MARTIN SCHÖNWETTER
2D-Gelelektrophorese des Aspergillus nidulans Proteoms mit freien
Trägerampholyten und Klonierung von EXT-1
Diplomarbeit
Zur Erlangung des akademischen Grades eines Magisters der Pharmazie
an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl-Franzens-Universität Graz
Univ.-Prof. Mag. Dr.rer.nat. Andreas Kungl Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Bereich Pharmazeutische Chemie
Die vorliegende Arbeit entstand am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Abteilung Pharmazeutische Chemie, Arbeitsgruppe Pharmaceutical Gene- and Biotechnology der Karl- Franzens-Universität Graz unter der Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Andreas Kungl.
Danksagung
An erster Stelle gilt mein Dank Herrn Univ.-Prof. Dr. Andreas Kungl für die hervorragende Betreuung meiner Diplomarbeit. Mit seinem kompetenten Wissen war er mir stets eine große Hilfe während der gesamten Zeit meiner Diplomarbeit. Außerdem möchte ich mich bei Dr.
Kungl sehr herzlich bedanken, dass ich die vorliegende Arbeit trotz der langen Pause seit Absolvierung des praktischen Teils dennoch zu einem Abschluss bringen durfte.
Einen herzlichen Dank möchte ich auch allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Dr. Kungl zukommen lassen, die mich während meiner praktischen Arbeit im Jahr 2002 mit ihrem Fachwissen ebenfalls immer sehr kompetent unterstützt haben und die mir zudem ein sehr kollegiales und freundschaftliches Arbeitsumfeld geboten haben.
Weiters bedanke ich mich sehr herzlich bei Univ.-Prof. Dr. Joseph Strauss und seinem Team der Arbeitsgruppe Mikrobielle Genetik am Institut für Angewandte Genetik und Zellbiologie der Universität für Bodenkultur in Wien, wo mir ein zweiwöchiger Forschungsaufenthalt im Rahmen meiner Diplomarbeit ermöglicht wurde. Auch hier wurde ich sehr freundlich aufgenommen und ich konnte einen interessanten Einblick in die Forschung der Arbeitsgruppe Strauss erlangen.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich nicht zuletzt auch bei meiner Familie, insbesondere bei meinen Eltern, die mir mein Studium überhaupt erst ermöglicht haben. Vielen Dank für die vielen finanziellen Opfer und für die moralische Unterstützung während all dieser Jahre!
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG...5
1.1 AUFGABENSTELLUNGUND ZIELDIESER ARBEIT...5
1.2 PROTEINE...6
1.2.1 Organisationsstufen der Proteine...11
1.2.2 Proteinbiosynthese...12
1.2.3 Eigenschaften von Proteinen...20
1.3 PROTEOMUND PROTEOMANALYSE (PROTEOMICS)...20
1.4 PROTEOMICSMIT ASPERGILLUSNIDULANS...22
1.5 EXT1...24
2 METHODENUND MATERIALIEN...27
2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN...27
2.1.1 Zellkultur...27
2.1.2 Nährmedien...27
2.1.3 Selektionsmedien...28
2.1.4 Inkubation...28
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN...29
2.2.1 Klonieren von DNA-Fragmenten...29
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...33
2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese...42
2.2.4 Plasmidpräparation (Mini-Prep)...44
2.2.5 RNA-Extraktion (RNA-Prep)...46
2.3 SPEKTRALPHOTOMETRISCHE METHODEN...47
2.3.1 Quantitative Proteinbestimmung mit dem BCA Protein Assay...49
2.3.2 Optische Dichte OD260 und OD280...52
2.4 PROTEINBIOCHEMIE: 2D-GELELEKTROPHORESE...53
2.4.1 Zellaufschluss und Probenvorbereitung...54
2.4.2 Erste Dimension: IEF...55
2.4.3 Zweite Dimension: SDS-PAGE...57
2.4.4 Visualisierung: Gelfärbung...58
3 EXPERIMENTELLER TEIL UND RESULTATE...61
3.1 PROTEOMANALYSEVON ASPERGILLUSNIDULANS...61
3.1.1 Anzucht von Aspergillus nidulans...61
3.1.2 Zellaufschluss...71
3.1.3 Erste Dimension der 2D-Gelelektrophorese...74
3.1.4 Zweite Dimension der 2D-Gelelektrophorese...79
3.1.5 Visualisierung der Protein-Spots...84
3.1.6 Optimierungsversuche und Ergebnisse...88
3.1.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Pierce BCA Protein Assay...94
3.2 KLONIERUNG VON EXT1...99
3.2.1 Amplifikation des gewünschten EXT1-Abschnitts...100
3.2.2 TOPO-Klonierung mit chemisch kompetenten Zellen...103
3.2.3 TOPO-Klonierung mit elektrokompetenten Zellen...105
3.2.4 Über-Nacht-Kultur (o.n.c.)...106
3.2.5 Herstellung eines Glycerin-Stock...107
3.2.6 Plasmidpräparation der Über-Nacht-Kultur...107
3.2.7 Kontroll-PCR der Plasmidpräparation...109
3.2.8 Linearisierung der Plasmid-DNA mit EcoRI...110
3.2.9 Eluierung der DNA-Bande aus dem Agarosegel...110
3.2.10 Neuerliche TOPO-Klonierung mit chemisch kompetenten Zellen...111
3.2.11 Linearisierung der Plasmid-DNA mit BamHI...112
3.2.12 Vergleich von nicht lineariserter und linearisierter Plasmid-DNA...114
3.2.13 Weitere Versuche mit mEXT1...116
4 ZUSAMMENFASSUNG...123
5 VERZEICHNISSE...125
5.1 LITERATURVERZEICHNIS...125
5.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS...131
5.3 TABELLENVERZEICHNIS...133
5.4 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...135
1 Einleitung
1.1 Aufgabenstellung und Ziel dieser Arbeit
Diese Diplomarbeit besteht aus zwei Aufgabenstellungen aus den Bereichen Proteinbiochemie und Molekularbiologie.
Die Hauptaufgabe befasste sich mit dem Bereich Proteinbiochemie. Aufgabenstellung hier war es, die Methoden der Proteomforschung, insbesondere die 2D–Gelelektrophorese (zweidimensionale Gelelektrophorese), zur Trennung der Proteine aus Zellen des Nitrat assimilierenden Pilzes Aspergillus nidulans zu optimieren. Es sollte eine Methode erarbeitet werden, um reproduzierbare 2D-Gele sowohl von nicht induzierten als auch von Nitrat induzierten Zellen herzustellen, um einen Einblick erhalten zu können, welche Proteine bei der Nitratverwertung beteiligt sind. Diese Proteine sollten in den 2D-Gelen als signifikant abweichende Spots erkennbar sein. Proteine von Interesse können anschließend aus den Gelen extrahiert und z.B. mit speziellen massenspektrometrischen Methoden identifiziert werden. Letzteres war aber nicht mehr Teil der Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit.
Für die Isoelektrische Fokussierung (IEF), welche die Erste Dimension der 2D- Gelelektrophorese darstellt, sollte dabei mit freien Ampholyten (Trägerampholyten) gearbeitet werden.
Als zweite Aufgabe neben der Proteomanalyse von Aspergillus nidulans sollte das Gen EXT1 kloniert werden. Dazu waren Arbeitsmethoden aus dem Gebiet der Molekularbiologie zu erlernen und anzuwenden. Insbesondere waren dies die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung des Gens aus der DNA-Vorlage, der Einbau des gewünschten DNA-Fragments in einen Plasmid-Vektor, die Transformation dieses Plasmids in kompetente, bakterielle Wirtszellen, das Vermehren dieser Bakterien in entsprechenden Nährmedien und die anschließende Plasmidpräparation zur Extraktion der in den Wirtszellen vermehrten DNA sowie die Überprüfung des Erfolgs der Arbeitsschritte mittels PCR und DNA-Gelelektrophorese.
Der praktische Teil dieser Diplomarbeit fand 2002 statt.
1.2 Proteine
Für die Proteomanalyse ist eine gute Kenntnis über den Aufbau und die Eigenschaften von Proteinen erforderlich. Daher folgt an dieser Stelle zunächst eine kurze Beschreibung der wichtigsten Eigenschaften von Proteinen.
Proteine sind wichtige Bestandteile der Zellen aller Lebewesen und haben als hochspezialisierte Moleküle unterschiedlichste Aufgaben. Proteine führen nahezu alle Zellfunktionen aus. Sie sind beteiligt am Aufbau der Zellbestandteile und fungieren als Enzyme, welche zahlreiche chemische Reaktionen an ihrer speziellen Oberfläche katalysieren. Proteine bilden Kanäle und Pumpen für den Transport von Molekülen in die Zelle und aus ihr hinaus. Proteine können als Signalvermittler und -empfänger fungieren.
Sie sind beteiligt an der DNA-Replikation und haben viele weitere spezielle Aufgaben, z.B.
als Antikörper, Toxine, Hormone, Bestandteil der elastischen Fasern, etc. (vgl. Alberts et al. 2011, S. 139).
Molekülketten bis 100 Aminosäuren werden als Peptide bezeichnet, Moleküle mit einer Anzahl größer 100 Aminosäuren nennt man Proteine. Peptide werden nochmals in Oligopeptide (bis 10 Aminosäuren) und Polypeptide (größer 10 Aminosäuren) unterteilt.
Bereits sehr kleine Peptidmoleküle aus nur wenigen Aminosäurebausteinen können hochwirksam sein. Beispielsweise besteht das Peptidhormon Somatostatin, welches als Release Inhibiting Hormon die Freisetzung des Somatotropin-Releasing-Hormons aus dem Hypothalamus in den Hypophysenvorderlappen und in Folge die Freisetzung des Wachstumshormons (Somatotropin) hemmt, aus nur 14 Aminosäuren. Octreotid, ein synthetisches Analogon des Somatostatins besteht aus nur acht Aminosäuren, hat aber die gleiche Wirkung von Somatostatin und wird als Arzneimittel eingesetzt.
Proteine bestehen aus einigen wenigen bis zu mehreren tausend Aminosäuren, welche zwischen alpha-Carboxygruppe der einen Aminosäure und alpha-Aminogruppe der anderen Aminosäure amidartig verknüpft sind. Diese Verknüpfung nennt man Peptidbindung. Abbildung 1-1 zeigt eine solche Peptidbindung am Beispiel von Alanylserin, welches aus einem Molekül Alanin und einem Molekül Serin besteht.
Wie aus Abbildung 1-1 ersichtlich, ergibt sich immer ein Aminoende (NH2-Gruppe), welches N-Terminus bezeichnet wird und ein Carboxylende (-COOH) oder C-Terminus.
Die Aminosäuresequenz wird immer vom N-Terminus zum C-Terminus von links nach rechts dargestellt (vgl. Alberts et al. 2011, S. 139).
In Abbildung 1-1 ist die Bindung zwischen Kohlenstoff- und Stickstoff-Atom als Einfachbindung dargestellt. Tatsächlich handelt es sich bei dieser Darstellung nur um eine mesomere Grenzstruktur. Abbildung 1-2 zeigt die tatsächliche Beschaffenheit der Peptidbindung. Es handelt sich um eine mesomeriestabilisierte Bindung bedingt durch die
Abb. 1-1: Alanylserin: Peptidbindung zwischen der Carboxygruppe von Alanin und Aminogruppe von Serin. Eigenes Werk, erzeugt mit GchemPaint (http://gchemutils.nongnu.org/)
Abb. 1-2: Löffler, Georg: Mesomerie der Peptidbindung. Basiswissen Biochemie: Mit Pathobiochemie 7. Auflage 2008, S. 27, Springer Medizin Verlag Heidelberg
Die Peptidbindung ist eine partielle Doppelbindung. Im Gegensatz zu einer herkömmlichen C-N- Bindung ist die C-N-Bindung in der Peptidbindung daher nicht frei um ihre Achse drehbar.
Elektronenverteilung zwischen der C=O – und der NH-Bindung. Die Peptidbindung hat also den Charakter einer sogenannten partiellen Doppelbindung. Diese Tatsache schränkt die Beweglichkeit der Peptidbindung so ein, dass die vier Atome der Peptidbindung tatsächlich in einer Ebene liegen (vgl. Löffler 2008, S. 27).
Aminosäuren, welche am Proteinaufbau beteiligt sind, werden als proteinogene Aminosäuren bezeichnet. In Proteinen kommen 20 verschiedene Aminosäuren vor, d.h.
es existieren 20 proteinogene Aminosäuren, welche über die Peptidbindung zu langen Peptidketten (Polypeptide) verknüpft sind. Jedes Protein besteht aus einer charakteristischen Aminosäuresequenz (vgl. Alberts et al. 2011, S. 140f).
Abbildung 1-3 zeigt die allgemeine Strukturformel von Aminosäuren. Die Aminosäuren unterscheiden sich nur durch die Seitenketten (Rest R). Das alpha C-Atom von Aminosäuren ist asymmetrisch, es gibt zwei Stereoisomere (optische Isomerie, D- und L- Form). Proteine sind ausschließlich aus L-Aminosäuren aufgebaut.
Durch die Verknüpfung der Aminosäuren zu Polypeptidketten entsteht ein Polypeptid- Grundgerüst, welches von der sich wiederholenden Abfolge von Atomen -NH-(CHR)-CO- dargestellt wird, wobei R für den Seitenkettenrest steht. Die Seitenketten der 20 proteinogenen Aminosäuren werden aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften in saure, basische, ungeladen polare und unpolare Aminosäuren eingeteilt. Die individuellen Eigenschaften eines Proteins sind bestimmt durch die unterschiedlichen Seitenketten und
Abb. 1-3: Löffler, Georg: Allgemeine Struktur von α-Aminosäuren. Basiswissen Biochemie: Mit Pathobiochemie 7. Auflage 2008, S. 13, Springer Medizin Verlag Heidelberg
alpha C-Atom mit Aminogruppe, Carboxylgruppe und variabler Seitenkette (Rest R)
die spezifische Anordnung der Aminosäuren im Molekül. Die Aminosäuren werden für gewöhnlich mit einem Dreibuchstabencode oder auch mit einem Einbuchstabencode abgekürzt (vgl. Alberts et al. 2011, S. 140-143).
In den folgenden Abbildungen Abb. 1-4 bis Abb. 1-8 sind die 20 proteinogenen Aminosäuren mit ihrer Einteilung in Anlehnung an Alberts et al. (2011, S. 141ff) abgebildet. In der Bildbeschreibung sind auch jeweils die Drei- bzw. Einbuchstabencodes in Klammer angegeben, z.B. Lysin (Lys/K).
Abb. 1-4: Aminosäuren mit basischer Seitenkette: Lysin (Lys/K), Arginin (Arg/R), Histidin (His/H). Eigenes Werk, erzeugt mit GchemPaint (http://gchemutils.nongnu.org/)
Abb. 1-5: Aminosäuren mit saurer Seitenkette: Asparaginsäure (Asp/D), Glutaminsäure (Glu/E).
Eigenes Werk, erzeugt mit GchemPaint (http://gchemutils.nongnu.org/)
Abb. 1-6: Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten: Asparagin (Asn/N), Glutamin (Gln/Q), Serin (Ser/S), Threonin (Thr/T), Tyrosin (Tyr/Y). Eigenes Werk, erzeugt mit
GchemPaint (http://gchemutils.nongnu.org/)
Abb. 1-7: Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten (1): Alanin (Ala/A), Valin (Val/V), Leucin (Leu/L), Isoleucin (Ile/I), Prolin (Pro/P). Eigenes Werk, erzeugt mit GchemPaint
(http://gchemutils.nongnu.org/)
Abb. 1-8: Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten (2): Phenylalanin (Phe/F), Methionin (Met/M), Tryptophan (Trp/W), Glycin (Gly/G), Cystein (Cys/C). Eigenes Werk, erzeugt mit GchemPaint (http://gchemutils.nongnu.org/)
1.2.1 Organisationsstufen der Proteine
Man unterscheidet zwischen vier Organisationsstufen der Proteine: Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur.
Als Primärstruktur der Proteine bezeichnet man die Aminosäuresequenz, also die Anordnung der Aminosäuren im Proteinmolekül. Die Primärstruktur ist entscheidend für die höheren Organisationsstufen von Proteinen.
Die Sekundärstruktur einer Polypeptidkette ist die räumliche Struktur des Rückgrats.
Sie ergibt sich allein durch Wasserstoffbindungs-Wechselwirkungen zwischen den N-H- und den C=O-Gruppen im Polypeptid-Grundgerüst, ohne dass die Seitenketten der Aminosäuren miteinbezogen werden. Es ergeben sich dadurch typische Formen wie die alpha-Helix und das beta-Faltblatt (vgl. Alberts et al. 2011, S. 146).
Die IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) definiert die Sekundärstruktur folgendermaßen: "secondary structure: The conformational arrangement (α-helix, β-pleated sheet, etc.) of the backbone segments of a macromolecule such as a polypeptide chain of a protein without regard to the conformation of the side chains or the relationship to other segments." (IUPAC 2010, http://goldbook.iupac.org/S05530.html)
Die Tertiärstruktur ist die dreidimensionale Anordnung des gesamten Proteinmoleküls einschließlich der Konformationen, die sich durch die Aminosäureseitenketten ergeben.
Definition der Tertiärstruktur durch die IUPAC: "tertiary structure: The spatial organization (including conformation) of an entire protein molecule or other macromolecule consisting of a single chain." (IUPAC 2010, http://goldbook.iupac.org/T06282.html)
Die Information für die Ausbildung der dreidimensionalen Gestalt eines Proteins ist in seiner Aminosäuresequenz enthalten. Proteine falten sich zur Konformation mit der geringsten Energie. Jedes Protein faltet sich für gewöhnlich zu genau einer einzigen
stabilen Konformation. Diese Konformation ändert sich oft ein wenig bei Wechselwirkungen mit anderen Molekülen der Zelle. Diese Änderung ist oft ausschlaggebend für die Funktion des Proteins. Für die Ausbildung und Stabilisierung der Tertiärstruktur sind nichtkovalente Bindungen wie elektrostatische Wechselwirkungen, van der Waals-Anziehungskräfte, Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbrücken verantwortlich (vgl. Alberts et al. 2011, S. 140-145).
Die Quartärstruktur von Proteinen ist die Anordnung von zwei oder mehreren Polypeptidketten mit Tertiärstruktur, welche durch Wasserstoffbindungen, van der Waals- Kräften und Coulombsche Kräfte zusammengehalten werden. Dies ist z.B. der Fall, wenn Proteine zu funktionellen Einheiten zusammenlagern.
Die IUPAC definiert die Quartärstruktur folgendermaßen: "quaternary structure: The defined organization of two or more macromolecules with tertiary structure such as a protein that are held together by hydrogen bonds and van der Waals and coulombic forces." (IUPAC 2010, http://goldbook.iupac.org/Q05004.html)
Eine weitere Organisationseinheit, die sich von den vier beschriebenen Organisationsstufen unterscheidet, ist die sogenannte Proteindomäne. Proteindomänen sind Strukturen, die von Teilen einer Polypeptidkette gebildet werden und sich unabhängig zu kompakten, stabilen Strukturen falten können. Proteine können mehrere unterschiedliche Domänen enthalten, welche unterschiedliche Funktionen ausüben. Eine Domäne enthält meist zwischen 40 und 350 Aminosäuren. Der Innenkern von Domänen kann aus alpha-Helices, Beta-Faltblättern oder verschiedenen Kombinationen dieser Faltungsstrukturen aufgebaut sein. Meist sind Domänen durch relativ unstrukturierte Abschnitte der Polypeptidkette miteinander verbunden (vgl. Alberts et al. 2011, S. 151).
1.2.2 Proteinbiosynthese
Das grundlegende Verständnis der Proteinbiosynthese trägt zum besseren Verständnis der Proteomik bei. Im folgenden werden daher die wichtigsten Komponenten und Schritte der Proteinbiosynthese vereinfacht zusammengefasst.
1.2.2.1 Wichtige Begriffe und deren Definitionen
In Lebewesen erfolgt der Aufbau der Proteine über die Proteinbiosynthese. Die Aminosäuresequenz von Proteinen ist in den Genen kodiert. Der Begriff Gen wird bei Alberts et al. (2011, S.1856) wie folgt definiert:
"Bezirk auf der DNA, der als eine Einheit transkribiert wird und die Information für ein einzelnes vererbtes Merkmal trägt. Üblicherweise handelt es sich dabei um (1) ein einzelnes Protein (oder ein Gruppe verwandter Proteine, die durch unterschiedliche posttranskriptionelle Prozessierung) gebildet werden oder (2) um eine einzelne RNA (oder eine Gruppe eng verwandter RNAs)."
Es handelt sich bei Genen also um spezielle Abschnitte auf der DNA, die den Code zur Herstellung eines (oder mehrerer verwandter) Proteine oder von RNA beinhalten.
Die Gesamtheit der genetischen Information (Erbinformation) einer Zelle oder eines Organismus wird als Genom bezeichnet. Es enthält alle Informationen, welche für die Entwicklung eines Lebewesens (oder Virus) nötig sind.
Definition des Genoms laut IUPAC: "genome: The complete set of chromosomal and extrachromosomal genes of an organism, a cell, an organelle or a virus; the complete DNA component of an organism." (IUPAC 2010, http://goldbook.iupac.org/G02616.html) Die Erbinformation ist dabei in sogenannten Chromosomen organisiert. Chromosomen sind organisierte Strukturen von langen DNA-Molekülen mit assoziierten Proteinen (vgl.
Alberts et al 2011, S. 1847), welche eine unterschiedliche Anzahl von Genen enthalten.
Die Anzahl der Chromosomen variiert dabei von Lebewesen zu Lebewesen.
Definition des Begriffs Chromosom bei der IUPAC: "A self-replicating structure consisting of DNA complexed with various proteins and involved in the storage and transmission of genetic information; the physical structure that contains genes (cf. plasmid). Eukaryotic cells have a characteristic number of chromosomes per cell (cf. ploidy) and contain DNA as linear duplexes. The chromosomes of bacteria consist of double-stranded, circular DNA molecules. " (IUPAC 2010, http://goldbook.iupac.org/C01077.html)
1.2.2.2 Nucleinsäuren: DNA und RNA
Die Nucleinsäuren DNA (Desoxyribonucleinsäure, engl. desoxy ribonucleic acid) und RNA (Ribonucleinsäure, engl. ribonucleic acid) sind lineare Polymere, die aus vier
verschiedenen Nucleotidbausteinen bestehen, welche über Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind.
Die Nucleotide der DNA enthalten die Purin-Basen Adenin (A) und Guanin (G) sowie die Pyrimidin-Basen Cytosin (C) und Thymin (T). Als Zucker enthalten sie Desoxyribose.
Die DNA-Einzelstränge lagern sich entgegengesetzt zu einem Doppelstrang zusammen, so dass an jedem Ende des Doppelstrangs ein 3'-Ende und ein 5'-Ende vorhanden ist.
Abb. 1-9: Chemische Struktur der DNA
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f0/Chemische_Struktur_der_DNA.svg (abgerufen am 22.08.2011); Urheber: Madeleine Price Ball; Lizenz: Creative Commons
Die Desoxyribonucleinsäure besteht aus den Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin, die sich über Wasserstoffbindungen zusammenpaaren (jeweils Adenin mit Thymin und Guanin mit Cytosin). Im DNA-Strang sind die Basen jeweils durch eine Phosphat-Desoxyribose-Gruppierung verbunden. Diese bilden das Rückgrat der DNA. Die Einzelstränge lagern sich in entgegengesetzter Richtung zum Doppelstrang zusammen.
Dabei paaren sich die Basen über Wasserstoffbindungen zusammen, und zwar Adenin mit Thymin über zwei Wasserstoffbrücken und Guanin mit Cytosin über drei Wasserstoffbrücken.
Im Unterschied zur DNA enthält die RNA als Zucker Ribose und anstelle der Base Thymin enthält sie Uracil (U). Da sich auch Uracil wie Thymin mit Adenin über Wasserstoffbindungen paaren kann, ist auch für die RNA eine komplementäre Basenpaarung möglich (vgl. Alberts et al. 2011, S. 370).
DNA und RNA bilden ähnlich wie die Polypeptide höher organisierte Strukturen aus, d.h.
auch hier gibt es räumliche Faltungen. Die DNA nimmt für gewöhnlich die Konformation einer schraubenförmigen Doppelhelix ein.
1.2.2.3 Transkription
Im ersten Schritt der Proteinbiosynthese wird die Information aus der DNA-Vorlage zunächst auf mRNA überschrieben. Diesen Schritt nennt man Transkription. Für die Transkription werden Enzyme, sogenannte DNA-abhängige RNA-Polymerasen, benötigt.
Diese Enzyme katalysieren die Bildung von Phosphodiesterbindungen und verknüpfen die Nucleotide. Die RNA-Polymerase bewegt sich entlang der DNA und entwindet die DNA- Helix direkt vor ihrem aktiven Polymerisationszentrum, um einen neuen Bereich des Matrizenstrangs für die komplementäre Basenpaarung freizulegen. Die RNA-Kette wird dadurch Nucleotid für Nucleotid in Richtung 5' 3' verlängert (vgl. Alberts et al. 2011, S.
372).
Spezielle Abschnitte der DNA dienen als Signale für die RNA-Polymerasen. Dadurch wird festgelegt, wo die RNA-Polymerase die Transkription beginnt bzw. beendet. Bei der Transkription in Eukaryoten sind viele Proteine als sogenannte Transkriptionsfaktoren beteiligt.
[Quellen: Alberts et al. 2011, S. 367 – 409]
1.2.2.4 Prozessieren eukaryotischer mRNA
In eukaryotischen Zellen wird bei der Transkription zunächst eine sogenannte prä-mRNA gebildet. Das Prozessieren dieser Vorläufer-mRNA zur reifen mRNA erfolgt im Kern. Dabei können drei wesentliche Schritte beobachtet werden:
(1) 5'-RNA-Capping: Sobald die RNA-Polymerase eine etwa 25 Nucleotide lange RNA- Kette hergestellt hat, wird an das 5'-Ende des neuen RNA-Moleküls ein sogenanntes Cap ("Kappe") angehängt. Dieses Cap besteht aus einem modifizierten Guaninnucleotid (7- Methylguanosin).
(2) 3'-Polyadenylierung: Am 3'-Ende wird ein Polyadenosin-Schwanz an die RNA angehängt.
Sowohl 5'-Capping als auch 3'-Polyadenylierung dienen als Signal, das der Zelle mitteilt, dass beide Enden der mRNA vorhanden sind und die mRNA-Sequenz somit vollständig ist. Sie kann aus dem Kern exportiert und zu einem Protein transliert werden.
(3) Spleißen: Die prä-mRNA enthält nicht kodierende Abschnitte (Introns) und kodierende Abschnitte (Exons). Bei der Reifung der prä-mRNA im Kern erfolgt das Spleißen (engl. splicing), bei dem die nicht kodierenden Introns entfernt werden.
[Quellen: Alberts et al. 2011, S. 385 – 409]
1.2.2.5 Translation
Die Übersetzung der reifen mRNA in Aminosäuresequenzen nennt man Translation. Die Translation von mRNA in Aminosäuren und deren Verknüpfung zu Polypeptidketten erfolgt an den Ribosomen im Cytoplasma. Abbildung 1-10 zeigt ein Schema der Translation.
Jeweils drei Nucleotide (Basentripletts, Codons) der mRNA codieren für eine Aminosäure.
Für die Translation ist tRNA (transfer RNA) verantwortlich. Die RNA besteht aus vier verschiedenen Nucleotiden, d.h. es gibt 4 x 4 x 4 = 64 mögliche Kombinationen von Nucleotid-Dreiergruppen, jedoch werden Proteine für gewöhnlich aus nur 20 Aminosäuren aufgebaut. Durch den vollständig entschlüsselten genetischen Code weiß man heute, dass manche Aminosäuren durch mehr als ein Triplett festgelegt werden (vgl. Alberts et al. 2011, S. 410f).
tRNAs sind kleine RNA-Moleküle mit ca. 80 Nucleotiden. Vier kurze Bereiche der tRNA- Moleküle bilden durch intramolekulare Basenpaarung eine Doppelhelix und ergeben die typische Faltung zu einer Kleeblatt ähnlichen Form (Sekundärstruktur). Durch weitere Wechselwirkungen über Wasserstoffbindungen zwischen verschiedenen Bereichen wird das Molekül weiter zu einer kompakten L-förmigen Struktur gefaltet (Tertiärstruktur). An den Enden dieser L-förmigen Moleküle befinden sich ungepaarte Nucleotide, die hauptverantwortlich für die Translation sind. Ein Bereich bildet das Anticodon, ein Triplett dreier aufeinanderfolgender Nucleotide, welches mit dem komplementären Codon
Abb. 1-10: Translation – Übersetzung der mRNA in Aminosäuresequenz.
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/70/Ribosom_funktion.png (abgerufen am 19.08.2011); Urheber: National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health;
Lizenz: Public Domain
Die Translation erfolgt an den Ribosomen im Cytoplamsa. Jeweils drei Nucleotide (Basentripletts, Codons) der mRNA codieren für eine Aminosäure. Für die Translation ist die tRNA (transfer RNA) verantwortlich. tRNAs enthalten jeweils drei zum jeweiligen Codon der mRNA passende (komplementäre) Nucleotide (sogenannte Anticodons) sowie eine Bindungsstelle für die zum Codon passende Aminosäure.
eines mRNA-Stranges paart. Der andere Bereich liegt am 3'-Ende des Moleküls und bindet die zum Codon passende Aminosäure. Manche Aminosäuren haben mehr als eine tRNA und manche tRNAs sind so gebaut, dass eine exakte Basenpaarung nur für die beiden ersten Positionen eines Codons notwendig ist und eine Fehlpaarung (Wobble- Paarung) bei der letzten Position toleriert werden kann (vgl. Alberts et al. 2011, S. 411).
Für die Erkennung und Kopplung der richtigen Aminosäuren sind spezifische Enzyme verantwortlich. Diese Enzyme werden Aminoacyl-tRNA-Synthetasen genannt. Sie koppeln die Aminosäuren kovalent an die Carboxygruppe am 3'-Ende der passenden tRNA-Moleküle. Diese katalytische Reaktion wird Aminoacylierung genannt (siehe Abbildung 1-11). Sie ist ATP-abhängig, es entsteht eine energiereiche Bindung zwischen tRNA und Aminosäure. Die Bindungsenergie wird später in der Proteinsynthese zum kovalenten Einbau der Aminosäure in die wachsende Polypeptidkette genutzt. In den meisten Zellen gibt es für jede Aminosäure eine eigene Aminoacyl-tRNA-Synthetase.
Viele Bakterien haben weniger als 20 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, hier ist eine Abb. 1-11: Alberts et al.: Aminosäureaktivierung. Molekularbiologie der Zelle. 5. Auflage 2011, S.
414, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA - ISBN 978-3-527-32384-5
Eine Aminosäure wird durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase in zwei Schritten für die Proteinsynthese aktiviert. Die Hydrolyseenergie des ATP wird benutzt, um eine Aminosäure über eine energiereiche Bindung an ihre tRNA zu koppeln. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase ist in dieser Abbildung nicht gezeigt.
Synthetase für die Kopplung von mehr als einer Aminosäure an die entsprechende tRNA verantwortlich (vgl. Alberts et al. 2011, S. 413ff).
Die Proteinsynthese erfolgt an Ribosomen. Ribosomen sind Komplexe aus vielen verschiedenen Proteinen und aus rRNA (ribosomale RNA). Sie sind aus einer großen und einer kleinen Untereinheit aufgebaut. Die Größenangabe erfolgt über den Sedimentationskoeffizienten (S-Wert), welcher die Sedimentationsgeschwindigkeit in einer Ultrazentrifuge angibt. Die Ribosomen von Prokaryoten (70S) bestehen aus einer großen Untereinheit mit 50S, welche sich aus 34 Proteinen, einer 5S-rRNA und einer 23S-rRNA zusammensetzt sowie aus einer kleinen Untereinheit mit 30S aus 21 Proteinen und einer 16S-rRNA. Eukaryotische Ribosomen (80S) bestehen aus einer großen 60S Untereinheit (ca. 49 Proteine, eine 5S-rRNA, eine 28S-rRNA und eine 5,8S-rRNA) und einer kleinen 40S Untereinheit (ca. 33 Proteine, eine 18S-rRNA).
Die beiden Untereinheiten liegen getrennt voneinander vor und lagern sich an einem mRNA-Molekül für die Synthese eines Proteins zusammen. Wenn ein Stopp-Codon erreicht wird, setzt das Ribosom das fertige Protein frei und die Untereinheiten trennen sich wieder. Die kleine Untereinheit ist für die korrekte Position des Leserasters bei der Codon-Anticodon-Paarung verantwortlich. Die große Untereinheit enthält ein Peptidyltransferasezentrum. Dieses katalysiert die Peptidbindung der Carboxygruppe einer wachsenden Polypeptidkette mit einer freien Aminogruppe der Aminosäure an einer tRNA (vgl. Alberts et al. 2011, S. 417 – 421).
Ein Start-Codon auf der mRNA, das Basentriplett AUG, ist für den Beginn der Translation zuständig. Es wird von der sogenannten Initiator-tRNA erkannt. Die Translation erfolgt bis zu einem Stopp-Codon (UAA, UAG oder UGA). Die Polypeptidkette wächst vom Amino-Ende zum Carboxy-Ende hin, da die Verlängerung am Carboxy-Ende erfolgt.
[Quellen: Alberts et al. 2011, S. 409 - 426]
1.2.3 Eigenschaften von Proteinen
Aufgrund der unterschiedlichen Aminosäure-Seitenketten in einem Polypeptidmolekül und aufgrund der für jedes Protein individuellen Aminosäuresequenz ergeben sich die individuellen Eigenschaften der Proteine, die in der Proteomanalyse genutzt werden:
(1) Proteine tragen unterschiedliche geladene Aminosäurereste, sie sind daher Polyelektrolyte. Die Ladung dieser Polyelektrolyte ist abhängig vom pH-Wert. Der pH- Wert, an welchem sich die negativen und positiven Ladungen des Proteins aufheben und das Proteinmolekül somit nach außen hin elektrisch neutral verhält, ist der isoelektrische Punkt pI. Am pI verhält sich das Protein neutral und bewegt sich nicht in einem elektrischen Feld.
(2) Jedes Protein hat eine charakteristische individuelle molekulare Masse (Mr).
Dadurch lassen sich Proteine mit entsprechenden Trennverfahren auch aufgrund ihrer Molekülgröße trennen.
(3) Ebenfalls aufgrund ihrer individuellen Aminosäuresequenz haben Proteine charakteristische chemisch-physikalische Eigenschaften. Proteinoberflächen können aufgrund verschiedener Wechselwirkungskräfte mit Matrixoberflächen, chromatographischen Säulen, etc. wechselwirken. Proteine lassen sich daher auch aufgrund von unterschiedlichen Adsorptions-, Affinitäts-, Retentions- und Bindungseigenschaften trennen.
[Quellen: vgl. Schrattenholz 2001, S. 49ff]
1.3 Proteom und Proteomanalyse (Proteomics)
Im Zuge der Erforschung und Entschlüsselung des genetischen Codes (z.B. durch das Human Genome Project) erkannte man, dass nicht ein Gen für ein Protein kodiert, sondern dass aus einem Gen mehrere Proteine hervorgehen können. Viele Genome, u.a.
das des Menschen, wurden mittlerweile größtenteils entschlüsselt. Für den Menschen ergeben sich dabei ca. 24000 Gene, die für Proteine codieren (vgl. Alberts et al. 2011,
S. 20). Dem gegenüber steht eine vielfach größere Anzahl von Proteinen. Diese Proteinvielfalt kann durch mehrere Faktoren erklärt werden:
(1) Alternatives Spleißen (alternative splicing): Eukaryotische DNA besteht aus kodierenden Exons und nicht kodierenden Introns. Die Introns werden zunächst zusammen mit den Exons in eine prä-mRNA überschrieben. Beim Prozessieren wird diese Vorläufer-mRNA vor der Translation in den Spliceosomen spezifisch gefaltet und an definierten Stellen geschnitten. Die Introns werden dabei entfernt und die Exons wieder zusammengefügt. Hierbei kann es zu alternativen Exon-Kombinationen kommen, was zu verschiedenen Proteinen führt.
(2) Posttranslatorisches Prozessieren: Durch chemische Modifikationen der primären Aminosäureketten wie z.B. Glykosylierungen, Anhängen von Phosphor- und Schwefelsäureresten oder durch Anhängen weiterer Proteine über Disulfidbrücken resultieren chemisch unterscheidbare Proteinderivate mit unterschiedlichen Funktionen.
(3) Posttranslatorische enzymatische Spaltungen der Aminosäureketten in funktional verschiedene Fragmente, denen manchmal auch noch Umgruppierungen zu neuen Ketten folgen.
Definition des Proteoms:
Die Gesamtheit der Proteine, welche durch das Genom einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus exprimiert werden, bezeichnet man als Proteom. Dieser Begriff wurde von Marc Wilkins 1994 in Anlehnung an das Genom geschaffen. Im Gegensatz zum Genom, welches in der DNA genau festgelegt ist, handelt es sich beim Proteom um eine variable Größe. Ein Proteom ist daher immer nur eine Momentaufnahme, die die exprimierten Proteine (und deren Menge) zu einer bestimmten Zeit unter bestimmten Bedingungen zeigt.
Man erhält bei der Proteomanalyse die momentan vorhandene Menge und die posttranslationalen Modifikationen jedes Proteins. Umweltfaktoren wie Stress, Temperatur, metabolischer Zustand, Kulturbedingungen, Interaktionen mit anderen Proteinen (Enzymen) u.a. sind Faktoren für die Beschaffenheit eines Proteoms (siehe
Abbildung 1-12). Auch Medikamente zählen zu diesen Einflüssen, sodass die Proteomanalyse gerade auch am Gebiet der Arzneimittelforschung einen hohen Stellenwert erhält.
Abb. 1-12: Wegner, Matthias: Umwelteinflüsse auf das Proteom.
http://www.home.pages.at/glasklar/proteom_analyse.html (abgerufen am 05.08.2011)
Aufgrund dieser Erkenntnisse weiß man heute, dass es für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Vorgänge in einem Organismus nicht ausreicht, nur dessen Genom zu entschlüsseln. Vielmehr ist es notwendig, die Gesamtheit der Genprodukte, d.h. der vorhandenen Proteine zu erfassen und zu analysieren.
1.4 Proteomics mit Aspergillus nidulans
Aspergillus nidulans (oder auch Emericella nidulans) zählt systematisch zur Klasse der Ascomycetes (Schlauchpilze), Unterklasse Ascomycetidae (Echte Schlauchpilze).
Bekannte Vertreter der Echten Schlauchpilze sind unter anderem die Echten Trüffel (Tuber, wertvolle Speisepilze), die Gießkannenschimmel (Aspergillus) wie z.B. Aspergillus
fumigatus (bewirkt Lungenerkrankungen beim Menschen), Aspergillus flavus (bildet cancerogene Aflatoxine) und die Pinselschimmel (Penicillium), deren Vertreter beispielsweise zur Herstellung von Penicillin und in der Lebensmittelindustrie zur Herstellung von Schimmelkäse von Bedeutung sind. Auch der zur Ordnung der Mutterkornpilze zählende Pilz Claviceps purpurea (Mutterkornalkaloide, Lysergsäurederivate) zählt zur artenreichen Unterklasse der Echten Schlauchpilze.
Aspergillus nidulans ist ein wichtiger Modellorganismus u.a. in den Disziplinen Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biotechnologie und Genetik. Aspergillus nidulans hat sich vor allem als Modellsystem für das Verständnis der Nitratverwertung etabliert.
Im Rahmen der Forschungen der Arbeitsgruppe Mikrobielle Genetik (Leitung Dr. Joseph Strauss) des Instituts für Angewandte Genetik und Zellbiologie (IAGZ) der BOKU Wien sollte auch eine Proteomanalyse von Aspergillus nidulans erfolgen. Dadurch erhoffte man sich ein ausführliches Verständnis über die Aktivierung der Nitratverwertung sowie v.a.
über die bei der Nitratverwertung exprimierten Proteine.
Die ersten Versuche der Proteomanalyse von Aspergillus nidulans mittels 2D- Gelelektrophorese fanden dabei im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Abteilung Pharmazeutische Chemie, Arbeitsgruppe Pharmaceutical Gene- and Biotechnology der Karl-Franzens-Universität Graz unter der Leitung von Dr. Andreas Kungl statt.
Literatur:
Burger, G., Strauss, J., Scazzocchio, C., and Lang, B.F. (1991) NirA, the pathway-specific regulatory gene of nitrate assimilation in Aspergillus nidulans, encodes a putative GAL4-type zinc finger protein and contains four introns in highly conserved regions. Mol Cell Biol. 1991 Nov;11(11):5746-55.
Muro-Pastor, M.I., Gonzalez, R., Strauss, J., Narendja, F. and Scazzocchio, C. (1999) The GATA factor AreA is essential for chromatin remodeling in a eucaryotic bidirectional promotor.
EMBO J. 1999 Mar 15;18(6):1584-97.
Narendja, F., Goller, S.P., Wolschek, M., and Strauss, J. (2002) Nitrate and the GATA factor AreA are necessary for in vivo binding of nirA, the pathway-specific transcriptional activator of Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 2002 Apr;44(2):573-83.
Punt, P.J., Strauss, J., Smit, R., Kinghorn, J.R., van den Hondel, C.A., and Scazzocchio, C.
(1995) The intergenetic region between the divergently transcribed niiA and niaD genes of Aspergillus nidulans contains multiple NirA binding sites which act bidirectionally. Mol Cell Biol.
1995 Oct;15(10):5688-99.
Strauss, J., Muro-Pastor, M.I., and Scazzocchio, C. (1998) The regulator of nitrate assimilation in ascomycetes is a dimer which binds a nonrepeated, asymmetrical sequence. Mol Cell Biol. 1998 Mar;18(3):1339-48.
1.5 EXT1
Das EXT1 Gen ist am langen Arm (q) des Chromosom 8 an Position 24.11 lokalisiert (Basenpaar 118,811,601 bis Basenpaar 119,124,057 am Chromosom 8, vgl.
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/EXT1).
Das EXT1 Gen enthält die Information für die Expression des Proteins Exostosin-1 (Glucuronsäure/N-Acetylglucosamin Copolymerase 1). Dieses Protein befindet sich im Golgi-Apparat, welcher ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen ist. Er modifiziert neu produzierte Enzyme und andere Proteine. Exostosin-1 bindet im Golgi- Apparat an ein weiteres Protein, Exostosin-2. Diese beiden Proteine bilden einen Komplex, welcher die Copolymerisation von Glucuronsäure (GlcA) und N- Acetylglucosamin (GlcNAc) zu Heparansulfat katalysiert (vgl. Wei et al. 2000). Das Polysaccharid Heparansulfat bildet mit Proteinen Proteoglykane. Proteoglykane sind Proteine, welche an mehrere Zucker gebunden sind. Heparansulfat ist beteiligt an der
Abb. 1-13: Lokalisation des EXT1 Gens am Chromosom 8.
http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/EXT1.jpeg (abgerufen am 29.08.2011) Das EXT1 Gen ist am langen Arm (q) des Chromosom 8 an Position 24.11 lokalisiert (8q24.11)
Regulation einer Reihe von Prozessen im Körper, unter anderem an der Blutgerinnung und an der Gefäßneubildung (Angiogenese). Es spielt auch eine Rolle in der Ausbreitung (Metastase) von Krebszellen.
Mutationen im EXT1 Gen :
Änderungen (Mutationen) im EXT1 Gen stehen in Verbindung mit der Entstehung von Hereditären multiplen Exostosen (HME), einer autosomal-dominant vererbten Erkrankung, bei welcher multiple benigne (nichtkanzerogene) Knochentumore (Exostosen) gebildet werden. Diese führen zu Fehlbildungen wie z.B. Kleinwuchs, Längendifferenzen der Extremitäten, Deformationen im Bereich der Knie und Sprunggelenke, Asymmetrien des Schulter- und Beckengürtels und Änderungen im Bereich des Handgelenks (vgl. Stieber und Dormans 2005).
Eine weitere Erkrankung in Zusammenhang mit einer Veränderung des EXT1 Gens ist das Langer-Giedion-Syndrom, welches durch eine Mikrodeletion1 am Chromosom 8 entsteht, wobei mindestens ein weiteres Gen, TRPS1 in Position 8q24.12, betroffen ist.
Das Langer-Giedion-Syndrom führt zu multiplen Exostosen, welche Schmerz, eingeschränkte Beweglichkeit von Gliedern sowie Druck auf Nerven, Blutgefäße, Rückenmark und Gewebe, welche die Exostosen umgeben, verursachen können. Weitere Symptome sind Kleinwüchsigkeit und zapfenförmige Enden der langen Röhrenknochen (Epiphysen). Typische äußere Merkmale von Personen mit Langer-Giedion-Syndrom sind spärliches Haupthaar, eine abgerundete Nase, eine lange flache Fläche zwischen Nase und Oberlippe und eine dünne Oberlippe. Manche Betroffene haben auch intellektuelle Einschränkungen (vgl. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/langer-giedion-syndrome).
Literatur:
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/EXT1: Eintrag zu EXT1 in der Genetics Home Reference. A service of the U.S. National Library of Medicine®
http://ghr.nlm.nih.gov/condition/langer-giedion-syndrome: Eintrag zum Langer-Giedion- Syndrom in der Genetics Home Reference. A service of the U.S. National Library of Medicine®
1Eine Deletion ist eine Mutationsform, bei welcher Nukleotidsequenzen (bis hin zu ganzen Chromosomen)
Cheung, P.K, McCormick, C., Crawford, B.E., Esko, J.D., Tufaro, F., Duncan, G. (2001) Etiological point mutations in the hereditary multiple exostoses gene EXT1: a functional analysis of heparan sulfate polymerase activity. Am J Hum Genet. 2001 Jul;69(1):55-66.
Lind, T., Tufaro, F., McCormick, C., Lindahl, U., Lidholt, K. (1998) The putative tumor suppressors EXT1 and EXT2 are glycosyltransferases required for the biosynthesis of heparan sulfate. J Biol Chem. 1998 Oct 9;273(41):26265-8.
Lüdecke, H.J., Wagner, M.J., Nardmann, J., La Pillo, B., Parrish, J.E., Willems, P.J., Haan, E.A., Frydman, M., Hamers, G.J., Wells, D.E., et al. (1995) Molecular dissection of a contiguous gene syndrome: localization of the genes involved in the Langer-Giedion syndrome. Hum Mol Genet. 1995 Jan;4(1):31-6.
McCormick, C., Leduc, Y., Martindale, D., Mattison, K., Esford, L.E., Dyer, A.P., Tufaro, F.
(1998) The putative tumour suppressor EXT1 alters the expression of cell-surface heparan sulfate.
Nat Genet. 1998 Jun;19(2):158-61.
McCormick, C., Duncan, G., Goutsos, K.T., Tufaro, F. (2000) The putative tumor suppressors EXT1 and EXT2 form a stable complex that accumulates in the Golgi apparatus and catalyzes the synthesis of heparan sulfate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jan 18;97(2):668-73.
Stieber, JR, Dormans, JP. (2005) Manifestations of hereditary multiple exostoses. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons 2005 Mar-Apr;13 (2):110–20.
Wei, G., Bai, X., Gabb, M.M., Bame, K.J., Koshy, T.I., Spear, P.G., Esko, J.D. (2000) Location of the glucuronosyltransferase domain in the heparan sulfate copolymerase EXT1 by analysis of Chinese hamster ovary cell mutants. J Biol Chem. 2000 Sep 8;275(36):27733-40.
Zak, B.M., Schuksz, M., Koyama, E., Mundy, C., Wells, D.E., Yamaguchi, Y., Pacifici, M., Esko, J.D. (2011) Compound heterozygous loss of Ext1 and Ext2 is sufficient for formation of multiple exostoses in mouse ribs and long bones. Bone. 2011 May 1;48(5):979-87.
2 Methoden und Materialien
2.1 Mikrobiologische Methoden
Bei der Anzucht von Aspergillus nidulans sowie bei der Klonierung von EXT1 wurden auch Mikrobiologische Methoden angewandt. Diese werden hier kurz beschrieben.
2.1.1 Zellkultur
Eine Zellkultur dient der Kultivierung von Zellen in vitro, also außerhalb des Organismus.
Dabei müssen die Bedingungen (Nährmedien, Temperatur, pH-Wert, Licht, etc.) genau auf die jeweiligen Zellen abgestimmt sein, um ein Überleben bzw. die Vermehrung der Zellen zu garantieren.
Zellkulturen sind für die Mikrobiologie, aber auch für viele andere Forschungsdisziplinen von großer Bedeutung. In der Pharmakologie und Toxikologie kann z.B. durch Tests an Zellkulturen eine große Zahl von Tierversuchen ausbleiben. Vor allem in neueren Forschungsrichtungen wie der Biotechnologie hat die Zellkultur heute eine große Bedeutung, z.B. bei der Erforschung und Herstellung von Monoklonalen Antikörpern und von Impfstoffen.
Bei der Arbeit mit Zellkulturen ist besonders auf steriles Arbeiten zu achten. Dies kann u.a. durch Arbeiten unter einer Laminar Flow Werkbank, Verwendung von sterilen Gerätschaften, Tragen von Mundschutz und Handschuhen etc. gewährleistet werden.
2.1.2 Nährmedien
Zellen können sowohl in flüssigen als auch auf festen Nährmedien kultiviert werden.
Wichtig ist dabei, dass die Zusammensetzung genau auf die jeweiligen Zellen bzw. auf den Zweck der Kultivierung angepaßt ist. Ein Nährmedium muss dementsprechend die wichtigsten Nährstoffe (z.B. Aminosäuren, Kohlenstoffquelle, Mineralstoffe,
Spurenelemente, etc.) und sonstige Substanzen enthalten, die für das Überleben und die Vermehrung der Zellen nötig sind.
Ein häufig eingesetztes Nährmedium ist LB (engl. lysogeny broth). LB ist ein Nährmedium aus Hefeextrakt (5g/L), Trypton (10 g/L) und Natriumchlorid (0,5-10 g/L) zur Kultivierung von Bakterien. LB wird sehr häufig für die Anzucht von Escherichia coli eingesetzt.
Weitere, häufig bei der Transformation von DNA in Bakterien eingesetzte Nährmedien sind SOB- und SOC-Medium.
SOB-Medium besteht aus 2% Trypton, 0.5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4.
SOC-Medium ist SOB-Medium, welches zusätzlich 20 mM Glucose enthält.
Feste Nährmedien (Nährböden, Keimplatten) werden durch Zusatz eines möglichst neutralen Geliermittels (meist Agar) hergestellt. Dazu wird das Geliermittel im flüssigen Nährmedium gelöst und diese Lösung in Petrischalen gegossen, wo sich beim Abkühlen durch Ausgelieren des Geliermittels ein fester Nährboden bildet.
2.1.3 Selektionsmedien
Dem Nährmedium können spezielle Stoffe (meist Antibiotika) zugesetzt werden, um so gezielt das Wachstum der gewünschten Zellen zu ermöglichen, welche gegen das zugegebene Antibiotikum resistent sind. Solche Medien nennt man Selektionsmedien, da sie selektiv nur die erwünschten Zellen heranwachsen lassen. Selektionsmedien haben u.a. eine große Bedeutung beim molekularbiologischen Klonieren (siehe Kapitel 2.2.1).
Ein sehr häufig eingesetztes Selektionsmedium bei der Klonierung mit Escherichia coli Bakterien ist LB-Amp, das ist LB-Medium mit dem Antibiotikum Ampicillin.
2.1.4 Inkubation
Für die optimale Vermehrung von Mikroorganismen und anderen Zellen ist ein Temperaturoptimum erforderlich. Dies wird durch Inkubation (Bebrütung) in speziellen
Apparaturen, sogenannten Inkubatoren bzw. Brutschränken, gewährleistet. Für Flüssignährmedien gibt es Inkubationsschüttler, in welchem die Flüssigkultur z.B. durch bewegliche Bodenplatten ständig in Bewegung ist. Dadurch wird die Vermehrung begünstigt. Die Drehzahl des Schüttlers kann dabei ebenso wie die Temperatur eingestellt werden.
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Klonieren von DNA-Fragmenten
Klonieren (oder Klonierung) ist eine molekularbiologische Technik zur massenhaften Vermehrung von DNA-Fragmenten (z.B. eines Gens). Dabei wird das gewünschte DNA- Fragment in einen Vektor (meist ein Plasmid) eingebracht, mit dessen Hilfe die DNA in geeigneten Wirtszellen (z.B. von Escherichia coli) amplifiziert wird. Das Einbringen des mit dem DNA-Fragment bestückten Plasmids in kompetente Wirtszellen nennt man Transformation. Nach der Transformation des Vektors in die Wirtszellen müssen diese in geeigneten Nährmedien (z.B. auf LB-Medium) bei optimalen Wachstumsbedingungen inkubiert werden. Dabei kommen spezielle Selektionsmedien zum Einsatz, welche idealerweise nur den Wirtorganismus wachsen lassen. Plasmid-Vektoren werden so designed, dass sie spezielle Resistenzgene gegen Antibiotika (z.B. Ampicillin) enthalten.
Dem Nährmedium wird das entsprechende Antibiotikum zugefügt, so dass sich nur Bakterienzellen vermehren können, welche das Plasmid mit dem Resistenzgen enthalten.
Nach der Inkubation im Nährmedium (z.B. auf LB-Amp Nährböden) können einzelne Bakterienkolonien herausgepickt und in einer Über-Nacht-Kultur vermehrt werden.
Anschließend kann die amplifizierte DNA-Sequenz mit Hilfe der Plasmidpräparation (Mini- Prep) extrahiert werden.
Für die Klonierung müssen zunächst geeignete Schnittstellen am zu klonierenden DNA- Fragment gefunden werden. Mit Hilfe spezieller Enzyme, sogenannter Restriktionsenzyme, werden sowohl das DNA-Fragment als auch der Vektor geschnitten. Der ringförmige Plasmid-Vektor wird dabei linearisiert. Dadurch ergeben sich passende Schnittstellen, an denen man das DNA-Fragment in den Vektor einbringen
kann. Je nach eingesetztem Restriktionsenzym können so überlappende Enden (sticky ends) oder glatte Enden (blunt ends) entstehen.
Das Einbringen der Fremd-DNA in das Plasmid nennt man Ligation (von lat. ligare:
verbinden). Die Ligation erfolgt mittels DNA-Ligasen, das sind spezielle Enzyme, die die Verknüpfung von Nucleinsäuresträngen unter Ausbildung von Phosphodiesterbindungen katalysieren.
Abbildung 2-1 zeigt eine schematische Darstellung der Einbringung eines DNA-Fragments in einen Plasmid-Vektor.
Restriktionsenzyme:
Restriktionsenzyme (oder genauer Restriktionsendonucleasen) werden aus Bakterien isoliert. Anhand ihres Aufbaus werden sie in drei Kategorien eingeteilt, wobei in der Molekularbiologie eigentlich nur die Typ II Restriktionsenzyme von Bedeutung sind. Diese schneiden DNA an genau definierten Stellen. Sie bestehen aus zwei unabhängigen Proteinen: Restriktionsenzym und Methylase. Beide erkennen die gleiche Zielsequenz, wobei das Restriktionsenzym die DNA schneidet und die Methylase hemimethylierte DNA vollständig methyliert und so vor dem Abbau durch das Restriktionsenzym schützt.
Abb. 2-1: Klonierung: Restriktion und Ligation
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/ee/Klonierung2.png (abgerufen am 22.08.2011); veröffentlicht unter der GNU Free Document Lizenz (GFDL)
Das zu klonierende DNA-Fragment (Insert) und der Plasmid-Vektor werden mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten. Das Plasmid wird dadurch linearisiert. Mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase wird das DNA-Fragment in das Plasmid eingebaut. Nach der Ligation ist das Plasmid wieder ringförmig. In dieser Darstellung sind die vom Restriktionsenzym geschnittenen Enden überlappend.
Dadurch schützt sich das Bakterium gegen den Abbau seiner eigenen DNA durch die Restriktionsenzyme. Die meisten verwendeten Restriktionsenzyme erkennen eine Sequenz von vier, sechs oder acht Basen (4-, 6- bzw. 8-cutter), selten auch 5 Basen (5- cutter). Die meisten Restriktionsenzyme schneiden innerhalb ihrer Erkennungssequenz.
Es gibt aber auch Enzyme, die in einem definierten Abstand von der Erkennungssequenz schneiden. Fast alle Restriktionsenzyme schneiden so, dass Fragmente mit 5'-Phosphat- und 3'-OH-Enden entstehen. Die Enden sind entweder glatt (blunt ends), d.h. in beiden DNA-Strängen wird an der gleichen Stelle geschnitten, oder es entstehen Überhänge (sticky ends), welche meist zwei oder vier Basen lang sind. Die Beschaffenheit der Enden ist wichtig für die Ligation. (vgl. Mülhardt 1999, S. 38 ff.).
Die Nomenklatur der Restriktionsendonucleasen ist wie folgt festgelegt: der erste Buchstabe (groß geschrieben) besteht aus dem Anfangsbuchstaben der Gattung, anschließend folgen die ersten beiden Buchstaben (klein geschrieben) des Artnamens des Bakteriums, aus welchem das Enzym isoliert wurde. Diese ersten drei Buchstaben werden kursiv dargestellt. Dahinter wird die Bezeichnung des Stamms oder Typs nicht kursiv und als Großbuchstabe angefügt. Zuletzt fügt man noch die Ordnungsnummer als Lateinische Ziffer an (vgl. Mülhardt 1999, S. 40). Meist werden mehr als nur ein Restriktionsenzym in einem Organismus entdeckt. Die Ordnungsnummer gibt an, um das wievielte Enzym es sich handelt, das aus diesem Organismus gewonnen wurde.
Beispiele: EcoRI = erstes aus Escherichia coli Stamm R gewonnene Restriktionsenzym, HaeIII = drittes aus Haemophilus aegyptius gewonnenes Restriktionsenzym
Transformation:
Für die Transformation des Vektors und die anschließende Vermehrung desselben benötigt man sogenannte kompetente Wirtszellen. Kompetente Zellen sind Zellen, welche fähig sind, DNA (Plasmide) aus dem sie umgebenden Medium aufzunehmen. Einige Bakterien besitzen eine natürliche Kompetenz, d.h. sie sind ohne Manipulation befähigt, DNA aufzunehmen. Bei der Transformation in der Molekularbiologie werden meist nicht natürlich kompetente Zellen (insbesondere Escherichia coli) verwendet. Um diese transformationskompetent zu machen, müssen sie manipuliert werden. Diese Manipulation kann mittels Chemikalien (chemisch kompetente Zellen) oder durch Elektroporation (elektrokompetente Zellen) erfolgen.
Bei der klassischen chemischen Transformation verwendet man Calciumchlorid (CaCl2) mit anschließender Hitzeschockbehandlung. Dabei werden Bakterienzellen (z.B. E.
coli) mit Calciumchlorid-Lösung behandelt, mit der zu transformierenden DNA (fertiger Ligationsansatz) gemischt und auf Eis inkubiert. Danach gibt man den Reaktionsansatz für kurze Zeit in ein Wasserbad (Hitzeschock bei 42 °C). Dem Transformationsansatz wird Nährmedium (z.B. LB- oder SOC-Medium) zugesetzt und anschließend wird für 30 bis 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zuletzt werden die Bakterien auf ein Selektivmedium (z.B. LB-Amp) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Der genaue Mechanismus der chemischen Transformation nach dieser Calciumchlorid-Methode ist nicht bekannt.
Die Ausbeute bei der chemischen Transformation ist eher gering. Der Erfolg ist abhängig von der DNA, dem Bakterienstamm, vom verwendeten Medium und auch von der eingesetzten DNA-Menge. Chemisch kompetente Bakterien sind empfindlich gegen zu hohe DNA-Mengen. (vgl. Mülhardt 1999, S. 116f).
Bei der Transformation mittels Elektroporation werden elektrisch kompetente Bakterien mit dem Ligationsansatz gemischt und in eine Elektroporationsküvette gegeben.
Elektroporationsküvetten sind spezielle Küvetten, welche Elektroden mit definiertem Abstand enthalten. Die Elektroporation erfolgt nach der Bedienungsanleitung des eingesetzten Elektroporators. Dabei wird ein elektrisches Feld angelegt, welches die Zellmembran der Bakterien permeabel macht. Direkt im Anschluss an die Elektroporation wird Nährmedium (z.B. SOC- oder LB-Medium) zugegeben und für 30 – 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Bakterien auf ein Selektionsmedium ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Ausbeute bei der elektrischen Transformation ist für gewöhnlich weitaus höher im Vergleich zur chemischen Transformation und die elektrokompetenten Zellen sind wesentlich toleranter gegenüber großen DNA-Mengen (vgl. Mülhardt 1999, S. 118).
[Quellen: Mülhardt 1999, S. 115 – 120]
TOPO-Klonierung:
Eine Variante für das Klonieren von PCR-Produkten ist das TOPO® Cloning von Invitrogen. Dabei wird anstelle einer DNA-Ligase ein spezieller Vektor (TOPO TA Cloning® Vector) verwendet.
Das Prinzip der TOPO-Klonierung beruht darauf, dass die DNA Topoisomerase I sowohl als Restriktionsenzym als auch als Ligase fungiert. Die natürliche Rolle der Topoisomerase I ist das Schneiden und anschließende Wiederzusammenfügen der DNA
während der Replikation. Die Topoisomerase I des Vaccinia Virus erkennt spezifisch die Sequenz 5'-(C/T)CCTT-3' und formt eine kovalente Bindung mit der Phosphatgruppe am 3'-Thymidin. Sie schneidet einen DNA-Strang und ermöglicht so das entwinden der DNA.
Anschließend ligiert sie die Enden des geschnittenen Strangs wieder und löst sich von der DNA. Zur Ausnutzung dieser Ligations-Aktivität der Topoisomerase sind die TOPO®- Vektoren linearisiert und enthalten Topoisomerase I kovalent am 3'-Phosphat gebunden.
Das ermöglicht den Vektoren DNA-Sequenzen mit kompatiblen Enden zu ligieren. Die Ligation ist nach 5 Minuten bei Raumtemperatur fertig (vgl.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/topo/The-Technology-Behind-TOPO- Cloning.html, übersetzt aus dem Englischen).
[Quellen: Mülhardt 1999, S. 38 – 46 u. S. 100 – 122 und Invitrogen Life Technologies 2011: The Technology Behind TOPO® Cloning (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/topo/The- Technology-Behind-TOPO-Cloning.html)]
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain reaction) ist eine wichtige Methode der modernen Molekularbiologie zur Vervielfältigung von DNA. Diese Vermehrung von DNA-Abschnitten (z.B. eines Gens) nennt man Amplifikation. Dazu reichen schon sehr geringe Mengen an DNA-Probe aus. Ihre Anwendungsgebiete sind heute vielfältig: Sie wird beispielsweise bei der Überprüfung des genetischen Abb. 2-2: TOPO® TA Cloning® eines mit Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Produkts. Abgerufen von http://www.invitrogen.com am 04.09.2011.
Der TOPO®-Vektor mit der für die Topoisomerase I spezifischen Sequenz und kovalent gebundener Topoisomerase I am 3'-Phosphat. Durch die Ligations-Aktivität der Topoisomerase I entfällt bei der TOPO-Klonierung der Einsatz einer DNA-Ligase. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur ist die Ligation beendet und die Topoisomerase I löst sich vom DNA-Strang.
Fingerabdrucks in der Forensik, bei der Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen (z.B. Vaterschaftstests), in der Archäologie und Evolutionsbiologie zur Untersuchung fossiler DNA eingesetzt und war wesentlich am Erfolg des Humangenomprojekts beteiligt.
Die PCR ist ein wichtiges Werkzeug in der Erkennung von Krankheiten. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist die Klonierung von Genen. Es gibt heute viele Variationen der PCR, wobei hier nur die in dieser Diplomarbeit benutzten Varianten besprochen werden.
Für die PCR wurden eigene Geräte (Thermocycler) entwickelt, in denen alle Schritte der PCR automatisiert ablaufen. In einem Thermocycler kann die PCR für viele Proben gleichzeitig erfolgen. Variablen wie Temperatur und Zeit der einzelnen Schritte sowie die Anzahl der Zyklen können über die Softwaresteuerung des Geräts eingegeben werden.
2.2.2.1 Grundprinzip der PCR (Standard-PCR)
Das Grundprinzip der PCR besteht aus drei wesentlichen Schritten (siehe Abbildung 2-3):
Im ersten Schritt wird der DNA-Doppelstrang der DNA-Vorlage in die beiden Einzelstränge aufgetrennt. Dieser Denaturierungsschritt wird bei 94 °C durchgeführt.
Da die Denaturierung sehr rasch erfolgt und um die Komponenten des PCR-Ansatzes (Nucleotide, Primer, etc.) vor übermäßigem Zerfall zu schützen, wird dieser erste Schritt der PCR kurz gehalten (vgl. Mülhardt 1999, S. 66f).
Im zweiten Schritt der PCR wird die Temperatur gesenkt, damit die Oligonucleotid-Primer an die DNA binden (hybridisieren) können. Dieser Schritt wird als Annealing bezeichnet.
Die Annealingtemperatur richtet sich nach den eingesetzten Primern bzw. deren Schmelztemperatur. Zur Berechnung der theoretischen Primer-Schmelztemperatur gibt es verschiedene Möglichkeiten, welche unterschiedlich einfach und unterschiedlich gut sind. Die einfachste Variante besteht in der näherungsweisen Berechnung der Schmelztemperatur (Tm) über den GC-Gehalt des Primers:
Tm = 4 * (Anzahl G bzw. C) + 2 * (Anzahl A bzw. T)
Diese Gleichung ist jedoch nur für kurze Primer mit einer Länge um 20 Basen brauchbar.
Aber auch kompliziertere, sehr viel genauere Gleichungen zur Berechnung der Schmelztemperatur geben keine hundertprozentig zuverlässige Werte, so dass man die
optimale Annealingtemperatur im Zweifelsfall empirisch ermitteln muss. Dazu eignen sich PCR-Maschinen, welche Temperaturgradienten ermöglichen (vgl. Mülhardt 1999, S. 67f).
Den dritten Schritt einer PCR bildet die Elongation. Hier wird die Temperatur auf das Arbeitsoptimum der jeweils eingesetzten DNA-Polymerase eingestellt. In der Elongationsphase findet die eigentliche Amplifikation, also der Aufbau der komplementären Stränge statt. Der Primer bildet den Beginn des neuen Komplementärstrangs, welcher von der DNA-Polymerase durch Einbau der freien Nucleotide entlang der Einzelstränge des DNA-Templates vom 3'-Ende zum 5'-Ende hin aufgebaut wird.
Die Elongationszeit sollte an die Länge des erwarteten Produkts angepasst sein. Sie sollte weder zu kurz noch zu lang gewählt werden. Bei Verwendung der Taq-Polymerase wird nach Mülhardt üblicherweise mit 0,5 – 1 Minute pro kb Länge gerechnet bzw. mit 2 min/kb bei Verwendung der Pfu-Polymerase (vgl. Mülhardt 1999, S. 68).
Durch die theoretische Verdoppelung der vorhandenen Stränge pro PCR-Zyklus (exponentielle Funktion) erhält man innerhalb kürzester Zeit aus einem Template Millionen von Duplikaten. Tatsächlich liegt der Multiplikationsfaktor je Zyklus nur bei ca.
1,55 bis 1,6. Dies liegt nach Mülhardt (1999, S.68) daran, dass die Vermehrungsrate zu Beginn der PCR geringer ist, da die Wahrscheinlichkeit geringer ist, dass sich Template, Primer und Enzym zur rechten Zeit am rechten Ort treffen. Die Vermehrungsrate steigt im Laufe der PCR durch die erhöhte Templatemenge an und verringert sich am Ende der Reaktion wieder aufgrund von Hemmung durch Pyrophosphat, zerbröselnde Nucleotide und rehybridisierendes Produkt.
In der Praxis werden meist ca. 30 Zyklen einer PCR durchlaufen, um vorwiegend DNA- Produkt mit gewünschter Länge zu erhalten.
Für die Amplifikation von DNA-Abschnitten mittels PCR benötigt man
• eine DNA-Vorlage (template),
• eine thermostabile DNA-Polymerase,
• Mg2+-Ionen für die Funktionalität der Polymerase,
• zwei DNA-Oligonucleotide (Primer), welche kurz vor der gewünschten Nucleotidsequenz binden (dieses also flankieren) und für den Start der DNA- Synthese an den Einzelsträngen nötig sind,
• Nucleotide für den Aufbau der Komplementärstränge,
• Puffer,
• geeignete PCR-Tubes
• sowie einen Thermocycler, in welchem die PCR stattfindet.
Abb. 2-3: Mülhardt, Cornel: Das PCR-Prinzip. Der Experimentator: Molekularbiologie.1. Auflage 1999, S. 66, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, Lübeck, Ulm
Die drei Schritte der PCR: Denaturierung, Annealing und Elongation
Thermostabile DNA-Polymerasen : Diese werden vorwiegend aus hitzestabilen Bakterien isoliert, teilweise sind sie auch gentechnisch verändert. Ihr Aktivitätsmaximum erreichen sie bei hohen Temperaturen (z.B. Taq-Polymerase bei 74 °C). Ein weiteres wichtiges Kriterium neben der Thermostabilität von DNA-Polymerasen für den Einsatz in der PCR-Technik ist die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur (proofreading), wofür eine 3'-5'- Exonucleaseaktivität des Enzyms verantwortlich ist. Eine hohe Korrekturaktivität der DNA-Polymerase führt zu besseren Ergebnissen, da weniger Fehler (Mutationen) entstehen, die aufgrund des Prinzips der PCR in großer Menge amplifiziert werden. Die Fehlerrate von DNA-Polymerasen wird auch vom eingesetzten Puffer beeinflusst.
Manche DNA-Polymerasen hängen am Ende noch eine zusätzliche Base an, die auf dem Templatestrang nicht vorhanden ist (vgl. Mülhardt 1999, S. 73f).
In Folge werden einige wichtige thermostabile DNA-Polymerasen und ihre Eigenschaften beschrieben:
Taq-Polymerase: isoliert aus dem hitzestabilen Bakterium Thermus aquaticus, welches in 70 °C heißen Quellen wächst. Das Aktivitätsmaximum dieser Polymerase liegt bei 74 °C und einem pH-Wert > 8. Taq verfügt über keine 3'-5'-Exonucleaseaktivität zur Fehlerkorrektur. Die Taq-Polymerase hängt am Ende des neu synthetisierten DNA- Strangs häufig noch eine zusätzliche Base an, meist ein Adenosin. Die DNA-Syntheserate der Taq liegt bei 2800 Nucleotiden pro Minute (vgl. Mülhardt 1999, S. 73).
Pfu-Polymerase (aus Pyrococcus furiosus), Tma-Polymerase (aus Thermotoga maritima), und Tli-Polymerase (aus Thermococcus litoralis): Diese Polymerasen besitzen eine höhere Temperaturstabilität als Taq und eine zusätzliche 3'-5'- Exonucleaseaktivität zur Fehlerkorrektur (proofreading). Die Amplifikationsprodukte enthalten keinen Basenüberhang, sondern haben glatte Enden. Ihre Syntheserate (z.B.
550 Nucleotide/Minute für Pfu) ist dafür deutlich geringer als jene der Taq-Polymerase (vgl. Mülhardt 1999, S. 73f).
Tth-Polymerase (aus Thermus thermophilus) und Tfl-Polymerase (aus Thermus flavus): die Eigenschaften dieser DNA-Polymerasen sind ähnlich denen der Taq- Polymerase, jedoch besitzen Tth und Tfl eine ausgesprochen hohe Reverse- Transkriptase-Aktivität. Diese Enzyme können daher sowohl für die cDNA-Synthese mittels RT-PCR als auch für die PCR verwendet werden (vgl. Mülhardt 1999, S. 74).
