Aus dem
Abteilung Virologie
Leiter: Prof. Dr. Herbert Schmitz
Dissoziation der NTPase und Helikase-
Aktivitäten der Superfamilie II
NTPase/Helikasen am Beispiel der Hepatitis C
Virus NTPase/Helikase
D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin
der Universität Hamburg vorgelegt von
Oliver Müller aus Konstanz
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG Seite
1.1 Das Hepatitis C Virus 1
1.2 Der Replikationszyklus des HCV 2
1.3 Genomische Organisation 2
1.3.1 Strukturproteine 3
1.3.2 Nicht-Strukturproteine 4
1.4 Struktur und Funktion von NTPasen/Helikasen 5
1.5 Inhibition der HCV NTPase/Helikase 10
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Materialien 11
2.2 Methoden 11
2.2.1 Expression und Reinigung der HCV NS3 NTPase/Helikase (1175-1657)
11
2.2.2 Expression und Reinigung der HCV NS3 NTPase/Helikase (1193-1658)
12
2.2.3 Expression und Reinigung der Domänen 1 und 2 der HCV NS3 NTPase/Helikase (1189-1525).
12
2.2.4 Proteolytischer Verdau der Domänen 1 und 2 der HCV NS3 NTPase/Helikase
13
2.2.5 Oligomarkierung und Herstellung des NTPase/Helikasesubstrates 13
2.2.6 Helikase Assay 14 2.2.7 ATPase Assay 15 2.2.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 15 2.2.9 TBE-Gele 16 2.2.10 Elektroblot 16 2.2.11 Immunoblot 16
2.2.12 Affinitätsmarkierunng mit 5'-p-fluorosulfonyl-benzoyl-adenosine (FSBA)
2.2.13 Färbungen von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen (SDS/PAGE) 17
2.2.14 Nukleotidbindungsassays 18
2.2.15 Proteinbestimmungen 18
3 ERGEBNISSE
3.1 Charakterisierung der NTPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase (1175-1657)
20
3.2 Charakterisierung der Helikase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase (1193-1658)
21
3.3 Relation der NTPase- und Helikase-Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase
22
3.4 Testung von Paclitaxel und Trifluoperazindihydrochlorid auf die Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase
25
3.5 Testung von Chlorethylguaninen auf die Inhibition der enzymatischen Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase
26
3.6 Herstellung der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364)
28
3.7 Charakterisierung der NTP-bindenden Domäne des NS3 der HCV NTPase/Helikase (1203-1364)
31
3.8 Inhibition der ATP-Bindung an der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364) 32 4 DISKUSSION 34 5 ZUSAMMENFASSUNG 39 6 LITERATURVERZEICHNIS 41 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 51 8 LEBENSLAUF 53 9 DANKSAGUNG 54 10 ERKLÄRUNG 55
1 EINLEITUNG
1.1 Das Hepatitis C Virus
Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein kleines, umhülltes Plus-Strang RNA Virus. Es ist ungefähr 9500 Nukleotidbasen [20] lang, es ist identifiziert als Hauptursache der non-A, non-B Hepatitis. Das 1989 [14, 15] entdeckte Virus führt bei einem Großteil der HCV Infektionen zu chronischer Hepatitis (85%), zu Leberzirrhose oder zum hepatozellulärem Karzinom [59, 68, 76]. Nach Angaben der WHO sind derzeit weltweit 3% der Bevölkerung von der Erkrankung betroffen, etwa 170 Millionen Menschen sind chronisch infiziert und 3 bis 4 Millionen infizieren sich jährlich neu. In Deutschland beträgt die Prävalenz 800000 und die jährliche Inzidenz 5000. Momentan existieren weder eine Impfung noch eine effektive Therapie.
Die gegenwärtige Behandlungspraxis der chronischen Hepatitis C besteht in der Gabe von Interferon alpha 2 oder pegyliertem Interferon alpha oder aber in der Kombinationstherapie aus Ribavirin (1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) und Interferon alpha 2 [59, 68]. Ribavirin, das erfolgreiche Wirkung gegen verschiedene RNA und DNA Viren wie das Influenzavirus [23], das Respiratorische Synzytial Virus [81], das Lassa Fieber Virus [58] und das Hantaan Virus [37] zeigt, war bei der Therapie der HCV Infektion als Monotherapie nicht wirksamer als ein Placebo [52, 97]. Als Langzeit-Monotherapie heilt Interferon alpha 2 nur 10% bis 30% der Patienten [59, 68, 70]. Die Kombination von Ribavirin mit Interferon alpha 2 zeigt eine Virusclearance von bis zu 40% bei Patienten mit einer chronischen Hepatitis C Infektion.
Zur Entwicklung weiterer antiviraler Konzepte ist das Verständnis der genomischen Organisation von grundlegender Bedeutung. HCV ist phylogenetisch klassifiziert als Virus der Hepaciviren, einem Genus der
Flaviviridae Familie [20], das die drei weiteren Genera Hepaciviren, Flaviviren und
Pestiviren [10, 92, 61], subsumiert. Ein Vorschlag für eine Nomenklatur der Flaviviren auf Basis phylogenetischer Analysen der Core-, E1-, und NS5 Region,
teilt die Viren in 11 definierte Genotypen und mindestens 70 Subtypen ein, die sich in ihrer geographischen Ausbreitung, der Therapieantwort und der Prognose unterscheiden. In Europa und Asien hat der Subtyp 1A von HCV die größte Prävalenz [25, 63]. Leider existiert bis dato noch kein effizientes Zellkultursystem, so daß Aussagen zur viralen Replikation und Funktion der Gene anhand verschiedener, etablierter Expressionssysteme gewonnen werden mußten.
1.2 Der Replikationszyklus des HCV
Nach der Bindung an den Zielzellrezeptor (CD81) [34] durchdringt das Virus die Zellmembran und die Plus-Strang RNA gelangt aus dem Nukleokapsid in das Zytoplasma. Die RNA dient als Matrize für mehrere Minus-Strang RNA´s. Die Synthese wird durch einen Membran-assoziierten-Replikase Komplex, der aus mindestens zwei viralen Proteinen besteht, erreicht: NS3 mit der Nukleosidtriphosphatase (NTPase/Helikase) und NS5B mit der RNA abhängigen RNA Polymerase (RdRp). Die Minus-Strang RNAs werden wiederum in Plus-Strang RNAs transkribiert und zum Nukleokapsid zusammengesetzt oder in ein Polyprotein übersetzt.
1.3 Genomische Organisation
Das virale Genom kodiert ein Polyprotein aus ungefähr 3010 Aminosäuren [16, 83], das nach Translation durch zelluläre, im Lumen des endoplasmatischen Retikulums lokalisierte, und zwei virale Proteasen in mindestens zehn verschiedene virale Proteine prozessiert wird [75, 92]. Es werden mehrere Strukturproteine (C(Core), E1, E2, p7) und Nichtstrukturproteine mit essentieller enzymatischer Aktivität für die virale Replikation (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) gebildet [16, 78]. Sowohl am 5´ als auch am 3´ Terminus ist das
Genom, das einen offenen Leserahmen bildet (ORF), von einer unübersetzten Region (UTR) begrenzt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur des HCV-Polyproteins.
Der obere Balken repräsentiert das Genom von HCV mit dem Offenen Leserahmen (ORF) und den unübersetzten Bereichen (UTR). Der untere Balken zeigt das HCV-Polyprotein, ca. 3010 Aminosäuren lang mit den Strukturproteinen in Hellblau und den Nichtstrukturproteinen in Dunkelblau dargestellt. Die enzymatischen Aktivitäten, die mit den Nichtstrukturproteinen assoziiert sind, sind bezeichnet. Die Pfeile zeigen die jeweiligen Schnittstellen der Serin- und der Autoprotease an.
1.3.1 Strukturproteine
Die 5´UTR besteht aus 341-344 Nukleotiden [12, 31]. Die Funktion der 5´UTR Region ist die einer cap-unabhängigen internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) [66, 88] mit einer Vielzahl von AUG Triplets als Startcodons [39, 65]. Das 3´UTR Ende bildet eine hochkonservierte Region, deren Funktion noch nicht geklärt ist. Verschiedene Hypothesen implizieren eine wichtige Rolle für die Replikation [38] oder für die Stabilisierung des Genoms [45]. Die ersten 191 Aminosäuren des HCV Polyproteins bilden das 21 kDa große, mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziierte, Core Protein [28, 35]. Das Core Protein enthält viele basische Aminosäuren, mit denen wahrscheinlich die Bindung an RNA ermöglicht wird [56]. Das Core Protein ist zusätzlich in der Lage die Hepatitis B Virus (HBV)- und die Humane Immundefekt Virus (HIV)- Replikation zu supprimieren [79]. Eine Interaktion mit zellulären Protoonkogenen [72], die
Transformation von embryonalen Rattenfibroblasten [73] und die Suppression der Apoptose wurden belegt und wichtig für die Pathogenese und für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms gehalten [74]. E1 und E2 repräsentieren als glykosilierte funktionelle Hüllproteine die Oberfläche der viralen Membran [62]. Verschiedene Experimente haben gezeigt, dass E1 und E2 zu membranständigen, nicht-kovalenten Komplexen aggregieren [18, 28, 50] und vermutlich ist dies für das Andocken des HCV an die Zielzelle von Bedeutung. Für das stark hydrophobe p7-Peptid ist bisher keine funktionelle Bedeutung bekannt [4].
1.3.2 Nicht-Strukturproteine
NS2 ist ein hydrophobes, 23 kDa großes, integrales Membranprotein. Das NS2 Protein bildet zusammen mit Teilen des NS3 eine zinkabhängige Metalloprotease [36], welche die autoproteolytische cis-Teilung der NS2/NS3 Region [26, 36] vermittelt. Unabhängig von dieser NS2/NS3 Protease ist die Serinprotease des NS3, die NH2-terminal gelegen ist [26, 36]. Das NS4A ist ein Co-Faktor der
NS3-Protease Aktivität [3, 53, 86]. Die Funktionen des NS4B und des NS5A sind unbekannt. Das NS5B stellt eine RNA- abhängige RNA Polymerase (RdRp) dar [5, 14]. Besonderes Augenmerk wird auf NS3 gelegt und intensive Studien haben sich mit seinen vielfältigen Funktionen beschäftigt. Es ist ein 70 kDa großes Protein. Im ersten NH2-terminalen Drittel des NS3 wird als katalytische
Untereinheit eine Serinprotease codiert, die Schnittstellen zwischen NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A und NS5A/5B [2, 27] besitzt, während ein 54 Aminosäuren großer Anteil des NS4A für einige dieser Schnittstellen ein essentieller Co-Faktor ist [3, 53, 86]. Dieser bildet einen stabilen Komplex mit NS3, wobei eine zentrale hydrophobe Region des NS4A sowohl als wichtig für die Komplexierung, als auch für die proteolytische Aktivität dargestellt wurde [3, 53, 86]. Die C-terminalen zwei Drittel des NS3 codieren eine RNA Nukleosidtriphosphatase (NTPase)/Helikase und eine bisher als singulär beschriebene RNA-Bindungsstelle [21, 85, 95]. Es gibt keinen Anhalt dafür, dass
die drei enzymatischen Funktionen des NS3 durch Proteolyse in einen C-terminalen und einen NH2-terminalen Teil getrennt werden. NS3 besitzt
weiterhin eine RNA/DNA Einzelstrang-Bindungsstelle [30, 41, 82]. Bei der Tumorgenese infolge einer HCV Infektion wurde eine Transformation von Mausfibroblasten und eine Tumorinduktion bei Nacktmäusen durch NS3 beschrieben [77]. Zusätzlich ließ sich auch feststellen, daß NS3 mit der katalytischen Untereinheit der PKC interagiert [9].
Unter den viralen Proteinen sind die vielversprechendsten antiviralen Ziele bei einer HCV Infektion die Enzyme des Replikasekomplexes. Der Replikasekomplex besteht aus der NTPase/Helikase, lokalisiert am COOH-Terminus des NS3 Proteins, der RdRp und anderen viralen Proteinen, die durch hydrophobe Aminosäuremotive fähig sind als Membrananker am Endoplasmatischen Retikulum zu agieren. Eine Reihe von Knock-out Experimenten, bei denen die NTPase/Helikase oder die RdRp Aktivitäten von Flaviviren ausgeschaltet wurde, demonstrierte die Schlüsselrolle dieser Enzyme für die Virusreplikation.
1.4 Struktur und Funktion von NTPasen/Helikasen
NTPase/Helikasen sind Nukleotidtriphosphat (NTP)-abhängige ubiquitäre Enzyme mit der Fähigkeit während der genomischen Replikation Doppelstrang DNA oder RNA Strukturen enzymatisch zu entwinden [24, 40]. Mutationen in verschiedenen humanen NTPase/Helikase Genen sind bisher mit sechs bekannten Erberkrankungen assoziiert: Werners Syndrom, Blooms Syndrom, Xeroderma pigmentosa, Trichothiodystrophy, Cockaynes Syndrom und mit der α-Thalassämie bedingten, X-chromosomal assoziierten geistigen Retardierung [19]. Über 80% aller Positiv-Strang RNA Viren, deren Genom sequenziert wurde, codieren zumindest eine potentielle NTPase/Helikase.
Erst vor kurzem sind Kristallstrukturen von NTPase/Helikasen aufgeklärt worden: Die von Bacillus stearothermophilus und von Escherichia coli [46, 80]. Seit 1997 ist die Kristallstruktur von HCV durch Yao N et al. und 1998 durch
Cho et al. und 1998 in Kokristallisation mit einem gebundenen Oligonukleotid durch Kim et al. [13, 43, 44, 95] aufgeklärt worden.
Die HCV NTPase/Helikase ist aus drei nahezu gleich großen Domänen aufgebaut. Die erste und zweite Domäne besitzt eine weitgehend ähnliche βαβ-Konformation, während Domäne 3 aus α-Helices besteht. Die erste und dritte Domäne ist eng gepackt und von Domäne 2 durch eine tiefe Spalte getrennt. In Kristallstrukturvergleichen zweier NTPase/Helikasen wurde festgestellt, dass die Domäne 2 gegenüber Domäne 1 und 3 verschieblich gelagert ist [95].
Abbildung 2: Ribbon Diagram der HCV RNA NTPase/Helikase Domänen und der Motive I-VI (PDB accession number 1HEI)
Basierend auf Sequenzvergleichen und Motivvergleichen wurden die RNA NTPase/Helikasen in drei Superfamilien (SF) unterteilt [24, 40]. Die Superfamilie II (SFII) besteht aus der HCV-, dem Initiationsfaktor eIF-4A-, der West Nil Virus-, dem bovinen viralen Diarrhoe-, der Plum Pox Virus- und der Vaccina Virus- NTPase/Helikase. Alle Superfamilie-II- NTPase/Helikasen (SFII)
enthalten sieben hoch konservierte Aminosäuresequenzen (Motiv I-VII) [24, 40], die auf der Oberfläche der Domänen 1 und 2 exprimiert sind [28, 95]. Viele der konservierten Aminosäuren sind nahe des Interdomänenspaltes, der die Domäne 2 von 1 und 3 trennt, lokalisiert [46]. Motiv I und II, auch als Walker Motiv A und B bezeichnet [89], sind sowohl in allen NTPase/Helikasen vorhanden als auch in einem weiten Spektrum anderer NTP-bindender Proteine [71]. Auf der Analyse der Walker Motive basiert die Einteilung in die verschiedenen Superfamilien und Subgruppen. Die Funktion der Walker Motive A und B, die die NTP-bindende Tasche bilden und in Domäne 1 liegen, ist weitgehend aufgeklärt. Das Walker Motiv A (G207-S-G-K-S/T) bindet die endständige Phosphat Gruppe des NTP. Das Walker Motiv B (D-E-X-H) chelatiert Mg2+ des
Mg2+-NTP Komplexes. Mutationen in diesen Motiven hoben die NTP-abhängige
hydrolytische Aktivität des Proteins auf [6, 94]. Geringe Unterschiede im Walker Motiv B respektive Motiv II unterteilt die SFII NTPase/Helikasen in weitere vier Subgruppen von Proteinen. In Abwesenheit von Substrat binden die Reste der Walker Motive aneinander und zusätzlich an die Reste der konservierten T-A-T Sequenz von Motiv III. Motiv III ist ein Teil der flexiblen „Switch Region“, die die erste mit der zweiten Domäne des Enzyms verbindet. Die Energieübertragung, die zur Entwindung benötigt wird, wird aus der NTP Hydrolyse gewonnen und vermutlich über diese „Switch region“, die als Motiv III bezeichnet wird, vermittelt [47]. Durch Aminosäurenaustausch in dieser Region (T322 zu A322) ließ sich die NTPase/Helikase-Aktivität um 50 Prozent mindern, während die ATPase-Aktivität unbeeinflußt blieb [42]. Durch Aminosäurensubstitutionen ließ sich auch die Rolle des Motivs IV der NTPase/Helikase zuordnen [42, 47]. Die Rolle des argininreichen Motivs VI, auf der Oberfläche von Domäne 2 gelegen, wird kontrovers beurteilt. Einerseits wird Motiv VI anhand von kristallographischen Daten als notwendig für die Bindung von RNA an die NTPase/Helikase [13, 95] betrachtet, andererseits schlägt Kim anhand der gewonnenen Daten bei der Kokristallisation der NTPase/Helikase mit einem Oligonukleotid vor [44], daß die argininreichen Reste des Motivs VI direkt für die ATP-Bindung der NTPase/Helikase mitverantwortlich sind.
Trotz einiger kinetischer und funktioneller Experimente mit NTPase/Helikasen der Superfamilie II ist der Mechanismus, der über die ATP-Bindung und Hydrolyse zur DNA/RNA Entwicklung führt, noch wenig bekannt. Die NS3 NTPase/Helikase zeigt Substratspezifität für RNA/DNA, DNA/DNA und RNA/RNA Hybride in 3' 5' Richtung für die Translokation entlang eines Polynukleotidsubstrates [10, 21, 69]. Das gebundene Polynukleotid liegt in einem Spalt, der Domäne 3 von 1 und 2 trennt [44]. Die Interaktionen zwischen dem Polynukleotid und der Helikase werden hauptsächlich durch nicht kovalente Bindungen der Domänen 1 und 2 in ihrer Struktur, die trotz geringer Sequenzhomologien sehr äquivalent ist, vermittelt.
Basierend auf der Struktur und der biochemischen Analysen wurden zwei unterschiedliche Mechanismen der Entwindungsreaktion von NTPase/Helikasen vorgeschlagen. In Anlehnung an Adenylatkinasen, bei denen eine Konformationsänderung durch NTP-Bindung stattfindet, wird ein „aktiver Mechanismus“ vermutet, in dem die NTP-Bindung zum Schluß der Domäne 1 und 2 führt, vermittelt durch die basischen Reste in Motiv VI (QRRGRTGR) mit NTP. Starke Konformationsänderungen sind in DNA metabolisierenden Enzymen nichts Einzigartiges. Sowohl bei RNA capping Enzymen in Anwesenheit von GTP als auch bei DNA Ligasen sind diese Konformationsänderungen, die zu einem Schluß der Struktur führen [42], beobachtet worden. Durch diesen Schluß wird das Polynukleotid, gebunden an Domäne 2 passiv mitbewegt, während Domäne 3 mit der Aminosäure W501 das 3´Ende des Polynukleotids aufgabelt und den Doppelstrang separiert. Die Hydrolyse des ATP würde in diesem Modell zu der Öffnung des Spaltes zwischen Domäne 1 und 2 führen. Dieser aktive Mechanismus ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Mechanismus der NTPase/Helikase-Aktivität nach Kim [44].
Die Bindung des Polynukleotids durch die HCV NTPase/Helikase bildet einen breiten Spalt zwischen Domäne 1 und 2. Die Bindung von ATP geschieht über den β-Phosphat Rest von ATP an Motiv I (GSGKT) und über die Bindung des γ-Phosphats mit dem gebundenen Mg2+ an die konservierten aziden Reste von Motiv II (DECH). Dies
führt zum Schluß des Spaltes zwischen den beiden Domänen und zur Bindung von konservierten Argininen in Motiv VI (QRRGRTGR) an die ATP-Phosphate. Der Schluß der beiden Domänen führt zur Translokation des Einzelstrangs in 5´-3´ Richtung. Die Hydrolyse von ATP führt wiederum zur Öffnung des Spaltes und zur Freisetzung von ADP.
In einem anderen Modell wird ein „passiver Mechanismus“ vorgeschlagen. Die NTPase/Helikase bindet an die Einzelstrangregion des Substrates und ist nicht aktiv beteiligt an der Trennung des DNA oder RNA-Doppelstranges [55, 57, 95]. In Übereinstimmung mit diesem Modell ist die Beobachtung, daß einige Proteine, wie das eukaryotische Replikations-Protein A [22], das Herpes Simplex Virus Typ 1 ICP8 Protein [7], T4gp32 [11] und das Protein Vasa von Drosophila melanogaster [32] fähig sind DNA Doppelstränge NTP unabhängig zu entwinden.
1.5 Inhibition der HCV NTPase/Helikase
Die Inhibition der NTPase/Helikase kann an mehreren Stellen erfolgen. Als Ziele bietet sich die Kompetition mit der NTP-Bindungsstelle, die Inhibition der NTPase-Aktivität durch eine allosterische Hemmung, die Inhibition der Kopplung der NTP Hydrolyse mit der Entwindungsreaktion und die kompetitive Hemmung der RNA Bindung an. Einige Inhibitoren der Flavivirenfamilie wie die Derivate von 5-ethynyl-1-beta-D-ribafuranosylimidazole-4-carboxamid, Tiazofurin oder Selenazofurin wurden entwickelt und auf die Inhibition des Yellow fever virus getestet, der Modus der Inhibition aber nicht näher spezifiziert [1, 17, 64]. Neuerdings ist der Versuch die NTPase/Helikase Funktion des HCV zu blockieren beschrieben worden. Einige dieser Compounds sind allerdings als Patente (ViroPharma: Diana et al. 1998, Diana and Bailey 1996) beschrieben und basieren auf zwei Benzimidazolen, die über Spacer verschiedener Länge vernetzt sind, die als kompetitive Inhibition der RNA Bindung wirken. Trotz der großen Attraktivität der NS3 NTPase/Helikase als antivirales Ziel gibt es bisher kein Therapeutikum für die Chemotherapie.
Es scheint notwendig, die Substraterkennung und Hydrolyse an der NTP-bindenden Tasche und besonders deren Assoziation mit der Entwindungsaktivität funktionell näher zu untersuchen. Aus diesem Grund wird im Folgenden der Versuch unternommen durch Verwendung von chemischen Verbindungen, welche im Speziellen mit der NTP-bindenden Stelle interferieren, den Einfluß der NTPase auf die Helikase der NTPase/Helikase zu untersuchen. Es werden die drei beschriebenen Funktionen NTP-Bindung, NTPase und Helikase der NTPase/Helikase im Einzelnen charakterisiert und in unterschiedlichen Assays der Einfluß von Aktivatoren und Inhibitoren auf die Funktionsfähigkeit des Holoenzyms getestet.
2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Materialien
Die verwendeten Oligonukleotide wurden im Bernhard-Nocht-Institut synthetisiert. Sequencing-grade Proteasen, Proteaseinhibitoren und polyklonales Kaninchen anti-FSBA (5'-p-fluorosulfonyl-benzoyl-adenosine) Serum wurden von Boehringer-Mannheim bezogen. Das Institut für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Universität Hamburg stellte das humane HCV-positive Antiserum zur Verfügung. Das Säulenmaterial Superdex-200 (High-Load) und Sephadex G-25 wurden von Pharmacia geliefert. [γ-33P] ATP, [γ-32P] ATP (3000
Ci.mmol-1) und [125I] Protein A (91.1 µCi.µg-1) wurden von Amersham
(Braunschweig), [14C] FSBA (47.6 Ci.mmol-1) von Du Pont (Bad Homburg)
erworben. Alle anderen verwendeten Chemikalien wurden von Sigma (Deisenhofen) bezogen. Die Röntgenfilme stammten von Kodak (Stuttgart). Nitrocellulose (NC) (BA 85, 0,45 µm) und Polyvinylidenfluorid (PVDF) wurden von Schleicher & Schüssel (Dassel) gekauft. Die Analysen wurden mit Hilfe der Software ENZFITTER (Biosoft) und Sigma Plot (Jandel Corp) unterstützt.
2.2 Methoden
2.2.1 Expression und Reinigung der HCV NS3 NTPase/Helikase (1175-1657)1
Das Protein wurde uns freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von LIH-HWA HWANG (Graduate Institute of Microbiology, National Taiwan University) zur Verfügung gestellt. Es war in Escherichia coli exprimiert worden [51]. Die Reinheit des Enzyms lag bei 80-85%.
1 Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Position der Aminosäuren des HCV Polyproteins nach
2.2.2 Expression und Reinigung der HCV NS3 NTPase/Helikase (1193-1658)
Die transformierten kompetenten Bakterien waren uns von der Arbeitsgruppe von Joonho Choe (Institute of Science and Technology, Taejeon, Korea) zur Verfügung gestellt worden. Die NTPase/Helikase (1193-1658) wurde in Escherichia coli exprimiert und gereinigt. Die NTPase/Helikase (1193-1658) enthielt am COOH-Terminus einen His-Tag. Die Expression in Escherichia coli wurde durch die Zugabe von Isopropylthio-b-D-galaktosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei 37°C wurden die Bakterien zentrifugiert und das Pellet in Bindungspuffer (5 mM Imidazol, 0,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,9]) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden bei -270°C schockgefroren und in eiskaltes Wasser überführt. Danach sonifizierten wir die Zellen. Nach Zentrifugation wurde der Überstand über eine mit Bindungspuffer äquilibrierte His-Tag Affinitätschromatographiesäule gereinigt. (Waschpuffer 60 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,9]). Elutionspuffer (1 M Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,9]). Die das Protein enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und gegen 50 mM Tris-HCl dialysiert. Die Reinheit des Proteins lag bei 90-95%.
2.2.3 Expression und Reinigung der Domänen 1 und 2 der HCV NS3 NTPase/Helikase (1189-1525)
Das Fragment, das die Domänen 1 und 2 der NTPase/Helikase (1189-1525) enthielt, wurde von Prof. Dr. Feucht (Institut für medizinische Mikrobiologie und
Immunologie, Universität Hamburg) kloniert und in Escherichia coli exprimiert [51].
Die Bakterien wurden nach zweistündiger Induktion mit IPTG (1 mM) durch Sonifikation lysiert. Das exprimierte Protein konnte über eine Affinitätschromatographiesäule mit Glutathionsepharose 4B (Pharmacia), wie vom Hersteller empfohlen, aufgetrennt werden. Das exprimierte Polypeptid wurde einer limitierten Proteolyse mit Thrombin unterzogen. Die Reinigung der
Domänen 1 und 2 der NTPase/Helikase (1189-1525) wurde durch eine Anionenaustauschchromatographie (Resource Q, Pharmacia) komplettiert. Die Reinheit des Proteins lag bei 90-95%.
2.2.4 Proteolytischer Verdau der Domänen 1 und 2 der HCV NS3 NTPase/Helikase
Die gereinigte Domäne 1 und 2 der HCV NTPase/Helikase (1189-1525) wurde wie folgt weiter prozessiert: 20 nmol des Enzyms wurden mit 1 nmol Staphylokokkus aureus V8-Protease in Tris/Glycerol/Triton Puffer für 60 Min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 µl 200 mM Phenylmethanesulfonylfluorid gestoppt, danach wurden die Proteine über eine Superdex 200 Säule chromatographisch aufgetrennt. Die Säule wurde äquilibriert und mit Tris/Glycerol/Triton Puffer (20 mM Tris/HCl [pH 7,5], 10% Glycerol, 0,05% Triton X-100, 1 mM EDTA und 1 mM ß-Mercaptoethanol) eluiert. Die Fraktionen, die die NTP-bindende Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364) (Fraktion 20-21 jeweils 3,2 ml) enthielten, wurden gepoolt und konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 20 mM Tris/HCl [pH 7,5] in 10% Glycerol bis zu einer Proteinkonzentration von 2 mg/ml verdünnt. Die Triton X100 Konzentration wurde auf <0,01% verringert. Die Reinheit des Proteins lag bei 98%.
2.2.5 Oligomarkierung und Herstellung des NTPase/Helikasesubstrates Die verwendeten Oligonukleotide hatten die Basensequenz
5´-AGAGAGAGAGGTTGAGAGAGAGAGAGTTTGAGAGAGAGAG-3´ (40 Basen) und 5´-CAAACTCTCTCTCTCTCAACAAAAAA-3´ (26 Basen). Das radioaktiv zu markierende Oligonukleotid wurde für 5 Min. bei 950C denaturiert.
Für die Reaktion wurden jeweils 5 pmol Oligonukleotid verwendet und in den Reaktionsansatz (50 mM Tris/HCl [pH 6,8], 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 20 u
Polynukleotidkinase T4, 10,2 pmol [γ-32P] ATP (0,03 Ci) ad 50 ml Aqua dest.)
überführt. Nach Inkubation für eine Stunde bei 370C wurde die Reaktion durch
Hybridisierung mit dem Komplementärstrang abgestoppt. Hierfür wurde der markierte DNA-Strang mit dem unmarkierten Komplementärstrang in einem eins zu drei Verhältnis auf 800C erhitzt und in vier Stunden langsam renaturiert.
Die Ermittlung des Umsatzes wurde dünnschichtchromatographisch durchgeführt. Gereinigt wurden die [γ-32P] ATP markierten Hybride in einem
nativen 8% TBE Gel. Die Gele wurden für 25 Min. bei 230C autoradiographiert.
Die DNA-Hybride wurden aus dem Gel geschnitten und in Aqua dest. eluiert.
2.2.6 Helikase Assay
Die Helikase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase wurde mittels des oben beschriebenen DNA Substrates ermittelt. Die Helikase-Aktivität wurde, wenn nicht anders spezifiziert mit 2 pmol des Enzyms in einem Standardreaktionsansatz (25 µl von 20 mM Tris-HCl, [pH 7,5], 2 mM MgCl2, 1
mM ß-Mercaptoethanol, 10% Glycerol, 0,01% Triton X-100, 0,1 mg BSA/ml, 9,5 µM ATP) mit einer je nach Versuchsansatz variierenden Konzentration an Substrat bestimmt. Der Reaktionsansatz wurde 30 Min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde mittels 5 µl Stoppuffer beendet (100 µM Tris-HCl [pH 7,5], 20 mM EDTA, 0,5% Sodiumdodecylsulfat (SDS), 0,1% Triton X-100, 25% Glycerin, 0,1% Bromophenolblau, 0,1% Xylencyanol). Die Proben wurden durch ein 15% Polyacrylamid-TBE Gel mit 0,1% SDS getrennt. Danach wurden die Gele getrocknet und bei –70°C autoradiographiert. Die Banden im Gel, die dem Substrat und die den Einzelsträngen entsprachen, wurden ausgeschnitten und die [γ32P]- Radioaktivität wurde gemessen. Alternativ wurden die Gele
autoradiographiert. Die freien Einzelstränge und die Doppelstränge wurden mittels der Gelimage Software (Amersham Pharmacia Biotech) quantifiziert. Die Effektivität der NTPase/Helikasereaktion wurde als Gesamtbetrag der Nukleotidbasen im Verhältnis zum unentwundenen Substrat errechnet. Die kinetischen Parameter wurden mittels nonlinearer Regressionsanalyse, unter
Verwendung von ENZFITTER (Biosoft) und Sigmaplot (Jandel Corp.), bestimmt.
2.2.7 ATPase Assay
Ein Standard ATPase Assay wurde für 30 Min. bei 300C durchgeführt. 10 pmol
der HCV NTPase/Helikase wurden in einem Standardreaktionsansatz (Endvolumen 25 µl) inkubiert. Der Ansatz enthielt 20 mM Tris/HCl [pH 7,5], 3 mM MgCl2, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 10% Glycerol, 0,01% Triton X-100, 0,1
mg/ml BSA und [γ-32P] ATP (0,5 µCi). Der Reaktionsansatz wurde durch Zusatz
von 0,5 ml Aktivkohlesuspension (2 mg/ml) gestoppt. Nach Zentrifugation bei 10000g für 10 Min. wurden 50 µl Aliquots des Überstandes Cerenkov gezählt. Die kinetischen Daten wurden durch eine nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung von ENZFITTER (Biosoft) und Sigma Plot (Jandel Corp) analysiert.
2.2.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde gemäß Lämmli [48] ausgeführt. Die Konzentration des Sammelgeles, welches die obere Phase bildete, lag bei 7,5% Acrylamid. Die Acrylamidkonzentration des Trenngeles variierte zwischen 10% bis 20% Acrylamid. Die Sammelgele waren mit „Upper“ Puffer (125 mM Tris/HCl, [pH 6,8], 0,1% SDS) und die Trenngele mit „Lower“ Puffer (400 mM Tris/HCl, [pH 8.8], 0,1% SDS) gepuffert. Die Elektrophoresen wurden in einer Mini-protean Kammer von Bio-Rad (München) ausgeführt. Die Bedingungen waren konstant 200 V in SDS-PAGE Laufpuffer (190 mM Glycin, 25 mM Tris/HCl [pH 6,8], 0,1% SDS). Zur weiteren Verwendung wurden die Gele entweder auf Nitrocellulose (NC) oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) geblottet oder gefärbt.
2.2.9 TBE-Gele
Native TBE Polyacrylamidgele wurden in Konzentrationen zwischen 8% und 12,5% hergestellt. Die einphasigen Gele enthielten TBE (90 mM Tris-Borat und 20 mM EDTA [pH 8,0], 0,1% SDS). Die Polyacrylamidgele wurden sowohl in einer mini-protean Kammer (Bio-Rad) als auch in einer Pegasus-Kammer elektrophoretisch aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde TBE verwendet. Die Elektrophoresebedingungen waren konstant 90 V für 4 h (Bio-Rad) beziehungsweise 6 h (Pegasus) bei 230C
2.2.10 Elektroblot
Der Transfer von Proteinen aus SDS-Polyacrylamidgelen erfolgte nach der Methode von Towbin [87] in einer Blotkammer (Bio-Rad) 12 Stunden bei Raumtemperatur mit konstant 40 V in Transferpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris/HCl [pH 8,8], 20% Methanol). Proteine, die ansequenziert werden sollten, wurden in glycinfreiem Puffer geblottet. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose (NC) und für Sequenzierungen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) transferiert. Die NC wurde getrocknet und mit Ponceaurot in 5% Essigsäure zur Darstellung und Markierung der Markerproteine gefärbt. Danach wurden die NC Folien wieder entfärbt (0,2% BSA in TTBS).
2.2.11 Immunoblot
Die SDS-Polyacrylamidgele (SDS-PAGE) wurden auf Nitrocellulose geblottet. Die NC wurde dann eine Stunde geblockt (Blocksolution: 1 mg/ml BSA, 25 mM Tris/HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl und 0,05% Tween 80 (BSA+TTBS)). Danach wurde die Folie mit dem entsprechenden Antiserum oder der Antikörperlösung für eine Stunde überschichtet (1:500 in TTBS). Nach dreimaligem Waschen der NC jeweils für 20 Min. (1% BSA in TTBS ) wurden die gebundenen Antikörper
direkt durch [125I] Protein A (0,5 µCi/ml) oder durch anti-human Serum vom
Kaninchen (1:500 in TTBS) für eine Stunde, nach weiterem dreimaligen Waschen gefolgt von [125I] Protein A für eine Stunde detektiert. Die NC wurde nochmals
gewaschen bis in der Waschlösung keine Radioaktivität mehr nachzuweisen war. Die Folie wurde an der Luft getrocknet und über Nacht mittels eines Röntgenfilmes oder unter Verwendung eines Analysers (ImageQuant) autoradiographiert.
2.2.12 Affinitätsmarkierung mit 5'-p-fluorosulfonyl-benzoyl-adenosine (FSBA)
5'-p-fluorosulfonyl-benzoyl-adenosine (FSBA) war gelöst in Dimethylsulfoxyl und wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zu einem Volumen von 50 µl des Reaktionsansatzes zugegeben, der 20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 3 mM MgCl2,10% (v/v) Glycerin, und 5 µg des Proteins enthielt. Nach Inkubation bei
30°C für 30 Min. wurde SDS Sample Puffer hinzugefügt, die Proben aufgekocht und in der SDS/PAGE elektrophoretisch getrennt
2.2.13 Färbungen von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen (SDS/PAGE) Die Silberfärbung erfolgte nach Heukeshoven und Dernick [33]. Die Trenngele wurden nach der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese für 30 Min. fixiert (10% Essigsäure und 30% Ethanol in Aqua dest.). Danach erfolgte dreimaliges Waschen jeweils für 20 Min. in Aqua dest. und Reduktion in 5 µg/ml Dithiothreitol in Aqua dest. für 30 Min., gefolgt von einer Inkubation mit 0,1% AgNO3 in Aqua dest. für erneut 30 Min. Die anschließende Entwicklung wurde
in 50 µl Formaldehyd (37%) in 100 ml Na2CO3 vollzogen. Gestoppt wurde die
Entwicklung durch Zugabe von 100 ml Zitronensäure (2,3 M).
Weniger sensitiv wurden die Trenngele in Coomassie gefärbt. Die Trenngele wurden bei 600C im Wasserbad für 30 Min. fixiert und gefärbt (10% Essigsäure,
30% Ethanol und 0,1% Coomassie Blue). Entfärbt wurden die Gele in Entfärber (10% Essigsäure und 30% Ethanol) im Wasserbad.
Analysiert und quantifiziert wurden die Banden mittels graphischer Analyse.
2.2.14 Nukleotidbindungsassays
Die Bindung von ATP mit der NTPase/Helikase (1203-1364) wurde in zwei verschiedenen Assays untersucht: (A) einer Mikrofiltrationsmethode und (B) einer Größenausschlußgelchromatographie.
A) Mikrofiltrationsassay: Der Reaktionsansatz (50 µl) enthielt 50 pmol der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364) und wurde für 30 Min. bei 300C inkubiert. Der Reaktionsansatz enthielt 20 mM Tris/HCl [pH 7.5],
3 mM MgCl2, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 10% Glycerol, 0,01% Triton X-100, 0,1
mg/ml BSA und [γ-32P] ATP (0,5 µCi). Die Reaktion wurde durch Zugabe von
eiskaltem 500 µl NaCl/P (20mM) gestoppt. Die Proben wurden dann durch Nitrocellulose, unter Verwendung eines Mikrofiltration Apparatus (Bio-Rad) unter Vakuum filtriert. Die Nitrocellulose wurde zweifach mit 2 ml 20mM NaCl/P gewaschen, getrocknet und das gebundene [γ-32P] ATP wurde sowohl
autoradiographisch erfaßt als auch nach Cerenkov gezählt.
b) Gel-Filtrations Assay: Der Bindungs Assay wurde mit 50 pmol der ATP-bindenden Domäne der NTPase/Helikase (1203-1364) durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Proben einer Gelfiltration unterzogen (0,4 x 12 cm, Sephadex G-25 Säule) und das ungebundene [γ-P32] ATP getrennt. Die
Fraktionen, die das an die NTP- bindende Domäne gebundene [γ-32P] ATP
enthielten, wurden nach Cerenkov gezählt.
2.2.15 Proteinbestimmungen
Proteinbestimmungen erfolgten nach der Methode von Lowry [54]. Proteinproben und BSA-Standardproben wurden für 30 Min. bei 40C präzipitiert
(10% TCA). Das Präzipitat wurde für 15 Min. bei 25000g zentrifugiert. Danach wurde das Pellet zweimal mit 100% Aceton gewaschen. Dem Pellet wurde Folin-Reagenz und 0,2% CuSO4, 0,4% NaK-Tatrat und 2% NaCO3 in Aqua dest. für
30 Min. zugegeben. Danach folgte die photometrische Bestimmung bei 578 nm. Die Reinheit der Proteine wurde durch densiometrische Messung silbergefärbter Gele festgestellt.
3 ERGEBNISSE
3.1 Charakterisierung der NTPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase (1175-1657)1
Es wurde in den Studien eine homogene Präparation des Enzyms verwendet. Die Reinheit des charakterisierten Enzyms lag bei etwa 85-95%. Wir stellten fest, daß die Kinetik der Reaktion des Enzyms abhängig von den Reaktionsbedingungen ist. Also war es notwendig diese zu optimieren, bevor das inhibitorische Potential verschiedener getesteter Compounds determiniert werden konnte.
Die Eigenschaften der ATPase wurden in einem Standardassay bestimmt, in welchem das, durch das Enzym aus [γ-32P ATP] hydrolysierte freie [32P]
gemessen wurde. Die Reaktionsgeschwindigkeit der HCV NTPase/Helikase wurde als eine Funktion der Konzentration der divalenten Ionen Mg2+ und Mn2+
beschrieben. Die Reaktion war streng von der Ionenkonzentration abhängig und erreichte bei optimalen Konzentrationen ein Maximum an Aktivität: 1-3 mM für Mg2+ und 0,3-0,5 mM für Mn2+. Bei höheren Konzentrationen (>50 mM) von
Mg2+ und Mn2+ wirkten die Ionen stark hemmend auf die ATPase. Die
monovalenten Ionen Na+ und K+ übten bis zu einer Konzentration von 100-300
mM keinen Einfluß aus. Bei höheren Konzentrationen bewirkten die Kationen einen inhibitorischen Effekt. Der maximale Umsatz des Enzyms wurde bei optimaler Mg2+ Konzentration gemessen. Die ATPase-Aktivität wurde nach 5
Min. messbar, war linear von 15 Min. bis 60 Min. und erreichte ihr Plateau nach 90 Min.
Unter optimalen Reaktionsbedingungen war die Lineweaver-Burk Kurve linear bis zu einer ATP Konzentration von 90 µM und ergab eine Km von 11 µM . Die
Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 4. Charakterisierung der verwendeten HCV NTPase/Helikase
(A) Die gereinigte Enzympräparation (10 pmol) wurde durch ein SDS/Polyacrylamidgel aufgetrennt und silbergefärbt dargestellt.
(B) Aliquote (20 pmol) der HCV NTPase/Helikase wurden in einem Reaktionsansatz mit ATP (11 µM) und ansteigenden Konzentrationen von Mg2+ (T) oder Mn2+ () wie angegeben inkubiert.
(C) Die Reaktion wurde im Reaktionsansatz mit 11 µM ATP und 3 mM Mg2+ durchgeführt und wurde zum
angegebenen Zeitpunkt terminiert.
(D) Der Lineweaver-Burk Plot stellt die Km für ATP dar. Das Reaktionsgemisch enthält das Enzym, 3 mM Mg2+ und
variierende Konzentrationen von ATP.
Die Abbildung stellt jeweils die Ergebnisse drei unabhängiger Experimente dar.
3.2 Charakterisierung der Helikase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase (1193-1658)
Die Untersuchung der Helikase-Aktivität des Enzyms erfolgte mittels eines Assays, wie er in Material und Methoden beschrieben ist. Für den Test wurde ein Substrat hergestellt, welches zwei partiell hybridisierte Oligo-DNAs enthielt. Die Entwindungsaktivität wurde durch Hydrolyse des kurzen [32P] markierten und
des langen unmarkiertem Strang des DNA-Hybridsubstrates nachgewiesen. Die Reaktion benötigte divalente Ionen und ATP. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei den optimalen Konzentrationen von divalenten Ionen gleichwie bei der ATPase der NTPase/Helikase beobachtet. Bei optimalen Konzentrationen von Mg2+ und ATP entwand 1 pmol des Enzyms 5,5
fmol (angegeben in Nukleinbasen) des DNA-Doppelstranges in der Sekunde. Die Entwindungsreaktion verlief linear und erreichte für die Helikase der NTPase/Helikase 20 Min. nach Reaktionsbeginn ein Plateau. Die Km für ATP
DNA-Substrat 4,7 pM. Es wurde kein signifikanter Unterschied beim Vergleich der enzymatischen Reaktionen der NTPase und der Helikase der NTPase/Helikase in Bezug auf das Temperaturoptimum (25° C) festgestellt.
Abbildung 5. Kinetik der enzymatischen Entwindungsreaktion der HCV NTPase/Helikase
Der Helikase Assay ist mit 10 pmol des Enzyms durchgeführt worden und wurde zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten beendet. Die Proben wurden auf einem 15% Polyacrylamid TBE Gel, 0,1% SDS enthaltend aufgetrennt. Das getrocknete Gel wurde bei –80°C für 14 Stunden autoradiographiert.
Die Autoradiographie ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
3.3 Relation der NTPase- und Helikase-Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase
Die Annahme, daß die NTPase der NTPase/Helikase zur Energiegewinnung benötigt wird, führte zur Überlegung die Helikase-Aktivität durch die Reduktion der NTPase-Aktivität, durch Blockade an der NTP-bindenden Stelle zu hemmen. Um diese Frage zu klären, wurden Ribavirin und Ribavirintriphosphat als bekannte Kompetitoren von NTP-Bindungsstellen auf die Inhibition der Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase getestet.
1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (Ribavirin) ist ein Compound, das keine Phosphatgruppen besitzt und als Analogon für Adenosin und Inosin gelten kann, in dem das C(2)=N(3) Fragment von Adenin entfernt ist. Diese Verbindung scheint mit der NTP-bindenden Stelle der NTPase/Helikase des HCV zu interagieren. Die Hemmung der NTPase-Aktivität der NTPase/Helikase durch Ribavirin war abhängig von der ATP Konzentration. Bei einer ATP Konzentration der Km entsprechend, wurde die NTPase-Aktivität der
Konzentration im Reaktionsansatz führte zu einer stärkeren Inhibition des Enzyms durch Ribavirin. Bei einer ATP Konzentration von 0,01 µM wurde eine IC50 von 600-700 µM gemessen. Diese Abhängigkeit von der ATP Konzentration
suggerierte einen kompetitiven Hemmungsmodus bezüglich ATP. Überraschenderweise wurde bei höheren Konzentrationen von Ribavirin (>750 µM) und ATP(>Km) eine Aktivierung der ATPase der NTPase/Helikase
festgestellt.
Der Mechanismus, der für die von der ATP Konzentration abhängigen Inhibition und Aktivierung der NTPase verantwortlich ist, sollte im Folgenden weiter untersucht werden. In diesem Zusammenhang war es wahrscheinlich, daß die Einführung einer 5´-Triphosphatgruppe in das Ribavirinmolekül, welche mit den Walker Motiven der NTP-bindenden Domäne des Enzyms interagieren und damit die Affinität der Bindung erhöht, somit zu einem verstärkten Potential der Inhibition führen würde.
Die Analyse der kinetischen Parameter der Inhibition der NTPase/Helikase durch 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide-5´-triphosphate (Ribavirintriphosphat) ergab tatsächlich ein verstärktes inhibitorisches Potential für Ribavirintriphosphat wie in Abbildung 6 dargestellt: Bei einer ATP Konzentration der Km entsprechend wurde eine halbmaximale Hemmung (IC50)
der NTPase der NTPase/Helikase bei 220 µmol Ribavirintriphosphat festgestellt. Die Reduktion der ATP Konzentration (kleiner als 1/3-1/10 der Km für ATP) im
Reaktionsansatz führte zu einer Verstärkung des hemmenden Effekts. So ergab sich beispielsweise bei einer ATP Konzentration von 0,01 µM eine IC50 von 40
µM. Die Hemmung war aber nicht komplett und erreichte maximal 25% der Kontrolle. Die graphische Analyse der Daten erbrachte, daß Ribavirintriphosphat als klassischer kompetitiver Inhibitor in Bezug zu ATP reagiert. Wurde die ATP Konzentration erhöht (>100 x Km), trat in Anwesenheit von
Ribavirintriphosphat eine signifikante Steigerung der ATPase-Aktivität ein. Insgesamt zeigte Ribavirintriphosphat einen größeren inhibitorischen Effekt auf die NTPase der NTPase/Helikase als Ribavirin.
Abbildung 6. Inhibition der ATPase Reaktion der HCV NTPase/Helikase durch Ribavirintriphosphat und Plots, die den Inhibitionstyp in Abhängigkeit von ATP darstellen.
(A) Die ATPase Reaktion wurde bei ATP Konzentrationen entsprechend 1 (z), 1/10 (), 1/100 (T) und 1/1000 (¡) der Km in Gegenwart ansteigender Konzentrationen von Ribavirintriphosphat durchgeführt. Die
ATPase-Aktivität gemessen für die jeweilige ATP Konzentration in Abwesenheit des Inhibitors war als 100% Wert angenommen.
(B) Die Dixon Plots zeigen den inhibitorischen Effekt von Ribavirintriphosphat in Gegenwart von ATP in den Konzentrationen von 300 nM, 100 nM, 30 nM korrespondierend 1/30 (), 1/100 (T), oder 1/300 ( ) der Km.
(C) Dies ist eine Darstellung der doppelt reziproken Plots nach Cornish-Bowden. Die gezeigten Resultate entsprechen Ergebnissen dreier unabhängiger Experimente.
Die durch Ribavirintriphosphat vermittelten Veränderungen der NTPase-Aktivität korrelierten nur teilweise mit Veränderungen in der Helikase-NTPase-Aktivität der NTPase/Helikase. Die Helikase-Aktivität wurde als Funktion ansteigender Konzentrationen von Ribavirintriphosphat untersucht. Nach 20 Min., zu diesem Zeitpunkt waren 95% des DNA Substrates entwunden, stoppten wir die Reaktion. Es wurde nur eine mäßige Hemmung mit einer IC50 von 150-200 µM
gemessen, bei einer ATP Konzentration, die der Km entsprach. Die Hemmung
war nicht komplett und erreichte ein Maximum von 35% der Kontrolle bei einer Ribavirintriphosphatkonzentration größer als 300 µM. Überaschenderweise wurde die gleiche Hemmung bei einer Reduktion der ATP Konzentration auf 0,01 µM oder 5 fM gesehen. Bei diesen Konzentrationen wirkte Ribavirintriphosphat als potenter Inhibitor der ATPase-Aktivität. Interessant war, daß die Inhibition der Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase durch Ribavirintriphosphat auch höher war, wenn die Reaktion früher gestoppt wurde. Wurde die Inkubationszeit auf 10 Min. reduziert, zu diesem Zeitpunkt ist etwa 60% des DNA Substrates entwunden, lag die IC50 bei 90 µM. Wurde die
lag die IC50 bei 30 µM. In allen Fällen war die Hemmung nicht komplett.
(Abbildung 7)
Abbildung 7. Inhibition der Entwindungsreaktion der HCV NTPase/Helikase und ihre Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion.
Die Helikase Assays wurden wie in Material und Methoden beschrieben in Gegenwart ansteigender Ribavirintriphosphat-Konzentrationen durchgeführt. Die Reaktion wurde nach 5 Min. (T), 10 Min. (z) und 20 Min. () Inkubation gestoppt. Die Proben wurden entsprechend der Legende von Abbildung 5 prozessiert. Die Helikase-Aktivität wurde quantifiziert, wie in Material und Methoden beschrieben. Die erhaltenen Werte sind als Prozente der Kontrolle (ohne Inhibitor) dargestellt und repräsentieren drei unabhängige Experimente.
3.4 Testung von Paclitaxel und Trifluoperazindihydrochlorid auf die Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase
Weitere Effektoren (Abbildung 8), die getestet wurden waren Paclitaxel, ein Compound, das strukturell nicht mit NTP verwandt ist und nachweislich mit dem Walker A Motiv der nukleotidbindenden Tasche von Effluxproteinen, Mitgliedern der ABC Superfamilie (ATP-binding cassette) [93] interagiert. Paclitaxel konnte die ATPase-Aktivität der NTPase/Helikase mit einer IC50 von
17 µM kompetitiv hemmen. Bei der Testung der Inhibition auf die Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase des Enzyms war Paclitaxel bis zu einer Konzentration von 1 mM nicht aktiv. Eine ähnliche Beobachtung wurde bei der Untersuchung von Trifluoperazindihydrochlorid als Inhibitor der NTPase/Helikase gemacht. Die Verbindung ist ein Calmodolin Antagonist und ist nicht verwandt mit den Nukleotid-5´-Triphosphaten. Die IC50 betrug 105 µM,
der Inhibitionstyp war ein nichtkompetitiver Mechanismus. Interessanterweise hemmt Triflourperazindihydrochlorid die Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase bei höheren Konzentrationen mit einer IC50 von 600-700 µM.
Abbildung 8: Kinetik der Inhibition der ATPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase durch Paclitaxel und Trifluoperazin.
Der ATPase Assay wurde mit 10 pmol der HCV NTPase/Helikase wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt.
(A) Effekt der ansteigenden Konzentrationen von Paclitaxel(z) und Trifluoperazin(T) auf die ATPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase. Die ATP Konzentration in dem Reaktionsansatz war der Km entsprechend (bestimmt für die
ATPase-Aktivität (11 µM)).
(B, C) Effekt ansteigender ATP Konzentrationen auf die Inhibition der ATPase-Aktivität durch Paclitaxel (B) und durch Trifluoperazin (C). Die ATP Konzentrationen waren entsprechend dem 0,3- ( ), 1,0- (z) und 3- ({) fachem Wert der Km. Der Typ der Inhibition wurde durch einen Dixon Plot analysiert.
3.5 Testung von Chlorethylguaninen auf die Inhibition der enzymatischen Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase.
In weiteren Experimenten wurden Derivate von O6-Benzylguanin, einem
Inhibitor der O6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase, mit erhöhter Spezifität für
humane Enzyme verwendet. Die Ursprungssubstanz O6-Benzylguanin war ein
schwacher Inhibitor der NTPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase (IC50>500µM). Interessante Beobachtungen wurden aber mit den Derivaten der
O6-Benzylguanine, in denen eine Chloroethylgruppe in Position 7 oder 9
substituiert wurde, gemacht. Während O6–Benzyl-N7-Chloroethylguanin das
gleiche inhibitorische Potential zeigte wie die Ausgangssubstanz, ergab sich überraschenderweise für O6–Benzyl-N9-Chloroethylguanin bei 650 µM eine
maximal 350% Stimulation der NTPase-Aktivität im Vergleich zur Kontrolle. Beide Chloroethylderivate, in denen die O6-Benzylguanin Gruppe entfernt wurde
(N7-Chloroethylguanin, N9-Chloroethylguanin), beeinflußten die NTPase bis zu
einer Konzentration von 500 µM nicht. Weiterhin wurde der Einfluß der Derivate auf die Helikase der NTPase/Helikase untersucht. Bei steigender
Konzentration der Derivate wurde eine schwache inhibitorische Wirkung des O6
-Chloroethylguanin beobachtet, während N7-Chloroethylguanin und N9
-Chloroethylguanin eine signifikante Erhöhung der Helikase-Aktivität bewirkte. Die Aktivierung der Entwindungsaktivität erreichte ein Maximum von 850% und 220% der Kontrolle für N7-Chloroethylguanin und N9-Chloroethylguanin bei
Konzentrationen von 200 µM bis 250 µM und eine 50% Steigerung gegenüber der Kontrolle bei 150 µM. (Abbildung 9)
Diese Daten zeigen die unabhängig zu regulierende Aktivität der NTPase und Helikase der NTPase/Helikase und damit eine Dissoziation beider enzymatischer Aktivitäten.
Abbildung 9: Vergleich des modulatorischen Effektes von Guanin- und O6-Benzylguaninderivaten auf die ATPase-
und Helikase-Aktivitäten der HCV NTPase/Helikase.
Die ATPase- (A) und Helikase- (B) Aktivitäten des Enzyms wurden als Funktion ansteigender O6-Benzylguanin (z),
O6- Benzyl-N9-Chloroethylguanin (T), O6-Benzyl-N7-Chloroethylguanin () und N9-Chloroethylguanin(S) und N7
-Chloroethylguanin (¡) untersucht. Die ATPase Reaktion wurde in Anwesenheit einer ATP Konzentration der Km
entsprechend durchgeführt. Die Aktivität des Enzyms wurde mittels einer Aktivkohle-Absorptions Methode wie in Material und Methoden beschrieben ermittelt. Die Helikase-Aktivität des Enzyms wurde bei 143 µM ATP und 4,7 pM Substratkonzentration bestimmt. Die 32P Radioaktivität des Released Strands wurde, wie in Material und
Methoden dargestellt, quantifiziert. Die ATPase- und Helikase-Aktivitäten gemessen in Abwesenheit eines Effektors waren 100%. Die Resultate zeigen das Ergebnis dreier unabhängiger Experimente.
(C) Die Autoradiographie eines TBE-Polyacrylamidgeles zeigt den aktivierenden Effekt von N7
-Chloroethylguanin auf die Helikase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase. Die Reaktion fand in Abwesenheit (Spalte 1) oder in Anwesenheit eines Compound in der Konzentration von 2,2 µM (Spalte 2), 6,6 µM (Spalte 3), 22 µM (Spalte 4), 66 µM (Spalte 5) oder 220 µM (Spalte 6) statt. Das native Substrat ist in Spalte 7 aufgetragen. Das getrocknete Gel wurde über 14 Stunden bei –80°C exponiert. Die Resultate zeigen das Ergebnis dreier unabhängiger Experimente.
3.6 Herstellung der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364)
Zur Klärung des divergenten Verhaltens der NTPase- und Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase wurden Bindungsstudien mit der NTP-Bindungsstelle der NTPase/Helikase durchgeführt. Die Untersuchung der Nukleotid-Bindung und deren Inhibition wurde zu diesem Zweck mittels einer proteolytisch erzeugten minimalen NTP-bindenden Domäne durchgeführt (1203-1364). Hierzu wurde das Fragment der gereinigten HCV NTPase/Helikase (1189-1525) welches die Domänen 1 und 2 enthielt, einer partiellen Proteolyse durch V8-Protease, Thermolysin, Proteinase K, Chymotrypsin und Trypsin unterzogen. Die Produkte durch V8, Trypsin und Thermolysin waren die am meisten Erfolgsversprechenden, da eine kleine Anzahl gut definierbarer Peptide entstand. Die Verdauprodukte wurden durch eine SDS/PAGE aufgetrennt und durch einen Immunoblot mit einem affinitätsgereinigten humanen anti-NS3 Serum detektiert (Abbildung 10 A). Zur weiteren Charakterisierung wurden die Verdauprodukte mittels Immunoblot und Detektion mit FSBA, einem nicht hydrolysierbaren Nukleosid-Analogon, analysiert (Abbildung 10 B). Der Antikörper erkannte folgende Produkte: Einerseits das nicht degradierte 42 kDa große Fragment der HCV NTPase/Helikase (1189-1525) und andererseits ein 26 kDa großes Protein im Trypsinverdau, ein 19 kDa großes Protein im V8 Verdau. Beim Verdau mit Thermolysin entstand kein FSBA-bindendes Fragment.
Abbildung 10: Analyse der ATP-Bindungskapazität der Verdauprodukte des Fragmentes der NTPase/Helikase von HCV (1189-1525).
Die Aliquote enthielten 125 pmol des Fragmentes der NTPase/Helikase von HCV (1189-1525) und wurden mit jeweils 1,25 pmol oder 2,5 pmol von Trypsin (Spalte 1 und 2), 1,25 pmol oder 2,5 pmol Thermolysin (Spalte 3 und 4), 1,25 pmol oder 2,5 pmol V8-Protease (Spalte 5 und 6) verdaut. Die Kontrolle ohne Enzym ist in Spalte 7 aufgetragen. Die degradierten Produkte des jeweiligen Verdaus wurden mit FSBA markiert, durch eine SDS/Page aufgetrennt, und auf Nitrocellulose transferiert. Danach wurde ein Immunoblot mit anti-NS3 (A) oder anti-FSBA Serum (B) und anschließender Detektion mit [ 125I] Protein A durchgeführt. Die Blots wurden für 10 Stunden exponiert.
Das 26 kDa große durch Trypsinverdau entstandene Fragment wurde N-terminal sequenziert. Die ersten fünf Zyklen ergaben die Sequenz S-T-V-F-T und identifizierten R1206 als Schnittstelle. Das durch V8 Proteolyse entstandene 19 kDa große NTP-bindende Protein ergab in den ersten fünf Zyklen der N-terminalen Sequenzierung die Sequenz T-T-M-R-S und determinierte die V8-Schnittstelle E1203. Ein durchschnittliches Molekulargewicht von 110-120 Da annehmend wurde die C-terminale Schnittstelle durch Trypsinverdau bei K1406, durch V8 Verdau bei E1363 oder E1364 lokalisiert. Der Vergleich von densiometrischen Scans der Coomassie-gefärbten Blots und die Detektion der gebundenen anti-FSBA Antikörper mit [125I] Protein A, ergab die gleiche FSBA
Bindungskapazität beider Fragmente. (Abbildung 10)
Da das durch V8 proteolytisch generierte 19 kDa große Fragment das kleinste FSBA-bindende Fragment war bestimmten wir den C-Terminus der Domäne. In der C-terminalen Sequenzierung ergab sich in den ersten beiden Zyklen die Sequenz E-E, die einzigartig für NS3 ist. Somit ist E1364 die Schnittstelle für die, durch V8 Proteolyse generierte ATP-bindende Domäne des Fragmentes der NTPase/Helikase. Die Lokalisierung der Schnittstellen ist in Abbildung 11 A illustriert.
Um die NTP-bindende Domäne der NTPase/Helikase (1203-1364) in aufgereinigter Form zu erhalten, wurde der Verdau mit V8 prolongiert. Dies
führte zu einer Degradierung des Fragmentes der NTPase/Helikase (1189-1525), das FSBA-bindende Fragment blieb aber resistent gegenüber einem prolongierten Verdau. Die NTP-bindende Domäne (1203-1364) wurde von anderen Verdauprodukten durch eine Größenausschlußsäulenchromatographie (Superdex 200) getrennt und aufgereinigt. Die Analyse der erhaltenen Fraktionen im Coomassie-gefärbten SDS/Polyacrylamidgel ergab ein Protein mit der molekularen Masse von 42 kDa für Fraktion 15-18, entsprechend der unverdauten HCV NTPase/Helikase (1189-1525) und ein Protein mit der molekularen Masse von 19 kDa für Fraktion 20-21, entsprechend der NTP-bindenden Domäne (1203-1364) der NTPase/Helikase (Abbildung 11 B).
Abbildung 11:
A: Schematische Darstellung der Generierung der ATP-bindenden Domäne mittels V8 vermitteltem proteolytischen Verdaus der HCV NTPase/Helikase.
Die oberste Abbildung stellt die Struktur des NS 3 von HCV und dessen enzymatische Aktivitäten dar. Die untere Abbildung zeigt die Lokalisation des in dieser Studie benutzten Polyproteins NS3 von HCV (1189-1525) Fragmentes mit der ATP-bindende Domäne. Die Schnittstellen der V8-Protease innerhalb des Polyproteins sind durch Pfeile markiert. Die Aminosäuren sind nach Takamizawa nummeriert [83].
B: Auftrennung des HCV Polyproteins (1189-1525) und der durch V8 Proteolyse generierten ATP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase duch eine Säulenchromatographie (Superdex 200).
20 nmol des HCV Polyproteins (1189-1525) wurden durch Verwendung von 1 nmol V8-Protease hergestellt. Die Reaktion wurde gestoppt und die Verdauprodukte wurden durch eine Größenausschlußchromatographie auf einer Superdex 200 Säule, wie in Material und Methoden beschrieben, getrennt. Aliquote (30 µl) der Fraktionen wurden durch ein SDS-Polyacrylamidgel getrennt und Coomassie gefärbt.
3.7 Charakterisierung der NTP-bindenden Domäne des NS3 der HCV NTPase/Helikase (1203-1364)
Die NTP-bindende Domäne, eluiert durch eine Superdex 200 Säule, wurde in weiteren Experimenten verwendet. Im Folgenden wurde die Bindungskapazität der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase für ATP untersucht. Zuerst wurden unter Verwendung von chromatographischen Verfahren und Mikrofiltrationsassays die optimalen Reaktionsbedingungen für die NTP-Bindung determiniert. Die Bildung von Komplexen von ATP mit der NTP-bindenden Domäne der NTPase/Helikase wurde nach 1-2 Min. mit Erreichen eines Plateaus nach 20 Min. beobachtet. Die Bindung von ATP an das HCV-Polyprotein war abhängig von den divalenten Metall-Kationen Mn2+ und Mg2+. Die maximale
Bindung wurde für Mn2+ bei 0,3 mM und für Mg2+ bei 3,0 mM festgestellt. Die
ATP-Bindungskapazität der NTP-bindenden Domäne der NTPase/Helikase war in Abhängigkeit einer optimalen Mg2+ Konzentration 2,8 fach niedriger als die
unter Mn2+. Weiterhin wurde die ATP-Bindung mittels einer kompetitiven
Verdrängung untersucht. [γ-32P]ATP wurde mit verschiedenen Konzentrationen
unmarkierten ATP´s kompetiert. Die Mengen an markiertem und gesamtem (markiertem und unmarkiertem) ATP gebunden an die NTP-bindende Domäne der NTPase/Helikase wurden analysiert und quantifiziert. Die Bindung war maximal bei 7,0 mM Gesamt-ATP und halb maximal bei 43,6 µM Gesamt-ATP. Diese Daten wurden nach der Methode von Scatchard ausgewertet und ergaben eine singuläre Bindungsstelle.
Abbildung 12: Kinetik und Abhängigkeit der ATP-Bindung der ATP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase von divalenten Kationen.
(A) Aliquote (50 µmol) der Domäne 1 und 2 der HCV NTPase/Helikase (1203-1364) wurden mit ATP inkubiert (43,6 µM) und die ATP-Bindung wurde durch ein Mikrofiltrationsassay oder durch eine Gelfiltrationsmethode, wie in Material und Methoden beschrieben zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt.
(B) Der Effekt ansteigender Mg2+- (T) und Mn2+- () Ionen auf die Bindung von ATP mit dem der Domäne 1 und
2 der HCV NTPase/Helikase (1203-1364) wurde mittels oben beschriebener Methoden nachgewiesen.
3.8 Inhibition der ATP-Bindung an der NTP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase (1203-1364)
Die Verbindungen, die auf ihre Interaktion mit der NTPase und Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase untersucht wurden, wurden auf ihre Fähigkeit der Bindung von ATP an die NTP-bindende Domäne der NTPase/Helikase zu inhibieren getestet. Die kinetischen Analysen der Inhibition wurden bei einer ATP Konzentration der Km entsprechend durchgeführt. Unter den Compounds
die getestet wurden waren Ribavirin, Ribavirintriphosphat, Derivate von O6
-Benzylguaninen, Paclitaxel und Trifluoperazin.
Ribavirin, Ribavirintriphosphat und die Derivate der O6-Benzylguanine zeigten
bis zu einer Konzentration von >1 mM keinen Effekt auf die Inhibition der ATP-Bindung der NTP-bindenden Domäne der NTPase/Helikase.
Paclitaxel und Trifluoperazin, reduzierten die ATP-Bindung schon bei niedrigeren Konzentrationen. Die Compounds inhibierten die NTP-Bindungsstelle konzentrationsabhängig mit einer IC50 von 22 µM und 98 µM.
Kinetische Analysen nach der Methode von Dixon (reziproke Geschwindigkeit der Bindungsreaktion versus Inhibitorkonzentration) ergaben Unterschiede im
Mechanismus der Inhibition von Paclitaxel und Trifluoperazin. Während Paclitaxel die NTP-bindende Domäne der NTPase/Helikase einfach kompetierte, war bei Trifluoperazin ein nichtkompetitiver Mechanismus feststellbar. Diese Ergebnisse korrelierten mit einer kompetitiven Hemmung der ATPase durch Paclitaxel und einer nichtkompetitiven Hemmung der ATPase der NTPase/Helikase durch Trifluoperazin. Die Inhibition der ATPase war abhängig von der Konzentration des Inhibitors. (Abb. 13)
Abbildung 13: Kinetische Analyse der Interaktion von Paclitaxel und Trifluoperazin mit der ATP-bindenden Domäne der HCV NTPase/Helikase.
(A) Effekt ansteigender Konzentrationen von Paclitaxel (z) und Trifluoperazin (T) auf die ATP-Bindungskapazität des HCV-Polyproteins-(1203-1364). Die Konzentration von ATP im Reaktionsansatz war der Kd entsprechend
(43,6µM).
(B, C) Effekt ansteigender Konzentrationen von ATP auf die Inhibition der ATP-Bindung des HCV-Polyproteins-(1203-1364) durch Paclitaxel (B) und Trifluoperazin (C). Die ATP Konzentrationen waren entsprechend dem 0,3 ( ), 1,0 (z), 3,0 ({) fachem der Kd (43,6µM). Der Typ der Inhibition wurde in einem Dixon Plot analysiert. Die
4 DISKUSSION
Die Entwindung des RNA-Doppelstranges durch die NTPase/Helikase ist eine von der NTP-Hydrolyse abhängige Reaktion, wenn man einen aktiven Mechanismus voraussetzt [42]. Folglich läßt sich annehmen, daß mit der Hemmung der NTP-Bindung eine Hemmung der NTPase und konsekutiv der Helikase der NTPase/Helikase einhergeht. In Experimenten wurde gezeigt, daß eine trunkierte Form des NS3, die NTPase/Helikase des HCV [14C]- FSBA, ein
ATP-Analogon, kovalent bindet [8]. Im Folgenden wurde die isolierte Domäne 1 mit dem Walker Motiv A und B durch limitierten proteolytischen Verdau mittels V8-Protease generiert und mittels affinitätsgereinigtem Antikörper detektiert. In N- und C- terminaler Sequenzierung wurden die Schnittstellen verifiziert. Es wurde in Bindungsstudien die in Motivanalysen [40, 89] und kristallographisch [44, 95] postulierte NTP-Bindungsstelle in Domäne 1 nachgewiesen. Das inhibitorische Potential verschiedener Compounds auf die isolierte Domäne wurde untersucht. Die Inhibition der NTP-bindenden Stelle durch Compounds, die nicht mit ATP strukturverwandt sind, war besonders interessant. Paclitaxel, ein antimitotisch wirkendes Agens, gewonnen aus der Western Yew Pflanze [90], war ein kompetitiver Inhibitor von ATP an der NTP-Bindungsstelle der NTPase/Helikase. Paclitaxel hemmte die ATP-Bindung konzentrationsabhängig mit einer IC50 von 22 µM. Es wurde der Inhibitionstyp der Hemmung von ATP
an der NTP-bindenden Stelle der trunkierten NTPase/Helikase näher untersucht und nach der Methode von Dixon (reziproke Geschwindigkeit der Bindungsreaktion versus Inhibitorenkonzentration) nachgewiesen. In einer Studie, die strukturelle Domänen des Murin P-Glykoproteins, einem Mitglied der ABC Superfamilie der Membranproteine identifizierte, markierte ein photoreaktives Paclitaxel Analogon Aminosäurensequenzen dem Walker Motiv A entsprechend [90]. Diese Beobachtung zeigt eine geringe Spezifität der NTP-bindenden Stelle. Es wurde nachgewiesen, daß eine breite Auswahl von Compounds wie z.B.: Azyclovirtriphosphat, azyklisches ATP, oder Tripolyphosphat durch die HCV NTPase/Helikase hydrolysiert wurden [69]. Ähnlich zeigte auch die RNA NTPase/Helikase vom bovinen Plum Pox Potyvius
[49], Gelbfiebervirus [84] und bovinen viralen Diarrhöe Virus [91] eine niedrige Selektivität für NTP.
Der Mechanismus, durch den Trifluoperazindihydrochlorid die NTP-Bindung und die NTPase der NTPase/Helikase hemmte, war komplizierter. Trifluoperazindihydrochlorid hemmte ATP an der NTP-bindenden Stelle der trunkierten NTPase/Helikase mit einer IC50 von 98 µM. Der Typ der Inhibition
war, wiederum nach der Methode von Dixon bestimmt, ein nichtkompetitiver. Die nichtkompetitive Hemmung resultierte entweder aus Konformationsänderungen des HCV Polyproteins oder aber aus einer allosterischen Hemmung der NTP-bindenden Stelle. Die Regulation einer ATP-Bindungsstelle durch Trifluoperazin ist nicht einmalig. Es wurde berichtet, daß eine Phosphatase-Aktivität des P-Glykoproteins von Multidrug resistenten chinesischen Hamster Eizellen durch Trifluoperazindihydrochlorid hochreguliert wurde [78]. Kinetische Studien ergaben einen gemischten Mechanismus der Aktivierung, basierend auf der Interaktion zwischen der ATPase Domäne des P-Glycoproteins und einer separaten Trifluoperazin-bindenden Stelle in der Transmembran Region des Proteins [29]. In Kenntnis der relativ geringen Spezifität der NTP-Bindungsstelle und der schwachen Inhibition der NTPase durch Paclitaxel und Trifluoperazin (IC50 17 µM respektive 105 µM) wurden
weitere Effektoren der NTPase/Helikase unterschiedlichen Profils auf die Funktion der NTPase und Helikase der NTPase/Helikase untersucht.
Mit Ribavirin, einem Compound, das bekanntermaßen mit der Nukleotid-bindenden Stelle verschiedener Klassen von Enzymen reagiert, wurden in Bindungsstudien ähnliche Effekte wie unter Paclitaxel festgestellt. Die beobachteten Auswirkungen auf die NTPase der NTPase/Helikase schien komplexer als die einer kompetitiven Hemmung zu sein. Bei höheren Konzentrationen von Ribavirin (>750 µM) und ATP(>Km) ergab sich
überraschenderweise eine Aktivierung der ATPase der NTPase/Helikase. Der verantwortliche Mechanismus blieb unklar, doch die Bindungsstudien würden die Existenz zweier funktionell aktiver NTP-Bindungsstellen stützen, einerseits mit einer höheren und andererseits mit einer niedrigen Affinität für Nukleoside. Die besetzte niedrig-affine Bindungsstelle würde demnach zu einer Modulation der
NTP-Utilisation der höher-affinen Stelle führen. Erklären würde dies auch den Befund, daß O6-Benzyl-N7-Chloroethylguanin und N7-Chloroethylguanin nicht
FSBA und ATP aus der isolierten Domäne 1, der hoch-affinen Bindungsstelle der HCV NTPase/Helikase verdrängen konnten, sich aber trotzdem als potente Inhibitoren der NTPase der NTPase/Helikase erwiesen. Diese These wird zusätzlich durch die Studien von Porter gestützt, der den Beweis für die Existenz zweier Bindungsstellen pro Monomer der HCV NTPase/Helikase in kinetischen Studien führte [67].
Die Einführung eines Triphosphates in das Ribavirinmolekül geschah in der Absicht, die Affinität der Bindung an die NTP-bindende Stelle zu erhöhen und konsequenterweise auch das inhibitorische Potential des Ribavirinmoleküls der NTPase der NTPase/Helikase zu erhöhen. Ein weiteres Argument war die Beobachtung, daß Gewebe von Ratten die mit Ribavirin behandelt wurden 5´-Mono, Di- und Triphosphate von Ribavirin und zusätzliche Metabolite enthielt [60]. Weitere Studien an Mäusen, die mit radioaktivem Ribavirin behandelt wurden, zeigten erhöhte intrazelluläre Level an Radioaktivität assoziiert mit Ribavirintriphosphat und in geringerer Konzentration mit 5´-Ribavirinmonophosphat und Ribavirindiphosphat [96]. Es wurde auch gezeigt, daß die Konzentration an Ribavirintriphosphat zum größten Teil die intrazelluläre Form des Medikamentes Ribavirin war und die zelluläre Konzentration an Ribavirintriphosphat der ATP Konzentration entsprach [96]. Man kann also annehmen, daß Ribavirintriphosphat die intrazelluläre Modifikation ist, in der Ribavirin als Inhibitor in der anti-HCV Therapie wirkt. Tatsächlich ist die Inhibition der NTPase der NTPase/Helikase stärker, als die unter Ribavirin, zusätzlich ist die Affinität für die niedrig-affine Bindungsstelle mit Einführung der Phosphatgruppen geringer und somit bei hohen Konzentrationen des Compounds und einer ATP Konzentration der Km größer
als (>750 µM) eine geringere Aktivierung der NTPase der NTPase/Helikase zu beobachten. Die NTPase-Aktivität erreichte eine maximale Inhibition von 25% der Kontrolle. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß Ribavirintriphosphat durch die NTPase/Helikase während der Inkubation in schwächer inhibitorische Metabolite degradiert wurde. Man kann folglich vermuten, daß das untersuchte
niedrigere inhibitorische Potential bei später erfolgter Terminierung der Entwindungsreaktion ebenfalls als Ursache die Hydrolyse von Ribavirintriphospat zu niedriger potenten Metaboliten hat. Die Untersuchung der Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase wurde in einem von der NTP-Bindung und NTPase-Aktivität unabhängigem Standard Testsystem durchgeführt, das das Screening von Inhibitoren auf die Helikase-Aktivität erlaubt. Hierzu wurde ein Substrat aus komplementären RNA/RNA Oligonukleotiden verwendet. Der 3´Terminus des Komplementär Stranges war spezifisch mit [32P] markiert, so daß
die Reaktionsprodukte der NTPase/Helikase in einem SDS/PAGE Gel aufgetrennt werden konnten. Die Quantifizierung wurde mittels Autoradiographie oder szintigraphischer Auszählung der markierten Banden vorgenommen. Die Aktivität der Helikase der NTPase/Helikase wurde als Funktion der Compoundkonzentrationen getestet. Es konnte gezeigt werden, daß die Aktivitäten für die ATPase und die Helikase der NTPase/Helikase mit unterschiedlicher Effizienz und durch unterschiedliche Mechanismen inhibiert wurden.
Am Beispiel von Ribavirintriphosphat bleibt bei Konzentrationen von ATP und Ribavirintriphosphat, bei denen die NTPase der NTPase/Helikase 50% der Kontrolle beträgt, die Helikase unbeeinflußt. Es kann aber trotzdem nicht ausgeschlossen werden, daß bei stark reduzierter ATP Konzentration (<1/1000 der Km), bei welcher Ribavirintriphosphat ein signifikant verstärktes, inhibitorisches Potential der NTPase-Aktivität zeigt, die Helikase-Aktivität von dem reduzierten NTPase Level betroffen ist. Die chemisch unterschiedlichen Compounds zeigten den gleichen Effekt der relativen Inhibition der NTPase bis zu einem bestimmten Betrag der Kontrolle, ohne die Helikase-Aktivität der NTPase/Helikase zu beeinflussen. Zusammengenommen ergibt sich, daß die NTPase-Aktivität nicht direkt an die Entwindungsaktivität der Helikase gekoppelt sein kann. Konsequenterweise ist die Anzahl der hydrolisierten NTP´s pro entwundener Hydrogenbrücken kein konstanter Wert. Dies wurde durch die Ergebnisse mit O6-Benzylguaninen bestätigt. Die Experimente zeigten, daß die
NTPase-Aktivität der HCV NTPase/Helikase entweder gesteigert oder gehemmt wird, ohne daß die Helikase-Aktivität des Enzyms beeinflußt wurde. Weiterhin
stimulierten N7- und N9-Chloroethylderivate der Guanine die Helikase-Aktivität,
ohne die NTP-Utilisation zu steigern. Die detaillierten Untersuchungen mit der NTPase/Helikase und der isolierten Domäne 1 ergaben, daß die Chloroethylguanine weder die Bindung von NTP an die Domäne 1 noch die NTPase der NTPase/Helikase beeinflußten. Die Compounds wirkten als „kompetitive Aktivatoren“ der Helikase-Aktivität. Konsequenterweise muß die Regulation der Helikase-Aktivität in vivo Co-Faktoren benötigen, die die Kopplung der Helikase und der NTPase der NTPase/Helikase ermöglichen. Neben der Inhibition der NTPase-Aktivität durch Interferenz mit der NTP-bindenden Stelle (1) und der Effektoren der NTPase-Aktivität durch einen allosterischen Mechanismus (2), stellt die Kopplung der NTPase mit der Helikase (3) einen weiteren Angriffspunkt auf der Ebene der Substraterkennung und Energieübertragung in der Modifikation der NTPase/Helikase der SFII-Helikasen dar.
