufgabe der Zukunft wird es sein, die Effektivität des Gentransfers durch bessere Transfersysteme zu steigern, Nebenwirkungen zu reduzieren und die Zielgerichtetheit in das zu therapierende Gewebe zu optimieren.

2.3. Methoden des Gentransfers

Die einfachsten Methoden zum DNA-Transfer sind die Calciumphosphat- und die Diethylaminoethydextran (DEAE-)-Methode, die aber in vivo nur begrenzt einsetzbar und in vitro nur wenig effizient und stabil sind (Sambrook et al., 1989; Felgner et al., 1991. Siehe auch Tabelle 4 ). Dies sind auch die limitierenden Faktoren für eine erfolgreiche Gentherapie. Im allgemeinen haben virale Vektoren die höchste Effizienz und werden deshalb bevorzugt gegenüber physikalischen Methoden verwendet. Unter diesen spielen retrovirale und adenovirale Vektoren eine große Rolle in dem Hepatozyten-gerichteten Gentransfer in vitro und in vivo.

Tab.2: Methoden des Gentransfers

Methode Stabilität Applikation

ex vivo in vivo chemisch Kalzium-Phospat S ++ − physikalisch Mikroinjektion S +++ − Jet-Injektion T ++ + viral Retroviren S +++ + Adenoviren T +++ +++

Die Stabilität der transferierten DNA und ihre Expression wurden als stabil (S), basierend auf ihrer Integration, und vergänglich (T), basierend auf dem Verlust an nicht-integrierter DNA, klassifiziert. −, nicht applizierbar; +, geringe Effizienz oder wenig geeignet; ++, mäßige Effizienz oder gut geeignet; +++, hohe Effizienz oder besonders geeignet (nach Strauss, 1994).

2.3.1. Versuche mit retroviralen Vektoren

Retrovirale Vektoren sind die am besten untersuchten Transportmittel für DNA (Mulligan, 1993; Grossman und Wilson, 1993), woraus sich folgende Schlußfolgerungen ergaben:

1. amphotrope retrovirale Vektoren haben ein breites Wirtsspektrum bezüglich der Spezies und Gewebe,

2. sie können bis zu 7 kb fremder DNA unterbringen,

3. eine Kopie des Virusgenoms wird in das Wirtsgenom integriert ohne Spezifität bezüglich der Zielsequenz und

4. das Virusgenom wird nur in sich replizierende Zellen integriert.

Während die ersten drei Punkte den retroviralen Vektor für eine Gentherapie gebräuchlich erscheinen lassen, begrenzt der vierte Punkt diese Möglichkeit auf sich teilende Zellen, welche man in vivo nur selten findet. Es wurde versucht, Hepatozyten in vitro zu transduzieren und anschließend zu transplantieren (Wilson et al., 1988; Grossman et al., 1991 und 1992; Chowdhury et al., 1991). Hierbei stellte sich heraus, daß nur 2-5 % der Leber durch funktionsfähige transduzierte Hepatozyten ersetzt werden konnte.

Eine Alternative ergab sich mit Hilfe der Hepatektomie, welche eine regenerationsinduzierende Wirkung hat und somit die Zellen zur Teilung anregt. Die

2.3.2. Adenovirale Vektoren

Adenovirale Vektoren haben bezüglich verschiedener Gewebe eine ähnliche Effektivität wie Retroviren, ihr entscheidener Vorteil liegt darin, daß man sie auch in ruhende Zellen transduzieren kann (Stratford-Perricaudet et al., 1990; Levrero et al., 1991). Im Gegensatz zu Retroviren integrieren Adenoviren ihr Genom nicht stabil in das Wirtsgenom, es geht nach einigen Zellteilungszyklen verloren. Adenovirale Vektoren können effizient transferiert werden, sowohl in vitro als auch in vivo (Stratford-Perricaudet et al., 1990; Levrero et al.;1991; Jaffe et al., 1992 und Li et al., 1993), wobei ein Verhältnis von Adenoviren/Zellen von 100/1 bestehen muß. Unter diesen Bedingungen werden über 95 % der Zellen transduziert (Li et al., 1993), die Expressionsrate aber sinkt nach ca. vier Wochen auf 0,5-10 % ab. Durch diese Aspekte werden adenovirale Vektoren interessant für eine Kurztherapie bei akuten Erkrankungen, ein einziges Problem entsteht bei wiederholter Anwendung durch die Bildung von Antikörpern gegen Adenoviren (Ginsberg et al., 1991).

2.4. Das adenovirale Vektorsystem

Zur Konstruktion von adenoviralen Vektoren wird fremde DNA in das Virusgenom eingebaut, nachdem zuvor entsprechende DNA-Sequenzen aus dem viralen Genom entfernt wurden. Dies ist notwendig, da das adenovirale Kapsid max. 105 % des Wildtyp-Genoms aufnehmen kann (Bett et al., 1993). Bei den Vektoren der ersten Generation wurden Sequenzen aus der E1-oder E3-Region ersetzt, es wurden auch kombinierte Deletionen durchgeführt; so konnten bis zu 7,5 kb fremder DNA in das Virusgenom integriert werden. Da die E1-Region des Adenovirusgenoms essentiell ist für die Replikation des Virus in der Wirtszelle (Ali et al., 1994), wurde diese Region vor der Transfektion entfernt, das Virus wurde sozusagen replikationsdefizient für alle Zellen außer 293-Helferzellen, die diese Region ersetzen (Graham et al., 1977). Zur Gewährleistung der Sicherheit bezüglich unkontrollierter Virusreplikationen werden zur Zeit nur Viren eingesetzt, die diese Deletion aufweisen. Die E3-Region beeinflußt die Replikationsfähigkeit des Virus überhaupt nicht, so daß die zu ersetzende DNA an dieser Stelle in das Virusgenom eingebaut werden kann, ohne eine Einschränkung der Replikation in der Wirtszelle zur Folge zu haben (Ali et al., 1994). Da die herkömmlichen adenoviralen Vektoren starke immunologische Reaktionen hervorgerufen haben (Yang et al., 1994), wurden diese dahingehend verändert, daß durch eine zusätzliche Deletion der E2A-Region, die für adenovirale Proteine kodiert, die immunologische Abwehrreaktion verhindert wurde. Diese Deletion verbessert die Persistenz der transferierten DNA und führt zu einer Reduktion der Infiltration des infizierten Gewebes mit zytotoxischen CD8+-T-Zellen, wie man es sonst beobachten würde (Engelhardt et al., 1994). Einige Proteine, für die die E3-Region kodiert, können die immunologische Abwehrmechanismus des Organismus auf infizierte Zellen herabsetzen (Wold et al., 1991), wie z.B. das Protein gp19k (Molekulargewicht: 19 kD), welches den Transport von MHC I (major histocompatibility complex class

I)-Proteinen an die Zelloberfläche verhindert, welche für die Erkennung von infizierten Zellen durch CD8+-T-Zellen notwendig sind (Williams et al., 1990; Cox et al., 1990). Tatsächlich verlängert das Protein gp19k bei einem E1/E3-deletierten adenoviralen Vektors die Persistenz der eingeführten DNA (Lee et al., 1995).

2.5. Neuere Entwicklung des adenoviralen Vektorsystems

Im Laufe der Entwicklung molekularbiologischer Methoden zum Gentransfer stellte sich die Frage nach Vereinfachung des DNA-Transportes und der Möglichkeit, DNA auf natürlichere Art und Weise in die Zellen einzuschleusen. Eine der am meisten erprobten Transfektionsmethode ist die Einbindung von DNA in einen Ca2+ -Phosphat-Komplex (Mandel und Higa, 1970; Graham und van der Eb, 1973).

Ein natürlicher Weg, fremde DNA in den Kern von eukaryoten Zellen einzubringen, ist der während einer DNA-Virus-Infektion. Eine andere Art ergibt sich aus dem Versuch, diesen Infektionsweg zu imitieren, indem man fremde DNA mit einem viralen Kernprotein, das eng an Virus-DNA gebunden ist, koppelt. Dies wurde mit Hilfe von Adenoviren in zahlreichen Studien versucht. Der Kern des Adenovirus besteht (wie im folgenden beschrieben) aus dem Virus-DNA-Molekül – 35.937 bp für Adenovirus Typ 2 (Roberts et al., 1986) – und aus den Proteinen V und VII (Laver et al., 1968; Maizel et al., 1968; Prage et al., 1968; Laver, 1970; Prage et al., 1970; Russel et al., 1971; Brown et al., 1975; Vayda et al., 1983). Der Kern enthält ebenfalls das terminale Virus-Protein, welches kovalent an das 5´-Ende der Virus-DNA gebunden ist (Robinson et al., 1973), und das sehr basische µ-Protein (Hosokawa und

Sung, 1976; Sung et al., 1977). Es konnte gezeigt werden, daß sich Adenovirus-DNA und das Kernprotein VII in Lösung zu Strukturen, die viralem Chromatin ähneln, wiederverbinden (Sato und Hosokawa, 1984). Das Protein VII hat einen hohen Gehalt an Arginin (23 %) und Alanin (18 %) (Prage und Pettersson, 1971; Russel et al., 1971; Sung et al., 1977) und bindet aufgrund seiner eigenen positiven Ladung gut mit den negativen Ladungen von DNA. In den Versuchen wurde die Möglichkeit von Adenovirus-DNA und dem Kernprotein VII, sich zu bestimmten strukturellen Einheiten wieder zusammenzuschließen, genutzt.

3. Molekularbiologischer Aufbau des Adenovirus

Es gibt drei Ebenen, auf denen der strukturelle Aufbau von Adenoviren untersucht werden kann:

• Die Molekülstruktur – zunächst durch die Tertiärstruktur von Makromolekülen. • Die Struktur des Makromoleküls – hauptsächlich die Quartärstruktur, d.h. die

Morphologie von isolierten Makromolekülen, wie Fiberproteine, Spikes.

Die Elektronenmikroskopie betrachtet die Makromoleküle (Fiberproteine, Hexone) und ihre Komplexe (Kapsid, Kern). Die ersten Studien begannen vor mehr als 20 Jahren (Nermut, 1980a). Sie zeigten, daß das Virus die Form eines Ikosaeders (Zwanzigflächners) hat und aus zwei strukturellen Hauptkomplexen besteht: dem Kapsid – einer ikosaedrischen Proteinhülle – und dem Kern – einem inneren Körper, der die Virus-DNA und zwei Major-Proteine einschließt. Die meisten Daten, die von Adenoviren bekannt sind, stammen von Adenovirus Typ 2 und 5 (Ad2 und 5).

3.1. Chemische und physikalische Eigenschaften der Adenoviren

Das Adenovirus enthält 11,6-13,5 % lineare doppelsträngige DNA (dsDNA), der Rest besteht aus Protein (Hitt et al., 1994). Es gibt keine Lipide, und nur 1 % ist glykosyliert (Fasern). Das Molekulargewicht von Säugetier-Adenovirus-DNA beträgt 0,20-0,25 x 108 _{Da [ 36,000 bp], wohingegen Vogel-Adenovirus-DNA ein}

Molekulargewicht von 0,30 x 108 Da besitzt. Die Sedimentationskonstante von Ad5-DNA beträgt 31 S, die von Ad2-Ad5-DNA 32 S (Black und Center, 1979). Die Ad5-DNA ist linear angeordnet und ca. 11-13 µm lang (M. Green et al.,1967a), im Inneren aber

kann eine zirkuläre Form bestehen, vermittelt durch das sog. terminale DNA-Protein (Robinson et al.,1973; Rekosh et al., 1977; Keegstra et al., 1977). Außerdem existieren in dem Virion elf Arten von Polypeptiden mit Molekulargewichten zwischen 3000 (3 K) bis 110 K (Tab. 1) (Philipson et al., 1975; Ginsberg 1979; Flint, 1980; Referenzen: Akusjävi und Persson, 1981). Das Molekulargewicht des gesamten Virions beträgt 1,75-1,85 x 108 Da (M. Green et al., 1967b; Devaux et al., 1983), der Dichtegradient in Cäsiumchlorid (CsCl) 1,33-1,35. Bei der Berechnung der Größe eine Adenovirion muß man die ikosaedrische Form berücksichtigen, da ihr Ausmaß sich von ihren Kanten, d.h. dem Abstand zwischen zwei Pentonen, ableitet. Die Größe wird entweder als Begriff eines Eck-zu-Eck-Abstandes (P= Kante x 1,902), als Kante-zu-Kante-Abstand (E= Kante x 1,618) oder als Durchmesser (D= Kante 1,7) des Viruspartikels in einer fünffachen Symmetrieorientierung angegeben (Mattern, 1969). Für Ad5 ergibt sich elektronenmikroskopisch eine Kantenlänge von 430 Å; daraus ergeben sich folgende Werte: P≈ 820 Å, E= 696 Å und D= 731 Å. Ein Wert von 736 Å

für D ergab sich nach Gefriertrocknen und Verdunkelung (Nermut, 1975). Schließlich wurde die Kantenlänge aufgrund der Daten der Neutronendiffraktion auf einen Wert von 520 Å berechnet. Dies zeigte, daß der Durchmesser D eines vollständig hydrierten Viruspartikels ungefähr 880 Å beträgt (Devaux et al., 1983).

Über eine Bindung der Fiberproteine der Viruskapsel an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche dringt das Adenovirus in die Wirtszelle ein (Defer et al., 1990). Der Eintritt in das Zellinnere erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Verga et al., 1991). Eine Integration der adenoviralen DNA in das Wirtszellgenom ist äußerst selten (Ali et al., 1994), dennoch wies die DNA adenoviraler Vektoren eine langandauernde Stabilität in transfizierten Zellkulturen auf, was mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden konnte (Merklein 1998). Bei der Betrachtung des

Infektionsweges ist es notwendig, Adenoviren mit und ohne onkogenem Potential zu unterscheiden. Die für den Gentransfer eingesetzten Adenoviren des Serotyps 2 und 5 besitzen kein onkogenes Potential. Andere hingegen haben durchaus die Fähigkeit, das Genom der Wirtszelle zu transformieren, hierfür sind vor allem die Adenovirustypen 12, 18 und 31 bekannt (Horwitz 1990). Diese Fähigkeit ist hauptsächlich in der Tatsache begründet, daß diese Adenoviren ihre DNA in das Wirtszellgenom integrieren (Doerfler et al., 1995).

Adenovirus-Infektion

Abb. 1: Schema: Adenovirus-Infektion

Tab. 3: Proteine des Adenovirus1

Nr. _Mol.gew.2 Anzahl d. Kopien/ Virion Name Stellung (Ort) Bemerkungen

II 108.000 720 Hexon Kapsid drei Polypeptide/Hexon

III 85.000 36 (?) Penton-Basis Kapsid, Horizontale

wahrscheinlich drei Po-lypeptide/Penton-Basis

IIIa 66.000 60 (?) ₋

Peripento-nale Region

phosphoryliert

IV 62.000 24 (?) Faser Kapsid,

Ho-rizontale

Nr. Mol.gew.2 Anzahl d. Kopien/ Virion Name Stellung (Ort) Bemerkungen IVa2 50.000 55.000 − (?) 2 − terminales DNA-Protein Kern-gebun-denes 5´-Ende der DNA DNA-gebunden − V 48.000 180 Kern-Protein I

Kernhülle schwach basisch, wenig phosphoryliert, DNA-gebunden VI 23.4000 420 (?) − Hexon-gebunden phosphoryliert, DNA-gebunden VII 18.000 1,070 Kern-Protein II Nukleo-kapsid basisch, DNA-gebunden VIII 13.000 − − Hexon-ge-bunden − IX 11.500 300 − gebunden an 9er-Gruppen − X 7000* 50 − Intern −

XI 4500* 125 ₋ Intern wahrscheinlich ein

Fragment von VII oder identisch mit dem µ

Protein

XII 3000* − − Intern wahrscheinlich ein

Fragment von VIII

3.2. Das Virusgenom

Das adenovirale Genom läßt sich funktionell in eine frühe (E1-E4) und eine späte Transkriptionsregion (L1-L5) unterteilen (Haddada et al., 1995). Die E1-Region wird sofort nach Eintritt des viralen Genoms in den Kern der Wirtszelle aktiv; sie kodiert für Regulatorproteine, die in der frühen Infektionsperiode benötigt werden (Grand, 1987). Die Proteine für die Virusreplikation, wie z.B. die DNA-Polymerase, sind in der E2-Region kodiert. Die E3-Region kodiert für Proteine, die der Herabsetzung der Wirtszellreaktion auf die Infektion dienen und die Viruselimination verlangsamen. Die E4-Region beinhaltet Gene für Proteine, die der bevorzugten Expression von viralen Genen zum Nachteil der Wirtszellgene dienen. Die späten Transkriptionsregionen kodieren für Polypeptide, die die Viruskapsel aufbauen (Horwitz, 1990).

4. Das Virus-Kapsid: Gliederung und Zusammensetzung

240 Hexone und 12 Pentone, die jeweils aus der Penton-Basis und einer Faser bestehen, bilden die ikosaedrische Proteinhülle des Adenovirus (Valentine und Pereira, 1965). Eine Besonderheit dieses Kapsid besteht darin, daß es nicht unter bestimmter Behandlung in die dreieckigen Facetten zerfällt (siehe Abb.2) – wie es zu erwarten wäre -,sondern in 9er-Gruppen von Hexonen, die entweder an Pentone gebunden (sog. peripentonale Hexone) oder frei sind. Elektronenmikroskopisch imponieren diese 9er-Gruppen auf zwei Arten: entweder linkshändig (LH) oder rechtshändig (RH), entsprechend der Definition von Pereira und Wrigley (1974).

Abb.4: Modell der Kernhülle,

bestehend aus 240 ringförmigen wahrscheinlich pseudosechs-eckigen Proteinmolekülen. Die Vertikalen sind von den Kapsid-Pentonen oder einem anderen

Abb. 2: Aufbau einer triangulären Facette

des Kapsids. P Pentone; Dreiecke – Spitzen der Hexone; Sechsecke – Seiten der Hexone. Aus: Nermut und Perkins (1979).

Abb. 3: Gefriertrocknung eines Avian

-Adenovirus. Die Pfeile bezeichnen die dreieckige Form einiger Hexone. Aus: Hayat 1977.

4.1. Das Hexon

Das Hexon ist ein Kapsomer und somit Hauptbestandteil der Proteinhüllenoberfläche. Die Aufgabe der Hexone besteht darin, gelöste Substanzen oder größere Moleküle, wie z.B. Enzyme, entlang des Kapsids zu transportieren; desweiteren spielen sie eine Rolle für das Virus bezüglich seiner Interaktionen mit der Umwelt und den zellulären Membranen. Ein Hexon besteht aus drei identischen Polypeptiden (Grütter und Franklin, 1974) und besitzt ein Molekulargewicht von 360 K. Die Basis ist rund und hat eine axiale Öffnung (25-30 Å); der Diameter beträgt 75-80 Å. Die Mitte erscheint hexagonal mit einem Durchmesser von 105 Å. Die Spitze ist dreieckig mit einem Y-förmigen Spalt, die Länge zwischen den Ecken und Kanten beträgt 95 Å. Sie ist in bezug auf die Mitte um 30 ° rotiert. Das Hexon hat eine Gesamthöhe von 105-110 Å.

Abb. 5: Adenovirus-Kapsomere nach

Negativfärbung. a) Hexone in verschiedener Ausrichtung, sowohl einzeln als auch in „Neuner-Gruppen“. b) links- (L) und rechtsdrehende (R) Neuner-Gruppen. Aus Nermut 1980a. c) Ad5-Pentone. d) Pentone mit zwei Fibern eines Avian-Adenovirus; die längere Fiber ist oft stark gebogen. Von Dr. N. G. Wrigley.

Es besteht weiterhin eine Polarität innerhalb des Hexons: die Spitze ist hydrophil und vorwiegend negativ geladen, wohingegen die Basis hydrophobe Eigenschaften aufweist (Nermut und Perkins, 1979). Die hydrophobe Seite interagiert mit der Kernoberfläche, welche hauptsächlich durch das Polypeptid V gebildet wird, außerdem bestimmt sie die Gruppenspezifität (Norrby, 1969). Die hydrophile Seite des Hexons trägt die Typ-spezifischen Antigeneigenschaften. Die Masse der Hexone pro Virion wurde als 0,778 x 108 _{Da berechnet, was ungefähr 46 % der Gesamtmasse eines}

Virions entspricht (Devaux et al.,1982).

4.2. Das Penton

Die Kapsomere der Vertikalen des Ikosaeders werden als Pentone bezeichnet, da sie von fünf (peripentonalen) Hexonen umgeben sind (Ginsberg et al.,1966). Es wird aus einer Penton-Basis und einem dünnen, antenngleichen Anhängsel, der sog. Faser, gebildet.

Abb. 6: H e x o n - M o d e l l, entwickelt aus elektronenmikro-skopischen Abbildungen und computergestützter Modelierung (Nermut und Perkins, 1979). a) dreieckige Spitze, b) runde Grundpartie mit der axialen Öffnung, c) die Seitenansicht und d) die Übersicht. Die pseudohexa-gonale Form ist hauptsäch-lich durch die dritte Lage von unten bedingt.

Abb. 7: Diagramm einer Fiber des Ad2. Die Dimensionen werden in Ångström angegeben.

(aus Nermut 1984).

Über das Molekulargewicht herrscht noch einige Ungewissheit: Das Molekulargewicht der Basis wurde mit 245 K berechnet, was hieße , daß es sich um ein Trimer handelte, das Gesamtgewicht mit 365 K. Das bedeutete, daß das Molekulargewicht der Faser 120 K betragen müßte, sie könnte also ein Dimer sein. Messungen mittels der Neutronenstreuung haben aber ein Gewicht von 160 K ermittelt (Devaux et al., 1982), was eher für einen trimeren Aufbau spricht. Einige elektronenmikroskopische Aufnah-men zeigten einen pentagonalen Aufbau der Penton-Basis (Pettersson und Höglund, 1969; Boudin et al., 1979), der Aufbau aus den drei Untereinheiten konnte aber noch nicht geklärt werden. Die Veröffentlichung der DNA-Sequenz half dabei, das Molekulargewicht der Faser zu berechnen (62,294). Anhand dieser Sequenz wurde ein Model der Faser konstruiert, woraus ersichtlich wird, daß der Schaft aus zwei Polypeptidketten in gekreuzter β-Konfiguration besteht; die hydrophobe Grundflächen

sind einander entgegengesetzt angeordnet (Earnshaw et al., 1979; Green et al., 1983).

4.3. Weitere mit dem Kapsid verbundene Proteine

Das Virus-Polypeptid (VP) IIIa, verbunden mit dem Scheitelpunkt des Kapsids, hat die Funktion eines Mediators zwischen der Penton-Basis – angenommen, daß es sich um ein Trimer handelt – und den fünf peripentonalen Hexonen inne (Everitt et al.,1975; Devaux et al.,1982). VP IIIa liegt in fünf Kopien pro Scheitelpunkt vor (Boudin et al.,1980). Desweiteren hat man herausgefunden, daß VP IVa₂, V, VI und VII an DNA gebunden sind (Russell und Precious, 1982), wobei die Aufgabe von IVa₂ im Kern noch unbekannt ist. Protein VI ist an das Hexon gebunden und löst sich von dem Viruskern unter der Behandlung mit Pyridin oder Desoxycholat (DOC) im Rahmen einer Gradientenzentrifugation (Everitt et al., 1973; Nermut, 1979). Das Polypeptid IX ist an die 9er-Gruppen gebunden, wahrscheinlich in einem Verhältnis von 15 Kopien pro 9er-Gruppe (Boulanger et al., 1979; Pereira und Wrigley, 1974; Colby und Shenk, 1981).

4.4. Der Aufbau des Kapsids

Die Anordnung des Adenoviruskapsids richtet sich nach den Erfordernissen der 5-, 3-, 2-Faltsymmetrie und der Forderung nach der größtmöglichen Anzahl von Bindungen, d.h. einem Minimum an freier Energie, zwischen den Kapsomeren. Das Kapsid gehört zur P-1-Klasse, mit einer Triangulationszahl T= 25. Die dreieckigen Spitzen der Hexone im Inneren einer 9er-Gruppe haben einen konstanten Scheitelkreis von 60 ° nahe der Kante der Dreicksfacette, was erklären könnte, warum das Kapsid bevorzugt in 9er-Gruppen zerfällt und nicht in Dreiecke oder wahllose Teile. Die Wechselwirkungen im Innern der 9er-Gruppen sind stärker als zwischen zwei benachbarten (Nermut und Perkins, 1979); eine alternative Erklärung dafür wäre die Existenz eines Verbindungsproteins innerhalb der 9er-Gruppen (Boulanger e t al.,1979). Die Ausrichtung der peripentonalen Hexone und ihr Zusammenspiel mit den Pentonen ist nur eine Annahme. Es kann sich auch um elektrostatische Anziehungen zwischen Hexonen und Pentonen handeln. Die Folgerungen aus dem Modell von Struktur und Funktion des Virus-Kapsids lauten also:

1) Das Kapsid ist stabil genug, um auch ohne Inhalt, d.h. den Kern, zu existieren (Pereira und Wrigley, 1974; Philipson 1979).

Abb. 8: Adenoviruskerne –

verschiedene Arten der Präparation. a) Gefriertrocknung mit Negativ-färbung; die Kerne liegen hier nahe an den Kapsiden. b) 0,5 % DOC bei 56°C, Negativfärbung mit Ammonium-Molybdat; die Ober-fläche ist bedeckt von ringförmigen Untereinheiten. Aus Nermut 1984.

Virusinnere ermöglicht wird. Das Kapsid wirkt also als Permeabilitätsbarriere, wahrscheinlich zusammen mit der darunterliegenden Kernhülle.

5. Der Viruskern

Abgesehen von dem ikosaedrischen Kapsid werden die Virusbestandteile als Kern bezeichnet; diese Bezeichnung ist seit 1968 allgemein gebräuchlich (Laver et al., 1968; Russel et al., 1971), aber die Definitionen und Vorstellungen über die Struktur dieser Kerne ist uneinheitlich. Die biochemische Definition (z.B. Mirza und Weber, 1977) besagt, daß der Kern aus Virus-DNA und zwei Kern-Proteinen (Protein V und VII) besteht. Sie sagt aber nichts über die Beschaffenheit des Komplexes aus, ob er von Natur aus gegliedert ist oder nicht. Die morphologische Definition beschreibt den Kern als einen dichten, wahrscheinlich ikosaedrisch geformten Körper, der aus einer oberflächlichen Proteinhülle und dem inneren DNA-Protein-Komplex, dem eigentlichen Nukleokapsid, besteht.3 Trotzdem herrscht noch viel Unklarheit über den Aufbau und die Funktion der zwei Hauptproteine V und VII (siehe auch Everitt et al., 1973; Mirza und Weber, 1982; Nermut, 1979).

5.1. Der Beweis für die Existenz einer Kernhülle

Mit Hilfe der Gefrierschnitt-Technik gefolgt von einer Negativfärbung konnten Einzelheiten der Kernoberfläche sichtbar gemacht (siehe Abb.9) (Brown et al., 1975; Nermut, 1975 und 1978), und so gezeigt werden, daß der Kern eine oberflächliche Hülle besitzt. Die Frage, die sich nun ergab, war die, welches der beiden Kernproteine diese Hülle bildet. Da sich gezeigt hatte, daß das Protein VII eng mit der Virus-DNA verbunden ist, blieb nur die Schlußfolgerung, daß das Protein V die Hülle bilden muß. Dieses Polypeptid hat ein Molekulargewicht von 48 K und liegt in 180 Kopien pro Virion vor (Everitt et al., 1973). Aufnahmen des Kerns mit einer hohen Auflösung zeigten ein ringförmiges Molekül von 50-80 Å im Durchmesser und einem Molekulargewicht zwischen 45 und 60 K (Nermut, 1980a). Bedingt durch die Nähe von Kern und Kapsid muß die Hülle wie ein Ikosaeder geformt sein mit einem T= 25, aber aus kleineren Proteinmolekülen als das Hexon. Die Scheitelpunkte der Hülle scheinen durch die Penton-Basis gut verschlossen zu sein. Dies zeigte die Entfernung der Basis durch Dialyse; hierdurch wurde die Hülle, und somit das Virion, durchlässig für Nukleasen, so daß sie in das Virusinnere gelangen konnten. Das alles erlaubte die Annahme, daß die Kernhülle zum einen das Virusgenom schützt, zum anderen zusammen mit dem Kapsid den Transport von Wasser und Salzen in das Innere und auch nach außen reguliert.

3

5.2. Der Aufbau des DNA-Protein-Komplexes (Nukleokapsid)

Verschiedene Methoden (siehe Ginsberg, 1979) haben gezeigt, daß dieser Komplex aus dem Protein VII und der an dieses gebundenen DNA besteht. Das Protein besteht zu ca. 22 % aus Arginin, was die negative Ladung der DNA vollkommen neutralisiert (Laver, 1970). Der exakte Aufbau dieses Komplexes wurde mit Hilfe der Elektronenmikroskopie und verschiedener biochemischer Versuche analysiert.

5.2.1. Elektronenmikroskopische Beobachtungen des Viruskerns

Es wurde beobachtet, daß die verschiedenen Untersuchungsmethoden zu verschiedenen Graden der Entspannung oder sogar zum Zerfall der DNA führen; oftmals wirkte dann die DNA wie „Spinnen“: der dichte Kern war mit Schleifen von DNA umgeben (Brown et al.,1975; Nermut et al., 1975). Unter Behandlung mit DOC (z.B. 0,4 % DOC bei 56 °C für 40 sek) konnte die DNA kontrolliert relaxiert und mittels der Elektronenmikroskopie betrachtet werden. Bei einer höheren Konzentration von Ethylenglykol-bis-(β-amino-ethyl-ether) N,N´-tetraessigsaurer Säure (EGTA), pH

7,5 , kam es zu einer Bandbildung des Kerns, oft mit einem perlschnurartigen Aussehen, mit einer Länge von ungefähr 100 Å (Nermut, 1979). Bei der Behandlung mit hohen Salzkonzentrationen (0,5-2,0 M NaCl) oder hohen pH-Werten (z.B. 10) kam es zu ähnlichen Erscheinungen; darüber hinaus sah man auch anstelle der Bänder stäbchenförmige Elemente mit einer Dicke von ca. 150 Å und einer Länge bis zu 100 Å. Die Begründung für dieses Verhalten der DNA in beiden Fällen liegt wohl in dem Entzug von Calcium, welches Brücken zwischen den DNA-Phosphatresten bildet und so die stäbchenförmigen Elemente in dem natürlichen Kern zusammenhält. Wird dieses Calcium nun entfernt, so trennen die Abstoßungskräfte die „Stäbchen“ voneinander und machen sie sichtbar.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß hohe Salzkonzentrationen zu einer proteinfreien DNA führen, da es wahrscheinlich zu einem Zusammenbruch der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen DNA und Protein VII kommt.

5.2.2. Biochemische Versuche mit „relaxierten“ Kernen

Mit [3_{H]-Arginin markierte Virusbestandteile (Vayda et al., 1983) bestätigten, daß mit}

Pyridin vorbehandelte Kerne Protein V, VII und µ enthalten, wie es schon von

Hokosawa und Sung 1976 beschrieben wurde. Aber dennoch wurde nur Protein VII in den Kernen, die ,mit hochkonzenrierten Salzlösungen behandelt wurden, gefunden. Durch UV-Bestrahlung wurde versucht, die Virus-DNA mit dem assoziierten Protein zu verbinden. Man fand heraus, daß nur das Protein VII einen Komplex mit der DNA bildet, und beide Monomere und Dimere des Protein VII konnten auf einem SDS-Gel nachgewiesen werden (Sato und Hokosawa, 1981). Die Dimere wurden ebenfalls nach

Nermut, 1979; Boulanger und Loucheux-Lefevbre, 1982). Die Ergebnisse zeigten, daß die DNA-Zusammensetzung durch die Kraft ihrer Wechselwirkungen mit den Kernproteinen verändert werden kann, und daß der DNA-Protein-Komplex eine geordnete Struktur bildet (Cowman und Fasman, 1978).

5.3. Das Versuchsmodell des Adenovirus-Nukleokapsids

Das Hauptproblem der Viruszusammensetzung bestand in der Frage, wie das verhältnismäßig große DNA-Molekül in dem zur Verfügung stehenden Raum konfiguriert sein konnte. Denn jede dichte Verpackung von DNA-Molekülen erfordert die Überwindung zweier spezifischer Eigenschaften der DNA: zum einen die Steifheit von DNA, die sich in Lösung wie ein starrer Stab von 625 Å Länge verhält (Hays et al., 1969). Zum anderen die starke negative Ladung der Phosphatgruppen an der Oberfläche der DNA. Daraus folgt, daß die DNA mit der höchstmöglichen Verdichtung gegliedert sein muß. Dies kann nur durch eine helikale Windung der DNA um einen Proteinkern mit einem minimalen Durchmesser von 80 Å verwirklicht werden. Energieberechnungen zeigten, daß DNA, ohne zu knicken (nonkinking), bis zu einem Krümmungsradius von 40-50 Å gebeugt werden kann (Finch et al., 1977; Sussman und Trifonov, 1978). Die zu einer Helix gebogene DNA benötigt Energie, um diese Form halten zu können. Es wurde vermutet, daß die Energie der elektrostatischen Bindung zwischen einem basischen Protein wie Protein VII und den DNA-Phosphatgruppen diesen Sachverhalt erfüllt. Wenn dem so wäre, wäre die DNA um einen Proteinkern gewunden, der entweder die Form einer Helix oder einer oligomeren Einheit hätte. Die noch vorhandenen oberflächlichen Phosphatreste könnten entweder durch Kationen oder – für den Fall eines engen physikalischen Kontaktes – durch Überbrückung von divalenten Kationen oder Polyaminen neutralisiert werden. Der Aufbau des Proteinkerns hängt von den Eigenschaften des DNA-gebundenen Proteins ab. Schon vor mehr als 40 Jahren wurde gezeigt (Crane, 1950), daß eine lineare Struktur durch identische, asymmetrische Einheiten, die miteinander auf eine identische Art und Weise interagieren, einen helikalen Aufbau haben. Existieren zwei oder mehr Proteine, werden diese identischen Untereinheiten wie die „Perlen auf einer Kette“ oder als eine superhelikale Struktur, wenn es weiter verdichtet würde, angeordnet. Für das Modell des Adenovirus-Nukleokapsids lagen folgende Daten vor: Die DNA hat eine Länge von 11-12 µm, was 34.000-36.000 bp

entspricht. Das Protein VII liegt in ca. 1100 Kopien vor. Eventuell sind noch andere Proteine (z.B. µ, X oder andere mit niedrigem Molekulargewicht) beteiligt. Der

Verdau der DNA mit einer Nuklease aus Staphylococcus aureus legt nahe, daß ein 150 bp langes sich wiederholendes DNA-Fragment existiert. Der Kern beinhaltet eine lineare Struktur von fast 150 Å im Durchmesser und einer Länge bis zu 0,3 µm

(Nermut, 1979). DNA-Filamente mit sog. „Perlen“ wurden nach Pyridin-Behandlung beobachtet (Mirza und Weber, 1982; Vayda et al., 1983). Sechs stäbchenförmige Elemente mit einer Dicke von 150 Å und einer Länge von 400-500 Å füllen das

Innere des ikosaedrischen Raumes des Virions aus. Das Volumen dieses Raumes beträgt 71.000 nm3 (basierend auf einer inneren Kantenlänge von 320 Å). Das Volumen einer sphärischen Perle beträgt bei einem Durchmesser von 90 Å 380 nm3_.

Es existieren prinzipiell zwei Möglichkeiten, wie der DNA-Protein-Komplex des Adenovirus aufgebaut sein könnte:

a) als kontinuierliche Helix oder

b) als diskontinuierliche Helix.

Der entscheidende Faktor ist hier der Proteinbestandteil. Gäbe es nur ein DNA-assoziiertes Protein, müßte der Komplex wie eine kontinuierliche Helix konfiguriert sein. Existierte noch ein anderes Protein, würde der kontinuierliche Aufbau unterbrochen werden, es würden sich wiederholende Untereinheiten bilden und die DNA-Superhelix wäre diskontinuierlich. Im folgenden sollen beide Modelle besprochen werden, obwohl heutzutage mehr Beweise für das Nukleosomen-Modell vorliegen (siehe Kap. 4.3.2.).

5.3.1. Das Modell der kontinuierlichen Helix

Dieses Modell geht – wie oben erwähnt – von der Existenz nur eines DNA-assoziierten Proteins aus, nämlich des Protein VII. Wie bereits erläutert wurde (Nermut, 1980a), würde dieses Protein ein lineares Filament als „Kern“ der DNA bilden, die darum herum spiralig gewunden wäre (siehe Abb. 9a+b). Dieses Filament wäre 80-90 Å dick und würde bei einer Länge von 1µm 1134 Kopien des Protein VII

und 11,5 µm DNA (= 36.000 bp) enthalten. Solche Filamente wurden beobachtet

(Nermut, 1980a); sie könnten superhelikale Strukturen bilden – die Stäbchen (Abb. 9c+d). Die eng gepackten DNA-Protein-Filamente würden durch Kalziumbrücken zwischen zwei gegenüberliegenden Phosphatgruppen zusammengehalten. Eine Windung der DNA umschlösse 86 bp (= 280 Å) und diese Form wäre verantwortlich für das Fehlen der typischen Nukleosomenmuster bei „eingekapselten“ Nukleokapsiden (Tate und Philipson, 1979; Brown und Weber, 1980; Mirza und Weber, 1982). Ein Proteinmolekül würde ca. 20 bp schützen, zwei Proteine bis zu 50 bp, wenn man relaxierte Kerne gefunden hat (Nermut, 1980b).

Abb. 9: Modell der kontinuierlichen Helix: Aufbau des DNA-Protein-Komplexes. a)

Helikaler Kern des VP VII-Moleküls. b) Aufsicht auf den Proteinkern mit der peripheren DNA. c) Superhelikaler Aufbau des DNA-Protein-Filamentes in stäbchenförmigen Elementen. d) Aufsicht von c). Aus: Nermut 1980a.

5.3.2. Das Nukleosomen-Modell

Es gibt zwei Argumente, die für dieses Modell sprechen:

1. Die Entdeckung von Schutzfaktoren nach Behandlung mit Staphylokokken-Nuklease (zuerst beschrieben von Corden et al., 1976, und schließlich von Mirza und Weber, 1982)

und

2. die Entdeckung der „Perlschnur“ in Kernisolierungen nach verschiedenen Behandlungen (Nermut, 1979; Mirza und Weber, 1982; Vayda et al., 1983). Für den Zweck dieses Modells, wurde angenommen, daß das geschützte DNA-Fragment ca. 150 bp lang ist, und daß sechs Kopie von Protein VII in einer Perle enthalten sind (Corden et al., 1976; Sato und Hosokawa, 1981; Mirza und Weber, 1982; Vayda et al., 1983). In diesem Fall hätte die nukleosomartige Perle eine Höhe von 50 Å und 80-90 Å im Durchmesser. Eine DNA-Windung wäre ca. 280 Å lang (d.h. 82 bp) und die Höhe einer solchen DNA-Helix betrüge ca. 25 Å. Bei einem linearen Aufbau (siehe Abb. 10) würden zwei vollständige Windungen der DNA eine

Perle umgeben, ein DNA-Stück mit einer Länge von 100 Å (= 30 bp) könnte zwei Perlen miteinander verbinden. Bei einem superhelikalen, magnetspulartigen Aufbau (siehe Abb. 11) würden nur 1,8 Windungen der DNA (= 148 bp und 504 Å) mit dem Proteinkern in Verbindung stehen, die Verbindungs-DNA wäre 20 bp lang. Mehrerer solcher Knäuel von Superhelices würden eine lineare Struktur mit einer Dicke von 150 Å bilden. Hier ergeben sich zwei Probleme: zum einen – wenn man eine Höhe der einzelnen Windung von 25 Å annimmt und fünf Perlen eine superhelikale Windung bilden – könnte es nur zwei Windungen und zehn Perlen pro 500 Å-Länge eines Stäbchens geben (bei 60 Perlen pro Kern). Zum anderen gäbe es viel Raum zwischen der ersten und der fünften Perle. Diese Probleme könnten gelöst werden, wenn man annähme, daß die perlschnurartigen Filamente eine antiparallele Helix bilden, wobei die Rille mit der aufsteigenden Superhelix gefüllt wird (siehe Abb.12). In diesem Falle würde sich die Zahl der Perlen verdoppeln, und wenn man die Verbindungsstücke mitzählte, käme man auf ca. 150 Perlen pro Virion. Dieses Modell ist für die Berechnungen der DNA-Länge und der Zahl der Proteinkopien pro Virion maßgebend gewesen. Mehrere Autorengruppen berechneten die Anzahl der Perlen anhand der Länge der DNA und der Länge der Nuleosom-DNA-Fragmente, so z.B. Mirza und Weber (1982): sie fanden heraus, daß es 200 Perlen pro Virion geben müßte, um 36.000 bp DNA unterbringen zu können. Aber schon 187 Perlen würden den zur Ver-fügung stehenden Raum des Kerninnern vollständig ausfüllen, vorausgesetzt, daß die 90 Å-Perlen möglichst dicht beieinander liegen. Daraus folgte, daß die Anzahl der Perlen unter 200 liegen mußte, man könnte sie auf 150-180 schätzen, abhängig von ihrer Größe (siehe Tabelle 4). Diese wurde in den Berechnungen mit 90 Å im Durchmesser und 50 Å in der Höhe angenommen, was ungefähr in der Größenordnung von Nukleosomen tierischen Chromatins liegt; so ergaben es elektronenmikroskopische Aufnahmen und solche mittels Röntgen-Kristallographie (Richmond et al., 1981). So ergab sich, daß ein Oktamer von vier Histon-Molekülen den Proteinkern bilden, und das H₁-Histon, welches zwischen den Nukleosomen liegt, hat die Funktion eines „Organisators“ (Vayda et al., 1983). Dieses Modell wurde durch die Ergebnisse der Elektronenmikroskopie unterstützt; trotzdem sind noch viele Fragen offen. Eines bleibt allerdings gewiß: der Adenovirus Nukleokapsid – der DNA-Protein(e)-Komplex hat eine helikale Struktur, was mittels der Röntgen-Diffraktigraphie bestätigt wurde (Devaux et al., 1983).

Tab. 4: Der DNA- und Proteingehalt pro Adenovirion, berechnet für 150 und 180

nukleosomartige Perlen (Nermut 1984) Perlen/ Virion Basenpaare/ Perle + Abstands-DNA Gesamtlänge der DNA bp µm VII-Ko-pien/ Virion

Länge der perlförmigen Filamente4 CTC= 90 Å CTC= 100 Å 150 170 180 25.500 27.000 8,7 9,2 900 900 1,35 µm 1,5 µm 80 170 180 30.600 32.400 10,5 12 1080 1080 1,6 µm 1,8 µm

Abb. 10: Diagrammförmige Darstellung des DNA-Verlaufes in dem „Nukleosomen-Modell“.

In diesem linearen Arrangement verläuft die DNA in zwei Windungen um die Perlen herum; die Verbindungs-DNA wäre 26 bis 30 bp lang. Aus Nermut 1984.

Abb. 11a + b: Superhelikaler Aufbau der Nukleosomen; es wird eine helikale Windung

gezeigt, hier interagieren 1.8 Windungen der DNA mit sechs Kopien des VP VII, der Zwischenraum wird von ca. 20 bp geformt.

Abb. 12: Modell eines stäbchenförmigen Elementes, gebildet aus zwei antiparallelen Helices

der Nukleosome. Die weißen Kugeln repräsentierren eine aufsteigende Helix, die schwarzen eine absteigende. Der Pfeil bezeichnet die Stelle, an der sie sich treffen. Aus Nermut 1984.

6. Das Körpermodell des Adenovirus

In diesem Modell sind nur die bekannten Strukturen beinhaltet, wie das Kapsid, die Kernhülle und der Nukleoprotein-Komplex. So faßt dieses Modell die letzten Jahrzehnte der Adenovirusforschung zusammen: die ikosaedrische Form und die Existenz von zwei verschiedenen Kapsomeren wurde schon sehr früh erkannt (Horne, 1962; Valentine und Pereira, 1965), die genaueren Einzelheiten des Hexons und des Viruskerns erst durch die computervermittelte Elektronenmikroskopie, die Röntgen-Kristallographie, die Neutronendiffraktion, Gefriertechniken und die Fortschritte in der Biochemie. Dieses Modell gewährt einen Einblick entlang der doppelten Symmetrieachse (siehe Abb. 13a) mit einem Ausschnitt des Inneren des Adenovirion (siehe Abb. 13b). Man erkennt. daß die 9er-Gruppe von Hexonen auf der linken und

Abb 12 Abb 11

Kanten-Kontakt. Betrachtet man das Innere des Modells, sieht man den inneren Nukleoprotein-Komplex in der Form eines Stäbchens, bedingt durch das als Superhelix konfigurierte DNA-Protein-Filament.

Abb. 13 a+b: Maßstabsgerechtes Modell des Adenovirion. a) Sicht entlang der doppelten

Symmetrieachse; 9er Gruppen treffen an der Ecke zusammen, im Kapsid befinden sich diese 9er Gruppen in linksdrehender Orientierung. b) Offene Sicht auf die Kernhülle unterhalb des Kapsids und drei der superhelikal angeordneten Stäbchen des eigentlichen Nukleokapsids. (C) Kapsid, (CS) Kernhülle, (NP) DNA-Protein-Komplex. Aus Nermut 1984.

7. Vektoren

Es werden bestimmte Voraussetzungen von einem DNA-Molekül verlangt, daß als Klonierungsvektor dienen soll: die wichtigste davon ist seine Replikationsfähigkeit, damit viele Kopien des DNA-Moleküls an die Tochterzellen des Wirtsorganismus weitergegeben werden können. Desweiteren ist die Größe von besonderer Wichtigkeit: relativ kleine Moleküle sind bezüglich ihrer Präparation einfacher zu handhaben, im Idealfall liegt ihre Größe unter zehn Kilobasen (kb). Außerdem sollte ein Vektor über wenigstens eine nur einmal vorkommende Restriktionsschnittstelle verfügen, um für die Herstellung von Rekombinanten fremde DNA einfügen zu können. Ein selektierbarer Marker wie z.B. eine Antibiotikaresistenz erleichtert die Identifizierung der rekombinanten Klone. In Bakterienzellen wurden zwei DNA-Moleküle entdeckt, die diesen Anforderungen genügen: Plasmide und Bakteriophagen.

7.1. Plasmide

Bei Plasmiden handelt es sich um ringförmige extrachromosomale DNA-Moleküle, die zumeist für Antibiotikaresistenzen kodieren. Sie enthalten außerdem einen

Replikationsstartpunkt (origin of replication, ori), der es ihnen ermöglicht, sich unabhängig von dem Bakterienchromosom vermehren zu können. Sie kommen in Größen zwischen 1 und 250 kb vor, ihre Kopienzahl, d.h. die Zahl an Plasmiden, die sich normalerweise in einer Bakterienzelle findet, schwankt zwischen eins und 50 und mehr: für die Klonierung ist also ein Plasmid ideal, das bis zu 10 kb groß ist und eine Kopienzahl von mindestens 50 hat. Um dies zu erreichen bzw. sie den verschiedenen Erfordernissen anzupassen, mußten die natürlich vorkommenden Plasmide verändert werden.

7.2. Bakteriophagen

Bei den Bakteriophagen ( kurz: Phagen) handelt es sich um Viren, die sich nur mit Hilfe von Bakterien vermehren können, d.h. spezifisch Bakterien infizieren. Sie bestehen zumeist aus einem DNA-Molekül und einer Schutzhülle aus Protein, dem Kapsid. Man unterscheidet Phagen mit Kopf und Schwanz, ohne Schwanz und filamentöse Phagen. Für die Molekularbiologie sind sie deshalb von Interesse, da die meisten lebenden Organismen von Viren infiziert werden und so die Möglichkeit gegeben ist, Viren als Klonierungsvektoren für höhere Organismen einzusetzen.

7.3. pJM17-Aufbau

Bei pJM17 handelt es sich um ein von McGrory et al. konstruiertes Plasmid, welches die gesamte DNA von Adenovirus Typ 5 enthält, mit einem Insert in der E1 Region, das die Verpackungszwänge(?) des Adenoviruskapsids übersteigt.

Abb. 14: Schnittstellenkarte des pJM17

7.4. pQE30-Aufbau

Die von der Firma Qiagen bereitgestellten pQE-Vektoren gehören zu den pDS-Plasmiden (Bujard et al., 1987). Sie wurden aus den pDS-Plasmiden pDS56/RBSII und pDS871/RBSII-DHFRS entwickelt (Stüber et al., 1990), haben eine Größe von ca. 3500 bp und enthalten folgende Elemente:

• A: Ein optimiertes, regulierbares Promotor-/Operator-Element, bestehend aus dem

T5-Promotor des E.coli Phagen und zwei lac-Operator-Sequenzen, welches durch den lac I-Repressor unterdrückt und durch Zugabe von IPTG induziert wird (Bujard et al., 1987).

• B: Eine synthetische Ribosomen-Bindungsstelle (RBSII), für eine optimale

mRNA-Erkennung und –Bindung.

• 6 x His: Eine optimierte Kodierungssequenz für das 6xHis-Affinitäts-Ende. • Eine mehrfache Klonierungsstelle (Polylinker).

• Ein Translations-Stop-Codon in allen Leserahmen.

• C: Den Transkriptions-Terminator 't0' des λ-Phagen (Schwarz et al., 1987).

• D: Eine Promotor-freies Gen für die Chloramphenicol-Acetyltransferase mit

• E: Den Transkriptions-Terminator T1 des E.coli-rrnB-Operons (Brosius et al.,

1981).

• Die Replikations-Region und das Gen für die β-Lactamase des Plasmids pBR322

(Sutcliffe, 1979).

Der in diesen Experimenten benutzte Vektor pQE30 trägt sein 6xHistidin-Affinitätsschwanz am 5'-Ende der multiplen Klonierungsstelle (Abb. 16a und b –Vektor-Schema). Der zu verwendende Vektor muß nur mit den dazu notwendigen Restriktionsendonukleasen verdaut werden, die lineare Form isoliert und die Kodierungsregion mit dem pQE-Vektor im Leserahmen ligiert werden.

Abb. 15: Aufbau und Schnittstellen des Vektors pQE30. Aus The QIAexpressionist 1992.

8. Konstruktaufbau pVII-pQE30

Für diese Verbindung – im Handbuch der Firma Qiagen auch Typ IV-Konstrukt genannt – muß der benötigte Vektor nur mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut, die lineare Form isoliert und die zu kodierende Region in Leserichtung ligiert werden. Zu diesem Zweck befindet sich das 6 x Histidin-Ende am 5'-Ende der multiplen Klonierungsstelle.

8.1. Aufbau

In der folgenden Tabelle wird das Vektorkonstrukt pQE30 mit der Insertionsstelle für die Sequenz des Protein VII dargestellt, wie es von der Firma Qiagen geliefert wird.

Tab. 5: Sequenz von pQE30 mit Markierung der Insertionsstelle für pVII (violette

und rosa Markierung)5

1 CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT 51 AATAGATTCA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG 101 AGGAGAAATT AACTATGAGA GGATCGCATC ACCATCACCA TCACGGATCC

151 GCATGCGAGC TCGGTACCCC GGGTCGACCT GCAGCCAAGC TTAATTAGCT 201 GAGCTTGGAC TCCTGTTGAT AGATCCAGTA ATGACCTCAG AACTCCATCT 251 GGATTTGTTC AGAACGCTCG GTTGCCGCCG GGCGTTTTTT ATTGGTGAGA

usw.

8.2. Zielvorstellungen

Die pQE-Vektoren der Firma Qiagen sind für eine Expression in verschiedenen E.coli-Stämmen geeignet. Durch das regulierbare Promotor-/Operator-Element kann eine gezielte und kontrollierte Expression erfolgen, die durch Zugabe von IPTG gesteuert wird, welches des Repressor in- und den Promotor aktiviert. Mit Hilfe des 6 x Histidin-Endes wird eine Reinigung des Expressionsproduktes vereinfacht, da dieser an speziellem Nickel-NTA-Harz-beschichteten Säulen bindet, und das Protein so scho-nend aus den Zellen entfernt werden kann.

9. Expression in SG13009 und M15

Die ebenfalls von der Firma Qiagen bereitgestellten E.coli-Stämme SG13009 (Gottesmann et al., 1981) und M15 (Villarejo und Zabin 1974) gewähren eine hohe Expressionsrate und sind einfach in ihrer Handhabung. Sie enthalten das Plasmid pREP4, welches sowohl das Gen für die Neomycin-Phosphotransferase kodiert (NEO, Beck et al., 1982), die für die Kanamycin-Resistenz dieser Bakterienstämme verantwortlich ist, als auch das lac I-Gen, welches für den lac-Repressor kodiert (Farabaugh 1978). Das führt dazu, daß diejenigen Zellen, die den transformierten Vektor enthalten, leicht mit Hilfe von Kanamycin-enthaltendem Nährmedium selek-tiert werden können. Die Expression wird über die Inaktivierung des Repressors gesteuert. Darüber hinaus enthält dieses Plasmid eine Region des Plasmids pACYC184, welches alle Informationen für die Replikation und die Retention von Plasmiden beinhaltet (Chang und Cohen 1978).

5

10. Fragestellung der vorliegenden Arbeit

Molekularbiologische Methoden des Gentransfers ermöglichten es, verschiedene Konzepte zur Analyse und Therapie genetisch bedingter Erkrankungen zu entwickeln. Eines davon besteht darin, durch Übertragung von Genen neue Therapieansätze herauszuarbeiten. Es ist bekannt, daß virale Vektoren als effektive Transporter für Gene in den menschlichen Organismus eingebracht werden können, so auch virale Kernproteine, die aufgrund ihrer Ladungseigenschaften gut an DNA binden. Bislang wurden diese Proteine aus in humanen HeLa-Zellen angezüchteten Virusstämmen (Doerfler, 1969) mit aufwendigen Methoden isoliert (Hosokawa und Sung, 1976; Sung et al., 1977).

In der vorliegenden Arbeit sollte daher versucht werden, die adenovirale dsDNA, die für das Kernprotein VII kodiert, mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren und nach dem Einbau in einen geeigneten Vektor in superkompetente E.coli-Stämmen zu transferieren. Diese Zellen sollen das Protein nach vorgenommener Induktion exprimieren. Das exprimierte Protein sollte über Nickel-beschichtete Säulen gereinigt werden. Da sich im Verlauf der Arbeit herausstellte, daß sich das Protein eben wegen seiner eigenen stark positiven Ladung nur schwer mittels der PCR amplifizieren läßt, und daß es außerdem zu wiederholten Mutationen im Bereich des Leserahmens kam, konnte das Protein in den dafür vorgesehenen Zellen nicht exprimiert werden.

B. M

M

1. Materialien

1.1. Chemikalien

Alle Chemikalien wurden in der höchsten erhältlichen Qualität verwendet. Nicht aufgeführte Chemikalien wurden in p.A. Qualität von der Firma Merck (Darmstadt) bezogen.

Acrylamid BioRad, München

Agarose (Seakem GTG) BioRad, München

Ammoniumpersulfat

Bactoagar Difco, Detroit

Bactotrypton Difco, Detroit

Borsäure Merck, Darmstadt

Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen

Coomassie (Willis Reagenz)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Deisenhofen

Dynabeads M-280 Streptavidin Dynal, Oslo

Eisessig Merck, Darmstadt

Essigsäure Merck,Darmstadt

Ethanol Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen

Ethylendiaminintetraesigsäure (EDTA) BioRad, München

Glukose Merck, Darmstadt

Glyzerin, wasserfrei BioRad, München

Isopropanol Merck, Darmstadt

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Sigma, Deisenhofen

Kaliumcarbonat Sigma, Deisenhofen

Kaliumchlorid Sigma, Deisenhofen

Kaliumhydroxid Sigma, Deisenhofen

Kalziumchlorid Sigma, Deisenhofen

KOAc

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt

Magnesiumsulfat Merck, Darmstadt

Manganchlorid Merck, Darmstadt

β- Mercaptoethanol BioRad, München

Methanol Merck, Darmstadt

MOPS

Natriumacetat Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid (wasserfrei) Merck, Darmstadt

Rubidiumchlorid Merck, Darmstadt

Salzsäure Merck, Darmstadt

TEMED

Tris[Hydroxylmethyl]aminomethan(TRIS) BioRad, München

Triton X-100 BioRad, München

Yeast-Extrakt Difco, Detroit

1.2. Molekulargewichtsstandards und Proteine

AmpliTaqDNA-Polymerase Perkin Elmer,

Weiterstadt

Bovines Serum Albumin Stratagene, Germany

Deoxyribonukleotidtriphosphate

(dATP, dCPT, dGPT, dTTP) Boehringer, Mannheim

DNA-Marker III Boehringer, Mannheim

DNA.Marker VI Boehringer, Mannheim

Oligonukleotide Genset, Paris

TIB MOLBIOL,Berlin Perfect MatchDNA polymerase enhancer Stratagene, Germany

Restriktionsenzym Sal I Boehringer, Mannheim

Restriktionsenzym Bam HI Boehringer, Mannheim

Restriktonsenzym Hind III Boehringer, Mannheim

Taq-DNA-Polymerase Boehringer, Mannheim

T4-Ligase Boehringer, Mannheim

Vektor pQE30 QIAGEN, Düsseldorf

Vent-DNA-Polymerase Bio Labs, USA

1.3. Puffer, Medien, Agarplatten und Antibiotika 1.3.1. Medien und Agarplatten

Broth-Agar: 1,5 % Bactoagar, 1 % Bactotrypton, 0,5 % Yeast-Extrakt, 0,5 % NaCl, 1 % 1M Tris-HCl (pH 7,5), 1 % 1M MgSO₄.

L-Broth-Medium: 1 % Bactotrypton, 0,5 % Yeast-Extrakt, 0,5 % NaCl, 1 % 1M Tris-HCl (pH 7,5), 1 % 1M MgSO₄.

Lennox-L-Broth-Medium: 1 % Bactotrypton, 0,5 % Yeast-extrakt, 0,5 % NaCl, 0,1 % Glukose, pH auf 7,5 eingestellt mit 1 N NaOH.

1.3.2. Puffer und Lösungen für die Kompetentmachung von SG13009 und M15

TFB 1: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl₂, 30 mM KOAc,

10 mM CaCl, 15 % Glycerin, pH 5,8 , steril filtriert.

TFB 2: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl₂,

15 % Glyzerin, pH 8,0 , autoklaviert.

1.3.3. Antibiotika

Ampicillin Sigma, Deisenhofen

Kanamycin GIBCO BRL, Eggenstein

Methicillin Sigma, Deisenhofen

1.4. Sonstige Pufferlösungen

1 x Bindungs- und Wasch

(B&W) –Puffer : 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA (pH 8,0), 1 M NaCl.

1 x TAE-Puffer : 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM Essigsäure, 1 mM EDTA (pH 8,0).

1 x TBE-Puffer : 90 mM Tris-HCl (pH 8,0), 89 mM Borsäure, 20 mM EDTA (pH 8,0).

1 x TNE-Puffer : 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA.

1 x TE : 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA ( pH 8,0). 6.6.2.-Puffer : 6 mM Tris-HCl (pH 7,2), 6 mM NaCl,

0,2 mM EDTA (pH 8,0).

P1-Puffer : 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNAse A.

P2-Puffer : 200 mM NaOH, 1 % SDS.

P3-Puffer : 3 M Kaliumazetat (pH 5,5).

QBT-Puffer : 750 mM NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0),

15 % Ethanol, 0,15 % Triton-X-100.

QC-Puffer : 1 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0), 15 % Ethanol. QF-Puffer : 1,25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5),

15 % Ethanol.

QX1, QX2 und QX3 : Die Zusammensetzung wird von der Firma QIAGEN nicht bekanntgegeben.

B-Puffer

(für Restriktionsenzyme): 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM 2-Merkaptoethanol, pH 8,0.

H-Puffer

B-Puffer (Expression): 8 M Harnstoff, 0,1 M Na-Phosphat, 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0).

C-Puffer (Expression): 8 M Harnstoff, 0,1 M Na-Phosphat, 0,01 M Tris-HCl (pH 6,3) PAGE-Proben-Puffer: 15 % β -Merkaptoethanol, 15 % SDS, 1,5 % Bromphenolblau, 50 % Glyzerin T4-Ligase-Puffer : 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM MgCl2, 50 mM DTE, 3 mM ATP

50xMaster MixPuffer 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 250 nM EDTA Opti-PrimePuffer 1-12: Puffer #1 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #2 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM Mg₂Cl, 750 mM KCl Puffer #3 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 35 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #4 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 35 mM Mg₂Cl, 750 mM KCL Puffer #5 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 15 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #6 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 15 mM Mg₂Cl, 750 mM KCl Puffer #7 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 35 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #8 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 35 mM Mg₂Cl, 750 mM KCl Puffer #9 100 mM Tris-HCl (pH 9,2), 15 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #10 100 mM Tris-HCl (pH 9,2), 15 mM Mg₂Cl, 750 mM KCl Puffer #11 100 mM Tris-HCl (pH 9,2), 35 mM Mg₂Cl, 250 mM KCl Puffer #12 100 mM Tris-HCl (pH 9,2), 35 mM Mg₂Cl, 750 mM KCl 1.5. Wasser

1.6. Bakterienstämme

Epicurian ColiXL1-BLUE MRF’ KAN competent cells Stratagene, Heidelberg SG13009 QIAGEN, Düsseldorf M15 QIAGEN, Düsseldorf 1.7. Reagenzienkits

ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequenzing Perkin Elmer, Weiterstadt Ready Reaction Kit

Ni-NTA Spin Kit QIAGEN, Düsseldorf

OPTI-PRIME PCR Optimization Kit Stratagene, Heidelberg PCR-Script SK (+) Cloning Kit Stratagene, Heidelberg

Plasmid Preparation Kit QIAGEN, Düsseldorf

QIAexpress Type IV Kit QIAGEN, Düsseldorf

QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Düsseldorf

1.8. Weitere Materialien

Sterile Labormaterialien wurden von den Firmen Nunc (Wiesbaden-Biebrecht) und Falcon (Cockeysville, MD) bezogen.

Nalgene-Einweg-Filtrationssysteme

0,2 µm und 0,45 µm Nalge, Rochester

PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht

Ultrazentrifugenröhrchen Beckman, München

1.9. Geräte

Autoklav „Bioclav“ Schütt, Göttingen

Gelkammern für Agarosegele BioRad, München

Gelkammern für Acrylamidgele BioRad, München Magnetrührer

PCR-Thermocycler Perkin-E., München

pH-Meter 537 A WTW, Weilheim

Spektrophotometer DU-62 Beckman, München

Ultrazentrifuge L5-50 B Beckman, München

Waage Wasserbad

2. Allgemeine Arbeitsmethoden

2.1. Sterilisation

Hitzestabile Geräte und Lösungen wurden in einem Autoklaven in feuchter Hitze bei 121 °C und 2 bar für 30 min sterilisiert. Lösungen mit hitzeempfindlichen Substanzen wurden mit einem 0,2 µm Filter sterilisiert.

2.2. Absorptionsmessung

Absorptionsmessungen wurden mit einem Spektralphotometer durchgeführt. Im ultravioletten Bereich wurden Glasküvetten (Quarzglas Suprasil) mit einer Schichtdicke von 1 mm und 0,5 ml Volumen verwendet.

3. Präparation des Plasmids pJM17

3.1. Prinzip

Die Methode zur Präparation von DNA aus einer Bakterienkultur kann in vier Schritte unterteilt werden:

1. Die Bakterienkultur wird herangezüchtet und dann geerntet. 2. Die Zellen werden aufgebrochen, damit ihr Inhalt frei wird. 3. Der Zellextrakt wird gereinigt.

4. Die entstandene DNA-Lösung wird angereichert.

3.2. Durchführung

Das Plasmid pJM17, welches die gesamte DNA des Adenovirus Typ 2 enthält (McGrory et al.,1987), trägt sowohl eine Ampicillin- als auch eine Tetrazyklin-Resistenz. Für das Wachsen der Bakterienkultur ist es allerdings günstiger, dem Nährmedium – in diesem Fall Lennox-L-Broth-Medium - nur Ampicillin in einer Konzentration von 20 µg/ml zuzufügen, da es sonst öfter zu Neuanordnungen

innerhalb des Plasmids kommt (Rudy et al., 1994). Es wurde mit der Inkubation einer 2-5 ml-Kultur aus einer Kolonie oder 0,1 ml einer eingefrorenen Kultur bei 37 °C im Brutschrank begonnen. Ca. 8 Stunden später wurde diese Kultur mit einem Liter Medium verdünnt und über Nacht unter starkem Schütteln im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Die Plasmid-Präpararion erfolgte nach dem QIAGEN Plasmid Purification Handbook, und zwar nach dem Maxi-Protokoll. Die 100 ml Bakterienkulturen wurden für 15 min bei 6000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment in 10 ml des RNAse A enthaltenden P1-Puffer resuspendiert. Dieses visköse Gemisch wurde unter Zugabe von 10 ml P2-Puffer für 5

für 15-20 min auf Eis inkubiert werden . Daraufhin wurde das Gemisch für 30 min bei 15000Upm und 4 °C zentrifugiert. In der Zwischenzeit wurden die QIAEX-Säulen (QIAGEN-tip 500) durch den Durchfluß von jeweils 10 ml QBT-Puffer equilibriert. Der Überstand der zentrifugierten Proben wurde abgenommen und die Säulen aufgetragen. Der Durchfluß durch die Säulen wurde nicht manuell beschleunigt, son-dern erfolgte allein durch die Schwerkraft. Die nun an das Säulenmaterial (speziell behandeltes Harz, das eine genaue Selektion von DNA gegenüber RNA und anderen Zellbestandteilen erlaubt) gebundene DNA wurde zweimal mit jeweils 30 ml QC-Puffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch Auswaschen der DNA mit.

15 ml QF-Puffer in frische, sterile 30 ml Glasröhrchen (Fa. GIBCO). Anschließend wurde die DNA in 0,7 Volumeneinheiten (10,5 ml) raumtemperiertem Isopropanol präzipitiert und für 30 min bei 9500 Upm und 4 °C zentrifugiert. Das die DNA enthaltende Sediment wurde nach Abzug des Isopropanols mit 15 ml eiskaltem 70 %igem Ethanol gewaschen und hierzu erneut für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und vollständig luftgetrocknet. Anschließend wurde die gereinigte DNA in 10-30 µl TE-Puffer aufgenommen. Die Quantifizierung der DNA-Menge

erfolgte mittels Spektralphotometrie wie unter 3.3.2. beschrieben.

4. Quantifizierung der DNA-Menge durch Spektralphotometrie

Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte durch Absorptionsmessung bei verschiedenen Wellenlängen im ultravioletten Bereich (Sambrook, 1989).

4.1. Prinzip

Licht einer definierten Wellenlänge wird beim Durchstrahlen einer probenhaltigen Küvette im Vergleich zu einer lösungsmittelhaltigen Küvette in seiner Lichtintensität verändert. Diese Schwächung oder Extinktion einer Lösung ist proportional der Konzentration der gelösten lichtabsorbierenden Substanz, ihrem Absorptions-koeffizienten und der Schichtdicke der Lösung. Diesen Zusammenhang beschreibt das Lambert-Beer-Gesetz, mit dessen Hilfe in diesem Fall die Konzentration der Lösung errechnet werden kann, gemäß OD = -log₁₀ (Intensität des durchgelassenen Lichtes)/(Intensität des eingestrahlten Lichtes).

4.2. Durchführung der OD-Messung

Zunächst wurden 5 µl der isolierten und in kleiner Menge TE-Puffer gelösten DNA

mit 495 µl TE-Puffer versetzt (1:100 Verdünnung). Zum Abgleich des Photometers

wurde der Leerwert von 500 µl TE-Puffer bestimmt und das Gerät mit TE-Puffer bei

den Wellenlängen 260, 270, 280 und 320 nm kalibriert. Die Proben wurden gemischt und die Extinktion in Quarzküvetten von 1 cm Schichtdicke bei den oben genannten Wellenlängen gemessen. Zwischen der Messung der verschiedenen DNA-Proben wurde die verwendete Küvette mit TE-Puffer gespült. Die Werte gaben in