Aus dem Department Innere Medizin Klinik für Kardiologie und Angiologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. C. Bode
Urin-Proteomanalyse als nicht-invasives Diagnostikum
zur Erkennung und Progressionsbeurteilung atherosklerotischer Läsionen im ApoE"'" Mausmodell
INAUGURAL- DISSERTATION zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät
der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2014 von Christine Sackmann geboren in Gengenbach
http://d-nb.info/1075731755
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 8
1.1 Epidemiologische Relevanz kardiovaskulärer Erkrankungen 8
1.2 Zielsetzung der Arbeit 12
2 Grundlagen 13
2.1 Proteomik 13
2.1.1 Begriffsdefinition 13
2.1.2 Die Entwicklung der Proteinforschung 14
2.1.3 Proteinauftrennung mittels Kapillarelektrophorese (CE) 15
2.1.3.1 Geräteaufbau 15
2.1.3.2 Ablauf eines CE-Durchlaufs 16
2.1.3.3 Theoretische Grundlagen 16
2.1.3.4 CE-Methoden 18
2.1.4 Proteindetektion mittels Massenspektrometrie (MS) 18
2.1.4.1 lonenquelle 19
2.1.4.2 Massenanalysator 21
2.1.4.3 Detektor 23
2.1.4.4 Parameter eines Massenspektrometers 24
2.1.5 Kopplungsverfahren: CE-MS 25
2.2 Die Atherosklerose 25
2.2.1 Pathogenese 25
2.2.2 Risikofaktoren 28
2.2.3 Klinische Manifestation und therapeutische Strategien 29 2.2.4 Die Bedeutung der Statine in der Atherosklerose-Therapie 30
2.2.5 Diagnostische Möglichkeiten 33
2.3 Das ApoE"'" Mausmodell in der kardiovaskulären Forschung 34
3 Material und Methoden 37
3.1 Tierstudie 37
3.1.1 Versuchstiere 37
3.1.2 Gruppenzuteilung und Studiendesign 37
3.1.3 Behandlung mit Atorvastatin 39
3.1.4 Uringewinnung 39
3.2 Urin-Analyse 41
3.2.1 Probenaufbereitung 41
3.2.2 CE-MS Analyse 41
3.2.3 Datenverarbeitung 42
3.2.3.1 Filterung relevanter Information 43
3.2.3.2 Bestimmung der wahren Molekülmassen 44
3.2.3.3 Kalibrierung des Massenspektrometers und Normalisierung der
Daten 45
3.2.3.4 Datenspeicherung und Clusteranalyse 47
3.2.4 Statistische Methoden 47
3.2.5 Klassifizierung mittels Support Vector Machine 51
3.2.6 Sequenzierung der Biomarker 53
3.3 Histologie 55
3.3.1 Gewebegewinnung und -aufbereitung 55
3.3.2 Histologische Aufarbeitung der Aortenbögen 57
3.3.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 58
3.3.4 Masson-Trichrome-Färbung 59
3.3.5 Oil-Red-O-Färbung 60
3.3.6 Immunhistochemie 61
3.3.6.1 Alpha-1-Antitrypsin 62
3.3.6.2 Pro-Epidermal Growth Factor (proEGF) 63
3.3.7 Analyse der Plaquegröße und -Zusammensetzung 64
3.3.7.1 Bestimmung der Plaquegröße 65
3.3.7.2 Bestimmung des Kollagen- und Lipidgehaltes 65 3.3.7.3 Semiquantitative Auswertung immunhistochemischer Färbungen 66
3.3.7.4 Statistische Auswertung 66
4 Ergebnisse 67
4.1 Identifizierung eines Atherosklerose-spezifischen Urin-Proteommusters im Trainings-Set 67
4.2 Klassifizierung des Trainings-Sets mittels Support Vector Machine.71
4.3 Markervalidierung im Test-Set 72
4.4 Verhalten des Urin-Proteommusters bei Fortschreiten der
Atherosklerose 73
4.5 Einfiuss der Atorvastatin-Therapie auf das Urin-Proteommuster 74
4.6 Sequenzierung der Markerproteine 76
4.7 Histologische Auswertung 78
4.7.1 Bestimmung der Plaquegröße 79
4.7.2 Bestimmung des Lipidanteils 79
4.7.3 Bestimmung des Kollagenanteils 80
4.7.4 Immunhistochemie: Alpha-1 -Antitrypsin und proEGF 81
4.8 Korrelation der Urin-Expression von Kollagen und Alpha-1 -
Antitrypsin mit dem histologischen Expressionsmuster 84
5 Diskussion 86
5.1 Die Multimarker-Strategie in der Atherosklerose-Forschung 87
5.2 Vorteile der CE-MS in der Proteomanalyse 89
5.3 Auswahl des Probenmaterials für die Proteomanalyse 91 5.4 Atherosklerose-spezifische Biomarker im ApoE"'" Mausmodell und
deren Rolle in der Atherogenese 92
5.5 Der Einfiuss von Atorvastatin auf das Urin-Proteommuster und die
Plaqueentwicklung und -Zusammensetzung 98
5.6 Proteomanalyse in anderen Forschungsgebieten 99
5.7 Limitationen 100
5.8 Ausblick 101
