rekombinanten Proteins. Hingegen konnte gezeigt werden, daß die Lebensdauer der Wirtszelle im Gegensatz zu replikationsfähigen Vektoren nicht verkürzt war (Merklein 1998).
Ein weiterer Vorteil der adenoviralen Vektorsystem liegt in seinem weiten Wirtsspektrum; so konnten bisher die unterschiedlichsten Organe auf ihre Infektionsfähigkeit durch Adenoviren untersucht werden, wie z.B. Muskulatur und Leber (Stratford-Perricaudet et al., 1990 und 1992), Lunge (Rosenfeld et al., 1992), Niere (Moullier et al., 1994) und Gehirn (Akli et al., 1993; LeGal-LaSalle et al., 1993). Es konnten auch schon in jüngerer Zeit Tumorerkrankungen mit Hilfe von adenoviralem Gentransfer behandelt werden (Cordier et al., 1995).
Die Effizienz des Adenovirus-vermittelten Gentransfers ist proportional zu der eingesetzten Vektordosis, d.h., daß die Genexpression nach Transfer bei hohen Vektordosen besonders effizient ist. Auch bei diesen hohen Dosen konnte lichtmikroskopisch keine Schädigung der Wirtszellen festgestellt werden. Zu bemerken wäre weiterhin, daß sich die meisten adenoviralen Vektoren auf Adenovirus Typ 2 oder 5 zurückführen lassen, für die kein onkogenes Potential bekannt ist (Ali et al., 1994); Adenoviren mit einer solchen Potenz – z.B. Typ 12, 18 und 31 (Horwitz 1990) – integrieren ihr Genom in das der Wirtszelle (Doerfler et al., 1995), was auf die Typen 2 und 5 nicht zutrifft.
2. Probleme des adenoviralen Vektormodells
Da es in den meisten Fällen nicht zu einer Integration der Virus-DNA in das Wirtsgenom kommt, ist natürlich die Stabilität der Expression auf nur wenige Wochen begrenzt. Dies zusammen mit der Immunabwehr der Wirtszelle schränkt die Praktikabilität dieser Gentransfer-Methode doch erheblich ein. Ein weiterer Aspekt, der die Anwendungsbreite der klassischen adenoviralen Vektorsysteme betrifft, liegt darin, daß es immer schwer ist, Patienten davon zu überzeugen, sich mit „infektiösem“
Material, in diesem Fall mit Adenoviren behandeln zu lassen. Die Angst in der Bevölkerung – und auch in den einzelnen Ethikkommissionen – ist doch zu groß, als daß man sich vorstellen könnte, daß ein solches Verfahren zu einer Routinemethode werden kann. Bisher blieb es nur den sog. hoffnungslosen Fällen vorbehalten, bei denen eine jede Infektionsgefahr immer in Kontrast zu dem sonst bald zu erwartenden Tod stand.
3. Ein Protein als Transfermolekül für DNA – Modifizierung des adenoviralen Vektormodells
Aufgrund dieser oben genannten Problematik, wie Infektionsgefahr, immunologische Abwehrreaktion und zu geringe Expressionsdauer, wurden einige Veränderungen an diesem Modell vorgenommen.
Der vorliegenden Arbeit liegt die Überlegung zu Grunde, anstelle des gesamten Virus – abgesehen von der Eliminierung der E1-Region – nur dasjenige Protein zu
transferieren, welches die Fähigkeit hat, in die Wirtszelle einzudringen, und darüber hinaus noch eine hohe Affinität zu DNA hat; also das „perfekte“ Transportermolekül für DNA. Ein solches Protein hätte verschiedene Vorteile gegenüber dem gesamten Virus: zum einen wäre eine Infektion ausgeschlossen, da nur ein isoliertes Protein übertragen werden würde. Ebenso ist keine immunologische Abwehrreaktion zu erwarten, die die Überlebenszeit der rekombinanten DNA verkürzen könnte. Auch die Gefahr einer onkogenen Potenz wäre gleich null gesetzt. Ein Protein des Adenovirus das die erforderten Eigenschaften erfüllt, ist das sog. maior core protein, das Protein VII. Durch seinen hohen Gehalt an Arginin besitzt dieses Protein eine hohe Affinität zu der negativ geladenen DNA. Außerdem besitzt es die Fähigkeit, in Zellen einzudringen, es hat eine sog. Schlüsselrolle im Infektionsweg der Adenoviren. Somit stellt das Protein VII den idealen Transporter für DNA in humane Zellen dar.
4. Grundlegendes zur Verwendung von Virusproteinen als Transportermoleküle
Das Protein VII wurde schon frühzeitig als mögliches Vehikel für DNA im Rahmen einer Gentherapie entdeckt. Jedoch war die Isolierung bzw. die Herstellung von einer genügenden Menge dieses Proteines sehr umständlich. Eine entsprechend große Anzahl von Adenoviren mußte spezifisch behandelt werden, um aus jedem einzelnen das Protein VII isolieren zu können.
4.1. Ziel dieser Arbeit
Die Überlegungen, die die Grundlage dieser Arbeit bildeten, bezogen sich auf eben diese herkömmlichen Verfahren zur Isolierung des Protein VII aus den Viren. Es war die Idee, die kodierende Sequenz für das Protein mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren, dieses Produkt mittels eines Expressionsvektors in Bakterienzellen zu transferieren, in denen dann das Protein in hoher Anzahl exprimiert wird. Dieses Verfahren würde den Einsatz von Protein VII für den Gentransfer in hohem Maße erleichtern, da man neben der Vereinfachung, eine große Menge des Proteins zu erhalten, also einer höheren Quantität, auch eine Stabilität bezüglich der Qualität garantieren könnte. Die Expression von Proteinen in Bakterienzellen ist eine bewährte und schon viel eingesetzte Methode.
4.2. Das Expressionsmodell
Voraussetzung für die Expression von Fremdgenen in Bakterienzelle wie z.B. E.coli ist der Einbau in einen geeigneten Expressionsvektor, der unter dem Einfluß von E.coli-Expressionssignalen steht. Hierbei ist zum einen die stärke des Promotors von Bedeutung, denn er steuert die Effizienz der Expression durch eine hohe
chemischen Verbindung wird die Transkription entweder ein- oder abgeschaltet. Eine Regulationsmöglichkeit der Expression ist in jedem Fall sehr wichtig, da einige Proteine eine schädliche Wirkung auf die Bakterien haben können, und man so verhindern kann, daß dieses sich in einer toxischen Konzentration in der Bakterienzelle ansammelt. Abgesehen davon kann eine dauerhaft starke Transkription die Replikationsfähigkeit der rekombinanten DNA nachteilig beeinflussen.
In diesem Versuch wurde das ein starker und gut steuerbarer Promoter vom Induktionstyp gewählt, nämlich der lac-Promotor. Diese Sequenz reguliert die Transkription der β-Galaktosidase, für die das lacZ-Gen kodiert – M13-Vektoren tragen hiervon nur einen Abschnitt, das lacZ´-Genfragment. Dieser Promotor wird von IPTG induziert, wird dieses dem Nährmedium zugesetzt, so wird die Expression angeschaltet (siehe Abb. 25).
Der lac-Promotor
-35 -10
lac Z IPTG
Transkription
Abb. 25: Der lac-Promotor (aus: Brown TA)
Weitere für die Transkription bzw. Translation wichtige Signale sind zum einen der Terminator, der das Ende des zu transkribierenden Gens beschreibt, und die Ribosomenbindungsstelle, an der das mRNA-Molekül anheften soll.
Expressionsvektoren, die alle diese Signale (Promotor, Terminator und Ribosomenbindungsstelle) enthalten, nennt man Kassettenvektoren, da sie diese in Form einer Kassette enthalten sind, in die die rekombinante DNA in eine nur einmal vorhandene Restriktionsstelle eingebaut wird. In dieser Arbeit wurde ein solcher Kassettenvektor pQE30 verwendet, in dessen einmalig vorkommenden Restriktionstellen BamHI und HindIII die Sequenz des Protein VII eingebaut wurde.
4.3. Probleme bei der Proteinexpression
Trotz der großen Fortschritte und der Optimierung bei der Herstellung von Kassettenvektoren gibt es immer noch zahlreiche Schwierigkeiten bei der Expression von Fremdgenen in großem Maßstab:
• bei der Transkription: die fremde DNA kann Sequenzen enthalten, die in den Bakterienzellen als Terminatoren wirken und somit die Expression vorzeitig beenden.
• zwischen Transkription und Translation: es ist essentiell vor Einbau der fremden DNA deren Introns zu entfernen, da diese von den Bakterienzellen nicht aus dem
Transkript herausgeschnitten werden können. Dies ist allerdings nur möglich, wenn man über eine cDNA verfügt, die mit Hilfe von mRNA konstruiert wurde und deshalb keine Introns enthält.
• bei der Translation: Es gibt für eine Aminosäure meist mehrere Codons, man nennt dies Codonnutzung. Es kommt aber häufig vor, daß bestimmte mögliche Codons von der Transfer-RNA (tRNA) bevorzugt werden. Dies spiegelt sich in einer Überzahl der entsprechenden tRNA wider; enthält aber die rekombinante DNA genau von diesen wenig genutzten Codons mehr, so kann die Translation behindert sein durch die zu geringe Anzahl der erforderlichen tRNA.
• nach der Translation: hier existieren zwei Probleme, zum einen kann es zu einem schnellen Abbau durch Proteasen, die Fremdgene erkennen und abbauen; dies kann durch veränderte E.coli-Stämme verhindert werden, denen diese Proteasen fehlen.
Zum anderen durch die Unterschiede in der Weiterverarbeitung (processing);
meistens werden Proteine nach der Translation durch Anfügen von chemischen Gruppen o.ä. weiterverarbeitet, was für ihre Funktion essentiell ist Dies verläuft bei den einzelnen Organismen auf unterschiedliche Art und Weise, so daß eine Veränderung hier die Funktionsfähigkeit des Proteins erheblich einschränken kann.
• in der Zelle: ein exprimiertes Protein kann die Wirtszelle auf verschiede Weise schädigen. Zum einen durch Toxizität, zum anderen durch einen hohen Energie-und Materialverbrauch, der das Bakterium hinsichtlich seiner Wachstumsgeschwindigkeit und seiner Zellstabilität im Gegensatz zu den nicht transfizierten Zellen benachteiligt, so daß die Rekombinanten in einer Kultur leicht überwuchert werden können, und so das protein nicht mehr exprimiert wird.
Bei der vorliegenden Arbeit stehen mehrere Probleme im Vordergrund: erstens die Schwierigkeiten bei dem Versuch der Amplifizierung mittels der Polymerase-Kettenreaktion als einer Voraussetzung für die Klonierung,. Zweitens die hohe Bindungkraft der DNA-Stränge aufgrund des hohen Gehaltes an Arginin. Drittens wahrscheinlich die verschiedene Codonnutzung bezüglich der Histidinreste, die hier vor allem durch CAT und CAC codiert wurden und viertens die Mutation im Leserahmen, die allerdings kein Problem der Expression im eigentlichen Sinne ist, sondern aus der Beschaffenheit der DNA resultiert.
5. Vergleich mit anderen Modellen für die Fremdgenexpression
Die einfachsten Methoden, fremde DNA zu transferieren, sind chemischer oder physikalischer Art, wie z.B. die Ca2+-Phosphat-Methode oder die Mikroinjektion, welche aber in vivo nur begrenzt einsatzfähig sind. So sind diese auch durch die Entdeckung und Nutzbarmachung viraler Vektoren stark verdrängt worden; hier wiederum stehen vor allem retrovirale und adenovirale Vektoren im Vordergrund.
5.1. Retrovirale Vektoren
Die Tatsache, daß Retroviren für so geeignete Vektoren erklärt, liegt darin begründet, daß diese ihr genetisches Material in das Wirtsgenom integrieren. Bei diesen Vektoren handelt es sich um Retroviren, bei denen die Signalsequenzen des Virusgenoms für die Kapselbildung entfernt wurden; so produzieren diese Vektoren alle für die Virusreplikation und -zusammensetzung notwendigen Proteine, ohne das Gefahr gelaufen wird, daß sich infektiöse Partikel bilden können.
Retrovirale Vektoren bergen allerdings den Nachteil, daß sie auf sich replizierende Zellen angewiesen sind, deren Zahl sich in vivo stark begrenzt hält.
5.2. Adenovirale Vektoren
Wie schon weiter oben erwähnt haben adenovirale Vektoren ein ähnlich breites Wirtsspektrum wie Retroviren, sie sind jedoch nicht auf die Replikationsfähigkeit ihrer Wirtszellen angewiesen, was ihren Einsatz in vivo besonders bevorzugt.
Hier ist jedoch der Nachteil, daß diese Vektoren innerhalb der Wirtszelle nicht sehr stabil sind, und deshalb auch eine Expression durch sie nur von begrenzter Dauer ist.
Dies läßt sich darauf zurückführen, daß Adenoviren ihr Genom nicht in das der Wirtszelle integrieren.
6. Sicherheit und Ethik
Wie bei jeder neuen klinischen Technik müssen auch bei der Gentechnik die möglichen Risiken der Methode dem möglichen Erfolgen gegenübergestellt werden.
Bezüglich der Verwendung von retroviralen Vektoren muß hier an die Möglichkeit der Kontamination mit replikationskompetenten Viren gedacht werden. Bei adenoviralen Vektoren muß man die onkogene Potenz einzelner Stämme bedenken, sowie an die Herstellung replikationsdefizienter Viren. Beide Faktoren können zu einer Induktion bzw. Infektion mit folgendem Tumorwachstum führen. Es konnte erklärt werden, daß ein replikationskompetentes Virus pathogen sein kann, wenn es eine chronische Virämie bei einem immungeschädigten Wirt auslöst.
Zu den Sicherheitsbestimmungen in der humanen Gentherapie kommen auch noch die ethischen Gesichtspunkte. Die Gentherapie wie sie heutzutage betrieben wird, behandelt ausschließlich Körperzellen und keine Keimzellen. Der Stellenwert dieser Art von Gentherapie ist ähnlich dem von Transplantationen oder anderen Zellbehandlungsmethoden. So bleiben zwei Aspekte offen: einmal die Keimzell-Gentherapie und der Punkt, der eine Verstärkung der Technologie begrenzt. Was für eine Keimzell-Gentherapie spräche, wäre die Tatsache, daß viele genetische bedingte Erkrankungen nur effektiv während der Embryogenese behandelt werden können. Auf der anderen Seite müssen die Sicherheitsstandards hoch angesetzt und eine Ausweitung der Möglichkeiten der Keimzell-Gentherapie auf schwerwiegende, d.h.
lebensbedrohliche Erkrankungen beschränkt bleiben.
Für die zukünftige Entwicklung der Gentherapie müssen drei Hindernisse überwunden werden:
1. Die für den Gentransfer verwendeten Vektoren sollen direkt in den Patienten injizierbar seien. Dies setzt ebenso voraus, daß der Vektor die Zielzelle erkennt und das entsprechende Organ penetrieren kann.
2. Befindet sich der Vektor in der Zielzelle, sollte er sicher an einer unproblematischen Stelle des Chromosoms integriert werden, oder das defiziente Gen ersetzen. Dies würde die Gefahr einer malignen Entartung rapide herabsetzen. Bis jetzt konnte nur gezeigt werden, daß adenoassoziierte Viren in der Lage sind, ihr Genom in eine kleine Region des kurzen Arms von Chromosom 19 zu integrieren. Werden die biochemischen Mechanismen, die für diese Integration verantwortlich sind, von den adenoassoziierten Viren isoliert, könnte es möglich sein, diese mit den bisherigen Vektormodellen zu kombinieren, und so deren Effizienz zu erhöhen.
3. Es sollte möglich werden, daß die induzierten Gene die Fähigkeit haben, auf physiologische Veränderungen im Blut oder von zellulären Metaboliten zu reagieren; so z.B. in der Gentherapie des Diabetes mellitus die stetigen Veränderungen des Blutzuckerspiegels.
Die Zukunft für die Gentherapie verspricht viel, und man soll hoffen, daß diese Technologie soweit ausreifen wird, daß eine große Bandbreite von Erkrankungen im nächsten Jahrhundert behandelt werden kann.