2. Material und Methoden
2.2 Isolierung und Analyse der Liganden
2.2.2 Isolierung von ApoE(3/3)- bzw. ApoE(4/4)-Liposomen
- humanes lyophilisiertes Apolipoprotein E(3/3), bzw. E(4/4) - Cholesterin von Sigma 1 µg/µl Stock in Ethanol - Lecithin von Sigma 100 µg/µl Stock in Ethanol - Cholsäure von Sigma
- Boratpuffer 50 mM, pH 8,0
- LPDS-Puffer (10 fach) 450 g NaCl (154 M) von J.T.Baker, Deventer 61 g Tris (100 mM) von Gibco
28 g EDTA (15 mM) von Merck ad 5 l A. dest., pH 8,6
- Dialyseschlauch: ´Visking® dialysis tubing 8/32, diameter Ø 6 mm´
Methode:
Um einen Lipidfilm zu erhalten, wurden 10 µl Cholesterin mit 5 µl Lecithin in einem Eppendorf-Tube unter Vortexen vermischt und unter Drehen und N2-Atmosphäre eingedämpft.
100 µg humanes ApoE wurden in 400 µl Cholat/Boratpuffer (0,234 g Cholsäure in 10 ml Boratpuffer) gelöst und die entstandene Lösung zu den eingedämpften Lipiden gegeben.
Im Anschluß an 30 Sekunden Vortexen und 20 Minuten Shaken wurden die Liposomen im Dialyseschlauch über 2 Tage gegen 10 fach verdünnten LPDS-Puffer dialysiert, um das Cholat aus dem Ansatz zu eliminieren, wobei der Puffer mindestens 3 mal gewechselt wurde.
Bei konstanten Puffervolumen ergab sich eine rechnerische Proteinkonzentration der Liposomen von 0,25 µg/µl, die durch die Proteinbestimmung nach Lowry überprüft und bestätigt wurde.
2.2.3 125I-Markierung von ApoE(3/3)- bzw. ApoE(4/4)-Liposomen Materialien:
- humanes lyophilisiertes Apolipoprotein E(3/3) bzw. E(4/4) - Cholesterin von Sigma 1 µg/µl Stock in Ethanol - Lecithin von Sigma 100 µg/µl Stock in Ethanol - Cholsäure von Sigma
- Boratpuffer 50 mM, pH 8,0
- LPDS-Puffer (10 fach) 450 g NaCl (154 M) von J.T.Baker, Deventer 61 g Tris (100 mM) von Gibco
28 g EDTA (15 mM) von Merck ad 5 l A. dest. pH 8,6
- 125I- Na
- Iodobead von Pierce - Slide-A-Lyzer
- PD-10-Säule (Sephadex G-25) 4 x mit Cholat/Boratpuffer equilibriert
Methode:
Aus Sicherheitsgründen wurde die 125I-Markierung der ApoE-Liposomen freundlicherweise von Dr. Jörg Heeren durchgeführt.
Zur Vorbereitung eines Lipidfilms wurden zunächst 2,5 µl Cholesterin mit 5 µl Lecithin in einem Eppendorf-Tube unter Vortexen vermischt und unter Drehen und N2-Atmosphäre eingedämpft.
Die folgenden Arbeitsschritte wurden an einem für radioaktives Arbeiten gerüsteten Arbeitsplatz hinter einem Bleischild durchgeführt.
100 µg humanes lyophilisiertes ApoE wurden in 400 µl Cholat/Boratpuffer (1,17 g Cholsäure in 50 ml Boratpuffer) aufgenommen und in ein Glasgefäß überführt. Für die weiteren Arbeitsschritte wurde das Gefäß in einen Bleibehälter gestellt.
Nach Zugabe von 1 µl 125I- Na und einem Iodobead wurde der Ansatz 20 min unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die 400 µl des Ansatzes auf die PD-10-Säule gegeben, um das freie 125I zu entfernen. Das Reaktionsgefäß wurde mit 600 µl Cholat/Boratpuffer gespült, die ebenfalls auf die Säule gegeben wurden. Um das markierte ApoE aus der Säule zu gewinnen, wurden 1,8 ml frischer Cholat/Boratpuffer auf die Säule pipettiert.
Nun konnte das 125I-ApoE in 1 ml Cholat/Boratpuffer auf den vorbereiteten Lipidfilm eluiert werden. Es folgten 30 Sekunden Vortexen und 20 Minuten Schütteln des Ansatzes.
Um die 125I-ApoE-Liposomen vom Cholat zu befreien, wurde das Gemisch in Slide-A-Lyzer überführt und über 2 Tage gegen 10fach verdünntem LPDS-Puffer dialysiert, wobei der Puffer mindestens 3 mal gewechselt wurde.
Die Radioaktivität der 125I-ApoE-Liposomen wurde mittels des Gammacounters ermittelt, die angenommene Proteinkonzentration betrug 0,1 µg/µl und wurde mit Hilfe der Proteinbestimmung nach Lowry (siehe unten) bestätigt.
2.2.4 Isolierung der Chylomikronen-Remnants Materialien:
- Chylomikronen (VLDL), TG-Konzentration 120 mg/ml, isoliert aus dem Plasma eines Patienten mit einem genetisch bedingten LpL-Defekt
- Nüchternplasma eines gesunden Probanden - Lipase 0,1 mg/ml
- Dulbecco´s PBS
- Tetrahydrolipostatin (THL) 50 mg/ml
- Halbmikro-Test für die Bestimmung von freien Fettsäuren von Roche, Mannheim - TG-Bestimmungskit von Roche, Mannheim
Methode:
Das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug in diesem Fall 36 ml, zusammengesetzt aus 18 ml Chylomikronenlösung und 18 ml Nüchternplasma. Die Chylomikronen (CM) wurden in einer Konzentration von 6 mg/ml eingesetzt, so daß 0,9 ml CM mit 17,1 ml PBS auf 18 ml aufgefüllt wurden. Die Chylomikronenlösung vermischt mit dem Plasma wurde im Wasserbad auf 37° C erwärmt, 100 µl des Gemisches wurden für die spätere Bestimmung der Hydrolyserate abgenommen. Dem erwärmten Ansatz wurde 0,2 µg auf Eis aufgetaute Lipase pro ml hinzugefügt, folglich 7,2 µg Lipase auf 36 ml. Die Hydrolyse konnte nun unter Schütteln 30 min im 37° C Wasserbad ablaufen. Mit Zugabe von 25 µg/ml THL wurde die Hydrolyse gestoppt. Erneut wurden 100 µl des Ansatzes für die Bestimmung der Hydrolyserate entnommen.
Die Isolierung der Chylomikronen-Remnants (CR) erfolgte durch Ultrazentrifugation bei 38000 rpm und 4° C in Eigendichte über Nacht. Die flotierten CR konnten mit Spatel und Kanüle von der Oberfläche des zentrifugierten Ansatzes abgetragen und resuspendiert
werden. Im Anschluß wurden die abgetragenen CR mit Sucrose in einer Endkonzentration von 12 % beschwert und unter PBS geschichtet für 4-5 h unter obengenannten Be-dingungen ultrazentrifugiert und erneut abgenommen.
Die Bestimmung der Hydrolyserate erfolgte photometrisch unter Verwendung des Halbmikro-Tests für freie Fettsäuren. Die Proben wurden wie in der Testanleitung beschrieben untersucht und die Konzentration der freien Fettsäuren nach der angegebenen Berechnungsformel errechnet. Erwartet wurde aufgrund der eingesetzten Lipase-konzentration eine Hydrolyse von ca. 40 %, die durch den Bestimmungskit bestätigt wurde.
Der Proteingehalt der CR wurde mit Hilfe der Triglycerid (TG)-Bestimmung ermittelt, 1,5
% der TG-Konzentration entspricht der Proteinkonzentration. Zur TG-Bestimmung mit Hilfe des kommerziellen TG-Testkits wurden 10 µl Probe mit 1 ml Reagenz vermischt und nach 10 min Inkubation die Extinktion photometrisch bei 546 nm gemessen. Durch Multiplikation mit dem angegebenen Faktor wurde der TG-Gehalt berechnet. Der aus diesem Gehalt ermittelbare Proteingehalt lag bei den verschiedenen Isolierungen zwischen 0,7 und 0,8 mg/ml.
2.2.5 Proteinbestimmung nach Lowry Materialien:
- Lösung A: - 2 % Na2CO3
- 0,02 % Natriumkaliumtartrat - in 0,1 N NaOH
- Lösung B: - 0,5 % CuSO4
- 5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) von Serva - in A. dest.
- Lösung C: - Lösung A + Lösung B im Verhältnis 50+1
- Lösung D: - Folin-Ciocalteus Phenolreagenz + A. dest. im Verhältnis 1:1 - Albumin Standard (2,0 mg/ml) von Pierce, Rockford, USA, als Standardreihe in folgenden Verdünnungen:
2 ; 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 mg/ml in 0,1 N NaOH - 0,1 N NaOH
Methode:
Um die eingesetzte Proteinmenge der Liganden in den Experimenten konstant halten zu können, mußte sowohl der Proteingehalt der kalten als auch der heißen Liganden bestimmt werden.
Für die Proteinbestimmung der ApoE-Liposomen wurde die modifizierte Methode nach Lowry, SDS-Lowry, angewandt. Zur besseren Löslichkeit der Lipoproteine enthält Lösung B in diesem Fall 0,1 % SDS.
Alle Proben einschließlich der Standardreihe zur Berechnung des Konzentrationsfaktors wurden als Doppelwerte eingesetzt. Je 20 µl der Proben und Standardlösungen wurden mit 80 µl 0,1 N NaOH verdünnt, mit 1 ml Lösung C vermischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Unter Vortexen wurde anschließend 100 µl Lösung D hinzugefügt und die Ansätze bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 min inkubiert. Die Proben färbten sich proportional zu ihrer Proteinkonzentration blau. Bei 760 nm wurde nach der Inkubation die Extinktion gemessen. Die Standardreihe ermöglichte die Berechnung des Konzentrationsfaktors, mit dessen Hilfe die Proteinkonzentration der Proben ermittelt werden konnte.
2.2.6 SDS-Polyacrylamidelektrophorese der Liganden Materialien:
- Sammelgel 3 % Acrylamid (Roth), 0,2 % Bisacrylamid (Serva), 0,02 % Ammoniumpersulfat, 0,1 % (v/v) Tetramethylethylendiamin (TEMED; Serva) in 50 mM Tris in A. dest.; pH 6,14
- Trenngel 12 % Acrylamid, 0,1 % Bisacrylamid, 0,05 % Ammoniumpersulfat, 0,125 % (v/v) TEMED in 524 mM Tris in A. dest.; pH 9,2
- Lysispuffer 50 mM Tris, 80 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 % Triton X-100; in A.
dest.; pH 8,0
- Protease-Inhibitoren 1 mM Pepstatin A, 10 mM Chymostatin, 10 mM Leupeptin, 10 mM Antipain von Galbiochem in Lysispuffer
- Probenpuffer 50 mM Tris, 5 % SDS (Serva), 8% Glycerin, 0,02 % Bromphenolblau in A. dest.; pH 8,0
- Untergelpuffer 420 mM Tris in A. dest.; pH 9,5
- Obergelpuffer 40 mM Tris, 40 mM Borsäure, 0,1 % SDS in A. dest.; pH 8,6 - ß-Mercaptoethanol (Serva)
- Triton X-100 10 %
- Trichloressigsäure 50 % - Aceton
- Chromassie-Blau-Lösung
- Entfärberlösung Methanol-Eisessig 80:20 - Film (Kodak)
Methode:
Um die Liganden in Bezug auf ihre Apolipoproteinzusammensetzung mit Hilfe des SDS-PAGE zu untersuchen, sollten die Proben zunächst durch Präzipitation aufkonzentriert werden. Dafür wurden 100µl der Liposomen mit A. dest. auf 1 ml aufgefüllt, auf Eis gekühlt und mit 150 µl 10 % Triton X-100 (final 0,1 %) und 300 µl Trichloressigsäure (final 10 %), beide Reagenzien gekühlt, versetzt und vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei 4° C konnten die Präzipitate mit 13.800 rpm 5 min abzentrifugiert werden.
Der Überstand wurde abpipettiert und verworfen, das Pellet mit 1 ml eiskaltem Aceton gewaschen und erneut zentrifugiert. Anschließend wurde der Acetonüberstand verworfen und das Proteinpellet in der benötigten Menge Probenpuffer resuspendiert. Für Minigele mit einem Taschenvolumen von 15 µl und einer Dicke von 1 mm wurden 12 µl verwendet, für größere Gele mit einem Taschenvolumen von 30 µl und einer Dicke von 1,5 mm wurden 24 µl eingesetzt. Um die Liganden zu reduzieren, wurden die Ansätze mit 1,5 bzw.
3 µl ß-Mercaptoethanol versetzt und 10 min bei 95° C erhitzt.
Um die radioaktiven Liganden im Gel aufzutrennen wurden vor der Reduktion 10 µl des Ansatzes mit 1 ml PBS aufgefüllt und die Radioaktivität im Gammacounter gezählt.
Die Liganden wurden in einer Menge entsprechend 15000 cpm pro line aufgetragen.
Die Auftrennung der Proteine erfolgte im SDS-PAGE angelehnt an die Methode von Neville (Neville et al., 1971) bei Konstanten 10 mA für Minigele und 40 mA für große Gele.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel entweder 20 min mit Chromassie-Blau gefärbt und mit Methanol-Eisessig-Gemisch entfärbt oder getrocknet und zur autoradiographischen Darstellung für 2 Tage bei –80° C in einer Filmkassette inkubiert.
2.3 Nachweis der Lipoprotein-Rezeptoren der verwendeten Zelllinien
2.3.1 SDS-Polyacrylamidelektrophorese der Zelllysate Materialien:
Siehe 2.2.6
Methode:
Um das Zellprotein zu isolieren, wurden Zellen der Linien auf Petrischalen (ø 10 cm) ausgesetzt. Am Versuchstag sollten die Zellen konfluent gewachsen sein. Die Petrischale mit den Zellen wurde auf Eis gestellt und die Zellen 3 mal kurz mit kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurde bis zu 1 ml Lysispuffer mit Protease-Inhibitoren auf den Zellrasen pipettiert und die Zellen mit einem Plastikscraper von der Schale abgekratzt.
Nach kräftigem Mischen wurde das Lysat 20 min auf Eis inkubiert und im Anschluß 30 min bei 13.800 rpm und 4° C zentrifugiert. Im entstandenen Pellet befanden sich die Zellkerne und andere Aggregate, im Überstand unter anderem die Membranbestandteile.
Das Pellet wurde verworfen, im Überstand die Proteinkonzentration ermittelt.
Die für die Darstellung im Gel benötigte Menge Lysat wurde mit Probenpuffer auf 100 µl aufgefüllt und wie unter 2.2.6 beschrieben aufgekocht. Die Ansätze wurden auf Gele mit einem Taschenvolumen von 150 µl und einer Dicke von 1,5 mm aufgetragen und aufgetrennt.
2.3.2 Westernblot und Immundetektion Materialien:
- Nitrozellulose Porengröße 0,45 µm (Schleicher und Schuell) - Ponceau-Lösung (Serva); 0,2 % in 3 % Trichloressigsäure - Blotpuffer 20 mM Tris, 150 mM Glycin, 20 % Methanol - Waschpuffer A 10 mM Tris, pH 7,4, 154 mM NaCl, 0,1 % Tween
- Waschpuffer B 10 mM Tris, pH 7,4, 154 mM NaCl, 0,1 % Tween, 0,1 % SDS, 0,25 % Natriumdesoxycholat
- Blockpuffer 10 % Milchpulver, 5 % BSA in Waschpuffer A - 1. Antikörper in 5 % BSA in Waschpuffer A
- 2. Antikörper in 10 % Milchpulver, 5 % BSA in Waschpuffer A
- Reaktionslösung 30 mg 4-Chlor-1-Naphthol in 10 ml Methanol ad 50 ml PBS
- Antikörper (AK):
Antigen Wirt Verwendung1 Verdünnung Firma/Referenz ApoE Kaninchen WB/IF 1:5000/1:500 DAKO, Hamburg ApoER2 Kaninchen WB 1:750 Dr. J. Nimpf, Wien Cubilin Kaninchen WB 1:1000 Dr. P. Verroust, Paris LDL-R(637-1) Kaninchen WB 1:250 Dr. J. Herz, Dallas LRP (377-2) Kaninchen WB 1:500 Dr. J. Herz, Dallas
MAP2 Maus IF 1:100 Sigma
Megalin (611) Kaninchen WB 1:1000 Dr. T. Willnow, Berlin
Tabelle 5: Primäre Antikörper
1 WB: Westernblot; IF: indirekte Immunfluoreszenz
Die sekundären Antikörper wurden über die Firma Dianova bezogen. Alle 2. AK waren absorbiert gegen humane Proteine, um Kreuzreaktionen zu minimieren.
- 2. AK für Westernblot
Ziege anti-Kaninchen, HRP-gekoppelt 1:5000 - 2. AK für indirekte Immunfluoreszenz
Esel anti-Kaninchen DTAF-markiert 1:250 Esel anti-Maus DTAF-markiert 1:250
Methode:
Die aufgetrennten Proteine wurden nach der SDS-PAGE von den Gelen im Elektroblot auf Nitrozellulose übertragen. Die großen Gele mit den Zelllysaten wurden 16 h bei 250 mA und 4° C geblottet.
Nach dem Blotten wurden die auf der Nitrozellulose-Membran haftenden Proteine mit Ponceau-Lösung gefärbt. Nun konnten die Membranen für die Inkubation mit den verschiedenen Antikörpern zurechtgeschnitten werden. Anschließend wurden die Membranabschnitte mit Waschpuffer A wieder vollständig entfärbt und 1-2 h bei Raumtemperatur unter Schwenken in Blockpuffer inkubiert, um die unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran mit BSA abzusättigen. Auf kurzes Waschen mit Puffer A folgte dann die Inkubation mit dem ersten Antikörper über Nacht bei 4° C. Beide Antikörper waren mit Blocklösung auf die jeweils erwünschte Verdünnung gebracht worden. Vor Inkubation mit dem zweiten Antikörper wurden die Membranen 1 Minute mit Puffer A, zweimal 10 Minuten mit Puffer B und noch mal 1 Minute mit Puffer A
gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers fand für 2 h bei Raumtemperatur statt.
Im Anschluß wurde erneut wie oben erläutert gewaschen. Mittels der Reaktionslösung wurde die Entwicklung gestartet und zum Stoppen der Reaktion mit A. dest gewaschen.
Bei schwachen Signalen in der Farbreaktion erfolgte alternativ die sensitivere Detektion mit dem Enhanced Chemiluminescence- (ECL-) System entsprechend der Vorschrift. Die Chemilumineszenz wurde autoradiographisch dargestellt.
2.4 Radioaktive Zellassays
2.4.1 Bindungs-, Aufnahme- und Abbauexperimente mit primären murinen hippokampalen Zellen
Materialien:
- 24 ´well´ (Schalen) Zellkulturplatten - Counterröhrchen
- Liganden - 125I-markierte ApoE(3/3), bzw. ApoE(4/4)-Liposomen, Proteingehalt 0,1 µg/µl
- Chylomikronen-Remnants (CR), Proteingehalt 0,7-0,8 µg/µl - Inkubationsmedium: 2,5 g Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V von Sigma
5 ml Hepes von Gibco ad 100 ml DMEM von Gibco pH 7,4 steril filtriert
- Waschpuffer 1: PBS von Gibco
- Waschpuffer 2: 1 g BSA (Endkonzentration 0,2 %) ad 500 ml PBS
pH 7,4
- Heparinlösung: 2 ml Liquemin® mit 20.000 U/ml von Roche ad 360 ml PBS ( Endkonzentration 110 U/ml)
- Trichloressigsäure 50 ml Trichloressigsäure (TCA) ad 100 ml H2O (Endkonzentration 50 %)
- Kaliumjodidlösung: 0,2 mg Kaliumjodid ad 1 ml A. dest. (20 % ige Lösung) - Wasserstoffperoxid H2O2 30 % von Sigma
- Chloroform
Methode:
Die primären murinen hippokampalen Zellen wurden wie unter 2.1.2 beschrieben präpariert und auf 24 ´well´ Zellkulturplatten ausgesetzt. Jeweils eine Kulturplatte wurde am 1. Tag, am 2. Tag und am 5. Tag für ein Zellassay eingesetzt.
Am jeweiligen Versuchstag wurde das Neuronenmedium mit einer Pasteurpipette abgesaugt und jedes well (Schale) mit 1 ml PBS einmal gewaschen. Da jede Schale mit einem Endvolumen von 200 µl Medium-Liganden-Gemisch inkubiert werden sollte, wurde in jede Schale die wie folgt errechnete Menge Inkubationsmedium pipettiert:
200 µl - Volumen heißer Ligand - Volumen kalter Ligand = Volumen Inkubationsmedium
Mit Hilfe dieser Zellassays sollte die konzentrationsabhängige Bindung, Aufnahme und der Abbau der synthetisch hergestellten ApoE(3/3)-Liposomen mit der Bindung, Aufnahme und dem Abbau der ApoE(4/4)-Liposomen verglichen werden.
Dazu wurden Konzentration von 0,1 µg, 0,2 µg und 0,3 µg 125I-markierte ApoE(3/3), bzw.
(4/4)-Liposomen pro well (200 µl) eingesetzt.
Für jede der Konzentrationen der beiden Isoformen waren 4 untereinander gelegene Schalen der Kulturplatten vorgesehen. Die unteren 2 wurden zur Ermittlung der unspezifischen Bindung mit einem 50 fachen Überschuß an kalten Chylomikronen-Remnants (CR) versetzt. Durch diese Aufteilung der Platten ergaben sich für jede Konzentration mit und ohne kalte Unterdrückung Doppelwerte.
Zunächst wurde der Überschuß an kalten CR in die untere Hälfte der Schalen pipettiert und die Kulturplatte kurz vorsichtig geschwenkt. Anschließend wurden in jede Schale der Platte die heißen Liganden in der entsprechenden Konzentration gegeben. Die heißen Liganden wurden in einer 1:10 Verdünnung mit Inkubationsmedium zugegeben, um genauer pipettieren zu können. Erneut folgte leichtes Schwenken der Platte. Im Anschluß wurden die Zellen 4 h bei 37° C im Brutschrank inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurde die Zellkulturplatte zunächst 5 min auf Eis gekühlt. Auch alle folgenden Arbeitsschritte, wenn nicht anders vermerkt, wurden auf Eis im Kühlraum durchgeführt, da bei diesen niedrigen Temperaturen keine weitere Aufnahme oder Abbau stattfindet.
Zur Bestimmung des Abbaus wurde das Inkubationsmedium untersucht, die Bindung wurde durch Abwaschen der an die Zelloberfläche gebundenen Liganden mit
Heparinlösung bestimmt und zur Ermittlung der Aufnahme wurde das Zelllysat analysiert.
Die nötigen Inkubationszeiten während der Analyse der gebundenen, aufgenommenen und abgebauten 125I-ApoE-Liposomen ermöglichte eine parallele Aufarbeitung, im folgenden werden sie Arbeitschritte jedoch zum besseren Verständnis nach Abbau, Bindung und Aufnahme getrennt beschrieben.
Abbau:
Um den Abbau der 125I-ApoE-Liposomen zu analysieren, wurde die Aktivität des Abbauproduktes 125I-Tyrosin im Inkubationsmedium bestimmt. Das gesamte Inkubationsmedium (200 µl) jeder Schale wurde dafür in je einem zugehörigen 1-ml- Eppendorfröhrchen mit 300 µl frischem Inkubationsmedium und 125 µl eiskalter TCA versetzt, ´gevortext´ und 30 min auf Eis inkubiert, um die nicht abgebauten heißen Liganden aus dem Medium zu fällen. Im Anschluß wurden die präzipierten Proteine 10 min bei 13.000 rpm und 4° C abzentrifugiert. Der Überstand wurde in je ein 2 ml Eppendorfröhrchen überführt, das Proteinpellet verworfen. Außer dem gewünschten radioaktiven 125I-Tyrosin enthält der Überstand auch noch freies 125I, das bei der Auszählung der Aktivität den Rückschluß auf den Abbau verfälschen würde. Zur Eliminierung des 125I aus dem Überstand der einzelnen Schalen wurde dieser mit je 5 µl Kaliumjodidlösung und 10 µl 30 % H2O2 versetzt, gevortext und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In Anwesenheit des Katalysators H2O2 und Kaliumjodid wird das freie 125I zu I2 reduziert. Nach der Inkubation wurde in jede Probe 500 µl Chlorform pipettiert und gut gevortext. In der so entstandenen oberen wässrigen Phase war nun das freie 125I-Tyrosin enthalten, in der unteren organischen Phase das extrahierte I2. 250 µl der oberen Phase wurden im Gammacounter gezählt, die gezählten counts wurden zur Errechnung des Abbaus verdoppelt, da nur die Hälfte des Überstandes eingesetzt wurde.
Bindung und Aufnahme:
Für die Analyse der Bindung und Aufnahme wurde der Zellrasen in den Schalen zunächst 1 mal kurz mit Waschpuffer 1 (PBS), dann 2 mal für je 10 min mit Waschpuffer 2 (PBS + 0,2 % BSA) und noch 1 mal kurz mit Waschpuffer 1 gewaschen. Um die spezifischen Bindungen der noch nicht aufgenommenen Liganden auf der Zelloberfläche zu lösen, wurde im Anschluß der Zellrasen jeder Schale mit 500 µl Heparinlösung bedeckt und für 20 min unter leichtem Schwenken bei 4° C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die
Heparinlösung aus den Schalen in je ein Counterröhrchen überführt und zur Ermittlung der Bindung im Gammacounter gezählt.
Die in den Schalen verbliebenen Zellen wurden zur Ermittlung der Aufnahme mit je 500 µl 0,1 N Natronlauge 30 min bei Raumtemperatur lysiert. Das Lysat wurde anschließend ebenfalls im Gammacounter gezählt.
Nachdem die Proben im Gammacounter bezüglich ihrer Radioaktivität untersucht wurden, konnte das Zellprotein der lysierten Zellen für jede Schale nach Bradford (s.u.) bestimmt werden. Dadurch konnten unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität der heißen Liganden die Bindung, Aufnahme und der Abbau der Liganden auf den Zellproteingehalt der entsprechenden Schale bezogen und die gebundenen, aufgenommenen und abgebauten Liganden pro 1 mg Zellprotein berechnet werden. Die Werte für die spezifische Bindung, Aufnahme und den Abbau wurden durch Subtraktion der Doppelwerte für die unspezifischen Reaktionen von denen für die Gesamtbindung, -aufnahme und den Gesamtabbau ermittelt.
2.4.2 Aufnahmeversuche mit primären murinen hippokampalen Zellen Materialien:
- siehe 2.4.1
Methode:
Die Assays wurden wie unter 2.4.1 beschrieben durchgeführt, im Gegensatz zu 2.4.1 betrug die Inkubationszeit jedoch nur 1 h. Die Bindung und der Abbau wurden nicht analysiert.
Die Zellen wurden wie beschrieben nach der Inkubation gewaschen, die Heparinlösung wurde verworfen, das Zelllysat im Gammacounter gezählt und anschließend bezüglich des Proteingehaltes untersucht.
2.4.3 Aufnahmeversuche mit HT 22-Zellen Materialien:
- siehe 2.4.1
Methode:
Wie unter 2.1.2 beschrieben, wurden HT 22-Zellen passagiert, gezählt und in einer Zellkonzentration von 1x106 auf 24 ´well´ Zellkulturplatten ausgesetzt. Die Zellen wurden
in DMEM + 10% FCS 48 h im Brutschrank inkubiert. Nach 48 h waren sie bis zur Subkonfluenz gewachsen. Die Versuche, HT 22-Zellen im serumfreien Medium auszuhungern, scheiterten mehrmals, die Zellen starben ab.
Am Versuchstag wurden die Zellen wie die primären murinen hippokampalen Zellen mit den Liganden für 1 h inkubiert. Mit den HT 22-Zellen wurden ausschließlich Zellassays mit 1 h Inkubationzeit durchgeführt. Es wurde nur die spezifische Aufnahme der Liganden analysiert.
2.4.4 Bestimmung des Zellproteins nach Bradford Materialien:
- Bio-Rad Protein Assay-Lösung von Bio-Rad Laboratories GmbH, München - Albumin Standard (2,0 mg/ml) von Pierce, Rockford, USA, als Standardreihe in folgenden Verdünnungen:
2 ; 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 mg/ml in 0,1 N NaOH - 0,1 N NaOH
- A. dest.
Methode:
Um die Zellproteinkonzentration pro Schale zu ermitteln, wurde die Proteinbestimmung nach Bradford eingesetzt.
Um eine Eichkurve zu erhalten, wurde unter Verwendung der Albumin-Standard-Lösung und 0,1 N NaOH eine Standardreihe mit folgenden Endkonzentrationen hergestellt: 2 ; 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 mg/ml.
Jeweils 10 µl der einzelnen Eichkonzentrationen wurden in Küvetten pipettiert und mit 90 µl 0,1 N NaOH aufgefüllt. Jede Konzentration wurde als Doppelwert eingesetzt, um eine größere Genauigkeit des Eichfaktors zu erreichen. Als Nullwert diente 100 µl 0,1 N NaOH.
Nach dem Zählen des Zelllysat im Gammacounter wurden die Counterröhrchen zunächst erneut geschüttelt. Aus jedem Röhrchen wurden 100 µl in je eine Küvette überführt. In jede Küvette einschließlich der Standardreihe wurde zunächst 700 µl A. dest. und anschließend 200 µl Bradford-Reagenz pipettiert. Alle Proben wurden gründlich gevortext und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Proprotional zur Proteinkonzentration entstand einen Blaufärbung. Die Extinktion wurde photometrisch bei 595 nm gemessen. Aus der Eichkurve der Standardreihe ergab sich der
Konzentrationsfaktor mit dessen Hilfe die Zellproteinkonzentration der einzelnen Schalen errechnet werden konnte.
2.5 Immunfluoreszenz
2.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz Materialien:
- PFA –Lösung 4 % Paraformaldehyd (PFA), 4 % Saccharose in PBS; pH 7,4 - Blocklösung 2 % BSA, 2 % Fetales Kälberserum, 4 % Eselserum in PBS; pH 7,4 - Antifading-Reagens 5 µl Mowiol + 0,01 % Phenylendiamin
- PBS - Nagellack
- Methanol, Azeton - Antikörper (siehe 2.3.2)
Methode:
Unterschiedliche Zellmarker und Lipoprotein-Rezeptoren wurden in hippokampalen Zellen mittels Immunfluoreszenz dargestellt. Dafür mußten die Zellen auf Deckgläschen ausgesetzt und bis zur Subkonfluenz des Zellrasens im Brutschrank inkubiert werden. Am Versuchstag wurden die Zellen kurz mit PBS gewaschen und anschließend für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit PFA-Lösung fixiert. Erneut wurde kurz mit PBS gewaschen, dann folgte die Dehydrierung und Permeabilisierung der Zellen durch 4-minütiges Waschen in eiskaltem Methanol und 2-minütiges Waschen in eiskaltem Azeton. Dreimal 5-minütiges Waschen in PBS rehydrierte die Zellen wieder.
Die Zellen wurden nun 30 Minuten bei RT mit Blocklösung inkubiert. Die Antikörper wurden mit Blocklösung auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Anschließend folgte die Inkubation mit dem ersten Antikörper für 1-2 h bei 37° C. Die Zellen auf den Deckgläschen wurden 3-5 mal mit PBS gewaschen und 30-60 min bei 37° C mit dem zweiten Antikörper inkubiert. Erneut wurde mit PBS gewaschen. Die Deckgläschen wurden mit 5 µl „Antifading-Reagens“ eingedeckelt und mit Nagellack am Rand luftdicht verschlossen.
Die Zellen wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Miroskop angesehen und mit der entsprechenden Software dokumentiert.
2.5.2 Aufnahmeexperimente mit den Zelllinien mittels Immunfluoreszenz Materialien:
- siehe 2.5.1 - DMEM
- DMEM + 2,5 % BSA
- ApoE(3/3) und ApoE(4/4)-Liposomen, Herstellung siehe 2.2.2
Methode:
Um die Aufnahme der Liposomen mit Hilfe von Immunfluoreszenz darzustellen, mußte der Zellrasen auf den Deckgläschen zunächst mit kurz DMEM gewaschen werden. Im Anschluß wurden die Zellen mit den Liganden für 10-60 min bei 37°C inkubiert. Die Liganden waren in DMEM + 2,5% BSA aufgenommen worden. Dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS nach der Inkubation befreite sie von unspezifisch gebundenen Liganden.
Die Deckgläschen konnten nun wie unter 2.5.1 beschrieben fixiert und mittels der indirekten Immunfluoreszenz untersucht werden.
2.6 Geräteliste
- Werkbank Typ BSB4A von Gelaire® Flow Laboratories
- Begasungsbrutschrank von Heraeus
- Biofuge fresco für Eppendorftubes von Heraeus
- Laborzentrifuge Rotana RP für Plasma-Isolierung von Hettich
- Ultrazentrifuge L7-55 mit Rotor SW 41 von Beckman
- Gammacounter Cobra ™ Auto-Gamma von Packard
- Lichtmikroskop und Objektive (Sp Plan 10 x, CD Plan 20 x) von Olympus - Spektralphotometer 150-20 von Hitachi
- Minigel-Elektrophoresekammer von Bio-Rad - Blottingkammer für Naßblot von Bio-Rad
- Laserscanning Mikroskop TCS mit Argon-Krypton-Laser von Leica auf DIMRBE-Miroskop, Objektiv: Plaapo 63x, n.A. 1,3 Öl von Lietz
- Lyophille Lyovac Gt 2 von Leybold-Heraeus