des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf Universität Hamburg
Direktorin: Prof. Dr. rer. physiol. Dr. h.c. Ulrike Beisiegel
Aufnahme, Abbau und Bindung von
ApoE(3/3)- versus ApoE(4/4)-Liposomen in hippokampalen Zellen
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg
vorgelegt von
Kathrin Röder
aus Hamburg
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am 08.02.2005
Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg.
Prüfungsausschuss, die Vorsitzende: Prof. Dr. U. Beisiegel Prüfungsausschuss, 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Seedorf Prüfungsausschuss, 3. Gutachter: PD Dr. W. Hampe
1.
Einleitung
1
1.1 Aufbau des zentralen Nervensystems 1 1.1.1 Grundstrukturen des ZNS 1
1.1.2 Neuronale Zellen 2 1.1.3 Glia-Zellen 4
1.1.4 Aufbau des Hippokampus 5
1.2 Lipoproteinstoffwechsel im Plasma 6
1.2.1 Metabolismus der exogenen Lipide 7
1.2.2 Metabolismus der endogenen Lipide 9
1.2.3 Rezeptoren im Lipoproteinstoffwechsel – die LDL-Rezeptor-Familie 10
1.2.4 Apolipoproteine im Plasma 13
1.3 Lipoproteinstoffwechsel im ZNS 14 1.3.1 Liquor cerebrospinalis 15
1.3.2 Lipoproteine und Apolipoproteine im ZNS 16
1.3.3 Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie im ZNS 19
1.4 Apolipoprotein E 21
1.4.1 Genlokus, Synthese und Struktur des Apolipoprotein E 21
1.4.2 Isoformen des ApoE 22 1.4.3 Rolle des ApoE im Lipoproteinstoffwechsel im ZNS 24 1.5 Alzheimersche Erkrankung 27
1.6 Ziel der Arbeit 28
2. Material und Methoden
29
2.1 Zellkultur 29
2.1.1 Primärkultur muriner hippokampaler Zellen 29
2.1.2 Zellkultur der HT 22- Zelllinie 31
2.2 Isolierung und Analyse der Liganden 32
2.2.1 Lyophilisation von ApoE(3/3) und ApoE(4/4) 32
2.2.3 125I-Markierung der ApoE(3/3)- bzw. ApoE(4/4)-Liposomen 34 2.2.4 Isolierung der Chylomikronen-Remnants 35
2.2.5 Proteinbestimmung nach Lowry 36
2.2.6 SDS-Polyacrylamidelektrophorese 37
2.3 Analyse der Rezeptoren der verwendeten Zelllinien 39
2.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese 39 2.3.2 Westernblot und Immundetektion 39
2.4 Radioaktive Zellassays 41
2.4.1 Bindungs-, Aufnahme- und Abbauexperimente mit primären murinen
hippokampalen Zellen 41
2.4.2 Aufnahmeversuche mit primären murinen hippokampalen Zellen 44 2.4.3 Aufnahmeversuche mit HT 22-Zellen 44 2.4.4 Bestimmung des Zellproteins nach Bradford 45
2.5 Immunfluoreszenz 46
2.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz 46
2.5.2 Aufnahmeexperimente mit den Zelllinien mittels Immunfluoreszenz 47
2.6 Geräteliste 47
3. Ergebnisse
48
3.1 Charakterisierung der Rezeptoren der hippokampalen Zelllinien und der
Liganden 48
3.1.1 Charakterisierung der Rezeptoren der hippokampalen Zelllinien 48 3.1.2 Charakterisierung der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen
bzw. 125I-ApoE(4/4)-Liposomen 50
3.1.3 Charakterisierung der Chylomikronen-Remnants 51
3.2 Aufnahmeassays mit hippokampalen Zellen mit 125I-ApoE(3/3)-Liposomen
bzw. 125I-ApoE(4/4)-Liposomen als Liganden 52
3.2.1 Aufnahme der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen in HT 22-Zellen bei kalter
3.2.2 Aufnahme der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen bei kalter Unterdrückung mit ApoE-Liposomen versus LDL versus CR versus RAP 56 3.2.3 Aufnahme der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen
am 2. Tag versus 5. Tag in Kultur 60 3.2.4 Vergleich der Aufnahme der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären
hippo-kampalen Zellen versus HT 22-Zellen 62
3.2.5 Aufnahme der 125I-ApoE(3/3)-Liposomen bei einstündiger versus vierstündiger Inkubation 63 3.2.6 Aufnahme, Abbau und Bindung von 125I-ApoE(3/3)-Liposomen bzw.
125
I-ApoE(4/4)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen 64 3.2.7 Aufnahme von 125I-ApoE(3/3)-Liposomen versus 125I-ApoE(4/4)-Liposomen
am 1. versus 2. versus 5. Tag in Kultur 67
3.3 Aufnahmeexperimente mit ApoE(3/3)-Liposomen versus
ApoE(4/4)-Liposomen als Liganden in der indirekten Immunfluoreszenz 69
4. Diskussion
73
4.1 HT 22-Zellen und hippokampale Primärkultur 73
4.2 ApoE(3/3)- und ApoE(4/4)-Liposomen als Liganden in
Aufnahmeexperimenten 75
4.3 Aufnahme von 125I-ApoE(3/3)-Liposomen in hippokampalen Zellen 76 4.4 Aufnahme, Abbau und Bindung von 125I-ApoE(3/3)-Liposomen versus
125
I-ApoE(4/4)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen 78
4.5 Aufnahme von ApoE(3/3)-Liposomen versus ApoE(4/4)-Liposomen in der
Immunfluoreszenz 80
4.6 Betrachtung der Ergebnisse vor dem biochemischen und
medizinischen Hintergrund 81
5. Zusammenfassung
85
6. Literaturverzeichnis
87
8. Danksagung
105
9. Lebenslauf
106
1.Einleitung
1.1 Der Aufbau des zentralen Nervensystems
1.1.1 Grundstrukturen des ZNS
Das ZNS setzt sich aus dem Rückenmark und dem Gehirn zusammen. Zum Schutz wird das Gehirn vom knöchernen Schädel und das Rückenmark von den Wirbeln der Wirbel-säule umgeben. Innerhalb dieser knöchernen Kapseln ist das ZNS von drei binde-gewebigen Hirn- bzw. Rückenmarkhäuten, den Meningen, umhüllt, bestehend aus Dura mater, Arachnoidea mater und Pia mater. Im subarachnoidalen Raum, in den Ventrikeln des Gehirns und im Zentralkanal umspült der Liquor das ZNS (siehe 1.3.1).
Im folgenden werden die Grundstrukturen des Gehirns, soweit für diese Arbeit von Interesse, aufgeführt.
Systematisch wird das Gehirn in Telencephalon (Endhirn), Diencephalon (Zwischenhirn) und Truncus encephali (Hirnstamm) unterteilt. Der Hirnstamm beinhaltet das Mesencepha-lon (Mittelhirn), das MetencephaMesencepha-lon (Nachhirn) mit Pons (Brücke) und Cerebellum (Kleinhirn) und die Medulla oblongata (verlängertes Rückenmark).
Näher soll das Telencephalon, der größte Abschnitt des menschlichen Gehirns (>80 % des Gehirngewichtes), beschrieben werden. Funktionell kann das Endhirn Informationen verarbeiten, speichern und komplexe Vorgänge steuern, einschließlich der emotionalen Einflüsse. Hier werden auch Ereignisse bewußt gemacht, Pläne entwickelt und Handlungsabläufe haben hier ihren Ursprung.
Das Endhirn besteht aus 2 Hemisphären, die durch eine tiefe Längsfurche (Fissura longitudinalis cerebri) voneinander getrennt sind, jedoch durch zahlreiche Nervenfaser-bündel miteinander verbunden werden. Die größte dieser verknüpfenden Kommissuren stellt der Balken (Corpus callosum) dar. Jede Hemisphäre wird von einer nervenzell-reichen Rinde (Cortex cerebralis) bedeckt und weist in der Tiefe subkortikale Kerne auf. Die Großhirnrinde (Cortex cerebri) läßt 6 Lappen unterscheiden: Lobus frontalis, Lobus parietalis, Lobus occipitalis, Lobus temporalis, Lobus insularis und Lobus limbicus. Ein weiterer Teil der Rinde ist der in der Tiefe liegende Hippocampus (siehe 1.1.4). Die funktionellen und strukturellen Spezialisationen der einzelnen Lobi des Cortex sind entsprechenden Lehrbüchern zu entnehmen und sollen hier nicht weiter ausgeführt werden. Entsprechend der anderen Abschnitte des ZNS weist auch das Endhirn eine innere Gliederung in graue nervenzellreiche (Substantia grisea) und weiße nervenfaserreiche
Substanz (Substantia alba) auf. Die graue Substanz besteht aus Perikarya, Neuropil, dem zwischen den Nervenzellen gelegenen Netzwerk aus Fortsätzen verschiedener Art (Neuriten, Dendriten und Gliafortsätzen), und Kapillaren. In der weißen Substanz ver-laufen die Nervenfasern, die von den Perikarya ausgehen, meist in Tractus gebündelt. Im Telencephalon wird die graue Substanz von den Endhirnkernen (im wesentlichen Nucleus caudatus, Putamen, Globus pallidus, Claustrum und Corpus amygdaloideum) und der Großhirnrinde (Cortex cerebralis) inklusive des Hippokampus gebildet. Die weiße Substanz, unter der Rinde und um die Kerne gelegen, besteht aus der Summe der markhaltigen und markarmen Nervenfasern, die der Verbindung der Rinde und der Endhirnkerne dienen.
1.1.2 Neuronale Zellen
Die Nervenzellen (Neurone) erfüllen die spezifischen Aufgaben des Nervengewebes: die Erregungsbildung, -verarbeitung und -leitung innerhalb des ZNS und an die Peripherie. Morphologisch sind die Neurone durch das Perikaryon, den Zellkörper (Soma) mit Zellkern und umgebendem Zytoplasma, und die Neuriten (Fortsätze), die sich in das Axon und die Dendriten unterteilen, gekennzeichnet. Die Dendriten sind in der Regel baumartig verzweigt und dienen der afferenten (zum Perikaryon hin) Leitung der Signale, die sie über ihre Synapsen (Kontaktstellen zwischen Axon und folgenden Strukturen, z.B. Dendriten) aus der Umgebung, von Sinnesepithelzellen oder von anderen Nervenzellen empfangen. Jedes Neuron besitzt nur ein Axon, das der efferenten (vom Perikaryon weg) Weiterleitung von Signalen oft über längere Strecken zu anderen Zellen (z.B. andere Nervenzellen, Muskelzellen, Drüsenzellen) dient. Es ist am distalen Ende verzweigt und überträgt sein Signal über mehrere Synapsen an die Zielzellen.
Das Perikaryon hat einerseits rezeptive Funktionen, ist anderseits aber auch das Stoffwechselzentrum des Neurons. Es verfügt über alle erforderlichen Organellen, insbesondere zur Proteinsynthese. Perikarya enthalten ein differenziertes rauhes endoplas-matisches Retikulum (rER), das sich mit freien Ribosomen zu sogenannten basophilen Nissl-Schollen zusammenlagert. Auch die Strukturen des Golgi-Apparates, des trans-Golgi-Netzwerkes sowie Mitochondrien und Lysosomen lassen sich im Zellkörper finden. Neurofilamente (ø 10 nm) und Aktinfilamente (ø 8 nm) bilden innerhalb des Perikaryons Bündel oder fassen z.B. rER und Ribosomen in Gruppen zusammen. Außerdem wirken Neurotubuli (neuronale Mikrotubuli) (ø 24 nm) bei intrazellulären Transportvorgängen sowie bei Exo- und Endozytose mit.
Die verzweigten Dendriten enthalten im Anfangsteil alle für das Perikaryon typischen Organellen einschließlich Nissl-Schollen und Golgi-Apparat. Mit der Entfernung vom Zellleib, fortschreitender Verzweigung und dadurch abnehmendem Durchmesser ver-schwinden die meisten Organellen jedoch, nur Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind auch noch in dünneren Dendriten vorhanden. Aktinfilamente, Neurofilamente und Neurotubuli sind hingegen auch noch in den feinsten Verästelungen zu finden, beeinflussen die Form der Dendriten und stehen im Zusammenhang mit Transportvorgängen.
Das einzelne Axon beginnt an einem Ursprungskegel (Axonhügel des Perikaryons) und verläuft mit gleichbleibendem Durchmesser umgeben von einer Gliascheide zu seiner Zielzelle. Im Plasma des Axons (Axoplasma) sind in der Regel weder rER und Ribosomen noch Golgi-Bestandteile zu finden, es sind jedoch glattes ER und Mitochondrien sowie ein charakteristisch stark ausgeprägtes Zytoskelett enthalten. Die parallel verlaufenden Bündel von Neurotubuli und Neurofilamenten dienen der Aufrechterhaltung der Architektur des Axons sowie den axoplasmatischen Transportvorgängen. Der axoplasmatische Transport findet entlang der Neurotubuli und Neurofilamente bidirektional statt, anterograd (vom Perikaryon zum Axonende) und retrograd (vom Axonende zum Perikaryon), und ist sowohl bei Migrationsvorgängen als auch bei Wachstumsprozessen von entscheidender Bedeutung.
Die Filamente des Zytoskeletts werden durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAP) stabilisiert, wobei eine lokale Spezifität auftritt. MAP-2 wird ausschließlich in die Dendriten transportiert, während τ (Tau), ein anderes MAP, nur in Axonen zu finden ist. Beide MAP kommen nur in Neuronen vor, so daß sie als Markerproteine fungieren.
Die Rezeptor-vermittelte Endozytose vieler Moleküle wie z.B. der Lipoproteine ist an einigen nicht-neuronalen Zellen erforscht worden und mittlerweile recht gut charakterisiert. Die spezielle Morphologie der Neuronen führt bei der Aufnahme von Molekülen zu einigen Besonderheiten, so daß im folgenden zunächst der Ablauf der Endozytose im allgemeinen beschrieben werden soll, um dann die neuronalen Besonderheiten zu erwähnen.
Die Liganden binden spezifisch an ihre Rezeptoren und werden über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Liganden und Rezeptoren werden durch verschiedene endosomale Kompartimente transportiert, an die Oberfläche der Zelle zurückgeleitet (recycelt) oder transzytiert. In sogenannten frühen und sortierenden Endosomen werden
die Liganden und Rezeptoren entkoppelt und sortiert. Moleküle, die recycelt werden sollen, werden in Recycling-Kompartimenten an die Zelloberfläche geleitet, während Liganden, die abgebaut werden sollen, in sogenannten ´multivesicular bodies´ (MVB) und späten Endosomen zu den Lysosomen transportiert werden. In nicht-neuronalen Zellen finden diese Vorgänge in der Regel nahe um den Zellkern statt.
In vitro wurde die Endozytose von neuronalen Zellen an Primärkulturen untersucht
(Zusammenfassung siehe Parton et al., 1992). Die endozytotische Aktivität ist an den Oberflächen der verschiedenen morphologischen Kompartimente der Neuronen unter-schiedlich. Entlang des Axons konnte mit Ausnahme der präsynaptischen Endigungen keine Endozytose festgestellt werden. Die Versorgung des Neurons mit Nährstoffen wird durch die hohe endozytotische Aktivität der gesamten somatodendritischen Oberfläche sichergestellt. Von Dendriten endozytotisch internalisierte Marker lassen sich in einem endosomalen Netzwerk nachweisen, das bis in die distalen Dendriten reicht. Hier scheint die Entkopplung der Liganden von den Rezeptoren und die Sortierung und Weiterleitung in Recycling-Kompartimente oder in MVB-ähnliche Kompartimente stattzufinden. Die frühen endosomalen Kompartimente in den Synapsen ähneln denen der Dendriten und scheinen an der Bildung der synaptischen Vesikel beteiligt zu sein.
Die späten Endosomen und die Lysosomen der Neuronen sind zentral im Soma und in den proximalen Anteilen der Dendriten lokalisiert, so daß die aufgenommen Liganden von den peripheren frühen Endosomen zum Umsatz und Abbau retrograd entlang des Axons und der Dendriten zum Perikaryon transportiert werden müssen. Der schnelle retrograde Transport erfolgt, wahrscheinlich durch MVB-ähnliche Strukturen vermittelt, entlang der Mikrotubuli.
1.1.3 Glia-Zellen
Ungefähr die Hälfte des Gesamtvolumens des zentralen Nervensystems besteht aus nicht-erregbaren Zellen. Den bei weitem größten Teil bilden die Gliazellen, in der Gesamtheit auch als Neuroglia bezeichnet, im geringen Anteil sind z.B. auch Gefäßzellen vorhanden. Gliazellen sind viel kleiner und zahlreicher als Neuronen. Das Verhältnis Nervenzelle zu Gliazelle wird auf 1 zu 10 geschätzt. Alle Gliazellen behalten zeitlebens ihre Teilungs-fähigkeit. Im ZNS lassen sich folgende Gliazellen unterscheiden: Astrozyten und Oligo-dendrozyten (gemeinsam als Makroglia bezeichnet), Mikroglia und Ependymzellen.
Die Makroglia und die Ependymzellen sind wie die Neuronen ektodermaler Herkunft, während die Mikroglia aus dem Mesoderm stammt und erst später ins ZNS einwandert.
Astrozyten sind die größten Zellen der Neuroglia und besitzen zahlreiche Fortsätze. Charakteristisch sind die verbreiterten Enden der Fortsätze, die als „Gefäßfüße“ die Kapillaroberflächen bedecken, aber auch auf der Oberfläche von Gehirn und Rückenmark mit ihren „Füßen“ die Membrana limitans gliae superficialis bilden, die die Pia mater von den Nervenzellen trennt. Zu unterscheiden sind protoplasmatische Astrozyten, die in der grauen Substanz vorkommen und viele kurze, stark verzweigte Fortsätze haben, und fibrillenreiche Faserastrozyten, die in der weißen Substanz auftreten und wenige lange Fortsätze aufweisen. Astrozyten stehen im Stoffaustausch mit Neuronen, sorgen so für die Versorgung der Nervenzellen und halten durch Aufnahme von Ionen und Neuro-transmittern das Milieu des Extrazellularraumes konstant. Als Antigen-präsentierende und Interleukin 1-sezernierende Zellen wird den Astrozyten auch eine immunologische Bedeutung zugeschrieben. Außerdem dienen Astrozyten während der Neurogenese als Leitstrukturen, die die Nervenzellen an ihren Bestimmungsort führen. Verbunden wird diese Aufgabe mit der Produktion von Substanzen, die das Nervenzellwachstum fördern und so nicht nur während der Neurogenese, sondern auch bei Regeneration von verletzten Nervenbahnen von Bedeutung sind.
Oligodendrozyten kommen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz vor. Sie bilden die Markscheiden im ZNS und verlaufen deshalb in der weißen Substanz parallel zu den markhaltigen Fasern. Von besonderer Bedeutung ist die Sekretion von Hemmstoffen, die eine wichtige Rolle in der Neurogenese und bei Regenerationsprozessen spielen dürften.
Mikroglia sind sehr bewegliche Zellen, die in der grauen und der weißen Substanz zu finden sind. Sie können phagozytieren und dienen bei immunologischen Prozessen als Antigen-präsentierende Zellen.
Ependymzellen begrenzen die Hohlräume von Gehirn und Rückenmark. Sie bilden eine wichtige, großenteils durchlässige Schranke zwischen innerem Liquorraum des ZNS und Nervengewebe. Als besondere Form bilden die Ependymzellen die Plexus choroidei.
1.1.4 Aufbau des Hippokampus
Der Hippokampus (lat. Seepferdchen, wegen seines S-förmigen Querschnittes) ist ein phylogenetisch altes Gebiet des Cortex (Archaeokortex). Zu großen Teilen wurde er während der Entwicklung des ZNS in die Tiefe des Großhirns verlagert. Funktionell ist der Hippokampus mit dem Lobus limbicus, dem limbischen System, verbunden und ist so an der Entstehung und Empfindung von Gefühlen beteiligt. Außerdem spielt das limbische
System eine besondere Bedeutung beim Speichern von Informationen und Zugriff auf das Gedächtnis. Der Hippokampus ist dem Balken eng benachbart und bildet eine Vorwölbung im Boden des Seitenventrikels. Auf einem Transversalschnitt durch den Hippokampus sind drei Abschnitte in S-förmiger Anordung zu finden: Regio entorhinalis, Subiculum und Gyrus dentatus, die zusammen das Ammonshorn bilden. Histologisch setzt sich der Hippokampus aus einer relativ homogenen Population von bis zu 90% pyramidalen Zellen mit gut beschriebener Morphologie (siehe 1.1.2) und ungefähr 10% Gliazellen (Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia, siehe 1.1.3) zusammen.
1.2 Lipoproteinstoffwechsel im Plasma
Um die physiologischen Abläufe des Organismus der Säugetiere aufrechtzuerhalten, ist eine permante Versorgung jeder Zelle des Körpers mit Lipiden essentiell. Als Haupt-vertreter der Lipide sind insbesondere Triglyzeride, Cholesterin und Phospholipide an vielen komplexen physiologischen Vorgängen im Organismus beteiligt. Triglyzeride dienen als energieliefernder Brennstoff, aus Cholesterin werden Steroide und Gallensäuren synthetisiert und gemeinsam mit Phospholipiden Zellmembranen aufgebaut.
Da die Lipide nicht in hydrophilen Transportmedien (z.B. Blut und Liquor) des menschlichen Organismus löslich sind, kann der Transport nur durch Lipoproteinen als amphiphile Transportform sichergestellt werden.
Lipoproteine sind komplexe hochmolekulare Partikel, die sich in unterschiedlichen Anteilen aus Cholesterin und seinen Estern, Triglyzeriden, Phospholipiden und speziellen Proteinen, den Apolipoproteinen, zusammensetzen. Die apolaren Lipide, Triglyzeride und Cholesterinester bilden den hydrophoben Kern der sphärischen Komplexe. Die umgebende Hülle ist vor allem aus Phospholipiden, freiem Cholesterin und Apolipoproteinen aufgebaut. Diese amphiphilen Bestandteile der Hülle sind mit ihrem apolaren Anteil zum Kern ausgerichtet, während die polaren Anteile auf der Oberfläche der Komplexe die Löslichkeit im hydrophilen Milieu vermitteln. Die assoziierten Apolipoproteine können als Bestandteil der Hülle nicht nur als Strukturproteine dienen, sie spielen auch eine große Rolle im Metabolismus der Lipoproteine. Sie werden als spezifische Liganden von den Oberflächenrezeptoren der Zielzellen gebunden und sind so an der Bindung und Aufnahme der Lipoproteine beteiligt. Die Bedeutung der Apolipoproteine wird durch ihre Modulation der Aktivität der Enzyme, die am Lipoproteinmetabolismus beteiligt sind, noch erweitert.
Die Lipoproteine werden mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation in Dichtefraktionen aufgetrennt, auf diese Fraktionen bezieht sich auch ihre gängige Nomenklatur (Kostner & Maerz, 2001; Havel et al., 1955). Zu den weiteren Charakteristika der verschiedenen Lipoproteinklassen zählen ihre unterschiedliche Größe, Zusammensetzung sowohl im Lipid- als auch im Apolipoproteinanteil, elektrophoretische Mobilität und unter-schiedlichen Syntheseorte. In Tab. 1 sind die wichtigsten Eigenschaften der Lipoproteine zusammengefaßt.
Chylomikronen (CM) sind die größten Lipoproteine mit der geringsten Dichte und dem höchsten Lipidanteil, Chylomikronen-Remnants (CR) sind Abbauprodukte der CM. VLDL (´very low density lipoproteins´) transportieren Lipide aus der Leber, IDL (´intermediär density lipoproteins´) und LDL (´low density lipoproteins´) entstehen aus VLDL durch Lipoproteinlipase-katalysierte Lipolyse und Austausch mit anderen Lipoproteinen.
HDL (´high density lipoproteins´) transportiert als kleinstes und dichtestes Partikel Cholesterin aus der Peripherie in die Leber.
Chylo-mikronen VLDL IDL LDL HDL Dichte [g/ml] <0,96 0,96-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,210 Durchmesser [nm] 75-1200 30-80 25-35 18-25 5-12 Molekulargewicht [kD] 5-1000x103 10-80x103 5-10x103 2-3x103 0.6-3,8x102
Syntheseort Darm Leber aus VLDL aus IDL Leber
Elektrophor. Mobilität keine Prä-ß Prä-ß / ß ß α
Zusammensetzung [% der Masse]: Triglyzeride 86 55 23 6 4 Cholesterin/-ester 5 19 38 50 18 Phospholipide 7 18 19 22 34 Proteine 1-2 6-10 11 21 45-55
Apolipoproteine (Apo) ApoA-I,-II,-IV ApoA-I,-II
ApoB48 ApoB100 ApoB100 ApoB100
ApoC-I,-II,-III ApoE ApoC-I,-II,-III ApoE ApoC-III ApoE ApoC-I,-II,-III ApoE
Tabelle 1: Charakteristika der Lipoproteine im Plasma
Die dargestellten Daten sind der Literatur entnommen (Kostner & Maerz, 2001; Kane et al., 1996; Gotto et al., 1986; Havel et al., 1955;). Die Nomenklatur wurde im vorhergehenden Text erläutert. Die elektrophoretische Mobilität bezieht sich auf die Auftrennung in einem nativen Agarosegel.
1.2.1 Metabolismus der exogenen Lipide
Die Stoffwechselwege der exogenen Lipide beschreiben die Aufnahme und den Transport der durch Nahrung zugeführten Lipide. Die Nahrungslipide erreichen den Dünndarm bereits teilweise durch ortsständige Lipasen in Mund und Magen hydrolisiert. Im Duodenum werden die entstandenen Lipidtröpfchen durch Gallensäure emulgiert. Die
pankreatische Lipase spaltet die Fette weiter, so daß freie Fettsäuren und 2-Monoacylglyzeride entstehen, die sich in Mizellen zusammenlagern. Im Jejunum werden die freien Fettsäuren und die Monoacylglyzeride entlang eines Diffusionsgradienten von den Enterozyten aufgenommen und sofort zu Triglyzeriden reverestert. Die Gallensäuren werden getrennt von den Mizellen rezeptorvermittelt resorbiert und in der Leber recycelt. In den Mukosazellen des Dünndarm erfolgt anschließend die Biosynthese der Chylomikronen. Im Golgi-Apparat der Zellen werden die reveresterten Triacylglyzerine mit Cholesterin, Phospholipiden und den Apolipoproteinen ApoA-I, -II, -IV und ApoB48
assoziiert, die so synthetisierten Chylomikronen werden exozytotisch an den extrazellulären Raum abgegeben. Über die intestinalen Lymphwege und den Ductus thoracicus gelangen die Chylomikronen in den Blutkreislauf (Hussain et al., 1996). Im Blutplasma verändert sich die Zusammensetzung der Chylomikronen, sie nehmen von intravaskulärem HDL die Apolipoproteine ApoC-I, -II und –III auf. ApoC-II dient als essentieller Kofaktor (Breckenridge et al., 1978) der endothelständigen Lipoprotein-Lipase (LpL), mit der die Chylomikronen während ihrer intravaskulären Passage in Kontakt kommen. LpL spaltet die Triglyzeride im Kern der Chylomikronen (Eisenberg et al., 1992). Hierbei entstehen freie Fettsäuren, die zum Weitertransport größtenteils an Albumin gebunden werden und Muskelzellen als Energielieferant dienen, im Fettgewebe gespeichert oder von Zellen als Membranbausteine verwertet werden (Olivecrona et al.,1993). Das Enzym LpL löst sich von den Heparansulfat Proteoglykanen (HSPG), an die es auf der Oberfäche der Endothelzellen gebunden ist, und verbleibt an die Partikel assoziiert (Felts et al., 1975; Krapp et al., 1996; Lutz et al., 2001). Die Zusammensetzung der Chylomikronen verändert sich durch den Kontakt mit den anderen Lipoproteinen weiter. Aus den Chylomikronen entstehen durch Austausch von Lipiden und Apolipoproteinen mit anderen Lipoproteinen kleinere und dichtere Chylomikronen-Remnants (CR). Während dieser Umwandlung nehmen die Chylomikronen neben den ApoCs auch ApoE von den HDL auf. ApoCs haben eine inhibitorische Wirkung auf die zelluläre Aufnahme der CR und werden wieder abgespalten, während ApoE an den CR verbleibt. ApoE vermittelt mit Unterstützung der partikelassoziierten LpL die Bindung der CR an die Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie (Beisiegel et al., 1989) und ermöglicht so die Rezeptor-vermittelte Endozytose der CR in die Leberzellen.
1.2.2 Metabolismus der endogenen Lipoproteine
In der Leber werden die Lipide, die mit den Chylomikronen-Remnants aufgenommen werden, zur endogenen Synthese von VLDL verwendet. Ähnlich der Synthese der Chylomikronen in den Mukosazellen werden die VLDL in den Hepatozyten produziert. Endogen synthetisierte Triglyzeride, Phospholipide und Cholesterin werden mit Apolipoproteinen assoziiert, die prozentuale Zusammensetzung ist Tabelle 1 zu entnehmen. VLDL besitzen charakteristischerweise ApoB100 und ApoE auf der
Ober-fläche ihrer Hülle, ApoCs nehmen sie wie die Chylomikronen von HDL auf. Die Zusammensetzung der VLDL ändert sich während der intravaskulären Passage ebenfalls entsprechend der Umwandlung der Chylomikronen in ihre Remnants. LpL katalysiert die Hydrolyse der Triglyzeride, Phospholipide und Cholesterin werden an HDL abgegeben. Das Cholesterin wird in den HDL katalysiert durch Lezithin-Cholesterinacyltransferase (LCAT) verestert und die Cholesterinester mit Hilfe des Cholesterin-Ester-Transfer-Protein (CETP) auf die VLDL übertragen. Es entstehen IDL, die sich durch weitere Hydrolyse, katalysiert durch LpL und die hepatische Lipase (HL), zu cholesterinreichen LDL umwandeln (Griffin & Packard, 1994).
VLDL, IDL und LDL können in allen Zwischenstufen durch Bindung von Apolipoproteinen an Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie endozytotisch aufgenommen werden. VLDL und seine Remnants sichern so die Versorgung der verschiedenen Gewebe des Körpers in Hungerzuständen. Für die Bindung von VLDL und IDL an die Rezeptoren dient vor allem ApoB100 aber auch ApoE als Ligand, LDL enthält nur noch ApoB100 als
Apolipoprotein. Nach der Endozytose der Partikel werden die Remnants lysosomal abgebaut und dadurch insbesondere Cholesterin für die Membran- und Hormonsynthese bereitgestellt (Kovanen et al., 1979). Um eine möglichst konstante Cholesterin-konzentration zu gewährleisten, unterliegt sowohl die Aufnahme von cholesterinhaltigen Partikeln als auch die de-novo-Synthese von Cholesterin in Leberzellen und anderen cholesterinverarbeitenden Geweben komplexen Regulationsmechanismen, die unter anderem über Rückkopplungsmechanismen eine up- bzw. down-Regulation der Rezeptoren bewirken. Da menschliche Zellen Cholesterin nicht abbauen können, kann Cholesterin nur durch die von Hepatozyten produzierten Gallensäuren aus dem Körper eliminiert werden. Zu hohe Cholesterinkonzentrationen im extrahepatischen peripheren Gewebe führen zu einem Rücktransport des Cholesterins in die Leber. Für den reversen Cholesterintransport synthetisiert die Leber diskoidale, lipidarme HDL, deren Apolipoproteinanteil sich vor allem aus ApoA-I und A-II und ApoE zusammensetzt. HDL
kann in der Peripherie freies Cholesterin absorbieren und mit Hilfe von LCAT verestern. Cholesterinreiches HDL wird entweder Rezeptor-vermittelt von der Leber aufgenommen oder durch Interaktion mit den anderen Lipoproteinen weiter verändert, indem es Cholesterinester transferiert und Triglyzeride aufnimmt. Triglyzeridreiche HDL werden durch Hydrolyse mit Hilfe von HL recycelt und können erneut in den reversen Transport von Cholesterin eintreten.
1.2.3 Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels
Sowohl im exogenen als auch im endogenen Metabolismus der Lipoproteine spielen die Rezeptoren der Zellen eine entscheidende Rolle. Durch Expression von Rezeptoren stellen die Gewebe ihre Versorgung mit den für sie notwendigen Lipiden und Proteinen sicher. Die Endozytose der Lipoproteine wird durch Wechselwirkungen zwischen Apolipoproteinen und Rezeptoren vermittelt. Die verschiedenen Gewebe können durch die entsprechenden Rezeptoren auf ihrer Oberfläche die für sie verwertbaren Lipoproteine aus dem Plasma selektieren und aufnehmen.
Von großer Bedeutung im Lipoproteinstoffwechsel erwiesen sich die Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Gen-Familie. Der Name der Familie lehnt sich an den von Goldstein und Brown identifizierten und charakterisierten LDL-Rezeptor (LDL-R) an (Goldstein & Brown, 1985). Bis heute umfaßt die LDL-Rezeptor-Familie 6 Mitglieder, von denen der LDL-R am besten bezüglich Funktion, Struktur und Regulation charakterisiert ist. Gemeinsam mit LDL-R bilden das ´LDL-R related protein´ (LRP) (Herz et al.,1988), der VLDL-Rezeptor (Takahashi et al.,1992), der ApoE-Rezeptor 2 (ApoER2), in der Literatur auch unter LR 7/8B zu finden, (Kim et al., 1996), das Megalin (auch als GP 330 bezeichnet) (Novak et al., 1996) und der LR11 (Sorla) (Yamazaki et al., 1996) die LDL-Rezeptor-Gen-Familie. Die Mitglieder zeichnet eine starke strukturelle Homologie zum LDL-R aus, sie sind alle aus jeweils fünf Strukturdomänen aufgebaut, weisen jedoch Unterschiede in Größe und Zusammensetzung sowie in Gewebeverteilung und Ligandenspezifität auf.
Aminoterminal sind die Rezeptoren extrazellulär durch eine hochkonservierte, cystein-reiche ´complement-type-domain´ gekennzeichnet, die der Ligandenbindung (ApoB100,
ApoE) dient. An diese Domäne schließt sich eine weitere cysteinreiche Sequenz an, in der sich Motive wiederholen, die eine starke Ähnlichkeit zum epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) aufweisen, so daß die Domäne auch als ´EGF-type-domain´ bezeichnet wird. Diese Region veranlaßt intrazellulär durch eine pH-abhängige Konformationsveränderung eine Dissoziation des gebundenen Liganden vom Rezeptor (Davis et al., 1987). Es folgt die
dritte, ca. 60 Aminosäuren umfassende Domäne, die sich durch viele o-glykosidisch gebundene Zuckerreste auszeichnet. Als vierte Domäne ist der transmembrane Anteil des Rezeptors anzuführen, der mit 22-25 Aminosäuren (AS) in die Membran eingefügt ist. Die kurze C-terminale cytoplasmatische Domäne bildet mit ca. 50 AS die letzte Domäne. Sie ist mit ihrer `NPXY´-Sequenz an der intrazellulären Verpackung der Rezeptoren in ´coated pits´ und dem Recycling des Rezeptors beteiligt (Chen, et al., 1990).
Den Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie sind weiterhin die Ca2+-abhängige Bindung ihrer Liganden und die Rezeptor-vermittelte Endozytose dieser Liganden gemeinsam. Außerdem binden alle Rezeptoren dieser Gruppe ApoE, LpL und das „Rezeptor-assoziierte Protein“ (RAP). Trotz dieser Gemeinsamkeiten erfüllen die einzelnen Rezeptoren aufgrund ihrer Expression in unterschiedlichen Geweben und ihrer verschiedenen Spezifität für bestimmte Liganden spezifische Aufgaben. Im folgenden werden die einzelnen Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie kurz vorgestellt.
Der LDL-R als Namensgeber der Familie ist ausführlichst erforscht worden. Er wird ubiquitär exprimiert und nimmt eine bedeutende Rolle im Cholesterinstoffwechsel ein. Da der LDL-R ApoB100- und ApoE-enthaltende Lipoproteine bindet, wird er in der Literatur
auch häufig als ApoB/E- Rezeptor bezeichnet. Es ist bekannt, daß Mutationen im Bereich dieses Rezeptors zur familiären Hypercholesterinämie führen, deren Krankheitsbild auf-grund von verminderter Aufnahme von LDL mit einem massiv erhöhten Cholesterin-spiegel und frühzeitiger Bildung von arteriosklerotischen Plaques (und ihren organischen Folgen einhergeht) (Goldstein & Brown, 1985; Hobbs et al., 1992). Die Bedeutung des LDL-R im Stoffwechsel der triglyzeridreichen Partikeln gilt es noch genauer zu untersuchen, es ist jedoch anzunehmen, daß die zelluläre Cholesterinhomöostase und die Regulation des Plasmacholesterinspiegels die Hauptfunktionen des LDL-R darstellen. Patientenstudien zeigten, daß der Chylomikronenmetabolismus bei homozygotem LDL-Rezeptordefekt im Gegensatz zum Cholesterinstoffwechsel ungestört abläuft (Rubinsztein et al.,1990) und auch einige Tiermodelle weisen keinen Einfluß von LDL-R-Defekten auf ihren Triglyzeridstoffwechsel nach (Kita et al.,1981; Ishibashi et al., 1994, 1996).
Das LRP (´LDL-related protein´) wird in Hepatozyten (Herz et al., 1988), Neuronen (Wolf et el., 1992), in Trophoblasten (Jensen et al., 1988), in Makrophagen (Watanabe et al., 1994) sowie in Fibroblasten, Muskelzellen, Astrozyten und Ependymzellen (Zheng et al., 1994) synthetisiert. LRP erwies sich als wichtig für die Aufnahme von ApoE-haltigen Remnant-Lipoproteinen, es bindet ApoE (Beisiegel et al., 1989), ß-VLDL (Kowal et al., 1989), LpL (Beisiegel et al., 1991; Chapell et al., 1994, Krapp et al., 1995) sowie HL (Ji et
a., 1994; Shafi et al., 1994). Außer den Liganden des Lipoproteinstoffwechsels bindet LRP auch noch einige Proteasen des Gerinnungssystems, auch in Komplexen (Bu et al., 1992) insbesondere α2Makroglobulin (Kirstensen et al., 1990), so daß LRP auch unter dem
Namen α2M-R/LRP bekannt geworden ist. LRP ist essentiell für die embryonale
Entwicklung und scheint bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung von Bedeutung zu sein.
Der VLDL-R ist im Fettgewebe, Gehirn, Muskelzellen der Herz- und Skelettmuskulatur und in Endothelzellen zu finden. Ähnlich LRP bindet er eine Vielzahl an Liganden, im Bereich der Lipoproteine VLDL und IDL (Takahashi et al., 1992), CR (Niemeier et al.,1996) und LpL (Argraves et al., 1995), außerdem Proteasen (Argraves et al., 1995) und Thrombospondin (Mikhailenko et al., 1997). Strukturell ähnelt der VLDL-R dem LDL-R stark, er besitzt aber eine Ligandenbindungsdomäne mehr als der LDL-R. Funktionell bindet VLDL-R im Gegensatz zu LDL-R nur ApoE- und nicht ApoB100-haltige
Lipoproteine und besitzt ein eingegrenztes Expressionsmuster. VLDL-R wird eine Bedeutung bei der Versorgung des Fettgewebes mit Speicherfett (Frykman et al., 1995) und der Muskulatur mit Energielieferanten zugeschrieben. Ebenso wurde eine Bedeutung in der Entwicklung des Kleinhirns und des cerebralen Kortex beschrieben (Trommsdorff et al., 1999).
ApoER2 (LR 7/8B) (Kim et al., 1996) weist insbesondere eine Expression im Gehirn, aber auch in geringen Anteilen in der Plazenta, den Ovarien, Testes und Blutplättchen auf. Die Rolle des ApoER2 ist zur Zeit noch weitgehend ungeklärt, angenommen wird aufgrund der vorwiegenden Lokalisation im Gehirn eine Beteiligung an Wachstums- und Organisationsprozessen im ZNS.
Auch die Rolle des LR 11 als jüngstes Mitglied der Familie ist noch nicht geklärt. Wie ApoER2 ist auch LR 11 vor allem im Gehirn zu finden, geringe Expression wurde aber auch in der Leber und der Nebenniere detektiert (Yamazaki et al., 1997). Seinen Namen erhielt der LR 11 aufgrund seiner 11 Ligandenbindungsdomänen, an die eine Bindung von Apo E bereits nachgewiesen werden konnte (Yamazaki et al., 1996). LR 11 weist interessanter Weise eine starke Homologie zum Rezeptor für das Neuropeptid ´head activator´ der Hydra (Hampe et al., 1999) auf.
Megalin (GP330) wird in adsorptiven Epithelzellen synthetisiert und ist so unter anderem im Gehirn, in Lunge und Niere zu finden. Dieser Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie scheint eine große Bedeutung für die Entwicklung der Gewebe, in denen er exprimiert wird, zu haben. Zunächst wurde Megalin als auslösendes Antigen der Heymanns
Autoimmun-Nephropathie bekannt. Mittels Klonierung konnte Megalin aufgrund seiner strukturellen Homologie zu dem LDL-R als Mitglied der LDL-R-Familie charakterisiert werden. Das Ligandenspektrum des Megalins ähnelt dem des LRP.
Die Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie sind nicht die einzigen Lipoproteinrezeptoren des Körpers. Zu erwähnen sind vor allem die Scavenger-Rezeptoren, die die Endozytose von oxidierten und acetylierten LDL durch Makrophagen vermitteln (Krieger & Herz, 1994). Bihain et al. beschrieben den Lipolyse stimulierten Rezeptor (LSR) auf Hepatozyten, dessen Rolle im Lipoproteinstoffwechsel jedoch noch weitgehend ungeklärt ist (Bihain et al., 1992; Yen et al., 1994). Weitere Lipoproteinbindungsproteine stellen die Heparan-sulfat-Proteoglykane (HSPG) dar. Die HSPG sind an der Oberfläche der Zellen lokalisiert und können mit ApoE (Ji et al., 1993) und LpL (Eisenberg et al., 1992) interagieren und so die Aufnahme von Lipoproteinen vermitteln. Kurz soll noch der Rezeptor Cubilin erwähnt werden, der in der Niere mit Megalin assoziiert ist und wahrscheinlich nur in dieser Verbindung mit dem Liganden endozytotisch aufgenommen werden kann. Liganden des Cubilins sind vor allem ApoA-I-haltige HDL.
1.2.4 Apolipoproteine im Plasma
Die Apolipoproteine in der Peripherie lassen sich nach strukturellen Gesichtspunkten in drei Gruppen unterteilen. ApoA-I - IV, ApoC-I - III und ApoE weisen amphipathische α-Helices aus 22 Aminosäuren auf, die der Bindung an die Lipide dienen. Die zweite Gruppe umfaßt ApoB100 und ApoB48, die zusätzlich zu den α-Helices ß-Faltblatt-Strukturen
besitzen. Die letzte Gruppe wird von ApoD, ApoH und ApoJ gebildet, die weder α-Helices noch ß-Faltblätter aufweisen, sondern stark glykosilierte Proteine darstellen. Als klassische Apolipoproteine werden ApoA, ApoB und ApoC bezeichnet, die nur in der Leber und im Dünndarm synthetisiert werden. ApoE zählt strukturell zwar zu den klassischen Apolipoproteinen, Syntheseorte und Funktionen ähneln jedoch eher der Gruppe der Apolipoproteine D, J und H. Tabelle 2 gibt einen Überblick über weitere Einzelheiten der Apolipoproteine im Plasma.
Apolipo-protein
Molekular-gewicht 1[kDa]
Assoziation
mit Syntheseort Funktion
A-I 28,3 HDL Leber, Darm LCATStrukturprotein, aktiviert 2 ,Ligand für SR-BI3 vermittelt Cholesterin-Efflux4 A-II 17,7 HDL Leber, Darm Strukturprotein, aktiviert HL5
A-IV 46 CM, HDL lipidarm Leber, Darm
aktiviert LCAT6, vermittelt Cholesterin-Efflux7, beeinflußt
TG-Stoffwechsel8, Sättigungssignal?9 B100 549 VLDL, LDL Leber Strukturprotein, Sekretion von
VLDL, Ligand für LDL-R
B48 264 CM Darm Strukturprotein, Sekretion von
CM C-I - III 6-9 CM, VLDL Leber, Darm
modulieren die LpL-Aktivität10, inhibieren die Aufnahme von
TRL11 D 33 HDL, VHDL Leber, Darm, Nebenniere, Niere, Gehirn reverser Chol-Transport? Interaktion mit diversen
lipophilen Molekülen12 E 34 CM, VLDL, HDL Leber, Makrophagen, Gehirn Bindung an Lp-Rezeptoren13, reverser Chol-Transport13 , immunregulator. Eigenschaften14
H 54 CM, VLDL lipidarm Leber, Darm, Plazenta, Gehirn Moduliert den TG- Stoffwechsel?15 Anti-Phospholipid-Syndrom16, Bindung an Megalin17 J 70 HDL, VHDL Leber, Makrophagen, Herz, Lunge, Gehirn
Multifunktionell, Rolle bei div, degenerativen Erkrankungen?,
Schutzfunktion an Gewebegrenzen18, Bindung an
Megalin19 Tabelle 2: Apolipoproteine und ihre Eigenschaften im Plasma
Der Tabelle sind Molekulargewicht der Apolipoproteine, die Lipoproteinklassen, mit denen sie assoziiert sind, und die Hauptsyntheseorte und –funktionen zu entnehmen. CM, VLDL, LDL, HDL wurden im Text erläutert, TRL: triglyzeridreiche Lipoproteine, VHDL:´very high density lipoproteins´; lipidarm: gefunden bei einer Dichte > 1,21 g/ml;
1
(Kostner & Maerz, 1996); 2(Sorci-Thomas et al., 1993); 3(Acton et al., 1996); 4(Fielding & Fielding, 2001); 5
(Mowri et al., 1992); 6(Steinmetz& Utermann, 1985, Jonas, 1998); 7(Fournier et al. 2000), 8(Hockey et al., 2001); 9(Tso et al., 1999); 10siehe Referenzen in (Patsch & Gotto Jr., 1996); 11(Jong et al., 1996);12(Navarro et al., 1998); 13(Davignon et al., 1999); 14(Pepe et al., 1986); 15(Gambino et al., 1999); 16(Lutters et al., 2002); 17
(Moestrup et al., 1998); 18(Jenne & Tschopp, 1992); 19(Kounnas et al., 1995)
1.3 Lipoproteinstoffwechsel im ZNS
Der Lipoproteinstoffwechsel des ZNS ist nach wie vor in vielen Bereichen ungeklärt. Es ist noch nicht gelungen, die im Liquor vorkommenden Lipoproteine bezüglich Funktion und Wirkungsweise unter physiologischen oder auch pathologischen Bedingungen eindeutig zu charakterisieren, ebenso wie die konkrete Beschreibung und Klassifizierung der Lipoproteine im ZNS schwerfällt.
Im folgenden werden zunächst der Liquor cerebrospinalis und seine Eigenschaften als Transportmedium der Metabolite des ZNS beschrieben, bevor die heutigen Erkenntnisse im Bereich des Lipoproteinstoffwechsels des ZNS zusammengefaßt werden.
1.3.1 Liquor cerebrospinalis
Die Strukturen des zentralen Nervensystems, das Gehirn und das Rückenmark, werden von einer klaren, farblosen, protein- und zellarmen Flüssigkeit umspült, dem Liquor cerebro-spinalis (´cerebrospinal fluid´(CSF), „Gehirnwasser“). Der Liquor befindet sich im äußeren Liquorraum, der sich zwischen Arachnoidea mater und Pia mater befindet, und im inneren Liquorraum, der die Ventrikel im Gehirn und den Zentralkanal im Rückenmark zusammenfaßt. Durch Kommunikation des inneren mit dem äußerem Liquorraum besteht eine Liquorzirkulation. Gebildet wird der Liquor von den Plexus choroidei der Ventrikel und vom Ventrikelependym und gelangt durch die Aperatura mediana und die Aperaturae laterales in den äußeren Liquorraum. Dort wird der Liquor zum größten Teil von den Granulationes arachnoidales (Arachnoidalzotten) resorbiert, ein Teil verläßt das ZNS auch durch die perineuralen lymphatischen Abgänge der Spinalnerven. Die Liquorräume eines Erwachsenen fassen zusammen ca. 140 ml, bis zu 30 ml davon befinden sich in den Ventrikeln. Pro Tag werden etwa 500 ml Liquor gebildet werden, so daß durch Neubildung und Rückresorption der Liquor mindestens 3mal am Tag ausgetauscht wird.
Der Liquor schützt einerseits als eine Art Wasserkissen das zentrale Nervensystem vor Erschütterungen und Traumen, ist aber andererseits am Stoffwechsel aller Strukturen des ZNS in sofern beteiligt, als daß er mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) über die Ependym- und Piazellen in Kontakt und Austausch steht. Das ZNS bildet ein eigenes, gegenüber dem Blutstrom abgeschlossenes Kompartiment, in dem die ISF den Transport von Nährstoffen und Produkten des Zellmetabolismus im Extrazellularraum ermöglicht. Die Zusammensetzung des Liquors läßt durch den beschriebenen Austausch mit der ISF auf die Stoffwechselaktivität des ZNS rückschließen. Drei verschiedene Barrieren stellen die Abgeschlossenheit des ZNS gegenüber dem Blutstrom sicher: Die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Blut-Liquor-Schranke (BLS) und die Liquor-Blut-Schranke (LBS). Die BLS wird im Bereich der Plexus choroidei durch spezialisierte Ependymzellen, die BHS an den Hirnkapillaren durch Endothelzellen und die LBS in den Arachnoidalzotten durch das sogenannte Neuroepithel gebildet. Die flächenmäßig größte und bedeutendste Barriere entsteht durch die BHS an den zahlreichen Hirnkapillaren, der Begriff
„Blut-Hirn-Schranke“ wird allerdings auch häufig als Zusammenfassung aller drei Barrieren im ZNS verwendet.
Der Bildung des Liquors erfolgt in den Plexus choroidei mit Hilfe von aktiven Ionentransportern, das Wasser folgt dem osmotischen Gradienten entsprechend passiv. So werden unter anderem Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, aber auch Aminosäuren und Glucose in den Liquor transportiert. Wie schon erwähnt ist der Liquor im Vergleich zum Plasma sehr proteinarm (Liquor 0,2-0,4 mg/ml; Plasma 50-70 mg/ml). Außer sehr großen Proteinen sind alle Proteine des Plasmas im Liquor vertreten, so daß postuliert wird, daß die Proteine durch sehr wenige, zeitweilige „Lecks“ im choroidalen Ependym an der BLS in den Liquor übertreten. Der Konzentrationsunterschied der Proteine zwischen dem Liquor- und Blutkompartiment wird auf eine sehr geringe Anzahl dieser „Lecks“ unter physiologischen Bedingungen zurückgeführt, krankheitsbedingt kann eine erhöhte Durchlässigkeit der BLS zu einem vermehrten Einstrom von Plasmaproteinen in den Liquor führen.
Zusätzlich zu der passiven Diffusion wird der Proteingehalt im Liquor durch aktive Transportvorgänge und durch Neusynthese der Proteine im ZNS beeinflußt. Die selbständige Synthese von Fettsäuren, Cholesterin, Phospholipiden und Sphingomyelinen macht das ZNS außerdem relativ unabhängig von dem Lipideinstrom aus dem Plasma. Aufgrund der hohen Syntheserate von Cholesterin stellen Cholesterin und seine Ester mit 33% den größten Anteil der Lipide im Gehirn dar, gefolgt von Lecithin und anderen Phospolipiden mit 30%.
1.3.2 Lipoproteine und Apolipoproteine im ZNS
Der Nachweis von Lipoproteinen im Liquor gelang bereits 1961 (Swahn et al., 1961). Erst einige Zeit später wurden die Apolipoproteine ApoA-I, C-II, C-III und E im Liquor detektiert (Roheim et al., 1979), mittlerweile konnten bis auf ApoB alle Apolipoproteine im Liquor nachgewiesen werden, wobei der Nachweis von ApoC-I - III noch nicht eindeutig gelungen ist. Die Konzentrationen der Apolipoproteine im Liquor im Vergleich zum Plasma sowie die Molekulargewichte sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Die Konzentration der Apolipoproteine im Liquor wird nicht wie bei den anderen Proteinen nur von ihrer Konzentration im Plasma und ihrem Molekularradius bestimmt, da die Apolipoproteine mit unterschiedlich großen Vertretern der heterogenen Gruppe der Lipoproteine assoziiert sind. Im Liquor sind die Konzentrationen von ApoE, D, J und A-I
ungefähr gleich, während im Plasma ApoA-I und –II und ApoB100 deutlich höher
konzentriert sind als die anderen Apolipoproteine (siehe Tabelle 3).
A-I A-II A-IV B100 B48 C-I-III D E J H
Molekular-gewicht [kDa] 28 17 46 549 264 6-9 33 34 70 54 Plasma [mg/dl]* 130 43 5-15 80 <5 5-12 9 4 13 20 Liquor [mg/dl] 0,451 0,051 nicht be-stimmt -2 -2 nicht be-stimmt 0,1-0,53 0,3-0,63 0,244 nicht be-stimmt Tabelle 3: Molekulargewichte und Konzentrationen von Apolipoproteinen im Plasma und im Liquor Der Tabelle sind die Molekulargewichte der wichtigsten Apolipoproteine sowie ihre Konzentrationen im Plasma und im Blut zu entnehmen.
*
(Kostner & Maerz, 1996); 1(LaDu et al., 1998); 2(Osman et al., 1995); 3(Holmquist et al., 1996; Terrisse et al., 1998); 4(Choi-Miura et al., 1992)
Die Synthese der Apolipoproteine E, D und J im ZNS konnte inzwischen nachgewiesen werden (Danik et al., 1993, Elshourbagy et al., 1985; Smith et al., 1990), so daß sich auch die Verschiebung der Mengenverhältnisse der Apolipoproteine im Liquor gegenüber dem Plasma erklären lassen. LaDu erforschte in vitro die Sekretion der synthetisierten Apolipoproteine von Astrozyten (LaDu et al., 1998). Die Apolipoproteine A-I und A-II werden nicht lokal synthetisiert, sondern über die BHS in Form von kleinen HDL3
-ähnlichen Partikeln in den Liquor aufgenommen (de Vries et al., 1995). ApoE-haltiges HDL scheint diesen Weg nicht passieren zu können, da entdeckt wurde, daß die ApoE-Isoform eines Lebertransplantats nur im Plasma, nicht jedoch im Liquor detektiert werden kann (Linton et al., 1991).
Zur Zeit ist es noch nicht gelungen eine eindeutige Charakterisierung und Klassifikation der Apolipoproteine im ZNS zu erarbeiten, die Ergebnisse bisheriger Untersuchungen sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Die Daten aus Tabelle 4 lassen den Rückschluß zu, daß ApoE und ApoA-I, die beiden Hauptapolipoproteine im Liquor, sowohl gemeinsam auf einem Lipoprotein (Borghini et al., 1993, Koch et al., 2001) als auch in getrennten Partikeln (Koudinov et al., 1996; Koch et al., 2001) zu finden sind. Es wurde die Hypothese aufgesetzt, daß die größeren ApoE-haltigen, im ZNS synthetisierten Lipoproteine mit den kleineren ApoA-I-ApoE-haltigen, aus dem Plasma stammenden Partikeln interagieren, wodurch die mittelgroßen ApoE- und ApoA-I-haltigen Lipoproteine entstehen. Zusätzlich wurde noch eine vierte Gruppe von
Lipoproteine, die weder ApoE noch ApoA-I enthält, im ZNS detektiert (Borghini et al. 1993, Koch et al., 2001). Die Ergebnisse aus Tabelle 4 stimmen darin überein, daß ApoA-I und ApoJ mit fast allen Lipoproteinklassen im Liquor assoziiert sind, während ApoD zum Teil in allen Gruppen (Borghini, Koch), zum Teil nur in bestimmten Dichtebereichen (Koudinov) gefunden werden konnte.
Referenz Auftrennung nachI Partikel Dichte [g/ml] Größe [nm] Untersuchte Apolipoproteine Pitas 19871 Dichte Protein ApoE-Fraktion ApoA-I-Fraktion 1,09-1,15 1,09-1,15 14 14 E A-I Borghini 19952 Größe Protein CSF-LpE CSF-LpA-I 3.Population - 20 20 32 A-I, A-IV, D, E, J A-I, A-IV, D, E, J A-IV, D, J Koudinov 19963 Dichte CSF-VLDL/LDL CSF-HDL2 CSF-HDL3 CSF-VHDL 1,006-1,063 1,063-1,125 1,125-1,210 1,210-1,250 - A-IV, E
A-I, A-II, A-IV, C-II, D, E, J A-I, A-II, A-IV, C-II, D, E, J A-I, A-II, A-IV, J
Guyton 19984 Dichte Größe HDL1 1,006-1,060 16 E Rebeck 19985 Dichte - >1,21 - E-A-Heterodimer LaDu 19986 Dichte Größe - 1,08-1,14 7-15 AQ-I, A-II, E, J Montine 19877
Dichte - <1,21 - A-I, E-A-II-Heterodimer
Koch 20018 Dichte Größe Protein CSF-LpE CSF-LpEA CSF-LpA sCSF-Lp 1,03-1,07 1,07-1,12 1,08-1,11 >1,17 14-17 8-15 11-13 <6 A-IV, D, E
A-I, A-II, A-IV, D, E, H A-I, A-II, A-IV, D A-IV, D, H, J Tabelle 4: Publizierte Daten zur Charakterisierung der Lipoproteine im Liquor
Zur Zeit besteht noch keine einheitliche Nomenklatur, so daß die Bezeichnung der Lipoproteine aus den jeweiligen Referenzen übernommen wurde.
I
Der Tabelle sind die Eigenschaften zu entnehmen, aufgrund derer die Auftrennung der Partikel erfolgte. Es wurden die Methoden der Salzgradientenzentrifugation („Dichte“), der Gelfiltration („Größe“) und der Affinitätschromatographie („Protein“) verwendet.
1
(Pitas et al., 1987); 2(Borghini et al., 1993); 3(Koudinov et al., 1996); 4(Guyton et al., 1998); 5(Rebeck et al., 1998); 6(LaDu et al., 1998); 7(Montine et al., 1998); 8(Koch et al., 2001)
Die Funktion der Lipoproteine im ZNS ist zur Zeit noch weitgehend ungeklärt. Bisher konnte gezeigt werden, daß ApoE-haltige Lipoproteine als Liganden von LRP das Auswachsen von Neuriten fördern (Fagan et al., 1996). Desweiteren wurde eine Funktion der Lipoproteine im ZNS bei der Verteilung von Lipiden nach Verletzung von Nerven beschrieben (Boyles et al., 1990; Poirier et al., 1993). Außerdem konnte Rebeck et al. in
vitro demonstrieren, daß die aus Liquor isolierte Gesamt-Lipoprotein-Fraktion den
intrazellulären Cholesterinspiegel senken und somit, wie HDL im Plasma, einen Chol-esterinefflux induzieren kann (Rebeck et al., 1998). Die Enzyme Lezithin-Cholesterin-acyltransferase (LCAT) und Cholesterinester-Transfer-Protein (CETP), die an der Cholesterin-Veresterung und dem Transport in der Peripherie beteiligt sind, konnten im ZNS ebenfalls gefunden werden (Albers et al., 1992; Demeester et al., 2000).
Weiterführende Untersuchungen der Funktion im ZNS liegen für die lokal synthetisierten Apolipoproteine E, D und J vor, von denen ApoE als Hauptlipoprotein angesehen wird. Auf die Eigenschaften und Funktionen des ApoE wird in Abschnitt 1.4 genauer einge-gangen, so daß hier zunächst ApoD und J beschrieben werden sollen. Die Haupt-funktionen der Apolipoproteine in der Peripherie sind Tabelle 2 zu entnehmen.
ApoD wird im ZNS und PNS eine Bedeutung als Lipidträger bei Regenerationsvorgängen und Reparaturprozessen zugeschrieben (Boyles et al., 1990; Franz et al., 1999; Ong et al., 1997; Terrisse et al., 1998). Ungeklärt ist bisher, ob unphysiologischen ApoD-Konzentrationen eine Markerfunktion für bestimmte neuropathologische Veränderungen zuzuschreiben ist.
ApoJ hingegen scheint eine Funktion als „Überlebens- und Erhaltungsfaktor“ zu übernehmen (O´Bryan et al., 1993) und an Grenzflächen zwischen Gewebe und Flüssigkeit eine Art Schutz darzustellen (Aronow et al., 1993). Es konnte gezeigt werden, daß ApoJ ß-Amyloid binden kann. ß-ß-Amyloid ist als in hohen Konzentrationen neurotoxisch wirkendes Peptid bekannt (Kounnas et al., 1995). Der entstehende ApoJ-ß-Amyloid-Komplex kann dann von Megalin gebunden und aufgenommen werden, so daß das ZNS vor der Neurotoxizität des ß-Amyloid beschützt wird (Matsubara et al., 1995). Der Rezeptor Megalin (GP330) ist der einzige Rezeptor der Säugetiere, der ApoJ als Ligand binden kann. Megalin wird nicht von Neuronen und Gliazellen exprimiert, sondern von den Zellen der Plexus choroidei und den Ependym- und Kapillarzellen der BHS (Zlokovic et al., 1996).
1.3.3 Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie im ZNS
Unter 1.2.3 sind die Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie im Einzelnen aufgeführt, ihre Eigenschaften erläutert und ihre Expression in den verschiedenen Geweben erklärt. Alle Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie werden im ZNS exprimiert, wenn auch in verschiedenen Ausmaßen und auf unterschiedlichen Zelltypen des Gehirns.
Der LDL-Rezeptor scheint vorwiegend in nicht-neuronalen Zellen exprimiert zu werden (Jung-Testas et al., 1992; Pitas et al., 1987a), in peripheren Nerven ließ sich jedoch auch eine schwache Expression finden. Außerdem konnte der LDL-R in geringem Maße in hippokampalen Primärkulturen nachgewiesen werden (Koch et al., 2001).
Der LRP wurde bisher vor allem in neuronalen Zellen verschiedener Gehirnbereiche detektiert (Bu et al., 1994), aber auch in Astrozyten in der Primärkultur embryonaler hippokampaler Zellen (Koch et al., 2001). Die Expression von LRP in nicht-neuronalen Zellen scheint jedoch auf pathologische Bedingungen und die Embryonalzeit beschränkt zu sein (Ishiguro et al., 1995, Yamamoto et al.,1997).
Die Expression des VLDL-R ist hingegen ausschließlich auf Neuronen beschränkt, wobei sich wie beim LRP ein somato-dendritisches Verteilungsmuster zeigt (Page et al., 1998; Trommsdorff et al., 1999), welches auch in der hippokampalen Primärkultur bestätigt werden konnte (Koch et al., 2001).
Eine Synthese von ApoER2 konnte fast nur im ZNS nachgewiesen werden, wobei er hier vor allem in den Neuronen detektiert werden konnte (Clatworthy et al., 1999). Aber auch in Zellen des Epithels des Plexus choroideus, der Arachnoidea und des Ependyms wurde ApoER2 gefunden (Stockinger et al.,1998). Die Lokalisation innerhalb der Neuronen wird noch kontrovers diskutiert, beschrieben wird sowohl eine ausschließlich somato-dendritische (Stockinger et al., 1998), als auch eine zusätzliche axonale Verteilung (Koch et al., 2001). Außerdem ist noch zu erwähnen, daß VLDL-R und ApoER2 direkt mit extrazellulären (Reelin) und intrazellulären (mDab1) Signalproteinen interagieren, die für die korrekte Positionierung der Nerven während des Wachstums wichtig sind.
Eine Expression von Megalin konnte wie unter 1.2.3 beschrieben weder in Neuronen noch in Gliazellen gefunden werden, jedoch in den Ependymzellen der Ventrikel und im Endothel der Hirnkapillaren (Zlokovic et al., 1996).
LR11 konnte bislang im Gehirn nur in neuronalen Zellen des Kortex, des Kleinhirns und des Hippokampus detektiert werden (Hermans-Borgmeyer et al., 1998). In den ausdifferenzierten Zellen der hippokampalen Primärkultur zeigte sich jedoch nur ein schwaches Signal im Bereich des somatischen Golgi-Apparates (Koch et al., 2001).
Zusammenfassend besteht ein vorwiegend neuronales Expressionsmuster der Rezeptoren LRP, VLDL-R, ApoER2 und LR11, während LDL-R vorwiegend in nicht-neuronalen Zellen detektiert werden konnte, aber auch im geringen Maße in Neuronen. Die Synthese des Megalins beschränkt sich im ZNS ausschließlich auf epitheliale Zellen.
1.4 Apolipoprotein E
Das Apolipoprotein E spielt einerseits im Stoffwechsel triglyzeridreicher Lipoproteine im Plasma eine bedeutende Rolle gilt aber andererseits auch als das Hauptapolipoprotein im ZNS. Neben der Leber weist das Gehirn die höchste ApoE-mRNA-Konzentration auf. Im nächsten Abschnitt soll zunächst die Struktur des Apolipoprotein E sowie seine häufigsten Isoformen erläutert werden, um im Anschluß auf die Rolle des ApoE im ZNS einzugehen.
1.4.1 Genlokus, Synthese und Struktur des ApoE
Die 1982 veröffentlichte Aminosäuresequenz (Rall et al., 1982) des ApoE konnte schon wenig später durch die Nukleotidsequenz bestätigt werden (Mc Lean et al., 1984). Kurz danach erfolgte die Lokalisation des ApoE-Gens auf dem langen Arm des Chromosom 19 in einem Gen-Cluster gemeinsam mit ApoC-I, C-II und pseudo ApoC-I. Das primäre Translationsprodukt des ApoE besteht aus 317 Aminosäuren, nach Abspaltung des Signalpeptids wird das reife Protein aus 299 Aminosäuren gebildet und hat ein Molekulargewicht von 34 kDa (Zannis et al., 1984). Das polymorphe, argininreiche ApoE-Molekül kann in nahezu allen Geweben des Säugetiers mit Ausnahme des Dünndarms synthetisiert werden, der Hauptsyntheseort ist aber die Leber. Geringere Produktion wurde vor allen in Astrozyten des ZNS (Boyles et al., 1985), in Makrophagen (Basu et al., 1982) und in Niere und Nebenniere detektiert (Lenich et al., 1988).
Die Synthese des ApoE kann in vitro durch verschiedene Regulationsmöglichkeiten an der Promotorregion des ApoE-Gens induziert werden (Smith et al., 1988). Durch ß-VLDL und Cholesterin wird die Synthese in Hepatozyten und Makrophagen stimuliert (Fazio et al., 1995), ebenso durch Schilddrüsen- und Wachstumshormone (Sjöberg et al., 1994; Vandenbrouck et al., 1994). Die in vivo-Relevanz dieser in vitro-Untersuchungen ist noch ungeklärt.
Strukturell besteht ApoE aus 2 Domänen, dem aminoterminalen Ende und dem carboxyterminalen Ende. Das aminoterminale Ende umfaßt etwa Zweidrittel des Moleküls (Aminosäurenreste 1-191) und besteht aus einem Bündel von 4 Helices (Weisgraber et al., 1994). Außerdem enthält die aminoterminale Domäne die Bindungsregion für die Rezeptoren und für Heparin (AS-Reste 134- 160) (Weisgraber et al., 1986). Diese Region zeichnet sich durch einen hohen Anteil an basischen Aminosäuren (AS) aus, die die Bindung an die negativ geladenen AS der Ligandenbindungsregion des LDL-R vermitteln
(Mahley et al., 1997; Weisgraber et al., 1994, Russell et al., 1989). Chemische Modifikation der basischen AS, das negativ geladene Heparin sowie das positiv geladene Protamin inhibieren diese Interaktion zwischen ApoE und dem LDL-R (Weisgraber et al., 1982; Brown et al., 1978).
Verbunden wird das aminoterminale Ende mit der carboxyterminalen Domäne durch eine sogenannte „hinge-region“. Das carboxyterminale Ende umfaßt die AS-Reste 216-299 und beeinhaltet die amphipathische Hauptbindungstelle für die Lipide (zwischen AS 244-272), sorgt also für die Verankerung des ApoE in den Lipoproteinen, aber dient auch als Bindungsregion für ß-Amyloid.
1.4.2 Isoformen des ApoE
Der ApoE-Polymorphismus wurde zunächst durch isoelektrische Fokussierung entdeckt (Utermann et al., 1975) und später auch auf genetischer Ebene nachgewiesen (Zannis et al., 1981, 1982). Neben einigen selteneren Varianten sind vor allem die drei Hauptisoformen ApoE 2, ApoE 3 und ApoE 4 in den Mittelpunkt gerückt. Für diesen Polymorphismus sind die drei unabhängigen Allele ε2, ε3 und ε4 verantwortlich. Diese Allele sind in der Bevölkerung unterschiedlich häufig vertreten, ε3 ist mit einer Allel-frequenz von 70-85 % das häufigste, gefolgt von ε4 mit 12-18 % und ε2 mit 3-12 %. Aufgrund des diploiden Genoms der Säugetier-Zellen ergeben sich drei verschiedene homozygote (ApoE 2/2, ApoE 3/3 und ApoE 4/4) und drei heterozygote (ApoE 2/3, ApoE 2/4 und ApoE 3/4) Phänotypen. Der häufigste Typ ApoE 3/3 gilt als Normaltyp.
Die molekulare Grundlage der drei beschriebenen Isoformen stellt ein Aminosäuren-austausch an zwei Stellen des ApoE-Moleküls dar. Der Wildtyp weist an der Position 112 seiner Aminosäurenfrequenz Cystein auf, an Position 158 Arginin (Cys112; Arg158). Die Isoform ApoE 2 hat an beiden Positionen Cystein (Cys112; Cys158), während die Form ApoE 4 beide Positionen mit Arginin (Arg112; Arg158) besetzt hat (Zannis et al., 1982). Der Austausch der Aminosäuren hat bei den Patienten deutliche klinische Auswirkungen. Cys158 anstatt von Arg158 in der Isoform ApoE 2 verändert die Größe und Konformation der Rezeptor-bindenden Region des ApoE, da die Interaktion zwischen Asp154 und Arg158 des ApoE 3 nicht mehr möglich ist. Asp154 bildet daher Verbindung mit Arg150 aus (Wilson et al., 1994), dessen Seitenkette Teil der Rezeptor-bindenden Region ist (Lalazar et al., 1988). Durch diesen Mechanismus verändert sich die Konformation der Rezeptor-bindenden Region und es resultiert eine deutlich erniedrigte Bindungsaffinität des ApoE 2 sowohl zum LDL-R als auch zum LRP. Dadurch ist die Aufnahme der CR und der
VLDL-Remnants stark erniedrigt, es resultieren erhöhte Triglyzerid- und ApoE-Spiegel und eine verminderte Aufnahme von Cholesterin in die Leberzellen. Es scheint eine Hochregulation der LDL-R zu folgen, so daß vermehrt LDL über die Bindung des Liganden ApoB100
aufgenommen wird und der LDL-Plasma-Spiegel sinkt. Zudem wird postuliert, daß der LDL-Spiegel durch einen verminderten Abbau von VLDL zu IDL aufgrund niedriger LpL-Aktivierung durch zu wenig ApoC-II in ApoE 2- Partikeln (Huang et al., 1998) erniedrigt ist. Außerdem scheint ApoE 2 die hepatische Lipase (HL) weniger zu stimulieren als ApoE 3, woraus eine verringerte Hydrolyse von IDL zu LDL resultiert (Mahley et al., 2000). Zusammenfassend weisen homozygote ApoE 2-Patienten erniedrigte LDL-, Cholesterin- und ApoB-Spiegel und erhöhte Triglyzerid- und ApoE-Spiegel auf. 5 % der Patienten (Zannis et al., 1982) entwickeln jedoch im Zusammenhang mit weiteren bisher ungeklärten genetischen oder umweltbedingten Faktoren eine Hyperlipoproteinämie Typ II nach Fredrickson, die mit hohen Cholesterin- und Triglyzeridwerten einhergeht und sich klinisch durch vorzeitige Arteriosklerose und ihre Folgen bemerkbar macht.
Die Isoform ApoE 4 besitzt ebenfalls eine veränderte Struktur und Funktion gegenüber ApoE 3 . Arg112 des ApoE 4 interagiert mit Glu109, wodurch die Verbindung von Glu109 mit Arg61 gelöst wird. Arg61 interagiert stattdessen mit Glu255 im carboxyterminalen Ende des Moleküls (Dong et al., 1996). Dadurch verändert sich die Konformation des ApoE entscheidend und es scheinen Unterschiede in der Lipoproteinpreferenz von ApoE 4 versus ApoE 2 und ApoE 3 zu resultieren. Klinisch weisen die Patienten mit homozygoten ε4-Genotyp im Plasma eine Erhöhung des LDL-Cholesterinspiegels auf (Davignon et al., 1988; Hallman et al., 1991). Die Bindungsaffinität von ApoE 4 wird als ähnlich der von ApoE 3 angesehen, jedoch vermutet man eine stärkere Affinität des E 4 zu VLDL, welches dann durch erhöhte Menge von ApoE 4 am Partikel vermehrt aufgenommen wird. Der erhöhte LDL-Spiegel durch erhöhten Abbau der VLDL führt zur „Downregulation“ des LDL-R und zu erhöhten LDL-Spiegeln im Plasma und den damit verbundenen Risiken. Großes Interesse haben die Veränderungen im zentralen Nervensystem, die mit der ApoE 4-Isoform einherzugehen scheinen, erweckt. ApoE 4 hat vor allem im Rahmen der Erforschung der Alzheimerschen Erkrankung eine Bedeutung als Risikofaktor erlangt. Die Frequenz des Alleles ε4 erwies sich bei Alzheimer-Patienten als dreifach höher als in der Normalbevölkerung (Strittmatter et al., 1995; Corder et al., 1993). Ebenso konnte ApoE in Plaques verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, wie z.B. der Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung (Namba et al., 1991), sowie als Bestandteil der Amyloidplaques detektiert werden (Wisniewski et al., 1992).
Weitere Aspekte und nähere Untersuchungen der Rolle des ApoE im ZNS sollen im nächsten Abschnitt erläutert werden, während die Funktion des ApoE im Plasma soweit im Rahmen dieser Arbeit von Interesse in Abschnitt 1.2.4 aufgeführt sind.
1.4.3 Rolle der ApoE-Isoformen im Lipoproteinstoffwechsel des ZNS
ApoE ist im extrazellulären Raum des ZNS in gebundener Form vorhanden. Außerdem wurde es im cytoplasmatischen Kompartiment in Endosomen, Lysosomen und Peroxisomen in Neuronen gefunden (Han et al., 1994; Rebeck et al., 1993).
Dem Apolipoprotein E konnte in vielen Untersuchungen eine neurobiologische Bedeutung zugewiesen werden, obwohl die genauen Interaktionen des ApoE im ZNS größtenteils bisher ungeklärt geblieben sind. Die Synthese und Sekretion von ApoE im ZNS in Astrozyten konnte nachgewiesen werden (Elshourbagy et al., 1985; Boyles et al., 1985; Pitas et al., 1987), außerdem wurde bewiesen, daß plasmatisches ApoE die BHS nicht passieren kann (Linton et al., 1991). Es zeigte sich, daß den ApoE-haltigen Lipoproteinen im ZNS eine bedeutende Rolle zugeschrieben werden muß (Pitas et al., 1998). ApoE scheint für die normale astrozytäre Sekretion von Lipoproteinen notwendig zu sein, da ApoE-„knock-out-Mäuse“ im Gegensatz zu ApoJ-„knock-out-Mäusen“ keine suffiziente Sekretion von Lipoprotein-Partikeln (bestehend aus Phospholipiden, Cholesterin und vor allem ApoE und ApoJ) aufweisen (LaDu et al., 2000). ApoE ist auf sezernierten Partikeln verschiedener Größe lokalisiert, während ApoJ in kleinen lipidarmen Partikeln gefunden werden konnte. Wahrscheinlich spielt ApoE eine große Rolle in der Lipidverteilung innerhalb des ZNS. Es scheint, als wenn die astrozytären Lipoproteine, ähnlich der Sekretion von HDL im Plasma, diskoidal sezerniert werden und durch Aufnahme von Cholesterinestern eine sphärische Konformation annehmen, bevor sie den Liquor erreichen (Rebeck et al., 1998). So könnten die von Astrozyten sezernierten Lipoproteine an dem Cholesterinefflux der neuronalen Zellen vor allem in Situationen der Zelldegeneration teilnehmen. Die für den Cholesterinefflux notwendigen Enzyme LCAT und CETP sind wie unter 1.3.2 aufgeführt im ZNS detektiert worden. Die beschriebenen möglichen Abläufe gilt es in folgenden Studien vertiefend zu untersuchen.
Der Ab- und Antransport von Lipiden könnte vor allem nach neuronalen Verletzungen eine große Bedeutung haben. So wurde beobachtet, daß ApoE, aber auch ApoJ nach verschiedenen Verletzungen des Gehirns vermehrt sezerniert werden (May et al., 1992; Poirer et al., 1994). Außerdem wurde gezeigt, daß nach einer Läsion des Hippokampus von
ApoE-„knock-out-Mäusen“ die lipidreichen Axontrümmer langsamer abtransportiert wurden als im ZNS des Wildtyps (Holtzman et al., 1999).
Von großem Interesse sind die möglichen Funktionsunterschiede zwischen den ApoE-Isoformen. Unterschiedliche Suffizienz der Isoformen beim Abtransport von Cholesterin und Lipiden nach Verletzung könnte eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen. ApoE 4 ist in diesem Zusammenhang als Risikofaktor für die Alzheimersche Erkrankung (im folgenden AD für ´Alzheimer´s Disease´ bezeichnet) bekannt geworden. Jedes ε4-Allel erhöht das Risiko der Erkrankung und erniedrigt das Alter des Erkrankungsbeginns des „late-onset familiar“ und des „sporadic“ AD (Corder et al., 1993). Im Gegensatz dazu scheint das ε2-Allel das Risiko zu senken und das Erkrankungsalter zu erhöhen (Corder et al., 1993).
In der Literatur sind zudem eine schlechtere Heilung nach Kopfverletzungen (Nicoll et al., 1996), cerebralen Blutungen (Alberts et al., 1995), kardialen Bypässen (Tardiff et al., 1997) und Schlaganfällen (Slooter et al., 1997) bei Patienten mit ε4-Allel im Vergleich zu jenen mit ε3-Allel beschrieben worden. Außerdem scheint ApoE 4 das Erkrankungsalter bei Parkinson-Patienten zu senken (Zarepesi et al., 1997).
Die neurobiologischen Hintergründe der beschriebenen Beobachtungen sind nach wie vor noch ungeklärt, im folgenden aufgeführte Untersuchungen haben einige Unterschiede im Stoffwechsel der einzelnen Isoformen ergeben.
Apo E 2 und ApoE 3 scheinen im Vergleich zu ApoE 4 intrazellulär unterschiedlich verarbeitet zu werden: ApoE 2 und ApoE 3 akkumulieren in Zellen, auch in Neuronen, in einem 2- bis 3-fachen Ausmaß in Vergleich zu ApoE 4 (Pitas et al., 1998). Die Bindung, Aufnahme und die Anlieferung der Lipide zu den Zellen durch ApoE 3 und ApoE 4 sind jedoch ähnlich. Zusätzlich konnte ApoE 3 in Vesikeln in Zellkörper und in Neuriten von Neuro-2a-Zellen detektiert werden, während ApoE 4 in signifikant geringerem Umfang von den Zellen gespeichert wird (Nathan et al., 1995).
ApoE 3 erhöht in vitro das Auswachsen von Neuriten, während ApoE 4 das Neuritenwachstum zu inhibieren scheint (Holtzman et al., 1995). Es wird postuliert, daß das Auswachsen der Neuriten mit den Isoform-spezifischen Effekten des ApoE auf das Cytoskelett, insbesondere auf das Mikrotubuli-Netzwerk, assoziiert ist. In Anwesenheit von ApoE 3 und ApoE 2 wird die Polymerisation von ß-Tubulin stimuliert und dadurch die Formation der Mikrotubuli stabilisiert, während ApoE 4 einen gegensätzlichen Effekt zeigt. Strittmatter et al. konnte beobachten, daß ApoE 3 und ApoE 2 im Gegensatz zu ApoE 4 mit dem Protein τ interagieren, das wahrscheinlich die Stabilisierung der
Mikrotubuli vermittelt (Strittmatter et al., 1994). ApoE 3 könnte τ vor Hyperphosphorylierung schützen, damit es mit den Mikrotubuli interagieren kann. Phosphoryliertes τ interagiert nicht mit Mikrotubuli, sondern bildet neurofibrilläre Bündel (´neurofibrillary tangles´, NFT) (Biernat et al., 1992; Goedert et al., 1992), eine charakteristische Erscheinung bei AD-Patienten und anderen neurodegenerativen Erkrankungen. Zusätzlich konnte beobachtet werden, daß auch das Protein MAP-2 (´microtubule-associated protein-2´), das ebenfalls die Mikrotubuli-Formation stabilisiert, nur mit ApoE 2 und 3, jedoch nicht mit ApoE 4 interagiert (Huang et al., 1994).
Unterschiede zwischen den Isoformen scheinen auch in der Bindung zu ß-Amyloid zu bestehen. Es wird postuliert, daß ApoE und auch ApoJ ß-Amyloid im ZNS binden und seine Entsorgung über Lipoproteinrezeptoren vermitteln (LaDu et al., 1994; Hammad et al., 1997). ApoE und ApoJ wurden in vivo in senilen Plaques gefunden (Choi-Miura et al., 1992) und in vitro in einem stabilen Komplex mit ß-Amyloid (Strittmatter et al., 1995, Aleshkov et al., 1997). Diese Komplexbildung scheint die Neurotoxizität des ß-Amyloid zu beeinflussen. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß in der Kultur von primären hippokampalen Zellen ApoE 3 vor der Neurotoxizität des ß-Amyloids schützt, nicht jedoch ApoE 4 (Jordan et al., 1998). Lösliches ß-Amyloid ist auch im Komplex mit Lipoproteinen, die ApoE und ApoJ enthalten, gefunden worden (Koudinov et. al., 1996).
In vitro wurde beobachtet, daß sowohl lipidfreies ApoE 3 als auch ApoE 4 mit ß-Amyloid
einen SDS-stabilen Komplex bilden kann, wobei ApoE 4 den Komplex schneller ausbildet und die Anwesenheit von reduzierenden Agentien die Bildung verhindert (Strittmatter et al., 1995). Nach längerer Inkubation von lipidfreiem ApoE mit ß-Amyloid bilden sich unlösliche hochmolekulare Komplexe, wobei ApoE 4 wiederum schneller dichtere Komplexe bildet (Sanan et al., 1994). Die Bindungsregion des Apo E für ß-Amyloid entspricht der Region, die für die Bindung der Lipoproteine verantwortlich ist (AS-Reste 244-272).
Werden jedoch lipidiertes ApoE 3 und 4 eingesetzt, so bindet ApoE 3 im Vergleich zu ApoE 4 ß-Amyloid mit 20-fach höherer Affinität (LaDu et al., 1994). Es wird postuliert, daß die stärkere Bindung durch ApoE 3 auch zu einer erhöhten Entsorgung des Komplexes führt und vor Entwicklung der Neurotoxizität schützt (LaDu et al., 1997; Kounnas et al., 1995).
Zusammenfassend beeinflußt der Aminosäurenaustausch des Restes 112 des ApoE 4 (anstatt Cystein Arginin) und die somit veränderte Konformation des ApoE 4 im Vergleich zu ApoE 2 und 3 die Funktion des ApoE stark. ApoE 4 unterscheidet sich von ApoE 2 und
