Zellkultur

Da das Kultivieren der Zellen als Grundlage der Versuche anzusehen ist, wird im folgenden zunächst näher auf die Arbeitsschritte in der Zellkultur eingegangen.

Um die benötigten sterilen Bedingungen zu gewährleisten, wurde im Rahmen der Zellkultur unter einer speziellen Sicherheitswerkbank („Hood“) gearbeitet.

2.1.1 Primärkultur muriner hippokampaler Zellen Materialien:

- Poly-L-Lysin 0,1 mg/ml in 100 mM Boratpuffer pH 8,5 (0,618 g Borsäure in 100 ml A. dest.)

- Fibronektin 0,01 mg/ml in Hanks´ Bal. Salt (HBSS)

- Präparationsmedium: Hanks´ Bal. Salt (HBSS) w/o Calcium, Magnesium & Phenol Red von Gibco

+ 0,6 % Glukose

+ 10 mM Hepes Buffer von Gibco

- Platingmedium: Minimal Essential Medium (MEM) with Earle´s salts and L-Glutamine von Gibco

+ 10 % Pferdeserum

+ 0,6 % Glukose

+ 10 mM Hepes

- Neuronenmedium: Neurobasal-A-Medium von Gibco

+ B27 Supplement von

+ 10 mM Hepes

Methode:

Zur Vorbereitung der Kultur wurden zunächst die Oberflächen der Schalen der Kulturplatten bzw. der Coverslips beschichtet. Nacheinander wurden die Gefäße mit Poly-L-Lysin und Fibronektin jeweils über Nacht bei 4° C inkubiert, nach jeder Beschichtung wurde 4 x kurz und 1 x 1 Stunde mit A. dest. gewaschen.

Am Präparationstag wurde das Präparationsbesteck mit 70-80 % igem Ethanol desinfiziert.

Die benötigte Anzahl an Petrischalen wurde mit dem Präparationsmedium gefüllt.

Für die Primärkultur hippokampaler Zellen aus dem Mäusegehirn wurden Gehirne von Mäuse-Embryonen am 15. Tag ihrer Entwicklung präpariert. Gepaart wurden Männchen des Stammes CBA und Hybride-Weibchen der Stämme CBA und C57black6, die Anzahl der Embryonen je Weibchen lag zwischen 8 und 12. Die Tötung der Mäuse wurde im Rahmen der Organentnahme durchgeführt, so daß nach Vorschrift des Tierschutzgesetzes die Anzeige von Tierversuche nicht erforderlich war.

Die trächtigen Weibchen wurden durch Genickbruch getötet, die Bauchdecke desinfiziert und das Fell mit Pinzette und Schere entfernt. Anschließend wurde das Peritoneum eröffnet, der Embryonenschlauch aus dem Abdomen entnommen und in eine Schale mit Präparationsmedium gelegt.

Unter semi-sterilen Bedingungen erfolgte nun unter dem Mikroskop die Präparation der Hippokampi. Die Embryonen wurden einzeln dem Schlauch entnommen, dekapitiert, das Gehirn herauspräpariert und in Präparationsmedium gelegt. Nach Trennung der beiden Hemisphären vom Hirnstamm folgte das sorgfältige Abziehen der Meningen und das Herauspräparieren der Hippokampi.

Zum Andauen wurden die Hippokampi in 10 ml Trypsin/EDTA-Lösung für 10 min unter leichtem Schwenken im 37° C-Wasserbad inkubiert.

Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Bedingungen unter der „Hood“.

Parallel zum Trypsinieren wurden die Schalen der gewaschenen Platten mit der Hälfte des pro Schale benötigten Platingmediums (0,5 ml) gefüllt und in den Brutschrank gestellt.

Das Trypsin wurde von den angedauten Hippokampi abgenommen und die Zellen dreimal mit je 10 ml Platingmedium gewaschen. Das Gewebe konnte nun in 2 ml Platingmedium mit verkleinerten Pasteurpipetten titruliert werden bis eine homogene Zellsuspension entstanden war. Die Zellsuspension wurde mit Platingmedium soweit verdünnt, daß die Hippokampi von 4 Embryonen (8 Hippokampi) auf eine der vorbereiteten 24-Schalen-Kulturplatten ausgesetzt und im Brutschrank bei 37° C kultiviert werden konnten.

Nach 3 Stunden Inkubation im Brutschrank hatten sich die Hippokampus-Zellen angeheftet und das Platingmedium konnte gegen das serumfreie Neuronenmedium ausgetauscht werden. Die Neuronen wurden 1, 2 oder 5 Tage im Neuronenmedium ohne Mediumwechsel kultiviert.

2.1.2 Zellkultur der HT 22-Zelllinie

HT 22-Zellen: zur Verfügung gestellt von der Arbeitsgruppe Fr. Prof. Dr. Schaller, ZMNH, Universitätsklinikum Eppendorf, Hamburg

Materialien:

- Zellkulturflaschen, -schalen und -platten, Zentrifugationsröhrchen (15 ml) aus Kunststoff von der Firma Nunc, Roskilde, Dänemark

- Zellkulturmedium: -Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) von Gibco, Paisley, Schottland

+ 10 % fetales Kälberserum (FCS) von Gibco

- Waschpuffer: Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline (PBS) von Gibco:

2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄

pH 7,4

- Trypsin/EDTA-Lösung von Gibco 0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA - Trypanblaulösung von Serva, Heidelberg; 1:10 verdünnt mit PBS

- Einfriermedium: -10 % DMSO (Dimethylsulfoxid) von Sigma, Deisenhofen -90 % FCS von Gibco

Medien, Puffer und Trypsin/EDTA-Lösung wurden vor Gebrauch im Wasserbad auf 37° C erwärmt.

Methode:

Die HT 22-Zelllinien lagerten in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff bei –196° C in Stickstoffaufbewahrungstanks. Zum Kultivieren der Zellen wurde den Tanks ein Röhrchen entnommen und zügig im Wasserbad bei 37° C aufgetaut. Rasches Arbeiten beim Auftauen der Zellen ist nötig, um die Schädigung der Zellen durch den im aufgetauten Zustand toxischen DMSO-Anteil des Einfriermediums zu minimieren. Die aufgetaute Zellsuspension wurde in ein 15 ml-Nunc-Spitzröhrchen überführt und tropfenweise mit 5 ml Zellkulturmedium versetzt. Das Röhrchen wurde 3 min bei 400 xg zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in 3 ml Medium resuspendiert und die Zellsuspension in eine mit 7 ml frischen Medium gefüllte Kulturflasche mit 80 cm² Kulturfläche überführt.

Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zur Konfluenz kultiviert.

Zur weiteren Proliferation und zum Aussetzen der Zellen auf für die Versuche geeignete Zellplatten war es nötig, die Zellen zu passagieren, d.h. nach Ablösung der Zellen vom Kulturflaschenboden wurden die Zellen verdünnt in neue Kulturflaschen oder auf Kulturplatten überführt. Hierzu wurde das Medium mit einer Pasteurpipette aus der Flasche abgesaugt, der Zellrasen am Boden der Flasche einmal mit PBS gewaschen und bei Raumtemperatur mit 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung 3 bis 5 Minuten inkubiert, bis sich die Zellen vom Flaschenboden gelöst hatten. Die entstandene Zellsuspension wurde in ein 15 ml Spitzröhrchen, das bereits 5 ml frisches Kulturmedium zur Inhibition des Trypsins enthielt, überführt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 2ml frischen Medium resuspendiert.

Anschließend wurde die Suspension entweder halbiert und in neue Kulturflaschen mit frischen Medium überführt oder nach Ermittlung der Zellzahl in der gewünschten Konzentration auf die Versuchsplatten ausgesetzt.

Zur Ermittlung der Zahl der lebenden Zellen wurden 50 µl der Zellsuspension mit Trypanblaulösung 8 oder 16 fach verdünnt. Die lebenden Zellen, die sich im Gegensatz zu den abgestorbenen nicht blau anfärben ließen, konnten nun in einer Neubauer Zählkammer ausgezählt werden. Die Zellzahl pro ml ließ sich durch folgende Rechnung ermitteln:

Mittelwert der Zellzahl der 4 großen Quadrate x Verdünnung x 10⁴

Die gewünschte Zellzahl wurde durch Verdünnung mit frischen Medium erreicht und auf die entsprechenden Platten verteilt.