DISSERTATION
Benedikt Käufler
MARTIN-LUTHER UNIVERSITÄT
HALLE-WITTENBERG
Medizinische Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Einfluss von Phosphodiesterasen auf kardiale Effekte nach 5-HT
4-
Rezeptorstimulation in transgenen Mäusen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin (Dr.med.)
Vorgelegt der medizinischen Fakultät
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von Benedikt Käufler
geboren am 15.04.1984 in Rotenburg (Wümme)
Gutachter/Gutachterin:
Prof. J. Neumann
Prof. W.-H. Zimmermann, Göttingen
Prof. T. Eschenhagen, Hamburg
05.11.2019
Referat
Funktionell wirksame Serotonin- (5-HT) Rezeptoren vom Typ 4 (5-HT4) sind in chronisch insuffizienten Ventrikeln von Menschen und Ratten nachgewiesen worden. Die über diese Rezeptoren vermittelten inotropen Effekte sind mit zunehmender Schwere der Herzinsuffizienz erhöht. Die andauernde Stimulation von 5-HT4-Rezeptoren während einer Herzinsuffizienz könnte zudem zu Herzrhythmusstörungen führen. Außerdem ergab die Behandlung mit einem 5-HT4 -Rezeptorantagonisten potentiell vorteilhafte Wirkungen. Es ist daher möglich, dass 5-HT4 -Rezeptoren von pathophysiologischer Relevanz für eine Herzinsuffizienz sind.
Phosphodiesterasen (PDEs) sind Enzyme, die cAMP abbauen und damit die cAMP- abhängigen Signalwege modulieren können. Durch unterschiedliche subzelluläre Verteilung verschiedener PDE-Isoenzyme kommt es zur Bildung von cAMP-Kompartimenten, in denen die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelten Effekte unterschiedlich moduliert werden. Die Funktion von PDEs bei der Regulation von 5-HT4-Rezeptor-abhängigen Signalen ist nicht genau verstanden. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche der kardialen PDEs in der Regulation des positiv inotropen Effektes (PIE) und des positiv chronotropen Effektes (PCE) nach 5-HT4-Rezeptorstimulation eine Rolle spielen. Es sind Kontraktionskraft- und Frequenzmessungen an isolierten elektrisch gereizten linken bzw. spontan schlagenden rechten Herzvorhöfen von transgenen und Wildtyp (WT) Mäusen durchgeführt worden. Die transgenen Mäuse wiesen eine Herzmuskelzell-spezifische Überexpression des humanen 5-HT4a-Rezeptors auf. Die transgenen Vorhöfe reagierten auf 5-HT positiv inotrop und positiv chronotrop, wohingegen die WT-Vorhöfe keine Reaktion auf 5-HT zeigten.
Der Einfluss von PDE2, PDE3 und PDE4 auf die 5-HT-vermittelte Inotropie und Chronotropie wurde einzeln und in Kombination durch spezifische Hemmstoffe (EHNA, Cilostamid, Rolipram) untersucht. Zum Vergleich wurde ein unselektiver PDE-Hemmstoff (IBMX) angewendet.
PDE2, PDE3 und PDE4 können den Serotonin-vermittelten inotropen Effekt nach 5-HT4 -Rezeptoraktivierung modulieren, wobei PDE4 den größten Einfluss hat. Bei der Regulierung der Frequenz könnte PDE4 ebenfalls beteiligt sein, allerdings nur in Kombination mit anderen PDEs.
Käufler, Benedikt: Einfluss von Phosphodiesterasen auf kardiale Effekte nach 5-HT4- Rezeptorstimulation in transgenen Mäusen. Halle (Saale), Univ., Med. Fak., Diss., 59 Seiten, 2019
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1 1.1 Serotonin ... 1 1.2 Serotoninrezeptoren ... 2 1.3 Serotoninwirkung am Herzen ... 2 1.3.1 5-HT4 Rezeptor-Signalkaskade ... 3 1.4 Phosphodiesterasen ... 5 1.4.1 Phosphodiesterase-Inhibitoren ... 8 1.5 Transgenes Mausmodell ... 101.6 Klinische Relevanz und Zielsetzung der Arbeit ... 11
2 Material und Methoden ... 12
2.1 Versuchstiere und Tierhaltung ... 12
2.2 Generierung 5-HT4a-Rezeptor überexprimierender Mäuse ... 12
2.3 Genotypisierung ... 12
2.3.1 Extraktion und Isolation der DNA ... 12
2.3.2 Bestimmung der DNA-Konzentration ... 13
2.3.3 PCR-Amplifikation ... 13
2.3.4 Agarosegelelektrophorese ... 14
2.4 Versuchsaufbau ... 14
2.4.1 Das Organbad ... 14
2.4.2 Die Messanlage ... 14
2.4.3 Organentnahme und Präparation der Herzen ... 16
2.5 Versuchsdurchführung ... 16
2.6 Statistik ... 17
2.7 Anhang ... 18
3 Ergebnisse ... 21
3.1 Genotypisierung ... 21
3.2 Kontraktionskraft- und Frequenzmessungen der Herzvorhöfe ... 22
3.3 5-HT-Konzentrations-Wirkungskurve ohne PDE-Hemmstoffe ... 23
3.4 Experimente mit einzelnen PDE-Hemmstoffen ... 25
3.4.1 EHNA ... 25
3.4.2 Cilostamid ... 27
II
3.4.4 IBMX ... 31
3.5 Experimente mit PDE-Hemmstoffkombinationen ... 33
3.5.1 Cilostamid und Rolipram ... 34
3.5.2 EHNA und Rolipram ... 36
3.5.3 Cilostamid und EHNA ... 38
3.5.4 Cilostamid, EHNA und Rolipram ... 39
3.6 EC50-Werte der Konzentrations-Wirkungs-Kurven ... 41
3.7 Anspannungs- und Relaxationszeiten der linken Vorhöfe von TG- und WT- Mäusen ... 42
4 Diskussion ... 44
4.1 Diskussion der Methoden ... 44
4.1.1 Transgenes Mausmodell ... 44
4.1.2 Kontraktionsexperimente ... 44
4.2 Einfluss PDE- Isoenzyme unter Basalbedingungen in rechten Vorhöfen ... 44
4.3 Einfluss PDE- Isoenzyme unter 5-HT Zugabe in rechten Vorhöfen ... 46
4.4 Einfluss PDE-Isoenzyme unter Basalbedingungen in linken Vorhöfen ... 46
4.5 Einfluss von 5-HT in Gegenwart von PDE-Isoenzymen in linken Vorhöfen ... 47
4.6 Fazit ... 48 4.7 Ausblick ... 52 5 Zusammenfassung ... 53 6 Literaturverzeichnis ... 54 7 Thesen ... 59 Lebenslauf ... VII Erklärungen ... VIII Publikationen ... IX Danksagung ... X
III
Abkürzungsverzeichnis
5’AMP Adenosin-5’-monophosphat 5-HT 5-Hydroxytryptamin (Serotonin) Abb. Abbildung AC Adenylylcyclase AKAP A-Kinase-Ankerprotein ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaarebpm Beats per minute (Herzschläge pro Minute)
bspw. beispielsweise
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
Ca2+ Calcium2+-Ionen CaCl2 Calciumchlorid
cAMP zyklisches Adenosin-3’,5’-monophosphat cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CO2 Kohlenstoffdioxid
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat EC50 halbmaximale effektive Konzentration EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ERK2 extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 2
EZR Extrazellulärraum
fmol Femtomol
g Gramm
GAF cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA
Hz Hertz IBMX 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin IE Internationale Einheit i.p. intraperitoneal i.v. intravenös Iso Isoprenalin IZR Intrazellulärraum Kg Kilogramm Ktr Kontrolle
IV KWK Konzentrations-Wirkungs-Kurve
Log Logarithmus zur Basis 10
LTCC spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanal
M molar (Mol/Liter)
mA Milliampère
MAP-Kinase Mitogen-aktivierte Protein-Kinase
µg Mikrogramm
mg Milligramm
Mg2+ Magnesium2+-Ionen MHC schwere Kette des Myosins
min Minute µl Mikroliter ml Milliliter µM Mikromolar (Mikromol/Liter) mm Millimeter mM Millimolar (Millimol/Liter) mmol Millimol mN Millinewton ms Millisekunden mRNA Boten-Ribonukleinsäure mV Millivolt n Stichprobenumfang Na+ Natrium n.b. nicht berechenbar nm Nanometer nM Nanomolar (Nanomol/Liter) O2 Sauerstoff P Phosphor
PCE positiv chronotroper Effekt
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PDE Phosphodiesterase
PIE positiv inotroper Effekt
pEC50 negativer dekadischer Logarithmus der EC50
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PKA cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A)
PLB Phospholamban
V Primer Oligonukleotid für die Polymerase-Kettenreaktion
RIVA Ramus interventricularis anterior
RNA Ribonukleinsäure
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RyR Ryanodin-Rezeptor (Ca2+-Freisetzungskanal)
s. siehe
s Sekunde
Sac Saccharose
s.c. subkutan
SDS Natrium-Laurylsulfat
SEM Standardabweichung des arithmetischen Mittels SERCA Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums
SR sarkoplasmatisches Retikulum
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TE Tris-Ethylendiamintetraessigsäure-Puffer
TG transgene Maus mit kardialer Überexpression humaner 5-HT4a-Rezeptoren
TnC Kalzium-bindendes Troponin
TnI Troponin I (Troponin-Inhibitor)
u.a. unter anderem
UCR Upstream-conserved-regions
UV-Licht ultraviolettes Licht
V 1. Volt 2. Volumen v. a. vor allem vs. versus WT Wildtyp-Maus z.B. zum Beispiel ZNS Zentralnervensystem
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Subzelluläre Verteilung von PDE-Isoenzymen und Signaltransduktion nach 5-HT4-
Rezeptorstimulation ... 4
Abb. 2: Struktur und Domänen der PDE-Isoenzyme ... 8
Abb. 3: Strukturformeln ... 10
Abb. 4: Versuchsapparatur für Kontraktions- und Frequenzmessungen ... 15
Abb. 5: Schematische Darstellung der Experimente ... 17
Abb. 6: Genotypisierung ... 21
Abb. 7: Repräsentative Mechanogramme der Reaktion von TG und WT auf Serotonin ... 23
Abb. 8: 5-HT Konzentrationswirkungskurve ohne PDE-Hemmstoffe ... 24
Abb. 9: EHNA ... 26
Abb. 10: Cilostamid ... 28
Abb. 11: Rolipram ... 30
Abb. 12: IBMX ... 33
Abb. 13: Rolipram und Cilostamid ... 35
Abb. 14: Rolipram und EHNA ... 37
Abb. 15: Cilostamid und EHNA ... 39
Abb. 16: EHNA, Cilostamid und Rolipram ... 40
Abb. 17: Signalwege in Kardiomyozyten bei 5-HT4- Rezeptorstimulation ... 50
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Struktur und Domänen der PDE-Isoenzyme ... 7Tabelle 2: Übersicht über pEC50-Werte von linken und rechten Vorhöfen von TG-Mäusen ... 41
Tabelle 3: Anspannungs- und Relaxationszeiten linker Vorhöfe ... 42
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Serotonin
Der US-Amerikaner Irvine Page forschte um ca. 1950 an möglichen Ursachen der arteriellen Hypertonie. Im Rahmen dieser Arbeiten wurde erstmals Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) als ein Vasokonstriktor im Serum beschrieben (Rapport et al. 1948). Der italienische Pharmakologe Vittorio Erspamer entdeckte 5-HT im Magen-Darm-Trakt. Aus enterochromaffinen Zellen des Magens konnte er eine Substanz isolieren, die er „Enteramin“ nannte. Später erkannte Erspamer, daß es sich bei dieser Substanz um 5-HT handelte (Erspamer 1952).
5-HT ist ein Gewebshormon und Neurotransmitter. Es kommt nicht nur im Organismus der Menschen und Säugetiere vor, sondern ist in der Natur weit verbreitet. Beispielsweise wird es von Pflanzen synthetisiert und ist u.a. in Nüssen, Bananen, Orangen und Kaffee enthalten (Ramakrishna et al. 2011).
Phylogenetisch betrachtet ist 5-HT ein sehr altes Hormon (Peroutka und Howell 1994). Das könnte eine Erklärung dafür sein, warum 5-HT für so viele physiologische Systeme im menschlichen Körper von großer Bedeutung ist. Hohe 5-HT Konzentrationen findet man vor allem in Thrombozyten. Die Freisetzung von 5-HT aus Thrombozyten bedingt im Zuge der Blutgerinnung eine Steigerung der Thrombozytenaggregation (Takano 1995). Im Magen-Darm-Trakt nimmt 5-HT als Gewebshormon eine zentrale Stellung ein und steuert vor allem die Peristaltik (Verbeuren 1992). Im zentralen Nervensystem wird 5-HT ein regulierender Einfluss auf Stimmung, Aggression, Schlafverhalten, Lern- und Gedächtnisfunktionen, Essverhalten sowie Schmerzempfindung zugeschrieben (Popova 2006, Wilkinson und Dourish 1991).
Veränderungen des Serotoninstoffwechsels haben möglicherweise Einfluss auf die Entstehung und den Verlauf von vielen Krankheiten wie z.B. Depressionen, Schizophrenie, Migräne, Angst- und Panikstörungen, Bluthochdruck, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Zöliakie (Shajib und Khan 2015). Am Herzen kann es insbesondere bei sehr hohen 5-HT-Plasmakonzentrationen, wie es zum Beispiel im Rahmen des Karzinoid-Syndroms vorkommt, zu strukturellen Veränderungen wie Insuffizienz der Aorten- und Pulmonalklappe kommen (Robiolio et al. 1995).
Des Weiteren wirkt 5-HT proarrhythmogen und wird mit der Entstehung von Vorhofflimmern in Verbindung gebracht (Kaumann 1994). Vorhofflimmern ist eine der häufigsten Arrhythmien und erhöht das Risiko für Tod, kongestive Herzinsuffizienz und Schlaganfall (Llod- Jones et al. 2004). Die 5-HT-Synthese findet hauptsächlich in den enterochromaffinen Zellen des Darmes (>90%), zu kleinem Anteil in Neuronen des Darmes (ca. 5%) und den intracerebral gelegenen Raphe-Kernen (<5%) statt (Shajib und Khan 2015, Baganz und Blakely 2013). Eine Passage von 5-HT durch die Blut-Hirn-Schranke ist nicht möglich. Nach Freisetzung in die Blutbahn wird 5-HT von zirkulierenden Thrombozyten aufgenommen. Diese können 5-HT speichern und bei Aktivierung
Einleitung 2 wieder freisetzen. Der Abbau von 5-HT erfolgt durch Monoaminoxidasen bevorzugt im Darm, Leber und in serotoninergen Neuronen (Yusuf et al. 2003).
1.2 Serotoninrezeptoren
5-HT vermittelt seine Wirkung über membrangebundene Rezeptoren. Es werden sieben 5-HT Rezeptor-Subtypen (5-HT1-7) unterschieden, die sich entsprechend ihrer Signaltransduktion in vier Klassen unterteilen lassen (Hoyer et al. 1994). Bis auf den 5-HT3-Rezeptor gehören alle übrigen 5-HT Rezeptoren zur Superfamilie der G- Protein- gekoppelten Rezeptoren. Die 5-5-HT3 Rezeptoren aktivieren direkt Kationenkanäle und haben Ähnlichkeit zu nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (Hoyer et al. 1994). Die Gruppe der 5-HT4,6,7 Rezeptoren aktivieren die Adenylylcyclase (AC), 5-HT1,5 Rezeptoren hemmen die AC und die 5-HT2 Rezeptoraktivierung stimuliert eine Phospholipase C (Xu et al. 2002).
1.3 Serotoninwirkung am Herzen
5-HT gelangt im wesentlichen über die Gefäße des Herzkreislaufsystems und letztendlich über die Koronararterien zum Herzen. Darüber hinaus findet eine 5-HT-Synthese auch direkt im Herzen statt (Gergs et al. 2013). Eine besondere Stellung haben die 5-HT4 Rezeptor-Subtypen. Durch das sogenannte alternative Spleißen, ein besonderer Vorgang im Rahmen der Transkription, existieren verschiedene Isoformen. Der 5-HT4a-Rezeptor ist die häufigste Isoform am menschlichen Herzen (Lezoualc`h et al. 2007). Über diese Rezeptoren wird an elektrisch stimulierten Präparaten linker Vorhöfe der positiv inotrope Effekt (PIE) und am Sinusknoten im rechten Vorhof der positiv chronotrope Effekt (PCE) von 5-HT vermittelt (Kaumann et al. 1990, Pino et al. 1998).
Die 5-HT4-Rezeptorstimulation geht mit einer cAMP-Erhöhung einher und es kommt zur Aktivierung der PKA (Kaumann et al. 1990). Die PKA phosphoryliert L-Typ-Calciumkanäle (LTCC), Phospholamban (PLB), Troponin und führt über intrazelluläre Calciumverschiebungen zu einer verstärkten Kontraktilität des Herzens (Gergs et al. 2009).
Im menschlichen Ventrikel vermittelt der 5-HT4-Rezeptor physiologisch keinen PIE. Jedoch wurde in Experimenten an insuffizientem Ventrikelmyokard und nach Vorbehandlung mit dem unspezifischen PDE-Hemmstoff 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX) ein larvierter 5-HT-vermittelter PIE entdeckt (Brattelid et al. 2004). Die gleiche Arbeitsgruppe wiederholte diese Beobachtung in einem Laborversuch mit Ratten. Die Präparate aus dem Ventrikel der Ratte exprimierten auf mRNA Ebene sowohl 5-HT2- als auch 5-HT4-Rezeptoren (Brattelid et al. 2012, Läer et al. 1998). Je schwerer die durch Okklusion einer Koronararterie (RIVA) hervorgerufenen
Einleitung 3 Herzveränderungen (Myokardhypertrophie bis zur schweren Herzinsuffizienz) waren, desto stärker war die über 5-HT4-Rezeptoren vermittelte inotrope Wirkung.
Afzal et al. (2008) untersuchten ebenfalls kardiale PDEs am insuffizientem Ventrikelmyokard von Ratten und Menschen. Die Kontraktilität wurde in den Präparaten der Ratte sechs Wochen nach Ligatur der linken Koronararterie und an den Präparaten von menschlichen Spenderherzen nach Herztransplantation gemessen (Afzal et al. 2008). Die postinfarktiellen Rattenherzen reagierten auf 5-HT positiv inotrop. Der inotrope Effekt konnte durch unselektive PDE-Hemmung mit IBMX und selektive PDE3-Hemmung mit Cilostamid verstärkt werden, EHNA und Rolipram zeigten dagegen keine Wirkungen. Durch die kombinierte PDE3- und PDE4-Hemmung mit Cilostamid und Rolipram ließ sich der inotrope Effekt weiter erhöhen als durch die alleinige PDE3-Hemmung. Die PDE3- und PDE4-Hemmung erhöhte die Wirksamkeit von 5-HT auf den PIE und in der Kontrollgruppe wurde ebenfalls ein 5-HT vermittelter PIE aufgedeckt. Die Versuche am menschlichen Myokard erbrachten bezüglich der PDE-Regulation ähnliche Ergebnisse (Afzal et al. 2008).
Des weiteren konnte man feststellen, dass sich die kardiale hämodynamische Leistung bei Patienten mit Herzinsuffizienz, durch Blockierung der 5-HT4 Rezeptoren verbesserte (Kjekshus et al. 2009).
1.3.1 5-HT
4Rezeptor-Signalkaskade
Bei einer Myokardkontraktion wird die Ca2+-Konzentration im Zytosol erhöht. Dieses geschieht maßgeblich durch die sogenannte Ca2+-induzierte Ca2+ Freisetzung. Durch den LTCC strömt Ca2+ nach Depolarisation in die Zelle. Trigger-Ca2+ initiiert die vermehrte Freisetzung von Ca2+ über den Ryanodin-Rezeptor (RyR) aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) in das Zytosol, wo das Ca2+ die Myofibrillen aktiviert und die Kontraktionskraft erhöht (Fabiato und Fabiato 1975, Bers 2008). Dieser Prozess kann durch 5-HT und einer folgenden Kaskade verbessert werden. Der 5-HT4 Rezeptor kann von 5-HT als auch von anderen synthetischen Agonisten aktiviert werden. Nach Stimulation des 5-HT4-Rezeptors kommt es über ein gekoppeltes G-Protein zur Aktivierung der AC und Bildung von cAMP aus ATP (Dumuis et al. 1988). In der Folge kommt es zur Aktivitätssteigerung der PKA (Kaumann et al. 1990). Durch Phosphorylierungen verschiedener Zielproteine durch die PKA wird diese Ca2+-Erhöhung weiter verstärkt. Phosphorylierung der LTCC in der Plasmamembran erhöht dessen Öffnungswahrscheinlichkeit und es kommt zum vermehrten Ca2+-Einstrom vom Extrazellularraum in den Intrazellularraum (Ouadid et al. 1992). Durch Phosphorylierung von PLB wird seine hemmende Funktion auf die Ca2+-ATPase im sarkoplasmatischen Retikulum (SERCA) geschwächt. Während der Diastole bewirkt die gesteigerte Aktivität von SERCA eine schnellere Relaxation (positiv lusitroper Effekt) und erhöht den Ca2+ -Transport vom Zytosol in das SR. In der nächsten Systole kann wiederum vermehrt Ca2+ aus dem SR freigesetzt und somit die Schlagkraft erhöht werden (Bers 2008). Die PKA phosphoryliert außerdem eine hemmende Untereinheit des Troponinkomplexes, wodurch kontraktile Elemente für
Einleitung 4 Ca2+ desensibilisiert werden und sich die Relaxationszeit verkürzt (Solaro und Rarick 1998). Es kommt zu einer negativen Rückkopplung durch Phosphorylierung und damit Aktivierung von PDEs. In der Folge wird cAMP verstärkt zu inaktiven 5`AMP abgebaut und der aktivierende Einfluss von cAMP auf die PKA wird aufgehoben (Francis et al 2011). 5-HT beeinflusst über 5-HT4 Rezeptoren auch die Schrittmacherzellen des Sinusknotens. Eine 5-HT4 Rezeptorstimulation führt zu erhöhtem Ca2+-Einstrom in die Zelle und es kommt zur Zunahme von elektrischen Impulsen, folglich steigt die Schlagfrequenz an (Pino et al. 1998). In Abb. 1 ist die Signaltransduktion bei 5-HT4a -Rezeptorstimulation in Herzvorhöfen schematisch dargestellt.
Abb. 1: Subzelluläre Verteilung von PDE-Isoenzymen und Signaltransduktion nach 5-HT4- Rezeptorstimulation
Die mutmaßliche subzelluläre Lokalisation der Phosphodiesterasen 2-4 ist schematisch dargestellt. Ca2+
gelangt über den L- Typ- Ca2+-Kanal (LTCC) in die Herzmuskelzelle. Dieser Prozess kann durch 5-HT über
eine Kaskade verstärkt werden. 5-HT bindet an den 5-HT4-Rezeptor und bewirkt über das stimulierende Gs
-Protein eine Aktivitätssteigerung der Adenylylcyclase im Sarkolemma. In der Folge steigt die Generierung von cAMP, welches die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) stimuliert. Die PKA phosphoryliert Phospholamban (PLB), Ryanodin- Rezeptoren (RyR), L- Typ- Ca2+-Kanäle , Troponin I (Tnl) und andere
regulatorische Proteine. Dies bewirkt eine Zunahme der Kontraktionskraft und schnellere Relaxation der Herzmuskelzelle. Die sogenannte „Calcium- induzierte Calciumfreisetzung“ führt zu vermehrten Ca2+- Freisetzung über den RyR aus dem SR in das Zytosol, wo Ca2+ die Myofibrillen aktiviert und zur stärkeren
Kontraktionskraft führt. In der Diastole wird Ca2+ über die sarkoplasmatische Retikulum Ca2+-ATPase
GS AC 5-HT 5-HT4-R RyR SERCA PLB Ca2+ Ca2+ Ca2+ TnI P Myofibrillen Kraft IZR EZR SR LTCC Ca2+ PDE 4B Ca2+ cAMP PKA P PDE 4D PKA P PLB PKA PDE 3A PDE 3 PDE 4D PDE 4D PDE 2 P PDE 4D Mitochondrium PDE 2
Einleitung 5 (SERCA) in das SR aufgenommen. Die Aktivität von SERCA ist höher, wenn der Phosphorylierungszustand von PLB durch PKA erhöht ist. PDE2-4 sind bei LTCC, PDE3 und PDE4 in der Nähe von PLB, PDE4 bei G-Protein gekoppelten Rezeptoren, RYR und Myofibrillen lokalisiert, PDE2 ist auch im Zytosol vorzufinden. PDE3 und PDE4 sind auch am Zellkern angebunden (hier nicht dargestellt).
1.4 Phosphodiesterasen
Die Aktivierung von 5-HT4 Rezeptoren erhöht den cAMP-Gehalt im Zytosol und führt zur Aktivierung zahlreicher zellulärer Prozesse wie Transkription, Zellteilung, Proliferation, Energiehaushalt und anderer Zell-spezifischer Funktionen, wie in diesem Kontext die Kontraktionskraft und Frequenz von Herzmuskelzellen (Leroy et al. 2018). Der Abbau von cAMP ist einzig durch cAMP-spezifische PDEs möglich (s. Tab.1). PDEs spalten cAMP zu inaktiven 5’-AMP und verringern oder beenden somit die durch c5’-AMP initiierten Effekte.
PDEs gehören zu einer heterogenen Gruppe von Enzymen die von wahrscheinlich 22 Genen kodiert werden. Es lassen sich insgesamt 11 PDE-Familien unterscheiden. Jede PDE-Familie kann von verschiedenen Genen stammen und durch das sogenannte alternative Spleißen existieren nahezu 100 PDE-Isoformen (Conti und Beavo 2007, Knight et al. 2016).
Die PDE-Isoformen unterscheiden sich in ihrem regulatorischen Mechanismus, Substratspezifität und -Affinität, katalytischen Eigenschaften und subzellulärer Lokalisation (Conti et al. 2014). Die Abb. 2 zeigt schematisch eine Übersicht mit Struktur und Domänen von PDE-Isoformen. Die Regulierung erfolgt durch verschiedene Prozesse wie Phosphorylierungen, Bindung zyklischer Nukleotide an allosterischen GAF-Domänen, Änderung des Expressionsniveaus, Wechselwirkung mit regulatorischen Ankerproteinen sowie reversible Translokation zwischen subzellulären Kompartimenten (Francis et al. 2011).
Unter diesen 11 PDEs gibt es PDE1, eine Ca2+/Calmodulin-aktivierte PDE; PDE2 ist eine cGMP- aktivierte PDE; PDE3 eine cGMP-gehemmte PDE; PDE4 ist eine cGMP-unabhängige und cAMP-spezifische PDE. PDE4, 7 und 8 spalten spezifisch cAMP, während PDE5, 6 und 9 nur cGMP spalten. PDE1, 2, 3, 10 und 11 sind unspezifisch und spalten cAMP und cGMP (Conti und Beavo 2007, Bobin et al. 2016). Tab. 1 zeigt eine Übersicht der PDEs mit Substratspezifität und Modulatoren. In Kardiomyozyten der Maus wurde mRNA für PDE1A, 1C, 2A, 3A, 3B, 4A, 4B, 4D, 5A, 7A, 8A, und 9A nachgewiesen (Isidori et al. 2015). Außerdem war mRNA von PDE2A, 3A, 3B, 4A, 4B, und 4D im Sinusknoten, rechten Vorhof und rechten Ventrikel zu finden (Hua et al. 2012). PDE5, 6 und 9 werden in dieser Arbeit nicht weiter berücksichtigt, da sie cGMP spezifisch sind und folglich nicht cAMP im Herzen spalten.
Von den verbleibenden PDEs sind PDE2, PDE3 und PDE4 hauptsächlich für die cAMP-Spaltung im Herzen verantwortlich und werden in dieser Arbeit näher betrachtet. Kardiale HT Effekte über 5-HT4 Rezeptoren sind in gesunden Vorhöfen und insuffizienten Ventrikeln von Menschen, insuffizienten Ventrikeln von Ratten und gesunden Vorhöfen und Ventrikeln von Schweinen
Einleitung 6 beschrieben worden. Es zeigen sich große Unterschiede in der cAMP-PDE Aktivität zwischen den Spezies, nämlich 4,55 pmol/min/mg Protein in Kardiomyozyten der adulten Ratte versus 92 pmol/min/mg Protein in Kardiomyozyten des Menschen (Johnson et al. 2012). Von der cAMP-PDE Aktivität fällt in Kardiomyozyten von Menschen 56% auf PDE1, 26% auf PDE3 und 11% auf PDE4 und nur ein sehr geringer Anteil fällt auf PDE2, wohingegen sich PDE1 in Ratten praktisch inaktiv zeigte (Johnson et al. 2012). Andere Autoren beschreiben in WT-Mäusen eine Gesamt-PDE-Aktivität von 33 pmol/min/mg Protein, davon 3 pmol/min/mg Protein für PDE1, 8 pmol/min/mg Protein für PDE3 und 3,5 pmol/min/mg Protein für PDE4 (Wang et al. 2017). In einer anderen Studie zeigte sich eine Gesamt-PDE-Aktivität von 250 pmol/min/mg Protein in humanem Ventrikelmyokard, 50 pmol/min/mg Protein im Myokard der Maus und 47 pmol/min/mg Protein im Myokard der Ratte (Richter et al. 2011). Der Anteil von PDE4 an der Gesamt-Aktivität betrug bei Präparaten von Menschen 8%, von Mäusen 32% und von Ratten 52% (Richter et al. 2011). Die verbleibende Aktivität war ungefähr gleichermaßen auf PDE1, PDE2 und PDE3 verteilt (Richter et al. 2011). Diese deutlichen Speziesunterschiede zeigen, dass sich Daten von Ratten oder Mäusen nicht einfach auf menschliche PDE-Daten übertragen lassen.
Eine zusätzliche Eigenschaft des PDE-Systems ist, dass die Aktivierung verschiedener Gs-Protein-gekoppelter Rezeptoren zur Aktivierung verschiedener PDE-Isoenzyme führt. Zum Beispiel bewirkt die Aktivierung von β1-Adrenozeptoren in Herzmuskelzellen eine bevorzugte Aktivierung der Variante PDE4D8, während die Stimulation der verwandten β2-Adrenozeptoren die Aktivierung der Variante PDE4D5 bewirkt (Richter et al. 2008). β1-Adrenozeptoren, nicht aber β2-Adrenozeptoren können eine Spleißvariante von PDE4B aktivieren, was bestätigt, dass verschiedene Rezeptoren die Aktivierung von verschiedenen PDEs verursachen (Mika et al. 2014). Unterschiedliche Rezeptoren aktivieren unterschiedliche PDEs, welche PDEs bei 5-HT4-Stimulierung aktiviert werden ist unklar. PDE-Isoenzyme haben unterschiedliche Funktionen im Herzen. cAMP und PDEs liegen in subzellulären Kompartimenten vor, wie es in der Abb. 1 dargestellt ist (McCormick et al. 2014, Nicholaev et al. 2006). Die kompartimentierte Signalvermittlung resultiert wohl aus der Fähigkeit individueller G-Protein-gekoppelter Rezeptoren räumlich unterschiedliche cAMP-Pools zu erzeugen. Diese wiederum aktivieren definierte Untergruppen von lokalisierten PKA, welche über A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) an spezifische Zielstrukuren gebunden sind. PDEs haben eine Schlüsselrolle bei der räumlichen Regulation von cAMP. Sie tragen nicht nur zur Etablierung von Grenzen bei der cAMP-Diffusion und zur Erzeugung von cAMP-Pools bei, in denen der Botenstoff in abgegrenzten subzellulären Kompartimenten eingeschlossen ist, sondern sie regulieren auch die cAMP-Konzentrationen innerhalb einzelner Kompartimente (McCormick et al. 2014). Zum Beispiel befindet sich PDE3A in der Nähe zum SR, PDE3B hingegen bindet an T-Tubuli in der Nähe von Mitochondrien (Movsesian et al. 2018). Die spezifische subzelluläre Lokalisation der Enzyme stellt also einen fundamentalen Mechanismus für die lokale Regulierung der Konzentration, Dauer und Spezifität von cAMP-anhängigen Signalen dar. Ohne diese PDE-abhängigen cAMP-Pools würde
Einleitung 7 jede Stimulation eines Rezeptors mit Adenylatzyklaseaktivierung zu einer gleichmäßigen Erhöhung der Botenstoffe führen. In der Folge würden die PKAs in allen Bereichen der Zelle aktiviert werden und die Signalspezifität wäre nicht mehr gewährleistet (McCormick et al. 2014, Conti und Beavo 2007). AKAPs sind Proteine, die PKA an spezifischen subzellulären Stellen binden und so dazu beitragen, die cAMP-Signalgebung spezifisch und physikalisch getrennt zu halten. AKAPs organisieren sich innerhalb desselben makromolekularen Komplexes mit G- Protein- gekoppelten Rezeptoren, AC, PDEs, PKA und deren Zielproteinen, und sorgen für selektive Phosphorylierungen und enge lokale Regulation des Signals (Kritzer et al. 2012).
Die Menge, Aktivität und Lokalisation von PDEs kann bei Herzerkrankungen wie Herzinsuffizienz oder Arrhythmien verändert sein (Abi- Gerges et al. 2009, Chan und Chan 2017, Lehnart et al. 2005, Movsesian et al. 2018).
Tabelle 1: Struktur und Domänen der PDE-Isoenzyme
Tabellarische Übersicht der PDE-Isoformen mit Substratspezifität, Modulatoren, Einfluss der Proteinkinase A (PKA) und Hemmstoffen. Konzentrationen (nM), die zu einer 50%igen Hemmung der PDE-Aktivität führen, aus (a) Maurice et al. 2014, (b) Zoraghi et al. 2006, (c) Bethke et al. 1991, (d) Wang et al. 2000, (e) Soderling et al. 1999, (f) D’Andrea et al. 2005, (g) keine Hemmung, Hayashi et al. 1998, (h) 20%igen Hemmung bei 100 µM IBMX, Wang et al. 2003 und (i) Bender und Beavo 2006. Die Pfeile aus der Reihe cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bedeutet, dass PDEs durch PKA phosphoryliert und aktiviert werden. Zyklisches AMP (cAMP), Zyklisches GMP (cGMP), erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochlorid (EHNA), 3-isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX).
PDE Isoformen
(Herz) Substrat PKA Modulatoren Hemmstoffe (IC 50 nM)
PDE 1 cAMP
cGMP ↑
Calcium und Calmodulin (↑) IBMX (15300)c PDE 2 cAMP cGMP cGMP (↑) EHNA (0,8) a IBMX (26200)c PDE 3 cAMP cGMP ↑ cGMP (↓) Cilostamid (50)a Milrinon (150)c IBMX (5600)c
PDE 4 cAMP ↑ Rolipram (1000)a
Rofluminast (0,6)a
IBMX (5800) c
PDE 5 cGMP Sildenafil (5)a
IBMX (3500)b
PDE 7 cAMP IBMX (5000)d
PDE 8 cAMP -g PDE 9 cGMP -h PDE 10 cAMP cGMP IBMX (2600) e PDE 11 cAMP cGMP IBMX (26000)f
Einleitung 8
Abb. 2: Struktur und Domänen der PDE-Isoenzyme
Die katalytische Domäne befindet sich im carboxy-terminalen Teil der PDEs. Die katalytische Domäne von PDE 3 beinhaltet eine einzigartige 44-Aminosäure-Insertion. Die PDE Familien besitzen Amino-terminale Subdomänen (GAF- Domänen, Transmembran Domänen, Ziel-Domänen, upstream conserved regions (UCR), PAS-Domänen und REC Domänen) und N- terminale hydrophobe Regionen, die für die subzelluläre Lokalisation, Einbau der PDEs in kompartimentierte Signalwege, Wechselwirkung mit Signal- und Gerüst-Molekülen und für die Regulation der PDE-Aktivität von Bedeutung sind. GAF-Domänen regulieren die allosterische Bindung zu cGMP (PDE 2, PDE 5 und PDE 11), die allosterische Bindung zu cAMP (PDE 10), und die Regulation der katalytischen Aktivität (PDE 2, PDE 5 und PDE 6). Die Phosphorylierungsstellen sind schematisch abgebildet. CaMKII, Calcium/Calmodulin- abhängige Proteinkinase II; ERK2, extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 2; PKA, Proteinkinase A; Pat7, 7-residue nuclear localization signal. (nach Maurice et al. 2014).
1.4.1 Phosphodiesterase-Inhibitoren
Um die Rolle von PDE 2, 3 und 4 hinsichtlich Inotropie und Chronotropie im Herzen zu analysieren, sind spezifische PDE-Hemmstoffe verwendet worden. Um Interpretation und einen Vergleich zu erleichtern, orientiert sich diese Arbeit an früheren Studien wie bspw. Afzal et al. (2008). Es sind Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochloride (EHNA), Cilostamid und Rolipram als spezifische PDE-Hemmstoffe jeweils einzeln und in Kombination verwendet worden. EHNA ist ein PDE2-Hemmstoff, Cilostamid ist ein PDE3-Hemmstoff und Rolipram ist ein PDE4 Hemmstoff. Als unselektiver PDE Hemmstoff wurde 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX) eingesetzt (Maurice et al. 2014). In der Abb. 3 sind 5-HT, cAMP, inaktives 5’AMP und die PDE-Hemmstoffe in der Strukturform zu sehen.
Das Modulieren eines bestimmten cAMP-Pools durch einen pharmakologischen Hemmstoff, bietet die Möglichkeit, einen spezifischen Effekt zu erzielen. Es wird erwartet, dass eine PDE-Hemmung den jeweiligen cAMP- abhängigen Effekt potenziert.
Einleitung 9
A
SerotoninB
cAMP ! 5’AMPC
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochloride (EHNA, PDE2-Hemmstoff)
Cilostamid (PDE3-Hemmstoff)
Einleitung 10
3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX, unselektiver PDE-Hemmstoff)
Abb. 3: Strukturformeln
(A) Serotonin (5-HT, 5-Hydroxy-tryptamin)
(B) zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) wird durch Phosphodiesterasen (PDE) zu inaktiven Adenosin-5’-monophosphat (5’AMP) abgebaut.
(C) Darstellung verwendete PDE-Hemmstoffe; Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine hydrochlorid (EHNA), Cilostamid, Rolipram, 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX), * = Kennzeichnung chirales Zentrum bei
Enantiomeren
1.5 Transgenes Mausmodell
Im Herzmuskelgewebe von Mäusen konnten keine funktionellen 5-HT-Rezeptoren nachgewiesen werden. Um den humanen 5-HT4a-Rezeptor genauer untersuchen zu können, wurde eine transgene Mauslinie verwendet, die den 5-HT4a-Rezeptor überexprimiert (Gergs et al. 2010). Dieses Modell lässt zu, daß der humane Rezeptor in vivo untersucht werden kann. Es wurden Experimente an elektrisch gereizten linken Vorhöfen und spontan schlagenden rechten Vorhöfen mit komplettem Sinusknoten durchgeführt. Es lassen sich Aussagen über Kontraktionskraft und Frequenz unter Basalbedingungen, nach Zugabe von 5-HT allein, nach Zugabe der jeweiligen PDE-Hemmstoffe und von 5-HT in Anwesenheit der PDE-Hemmstoffe machen. Als Kontrollgruppe dienen die Wildtyp-Geschwistertiere, die keine Antwort auf 5-HT zeigen (Gergs et al. 2010; 2013).
Anders als z.B. bei menschlichen Herzmuskelpräparaten, konnten hier standardisierte Bedingungen eingehalten werden. Einflüsse durch Vorerkrankungen oder Vormedikation können in dem hier genutzten Versuchsmodell ausgeschlossen werden.
Der 5-HT-Rezeptor-Subtyp kann bei der Übertragung des positiven inotropen Serotonineffektes zwischen den Spezies variieren, was die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Tierexperimenten auf den Menschen erschwert (Hoyer et al. 2002). Es wurden Unterschiede in der Aminosäuresequenz u.a. des C-terminalen Endes des 5-HT4a-Rezeptors zwischen Schwein und Mensch festgestellt (De Maeyer et al., 2008). Diese Arbeit orientiert sich an früheren Studien, jedoch wird hier einzig der humane 5-HT4a-Rezeptorsubtyp in gesundem Vorhofmyokard transgener Mäuse untersucht.
Einleitung 11
1.6 Klinische Relevanz und Zielsetzung der Arbeit
5-HT und seine Signalwege beeinflussen die Entstehung und den Verlauf von Krankheiten. Insbesondere die 5-HT4-Rezeptoren könnten von pathophysiologischer Relevanz bei insuffizienten Herzen sein (Afzal et al. 2008). PDEs haben Einfluss auf die Regulation der durch 5-HT4 -Rezeptorstimulation ausgelösten Signalwege. Das Verständnis über die Funktionsweise der verschiedenen PDE-Isoformen kann Hinweise über Genese und Verlauf von Krankheiten geben. PDE-Isoformen sind aufgrund ihrer spezifischen Verteilung in verschiedenen Geweben, auf zellulärer sowie subzellulärer Ebene von besonderem Interesse als therapeutische Zielstrukturen. Heute werden mehrere PDE-Hemmstoffe unter bestimmten Voraussetzungen klinisch eingesetzt. Milrinon, ein PDE3-Hemmstoff wird in der Behandlung der terminalen Herzinsuffizienz verwendet. Durch das Auftreten von Herzrhythmusstörungen und erhöhten Mortalität bei längerer Anwendung ist Milrinon nur zur Kurzzeittherapie zugelassen (Packer et al. 1991). Ein weiterer beliebter Calcium-Sensitizer, aber auch PDE3-Hemmstoff ist Levosimendan, welcher ebenfalls in der Behandlung von Herzinsuffizienz im Endstadium eingesetzt wird (Orstavik et al.2014). Rolipram und andere PDE4-Hemmstoffe wurden in der Therapie von Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) verwendet (Dal Piaz und Giovannoni 2000). Die am häufigsten angewendeten PDE-Hemmstoffe sind Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil. Sie hemmen im Wesentlichen PDE5 und werden bei der erektilen Dysfunktion verschrieben (Lugnier 2006). Hier soll herausgefunden werden welche PDE-Isoformen (PDE2, PDE3, PDE4) den größten Einfluss auf die 5-HT4-Rezeptor-vermittelten Effekte in elektrisch gereizten linken Vorhöfen und im Sinusknoten spontan schlagender rechter Vorhöfe haben.
Material und Methoden 12
2 Material und Methoden
2.1 Versuchstiere und Tierhaltung
Für die Experimente wurden transgene (TG) und Wildtyp-Mäuse (WT) verwendet. Die Versorgung erfolgte mit handelsüblichen Labortierfutter und Wasser ad libitum. Männliche und weibliche Tiere wurden getrennt gehalten. Das Durchschnittsalter der Wildtyp-Tiere betrug am Versuchstag 119,7 Tage und sie wogen im Mittel 35,2 Gramm; die transgenen Geschwistertiere waren im Durchschnitt 108,4 Tage alt und wogen 33,8 Gramm. Es wurden ähnlich viele männliche und weibliche Tiere verwendet.
2.2 Generierung 5-HT
4a-Rezeptor überexprimierender Mäuse
Es wurde eine transgene Mauslinie mit herzspezifischer Überexpression des humanen 5-HT4a -Rezeptor verwendet. Die kodierende Sequenz des 5-HT4a-Rezeptors wurde durch RT-PCR aus humanen Herzmuskelzellen isoliert und durch die Restriktionsendonukleasen Kpnl und Sacl aus dem PCR-Produkt herausgeschnitten (Abb. 6B) und folgend die cDNA in eine Expressionskassette eingefügt. Die Expressionskassette enthält den Promotor der α-Isoform der schweren Kette des Myosins (α-MHC) der Maus. Die Transkription des Rezeptors war somit unter gewebsspezifischer Kontrolle dieses Promotors. Zur Terminierung der Transkription enthielt die Expressionskassette eine Simian Virus 40 (SV40)-Poly-A-Signalsequenz (Gergs et al. 2010).
Diese α-MHC-5-HT4a-Expressionskassette war in befruchtete Eizellen von FVB/N-Mäusen injiziert worden. An den entstandenen transgenen Mäusen konnte eine herzspezifische Überexpression des 5-HT4a-Rezeptors nachgewiesen werden. Abschließend wurden die Tiere in einen CD1-Hintergrund eingekreuzt (Gergs et al. 2010).
2.3 Genotypisierung
2.3.1 Extraktion und Isolation der DNA
Zur Genotypisierung wurden den Versuchstieren im Alter von vier Wochen etwa 5 mm der Schwanzspitze mittels Skalpell entfernt. Durch Ohrmarkierungen konnte die sichere Zuordnung der Mäuse gewährleistet werden.
Der enzymatische Abbau der Biopsien erfolgte im Eppendorf-Thermomixer bei 55°C über 12 Stunden. Das Reaktionsansatz enthielt 700 µl TE/SDS-Puffer und 30 µl Proteinase K. Die Gewinnung der genomischen DNA aus dem Lysat erfolgte mittels Phenol-Chloroform-Extraktion (modifiziert nach Sambrook und Russel, 2000). Nach mehrfacher Behandlung mit Phenol und
Material und Methoden 13 Chloroform, bildet sich eine obere wässrige Phase und eine untere organische Phase. Die obere Phase enthält dabei die DNA, während die untere Phase Proteine und Verunreinigungen enthält. Nach enzymatischem Abbau der Schwanzspitzen wurden 700 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben und gut vermischt. Durch Zentrifugation bei 14000 rpm für drei Minuten bildeten sich zwei Phasen. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß gefüllt, die untere Phase wurde verworfen. Es folgte die Zugabe und das Vermischen von 700 µl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) sowie erneute Zentrifugation bei 14000 rpm für drei Minuten. Erneut wurde die obere Phase entnommen und nun mit 70 µl Natriumacetat und 770 µl reinem Ethanol versetzt, um die DNA aus dem Gemisch auszufällen und von den Phenolresten zu reinigen. Anschließend wurde das Lysat bei 14000 rpm für zehn Minuten zentrifugiert, um die DNA zu sedimentieren. Das Sediment wurde vom Überstand getrennt und mit 1 ml 70%igen Ethanol gewaschen und wiederum bei 14000 rpm für zehn Minuten zentrifugiert. Danach wurde das entstandene Sediment bei ca. 30°C im Heizblock getrocknet. Abschließend wurde die DNA mit 50 µl TE-Puffer für 15 Minuten bei 65 °C inkubiert. Die weitere Aufbewahrung bis zur Weiterverwendung erfolgte bei 4°C.
2.3.2 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA-Konzentration wurde mit einem Biophotometer (Eppendorf) bestimmt. Als Kontrollwert diente eine Leerwertmessung ohne DNA. Die Bestimmung der DNA-Konzentration der Probe erfolgte durch Messung der Extinktion bei 260 nm (E260). Bei einer Messküvette mit 10mm Dicke und einem OD260-Messwert von 1,0 enthält die Probe 50 µg/ml doppelsträngige DNA. Die Berechnung für den DNA-Gehalt erfolgt mit der Fomel E260 x 50 µg/ml x Verdünnungsfaktor = X µg/ml. Eine Aussage über Qualität der Probe erfolgt durch Berechnung des Quotienten aus der OD260 zur OD280, Werte zwischen 1,8 und 2,0 weisen auf eine hohe Reinheit der DNA hin.
2.3.3 PCR-Amplifikation
Die Vervielfältigung der gesuchten DNA-Sequenz erfolgte durch die Polymerase-Kettenreaktion PCR). Die DNA wird in einem Versuchsgefäß mit einem speziellen Reaktionsansatz zusammengeführt. In den jeweiligen Proben war ein PCR-Puffer mit 1,5 mM Magnesiumchlorid, 200 µM dNTP-Mix, jeweils 1 µM forward- und reverse-Primer und 2,5 U einer thermostabilen Taq-DNA-Polymerase enthalten (s. Anhang). Reinstwasser wurde zur Auffüllung bis 50 µl verwendet. Das nachzuweisende PCR-Produkt hatte eine Größe von 508 bp.
Material und Methoden 14
2.3.4 Agarosegelelektrophorese
In der Agarosegelelektrophorese werden zu trennende elektrisch geladene Moleküle aufgrund verschiedener Laufgeschwindigkeit in einem Gel unter Einfluss eines elektrischen Feldes beurteilt. Kleinere Moleküle wandern im Gel weiter als größere Moleküle. Es werden Marker zur Beurteilung der Länge der DNA-Fragmente, eine positive und negative Kontrolle verwendet. Für die Auftrennung des PCR-Produktes wurde ein 1%iges Agarosegel mit einer TAE-Pufferlösung benutzt. Alle Proben wurden mit 8 µl Ladepuffer (s. Anhang) versehen und in die vorgesehenen Taschen im Gel eingefüllt. Für ca. 45 Minuten wurde eine konstante Spannung von 80 mV angelegt. Danach wurde eine Färbung mit Ethidiumbromid vorgenommen. Das Ergebnis der Genotypisierung konnte so unter UV-Licht beurteilt und fotografisch dokumentiert werden. In Abb. 6A ist ein Ergebnis der Agarosegelelektrophorese gezeigt.
2.4 Versuchsaufbau
2.4.1 Das Organbad
Für jede Versuchsreihe wurde eine sogenannte Tyrode-Lösung frisch vorbereitet, um für die präparierten Vorhöfe ein physiologisches Milieu zu schaffen. Diese Tyrode-Lösung setzte sich aus drei verschiedenen Stammlösungen in genau definierter Konzentration (s. Anhang) zusammen und wurde mittels Aqua bidest. auf 1 Liter aufgefüllt. Es folgte die kontinuierliche Begasung mit Carbogen (95 % O2 und 5 % CO2), nach 30 Minuten wurden 0,8 ml Calciumchlorid-Lösung (33,2 g CaCl2/100 ml H2O), 49,3 mg Ascorbinsäure, 19 mg Na2EDTA und 1 g Glucose hinzugefügt.
2.4.2 Die Messanlage
Die Messanlage (Abb. 4) für die Kontraktionsversuche bestand aus doppelwandigen Organbädern, welche jeweils eine Haltevorrichtung für einen präparierten Vorhof bieten. Der innere Teil mit einem Volumen von 10 ml war für die präparierten Vorhöfe vorgesehen und wurde mit Tyrode-Lösung aufgefüllt. Die Carbogenbegasung war am unteren Teil des Bades angesetzt. Der äußere Teil des doppelwandigen Organbades war Teil eines beheizbaren Wasserkreislaufes, so dass die Temperatur im Organbad stetig bei 37°C gehalten werden konnte.
Die präparierten Vorhöfe konnten an den vorgesehenen Befestigungsdrähten angebracht und in das Organbad eingetaucht werden. Die Kontraktionskraft wurde über den oberen Befestigungsdraht auf einen Kraftaufnehmer übertragen und dessen Signale über einen Brückenverstärker verstärkt und letztendlich zum Schreiber geleitet. Der Schreiber wurde auf 5 mm pro Minute eingestellt und konnte bei Bedarf auf 100 mm pro Sekunde erhöht werden, dies diente der Darstellung einer
Material und Methoden 15 Einzelkontraktion. Nach Eintauchen der Haltevorrichtung in die Tyrode, hing das Präparat genau zwischen zwei Reizelektroden.
Bei Versuchen mit linken Vorhöfen wurde das Präparat mit einer Frequenz von 1 Hz und Impulsdauer von 5 ms elektrisch stimuliert. Die angelegte Spannung lag bei ca. 10 % über der Reizschwelle. Die Kontraktionskraft konnte so gemessen und über den Schreiber ein Mechanogramm angefertigt werden. Bei Versuchen mit rechten Vorhöfen und intaktem Sinusknoten und Reizleitungssystem war keine elektrische Stimulation notwendig. Es kam zu einer spontanen Kontraktion des Präparates und die Schlagfrequenz konnte gemessen werden.
Jeder Versuchsreihe ging eine Kalibrierung voraus. Ein Nullpunkt wurde festgelegt. Mit einem vorgegebenen Gewicht wurde eine Kraft von 5 mN erzeugt und der Ausschlag des Schreibers für zwei Empfindlichkeitsstufen dokumentiert. Die Kontraktionskraft der Präparate konnte so nachfolgend mit der Kalibrierung auf das vorgegebene Gewicht korreliert werden.
A
B
Abb. 4: Versuchsapparatur für Kontraktions- und Frequenzmessungen
(A) Foto Originalversuchsapparatur. Dargestellt ist ein doppelwandiges Organbad, welches im Inneren mit Tyrode-Lösung gefüllt ist. Die Begasung des Organbades erfolgt von unten durch Carbogen (95% O2, 5%
CO2). Der äußere Anteil des Organbades ist Teil eines Wasserkreislaufes und dient der Temperaturerhöhung
im Organbad auf 37°. Über dem Organbad ist die nicht eingetauchte Präparathalterung mit den zwei Reizelektroden zu sehen. Der obere Halterungsdraht ist am oberen Pol mit der Messkammer verbunden. (B) Schematische Darstellung Versuchsapparatur. Abgebildet ist ein doppelwandiges Organbad mit dem aufgehängten Muskelpräparat, den Reizelektroden, das Reizgerät, der Kraftaufnehmer, der Brückenverstärker und der Schreiber. Der Schreiber zeichnet die Muskelkontraktionen als Mechanogramm auf. Die Tyrodelösung im Organbad wird mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) begast und durch den Wassermantel in der Doppelwand
des Organbades auf 37°C temperiert (modifiziert nach Frenker 2013).
Carbogen Doppelwandiges Organbad Reizgerät Kra7aufnehmer Reizelektroden Präparathalterung Tyrodelösung
Material und Methoden 16
2.4.3 Organentnahme und Präparation der Herzen
Zu Beginn eines Versuchs wurden als Thromboseprophylaxe 500 IE Heparin und zur Narkotisierung gewichtsabhängig (50-75 mg/kg Körpergewicht) Pentobarbital i.p. injiziert. Bei Eintritt der vollen Narkose erfolgte die Fixierung an den peripheren Extremitäten. Mit spitzer und stumpfer Präparation wurde schichtweise der knöcherne Thorax freigelegt. Mit der Schere wurden beidseits die Rippen vom Sternum gelöst. Danach ließ sich das Sternum problemlos nach kranial umklappen und ermöglichte so eine freie Sicht auf das Herz. Die zu- und abführenden Gefäße wurden mit der Schere vorsichtig durchtrennt und das Herz konnte entnommen und rasch in ein mit Tyrode-Lösung gefülltes Gefäß überführt werden. Das im Herzen verbliebene Blut wurde durch leichte Kompression und Eigenkontraktion hinausgespült.
Die Präparation der rechten und linken Herzvorhöfe erfolgte auf einer ebenfalls mit Tyrode-Lösung gefüllten und mit Carbogen begasten Präparierschale. Während der gesamten Präparation war äußerste Sorgfalt geboten, um den sensiblen Sinusknoten und die Herzmuskelfasern nicht zu schädigen. Rechter und linker Vorhof wurden komplett vom restlichen Herzen und Geweberesten freigelegt. Am oberen und unteren Pol der Präparate wurden kleine Häkchen für die Haltevorrichtung angebracht. Anschließend konnte das vorsichtige Einhängen in der Versuchsapparatur erfolgen.
2.5 Versuchsdurchführung
Der Versuchsablauf der jeweiligen Experimente ist in Abb. 5 dargestellt. Es wurden jeweils transgene Tiere und Wildtyp-Tiere verwendet. Nach Einhängen der rechten und linken Vorhöfe in das Organbad wurden diese manuell vorgespannt. In den ersten 30 Minuten erfolgte alle 10 Minuten ein Badwechsel mit 10 ml frischer Tyrode-Lösung. Wenn sich hier bereits Arrhythmien der Vorhöfe darstellten, die durch das dreimalige Spülen und Korrigieren der Vorspannung nicht sistierten, musste von einer Schädigung der Präparate ausgegangen werden. Diese Präparate wurden in der Auswertung nicht berücksichtigt. Nach Einstellen einer stabilen Kraft- und Schlagfrequenz war die Versuchsvorbereitung abgeschlossen.
Zu Beginn wurde die erste 5-HT-Konzentrations-Wirkungskurve (KWK 1) erhoben. Sie begann mit Zugabe von 10-10 M Serotonin und wurde kumulativ (3x10-10 M, 10-9 M, 3x10-9 M, 10-8 M, etc.) alle 5 Minuten bis zu einer maximalen Konzentration von 10-6 M erhöht. Nach der ersten KWK folgte das sogenannte Spülen: dreimalig wurde alle 5 Minuten die 10 ml Tyrode-Lösung im Organbad vollständig ausgewechselt. Das sogenannte Spülen dient dem Auswaschen der zuvor verwendeten Substanzen. Anschließend konnte der jeweilige PDE-Hemmstoff oder die PDE-Hemmstoff Kombination in das Organbad pipettiert werden. Die Konzentration der PDE-Hemmstoffe ergab sich
Material und Methoden 17 aus Vorexperimenten und Studien anderer Forschungsgruppen. EHNA und IBMX wurden als Racemat verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wurde eine zweite 5-HT-Konzentrations-Wirkungskurve (KWK 2) erhoben (Abb. 5).
Abb. 5: Schematische Darstellung der Experimente
Die Experimente wurden mit einer Konzentrations-Wirkungskurve (KWK 1) mit Serotonin in 10er Schritten von 10-10 M bis 10-6 M begonnen. Es folgte das sogenannte Spülen (S), dreimaliger Wechsel der 10 ml Tyrode-Lösung im Organbad alle 5 Minuten. Dann die Zugabe der PDE-Hemmstoffe in genau definierter Konzentration. Nach einer Einwirkzeit von 30 Minuten wurde erneut eine Konzentrations-Wirkungskurve (KWK 2) mit Serotonin in gleicher Weise erhoben. Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochloride (EHNA); 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)
2.6 Statistik
Bei den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Daten handelt es sich um Mittelwerte und zugehörigen positiven und negativen Standardfehlern (SEM). Für die statistische Signifikanz wurden je nach Fragestellung der verbundene und unverbundene t-Test nach Student sowie die Varianzanalyse ANOVA mit folgender Fehlertestung nach Bonferroni verwendet. P-Werte kleiner als 0,05 wurden als signifikant gewertet. Für die Auswertung der Daten und Ermittlung der EC50 -Werte wurde das Programm GraphPad Prism 5.0 für Windows (GraphPad Inc., San Diego, USA) verwendet. Die Anzahl der einzelnen Versuche ist mit einem „n“ bezeichnet.
KWK 1
S
Cilostamid (10-6 M) KWK 2 Experiment 1: Experiment 2: KWK 1S
EHNA (10-6 M) KWK 2 Experiment 3: KWK 1S
IBMX (10-6 M und 10-5 M) KWK 2 Rolipram (10-7 M und 10-6 M) KWK 2 EHNA 10-6 M + Rolipram 10-6 M KWK 2 Cilostamid 10-6 M + Rolipram (10-7 M und 10-6 M)KWK 2
KWK 1
S
Cilostamid 10-6 M + EHNA 10-6 M KWK 2Cilostamid 10-6 M + EHNA 10-6 M + Rolipram 10-7 M KWK 2
Experiment 4: Experiment 5: Experiment 6: Experiment 7: Experiment 8: Zeit KWK 1
S
KWK 1S
Material und Methoden 18
2.7 Anhang
Puffer und Lösungen
Alle Chemikalien wurden in pro analysi-Qualität oder im besten kommerziell erhältlichen Reinheitsgrad verwendet. Soweit keine anderen Angaben gemacht werden, wurde das für Puffer und Lösungen verwendete Wasser als Reinstwasser (18 Ohm) aus einer Wasseraufbereitungsanlage gewonnen.
Genotypisierung der Versuchstiere
Proteinase K-Lösung Proteinase K 10 mg/ml
TE/SDS-Puffer Tris HCl 50 mM, EDTA 100 mM, SDS 0,5 %, pH 8,0; Sterilisierung durch Autoklavieren
TE-Puffer Tris HCl 10 mM, EDTA 0,25 mM;
Sterilisierung durch Autoklavieren Natriumacetat-Lösung Natriumacetat 3 M, pH 6,0
DEPC-Wasser DEPC 0,1 %(V/V)
dNTP-Mix
Agarosegel Agarose 1 %, TAE-Puffer, Ethidiumbromid 0,01 %
TAE-Puffer Tris Base 1,99 M, Eisessig 0,99 M, EDTA 59,5 mM
Ladepuffer TAE-Puffer 50 %, Glycerol 50 %, Bromphenolblau
Kontraktionskraft- und Frequenzmessungen an Mausvorhöfen
Tyrode
Stamm I NaCl 17,5 % (g/V), KCl 1,005 % (g/V),
MgCl2 x 6H2O 0,56 % (g/V)
Stamm II NaHCO3 5,00 % (g/V)
Stamm III NaH2PO4 x H2O 0,29 % (g/V)
NaCl 119,8 mM KCl 5,4 mM MgCl2 x 6H2O 1,1 mM NaHCO3 22,6 mM NaH2PO4 x H2O 0,42 mM CaCl2 x 2H2O 1,8 mM
Material und Methoden 19 Glucose 5,05 mM Ascorbinsäure 0,28 mM Na2-EDTA 0,05 mM pH 7,4 Verwendete Substanzen
Agarose, Typ SeaKem FMC bioproducts, Philadelphia, USA
L (+) – Ascorbinsäure Merck, Darmstadt
CaCl2 x 2H2O Merck, Darmstadt
Chloroform C. Roth GmbH, Karlsruhe
Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma-Aldrich, Steinheim
DNA-Leiter GeneRulerTM Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
dNTP MBI Fermentas, Heidelberg
Essigsäure 100 % Merck, Darmstadt
Ethanol 100 % C. Roth GmbH, Karlsruhe
Ethidiumbromid Fluka Chemie GmbH, Neu-Ulm
Glucose Merck, Darmstadt
Heparin Biochrom AG, Berlin
Isoamylalkohol C. Roth GmbH, Karlsruhe
Isoprenalin Sigma-Aldrich, Steinheim
KCl Roth, Karlsruhe
MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt
Natriumacetat C. Roth GmbH, Karlsruhe
NaCl Merck, Darmstadt
Na2-EDTA C. Roth GmbH, Karlsruhe
NaHCO3 Merck, Darmstadt
NaH2PO4 x H2O Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt
Pentobarbital Spofa, Prag, Tschechien
Phenol C. Roth GmbH, Karlsruhe
Proteinase K Sigma-Aldrich, Steinheim
Serotonin Sigma-Aldrich, Steinheim
PCR-Puffer, 15 mM MgCl2 Ampliqon, Odense, Dänemark
Taq-DNA-Polymerase Ampliqon, Odense, Dänemark
HCl C. Roth GmbH, Karlsruhe
Material und Methoden 20
Geräte und Bezugsquellen
PCR-Gerät Mastercycler gradient; Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg Zentrifuge Modell 5415 C; Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg Biophotometer; Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg
Elektrophoresekammer Typ Horizon 58; Life Technologies, Gaithersburg, USA Waage Typ AT261 DeltaRange; Mettler Instruments GmbH, Gießen
pH-Meter; WTW GmbH, STH 600, Weilheim
Kontraktionskraftmessanlage (Föhr Medical Instruments GmbH, Seeheim)
- Verstärker und integrierter Schreiber (Graphtec, Linearcorder mark, VII, WR 3101) - Reizgerät mit 4 Kanälen (ELV Takt- und Impulsgenerator TIG 7000)
- Wärmebad (CS Lauda)
- 4 Transducer (Kent, Scientific corporation, Isometric Transducer) - 4 Doppelwandgefäße, 4 Stative, 4 Elektroden, Halterungsstäbe, Haken Prism 5; GraphPad Software, San Diego, USA
Primer
Forward Primer MHC-SEQ-P1, biomers.net GmbH, Ulm ACC CTT ACC CCA CAT AGA CC Reverse Primer 5-HT-SEQ-P1R, biomers.net GmbH, Ulm
AAA CAC CTC CCC ATA AAT CC
PCR-Programm
Denaturierung 94 °C 2 min 1 Zyklus
Denaturierung 94 °C 45 s
Annealing 56 °C 15 s 30 Zyklen
Elongation 72 °C 30 s
Ergebnisse 21
3 Ergebnisse
3.1 Genotypisierung
Das 5-HT4a-Rezeptor-Transgen wurde in die Maus-DNA integriert. Zur Kontrolle, ob es sich bei den Tieren um Träger des humanen 5-HT4a-Rezeptorgens im Genom handelt, wurde aus Schwanzspitzen der Tiere die genomische DNA extrahiert und eine PCR durchgeführt (s. 2.3.1 und 2.3.3). Das Ergebnis einer Genotypisierung ist exemplarisch in Abb. 6 aufgeführt. Mit einem Photometer wurde der Reinheitsgrad der DNA überprüft. Hierzu wurde die optische Dichte bei 260 nm und 280 nm gemessen und anschließend wurde aus beiden Werten der Quotient gebildet. Bei allen Kontrollen konnte ein hoher Reinheitsgrad der DNA nachgewiesen werden.
A
B
Abb. 6: Genotypisierung
(A) Es ist ein beispielhaftes Ergebnis der Agarosegelelektrophorese dargestellt. Mittels PCR wurden zuvor die DNA-Proben der Versuchstiere vervielfältigt und auf das Gel aufgetragen. In der Agarosegelelektrophorese werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt. Die gesuchte DNA-Sequenz hat eine Größe von 508 bp. Am linken Rand lief eine 100 bp DNA-Leiter als Marker mit. Marker (M); Positivkontrolle (+); Negativkontrolle (-); transgene Mäuse (TG); Wildtyp-Mäuse (WT).
(B) Schematische Darstellung der α-MHC-5-HT4a-Expressionskassette. Die Generierung einer Mauslinie mit
herzspezifischer Überexpression des humanen 5-HT4a-Rezeptors erfolgte mittels Injektion der α-MHC-5-HT4a
M + - TG TG TG WT WT
1000 bp -
500 bp -
α-MHC-Promotor cDNA 5-HT4a SV 40 poly A
Nrul Kpnl Sacl Nrul
508 bp
5` 3`
Ergebnisse 22 Expressionskassette in befruchtete Eizellen. Die entsprechende Sequenz für den humanen Rezeptor wurde durch die Restriktionsendonukleasen Kpnl und Sacl herausgeschnitten und folgend in die Expressionskassette eingefügt. Die Transkription stand unter gewebsspezifischer Kontrolle des α-MHC-Promotors der Maus. Die Terminierung erfolgte durch eine Simian Virus 40-Poly-A-Signalsequenz. Mit Hilfe von spezifischen Primern (s. Anhang) konnte das Transgen im Genom der Maus nachgewiesen werden.
3.2 Kontraktionskraft- und Frequenzmessungen der Herzvorhöfe
Die Vorhöfe der Mäuse wurden, wie in 2.4.3 beschrieben, präpariert und entsprechend in die Organbäder eingehängt. Die gemessene Kraft der linken Vorhöfe und die Schlagfrequenz der rechten Vorhöfe wurden von einem Schreiber in Form eines Mechanogramms aufgezeichnet. Die Abb. 7 zeigt eine Auswahl repräsentativer Original- Mechanogramme.
A
B
WT TG = 5-HT 10-6 M = Kontrolle 3 mN 30 ms 9 8 7 6 5-HT (-log[M]) TG 3 mN 5 min 10 WT 3 mNErgebnisse 23
C
Abb. 7: Repräsentative Mechanogramme der Reaktion von TG und WT auf Serotonin
(A) Mechanogramm der Kontraktionskraft eines elektrisch gereizten linken Vorhofs einer transgenen Maus (TG), die den 5-HT4a-Rezeptor überexprimiert (oben) und einer Kontrollmaus (WT, unten). Auf 5-HT Zugabe
erfolgt der schnelle und konzentrationsabhängige PIE in TG-Tieren, bei der Kontrolle (WT) tritt kein Effekt ein. Abszisse: Zeit in Minuten (min); Ordinate: Kontraktionskraft in Millinewton (mN).
(B) Einzelkontraktionen der elektrisch gereizten linken Vorhöfe von TG und WT unter Ausgangsbedingungen (Kontrolle) und nach 10-6 M 5-HT. Ordinate: Kontraktionskraft in Millinewton (mN).
(C) Einzelkontraktionen spontan schlagender rechter Vorhöfe unter Ausgangsbedingungen (Kontrolle) und bei maximaler 5-HT Konzentration (10-6 M) am Ende der Konzentrationswirkungskurve. Abszisse: Zeit in
Sekunden (s); Ordinate: Kontraktionskraft in Millinewton (mN).
3.3 5-HT-Konzentrations-Wirkungskurve ohne PDE-Hemmstoffe
Die Ausgangslage der linken Vorhöfe und die Grundfrequenz der rechten Vorhöfe von TG-Mäusen wiesen keine Unterschiede gegenüber den WT-Mäusen auf. Die linken Vorhöfe von TG zeigten im Durchschnitt eine Kraft von 3,08 ± 0,22 mN (n=27) und die von WT 3,61 ± 0,26 mN (n= 23). Die spontane Basalfrequenz rechter Vorhöfe von TG lag bei 469 ± 16 bpm (n=20) und die von WT bei 438 ± 15 bpm (n=21).
Die linken Vorhöfe von TG reagierten auf 5-HT positiv inotrop (Abb. 8A). Ein exemplarisches Mechanogramm mit 5-HT-Effekten der linken Vorhöfe von WT und TG ist in Abb. 7A dargestellt. Der PIE war von der 5-HT-Konzentration abhängig (-log EC50= 8,02 ± 0,03). Die Kontraktionskraft der linken Vorhöfe von WT zeigte keine Zunahme unter der 5-HT KWK (Abb. 8A). Die rechten Vorhöfe von TG reagierten konzentrationsabhängig positiv chronotrop (Abb. 7C und Abb. 8B). Die rechten Vorhöfe von WT zeigten keine Zunahme der Frequenz. Es zeigte sich sogar ein leichtes Abfallen der Frequenz im Verlauf der KWK, dieser Abfall war statistisch nicht signifikant.
100 ms
Kontrolle 5-HT 10-6 M
TG 3 mN
Ergebnisse 24 Die Anspannungszeiten der linken Vorhöfe von TG verkürzten sich unter der 5-HT-KWK. Vor Beginn der 5-HT-KWK wurde im Durchschnitt eine Anspannungszeit von 29,1 ± 0,73 ms und bei der maximalen 5-HT-Konzentration 27,6 ± 0,68 ms gemessen (Tab. 3). Die Relaxationszeit der linken Vorhöfe von TG zeigte unter der 5-HT-KWK keine wesentlichen Veränderungen. Die WT-Tiere zeigten ebenfalls keine Veränderungen der Anspannungs- und Relaxationszeit unter der 5-HT-KWK (Tab. 3).
A
B
Abb. 8: 5-HT Konzentrationswirkungskurve ohne PDE-Hemmstoffe
(A) Effekt von 5-HT auf die Kontraktionskraft elektrisch gereizter (1 Hz) linker Vorhöfe von 5-HT4-Rezeptor
überexprimierenden Mäusen (TG, Kreise) und Wildtyp-Geschwistertieren (WT, Quadrate). Ktr = basale Kontraktionskraft vor Serotoninzugabe. Die Kontraktionskraft ist auf der Ordinate in Millinewton (mN) angegeben. Die Abszisse zeigt den negativen dekadischen Logarithmus der 5-HT Konzentration.
(B) Effekt von 5-HT auf die Frequenz spontan schlagender rechter Vorhöfe von TG (Kreise) und WT (Quadrate). Auf der Ordinate ist die Schlagfrequenz in Schlägen pro Minute (1/min) aufgetragen. Ktr = Grundschlagfrequenz vor Serotoninzugabe.
Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Experimente an. * = erster signifikanter Unterschied gegenüber Ktr (P<0,05), + = erster signifikanter Unterschied gegenüber WT (P<0,05).
0 2 4 6 8 10 TG (n=27) WT (n=23) Ktr
*
+ 10 9 8 7 6 5-HT (-log[M]) K ra ft ( m N) 350 400 450 500 550 600 TG (n=20) WT (n=21)*
+ Ktr 10 9 8 7 6 5-HT (-log[M]) F re q u e n z ( 1 /m in )Ergebnisse 25
3.4 Experimente mit einzelnen PDE-Hemmstoffen
3.4.1 EHNA
Die basale Kraft der linken Vorhöfe von TG vor Inkubation mit EHNA lag bei 3,06 ± 0,6 mN (n=5) und von der WT-Kontrollgruppe bei 3,4 ± 0,27 mN (n=5). Die basale Frequenz der rechten Vorhöfe von TG lag bei 458 ± 23 bpm (n=5) und von WT bei 396 ± 15 bpm (n=5).
Die linken Vorhöfe von TG und WT zeigten nach dreißig-minütiger Inkubation mit EHNA 1µM keine Veränderung der Kontraktionskraft (Ktr2 vs. Ktr1 in Abb. 9A und Abb. 9B). Bei den rechten Vorhöfen von TG und WT kam es zu einem geringen Abfallen der Frequenz (Ktr2 vs. Ktr1 in Abb. 9C). Die Frequenzabnahme war allerdings statistisch nicht signifikant (p = 0,08). Ab einer Konzentration von 3x10-8 M Serotonin im Organbad stieg die Kontraktionskraft der linken Vorhöfe transgener Tiere bezogen auf Ktr2 an (Abb. 9A). In Abb. 9B ist die Konzentrations-Wirkungs-Kurve normalisiert auf die Ktr1 dargestellt. Die 5-HT KWK ohne einen PDE- Hemmstoff (Dreiecke) ist zusätzlich in den jeweiligen Abbildungen eingefügt (Abb. 9A und 9B).
Unter EHNA kam es zu einer signifikanten Verschiebung des PIE zu höheren 5-HT Konzentrationen (Abb. 9B, Kreise, -log EC50=7,56 ± 0,01, p<0,05 vs. KWK ohne EHNA). Die linken Vorhöfe von WT reagierten nicht auf 5-HT.
Die rechten Vorhöfe von TG reagierten positiv chronotrop und zeigten ab einer 5-HT-Konzentration von 3x10-8 M einen Frequenzanstieg in Bezug auf Ktr2 und gegenüber den WT-Tieren (Abb. 9C). EHNA veränderte die Anspannungs- und Relaxationszeiten in linken Vorhöfen von TG und WT nicht (Ktr1 vs. Ktr2, Tab. 3). Unter der 5-HT-KWK kam es zu einer Verkürzung der Anspannungszeit der linken Vorhöfe von TG (Tab. 3A). Die Relaxationszeit verkürzte sich nicht signifikant. Die WT-Tiere zeigten keine 5-HT-abhängigen Veränderungen der Anspannungs- und Relaxationszeiten.
A
0
2
4
6
8
10
*
+
Ktr1Ktr2 10
9
8
7
6
TG Kontrolle (n=5) TG EHNA (n=5) WT EHNA (n=5) (§)5-HT (-log[M])
K
ra
ft
(
m
N)
Ergebnisse 26
B
C
Abb. 9: EHNA(A) Effekte von 5-HT alleine (Dreiecke) und in Gegenwart von 1µM Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochlorid (EHNA) auf die Kontraktionskraft elektrisch gereizter (1 Hz) linker Vorhöfe von 5-HT4-
Rezeptor überexprimierenden Mäusen (TG, Kreise) und Wildtyp-Geschwistertieren (WT, Quadrate). Ktr1 = basale Kontraktionskraft vor Inkubation mit EHNA. Ktr2 = Kontraktionskraft nach Inkubation mit EHNA. Abszisse: negativ dekadischer Logarithmus der 5-HT-Konzentration, Ordinate: Kontraktionskraft Millinewton (mN).
(B) Auf Ktr1 normalisierte Effekte von 5-HT alleine (Dreiecke) und in Gegenwart von 10-6 M EHNA auf die Kontraktionskraft elektrisch gereizter (1 Hz) linker Vorhöfe von TG (Kreise) und WT (Quadrate). Abszisse: negativ dekadischer Logarithmus der 5-HT-Konzentration, Ordinate: Kontraktionskraft in delta-Millinewton (Δ mN).
(C) Effekte von 5-HT in Gegenwart von 10-6 M EHNA in spontan schlagenden rechten Vorhöfen von TG (Kreise) und WT (Quadrate). Ktr1 = basale Schlagfrequenz vor Inkubation mit EHNA. Ktr2 = Schlagfrequenz nach Inkubation mit EHNA. Abszisse: negativ dekadischer Logarithmus der 5-HT Konzentration, Ordinate: Schlagfrequenz in Schlägen pro Minute (1/min).
n = Anzahl der Experimente, * = erster signifikanter Unterschied gegenüber Ktr2 (P<0,05), + = erster signifikanter Unterschied gegenüber WT (P<0,05), § = signifikanter Unterschied vs. TG Kontrolle.
0
2
4
6
8
TG Kontrolle (n=5) TG EHNA (n=5)*
Ktr1Ktr2
WT EHNA (n=5)10
9
8
7
6
+
*
(§)5-HT (-log[M])
K
ra
ft
(Δ
mN
)
300
400
500
600
TG EHNA (n=5) WT EHNA (n=5)*
+
Ktr1Ktr2 10
9
8
7
6
5-HT (-log[M])
F
re
qu
en
z (
1/m
in
)
Ergebnisse 27
3.4.2 Cilostamid
Die basale Kontraktionskraft der linken Vorhöfe und die Schlagfrequenz der rechten Vorhöfe von TG unterschieden sich nicht im Vergleich zu der WT-Kontrollgruppe. Die basale Kontraktionskraft in linken Vorhöfen betrug im Durchschnitt von TG 1,82 ± 0,15 mN (n=8) und von WT 2,15 ± 0,31 mN (n=6). Die Frequenz der rechten Vorhöfe von TG lag bei 382 ± 11 bpm (n=6) und von WT bei 395 ± 22 bpm (n=6). Die Inkubation mit dem PDE3-Hemmstoff Cilostamid (10-6 M) bewirkte keinen Anstieg der Kontraktionskraft der linken Vorhöfe von TG und WT (Ktr2 vs. Ktr1 in Abb. 10A). Auch in den rechten Vorhöfen konnte Cilostamid (10-6 M) keine Veränderung der Frequenz bewirken (Ktr2 vs. Ktr1 in Abb. 10B).
Ab einer 5-HT-Konzentration von 3x10-9 M stieg die Kontraktionskraft der linken Vorhöfe von TG bezogen auf Ktr2 an (2,14 ± 0,19 mN vs. 1,82 ± 0,15 mN, siehe Abb. 10A). Gegenüber WT-Vorhöfen zeigte sich ab einer 5-HT-Konzentration von 3x10-8 M ein Kraftanstieg. Die 5-HT KWKs ohne Cilostamid (Dreiecke) sind in der Abb. 10A mit dargestellt. Unter Cilostamid kam es zu einer Verschiebung des PIE von 5-HT zu höheren Konzentrationen (-log EC50=7,28 ± 0,13, Abb. 10A). Die Anspannungszeiten der linken Vorhöfe von TG zeigten unter der 5-HT-KWK eine Tendenz sich zu verkürzen, ohne dass dieser Effekt signifikant wurde (s. Tab. 3). Die linken Vorhöfe von WT zeigten keine Veränderungen unter der 5-HT-KWK bezüglich Anspannungs- und Relaxationszeiten. Die rechten Vorhöfe von TG zeigten ab einer Konzentration von 10-8 M Serotonin einen Anstieg der Frequenz gegenüber Ktr2 und auch gegenüber den WT-Vorhöfen (s. Abb. 10B). Die Wirksamkeit von 5-HT auf den PCE wurde durch EHNA nicht verändert (Tab. 2). Die rechten Vorhöfe von WT vermittelten keine chronotropen Effekte. Bei hohen 5-HT Konzentrationen kam es zu einem leichten Abfall der Schlagrate, der Effekt war nicht signifikant.
