Pharmazeutische Chemie
Entwicklung und Validierung direkter, heterogen- kompetitiver Enzyme-linked Immunosorbent Assays für
Indometacin sowie (R)- und (S)-Ketoprofen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster
vorgelegt von Anne-Marie Reygers
aus Bocholt
-1999-
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
THEORETISCHER TEIL
1 Einleitung 1
2 Antirheumatika 2
3 Indometacin 4
3.1 Chemie 4 3.2 Pharmakokinetische Eigenschaften 4 3.3 Pharmakodynamische Eigenschaften 5
4 Überblick über die Analytik von Indometacin 7
4.1 Qualitative Methoden 7 4.2 Quantitative Methoden 7 4.2.1 Titration 7 4.2.2 Quantitative Dünnschichtchromatographie 7 4.2.3 Polarographie 8 4.2.4 Spektrophotometrie 8 4.2.5 Fluorimetrie 9 4.2.6 Chromatographie mit überkritischen mobilen Phasen (SFC) 9 4.2.7 Kapillarelektrophorese (CE) 10 4.2.8 Gaschromatographie (GC) 10 4.2.9 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 11 , 4.2.10 Radioimmunoassay (RIA) 13
5 (R)-und (S)-Ketoprofen 14
5.1 Chemie 14 5.2 Pharmakokinetische Eigenschaften 15 5.3 Pharmakodynamische Eigenschaften 15
Inhaltsverzeichnis II
6 Überblick über die Analytik von (R)- und (S)-Ketoprofen 16
6.1 Qualitative Methoden 16 6.2 Quantitative Methoden 16 6.2.1 Titration 16 6.2.2 Polarographie 17 6.2.3 Spektrophotometrie 17 6.2.4 Chromatographie mit überkritischen mobilen Phasen (SFC) 17 6.2.5 Kapillarelektrophorese (CE) 18 6.2.6 Gaschromatographie (GC) 18 6.2.7 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 19
7 Antikörper 21
7.1 Eigenschaften 21 7.2 Bildung der Antikörper 22 7.3 Antigen-Antikörper-Reaktion 23
8 Enzymimmunoassays 27 8.1 Allgemeines : 27 8.2 Prinzip des Enzymimmunoassays 28
8.2.1 Heterogen-kompetitiver direkter ELISA mit Festphasen-
gebundenem Antikörper 30 8.2.2 Heterogen-kompetitiver indirekter ELISA mit Festphasen-
gebundenem Antigen 31 8.2.3 Heterogen-nichtkompetitiver Sandwichassay 32 8.3 Auswerteverfahren für Enzymimmunoassays 33
9 Synthesen und Analytik der Hapten-Protein-Konjugate 34
9.1 Synthesen der Hapten-Protein-Konjugate 34 9.1.1 Aktivestermethode 35 9.1.2 Carbodiimid-Methode... 37 9.1.3 Carbodiimid-Additiv-Methode 38 9.2 Überprüfung der Enantiomerenreinheit der Ketoprofen-Enantiomere 39
Inhaltsverzeichnis III
9.3 Analytik der Hapten-Protein-Konjugate 40 9.3.1 Methode nach Schartiger 40 9.3.2 HPLC-Bestimmung 41 9.3.3 UV/VIS-Spektroskopie 42
10 Immunisierung 43 10.1 Isolierung der y-Globulin-Fraktion 43
11 Synthese und Analytik der Hapten-Enzym-Konjugate 45
11.1 Auswahl des Markerenzyms 45 11.2 Synthese der Hapten-POD-Konjugate 48
12 Immunchemische Untersuchung der Antiseren 49 12.1 Agarosegeldoppeldiffusion nach Ouchterlony 49
13 Testentwicklung 51
13.1 Allgemeines Testverfahren 51 13.1.1 BeSchichtung der Mikrotiterplatten 51 13.1.2 Spezifische Immunreaktion 52 13.1.3 Farbreaktion 52 13.1.4 Blind-und Bo-Werte 52
14 Testentwicklung für Indometacin 53
14.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 53 14.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 54 14.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 55 14.4 Abhängigkeit der Indometacin-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 58
15 Validierung des Indometacin-ELISA 61 15.1 Kalibrationskurve 61
Inhaltsverzeichnis IV
15.2 Kreuzreaktivität 62 15.3 Präzision 71 15.3.1 Intraassaypräzision 72 15.3.2 Interassaypräzision 73 15.4 Richtigkeit 74 15.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze 75 15.6 Meßbereich 77 15.7 Wiederfindungsrate... 79 15.7.1 Quantitative Bestimmung von Indometacin aus Fertigarzneimitteln..79
15.7.1.1 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
Indomet ratiopharm® 50 Kapseln 79 15.7.1.2 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
Indomisal® 100 Suppositorien 80 15.7.1.3 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
Indomet-ratiopharm® Gel 81 15.7.1.4 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
IndoTop® ratiopharm Spray 82 15.7.2 Quantitative Bestimmung von Indometacin aus mit Indometacin ge-
spiktem Kunsturin und Humanserum 84
16 Vergleich des Indometacin-ELISA mit der HPLC-Analytik 87
17 Testentwicklung für (S)-Ketoprofen 89
17.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 89 17.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 90 17.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 91 17.4 Abhängigkeit der (S)-Ketoprofen-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 94
18 Validierung des (S)-Ketoprofen-ELISA 97 18.1 Kalibrationskurve 97 18.2 Kreuzreaktivität 98
Inhaltsverzeichnis
18.3 Intraassaypräzision 104 18.4 Interassaypräzision 105 18.5 Richtigkeit 105 18.6 Nachweis-und Bestimmungsgrenze 106 18.7 Meßbereich 106
19 Testentwicklung für (R)-Ketoprofen 108
19.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 108 19.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 109 19.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 109 19.4 Abhängigkeit der (R)-Ketoprofen-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 112
20 Validierung des (R)-Ketoprofen-ELISA 115
20.1 Kalibrationskurve 115 20.2 Kreuzreaktivität 116 20.3 Intraassaypräzision 122 20.4 Interassaypräzision 122 20.5 Richtigkeit 123 20.6 Nachweis-und Bestimmungsgrenze 124 20.7 Meßbereich 124
21 Zusammenfassung 125
EXPERIMENTELLER TEIL
22 Allgemeines 128 22.1 Geräte und Materialien 128 22.2 Häufig verwendete Puffer und Lösungen 129
Inhaltsverzeichnis ^ VI
23 Synthesen und Charakterisierung der Hapten-Protein-Konjugate 131
23.1 Aktivestermethode 131 23.1.1 Synthese von Indometacin-NHS-Ester 131 23.1.2 Anbindung an BSA 133 23.2 Carbodiimidmethode 133 23.3 Carbodiimid-Additiv-Methode 134 23.4 Indometacin-Poly-D-Lysin-Konjugat 134 23.5 Überprüfung der Enantiomerenreinheit der Ketoprofen-Enantiomere 134 23.6 Analytik der Hapten-Protein-Konjugate 135 23.6.1 Bestimmung der Anbindungsrate nach Schöniger 135 23.6.2 Bestimmung der Anbindungsrate mittels HPLC 136 23.6.2.1 Chromatographische Bedingungen 136 23.6.2.2 Auswertung der Chromatogramrne 136 23.6.3 Bestimmung der Anbindungsrate mittels UV/VIS-Spektroskopie ...138
24 Synthese und Charakterisierung der Indometacin-POD-Konjugate 140
24.1 Herstellung der Indometacin-POD-Konjugate 140 24.1.1 Aktivestermethode 140 24.2 Aktivitätsbestimmung der POD-Konjugate 140
25 Charakterisierung der Antiseren 143
25.1 Agarosegeldoppeldiffusion nach Ouchterlony 143 25.2 Bestimmung des Gesamtproteingehaltes nach Biuret 144 25.3 Gewinnung der y-Globulin-Fraktion 145
26 Testentwicklung für Indometacin 148
26.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 148 26.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 149 26.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 150 26.4 Abhängigkeit der Indometacin-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 150 26.5 Pipettierschema 151
Inhaltsverzeichnis '_ VII
27 Validierung des Indometacin-ELISA 152
27.1 Kalibrationskurve \ 152 27.2 Kreuzreaktivität 154 27.3 Intraassaypräzision 156 27.4 Interassaypräzision 157 27.5 Richtigkeit 158 27.6 Meßbereich 159 27.7 Wiederfindungsrate 160
27.7.1 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus Indomet
ratiopharm® 50 Kapseln 160 27.7.2 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
Indomisal® 100 Suppositorien 161 27.7.3 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
Indomet-ratiopharm® Gel 162 27.7.4 Bestimmung von Indometacin nach Isolierung aus
IndoTop® ratiopharm Spray 163 27.7.5 Bestimmung von Indometacin aus mit Indometacin gespiktem
Kunsturin 164 27.7.6 Bestimmung von Indometacin aus mit Indometacin gespiktem
Humanserum 166
28 Vergleich des Indometacin-ELISA mit der HPLC-Analytik 168
29 Testentwicklung für (S)-Ketoprofen 172
29.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 172 29.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 173 29.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 173 29.4 Abhängigkeit der (S)-Ketoprofen-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 174 29.5 Pipettierschema 174
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30 Validierung des (S)-Ketoprofen-ELISA 175
30.1 Kalibrationskurve 175 30.2 Kreuzreaktivität 177 30.3 Intraassaypräzision 179 30.4 Interassaypräzision 180 30.5 Richtigkeit 181 30.6 Meßbereich 182
31 Testentwicklung für (R)-Ketoprofen 183
31.1 Ermittlung optimaler Antikörper- und Enzymtracerkonzentrationen 183 31.2 Temperatur-Zeit-Optimierung des Coatings 183 31.3 Temperatur-Zeit-Optimierung der Inkubation 184 31.4 Abhängigkeit der (R)-Ketoprofen-Antikörper-Bindung von pH-Wert
und Ionenstärke des Inkubationspuffers 184 31.5 Pipettierschema 185
32 Validierung des (R)-Ketoprofen-ELISA 186
32.1 Kalibrationskurve 186 32.2 Kreuzreaktivität 188 32.3 Intraassaypräzision 190 32.4 Interassaypräzision 191 32.5 Richtigkeit 192 32.6 Meßbereich 193
33 Literaturverzeichnis 194
