Medizinische Hochschule Hannover Institut für Neuroanatomie
Charakterisierung genetisch modifizierter dopaminerger Progenitorzellen in vitro und in situ – immunzytochemische,
biochemische und elektrophysiologische Untersuchungen
INAUGRAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften -Doctor rerum naturalium-
(Dr. rer. nat.)
Durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von
Meltem Özer aus Hagen
Hannover (April, 2013)
Supervisorin: Prof. Dr. C. Grothe
Betreuergruppe: Prof. Dr. C. Grothe Prof. Dr.med. S. Bleich Prof. Dr. K. Weißenborn 1.Gutachten: Prof. Dr. C. Grothe
Institut für Neuroanatomie
Medizinische Hochschule Hannover Carl-Neuberg-Straße 1
30625 Hannover
Prof. Dr.med. S. Bleich
Medizinische Hochschule Hannover
Klinik für Psychiatrie, Sozialpsychiatrie und Psychotherapie Carl-Neuberg-Straße 1
30625 Hannover
Prof. Dr. K. Weißenborn
Medizinische Hochschule Hannover Klinik für Neurolgie
Carl-Neuberg-Straße 1 30625 Hannover 2.Gutachten: Prof. Dr. H. Widmer
Inselspital Bern
Universitätsklinik für Neurochirurgie
Forschungslabor für restorative Neurowissenschaften CH-3010 Bern
Tag der mündlichen Prüfung:___________12.4.2013______________
Teile der Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
Ratzka A, K. I., Ozer M, Nobre A, Wesemann M, Jungnickel J, Köster-Patzlaff C, Baron O, Grothe C (2012).
"The co-layer method as an efficient way to genetically modify mesencephalic progenitor cells transplanted into 6-OHDA rat model of Parkinson's disease." Cell Transplantation 21 479-762
In Kürze eingereichte Arbeit:
Rumpel R (1,*), Alam M (2,*), Klein A (1), Oezer M (1,3), Wesemann M (1), Krauss JK (2,3), Schwabe K (2,3), Ratzka A
(1,#)
, Grothe C (1,3,#)
“Neuronal firing activity and gene expression changes in the subthalamic nucleus after transplantation of dopamine neurons in hemiparkinsonian rats”
I
Zusammenfassung...XII Abstract ... XV
1. Einleitung – Allgemein ... 1
1.1 Morbus Parkinson ... 1
1.2 Motorisches System ... 4
1.3 6-OHDA-Rattenmodell zur Untersuchung von Morbus Parkinson ... 6
1.4 Therapie des Morbus Parkinson... 7
1.4.1 Medikamentöse Therapie ... 7
1.4.2 Tiefe Hirnstimulation ... 8
1.4.3 Transplantation von Stammzellen... 9
1.4.3.1 Embryonale Stammzellen (ES) und adulte Stammzellen ... 10
1.4.3.2 Vorläuferzellen aus dem fötalen ventralen Mesencephalon (VMZ) ... 10
2. Einleitung – Teil 1... 12
2.1 Neurotrophe Faktoren ... 12
2.1.1 CDNF und MANF... 12
2.1.2 GDNF-Superfamilie ... 13
2.1.2.1 GDNF ... 13
2.1.3 NT-Familie ... 13
2.1.3.1 BDNF ... 14
3. Einleitung - Teil 2 ... 17
3.1 Whole cell (Ganzzell) Patch-Clamp Messverfahren ... 17
3.2 Elektrophysiologische Eigenschaften von Neuronen... 17
3.3 Elektrophysiologische Eigenschaften von dopaminergen Neuronen... 18
4. Material – Allgemein ... 21
4.1 Chemikalien ... 21
4.2 Geräte und Material... 23
5. Material – Teil 1 ... 24
5.1 Zellkultur ... 24
5.1.1 Beschichtung der Platten... 24
5.1.2 Medien... 24
5.1.3 Präparationsmedium... 24
5.1.4 Attachmentmedium E12 Ratte ... 24
5.1.5 Attachmentmedium E14 Maus... 24
5.1.6 Proliferationsmedium ... 25
5.1.7 Differenzierungsmedium E12 Ratte... 25
5.1.8 Differenzierungsmedium für die Transplantation ... 25
5.1.9 Differenzierungsmedium E14 Maus ... 25
5.2 Transfektion ... 26
5.2.1 Nukleofektion... 26
5.2.2 Lipofektamin ... 26
5.2.3 Plasmide ... 26
5.3 Immunzytochemie (ICC)... 27
5.3.1 Fixieren... 27
5.3.2 Blocklösung... 27
5.3.3 Antikörper ... 27
5.3.3.1. Primär Antikörper-Immunzytochemie ... 27
5.3.3.2 Sekundäre Antikörper-Immunzytochemie ... 27
II
5.3.3.3 Primäre Antikörper-Western Blot ... 27
5.3.3.4 Sekundäre Antikörper-Western Blot ... 28
6. Material – Teil 2 ... 29
6.1. Patch-Clamp ... 29
7. Methode - Teil 1 ... 30
7.1 Tierhaltung und Verpaarung ... 30
7.2 Embryopräparation von Sprague-Dawley Ratten und TH-EGFP (Enhanced green fluorescent protein) Mäusen... 30
7.3 SPRD in vitro Colayer und Monolayer Experimente... 31
7.4 Colayer versus Monolayer ... 31
7.5 Colayer Zellkultur Methode – Vergleich von EGFP-Flag und BDNF-Flag transfizierten Colayer-Kulturen... 32
7.6 Transfektion ... 33
7.7 Screening verschiedener neurotropher Faktoren... 34
7.8 Immunzytochemie (ICC)... 35
7.9 Ermittlung der Anzahl dopaminerger Neurone in Mono- und Colayer ... 35
7.10 Immunzytochemische Doppelfärbungen der Kulturen ... 36
7.11 Sezernierung von BDNF-Flag... 37
7.12 Induktion des trkB-Rezeptors mit BDNF-Flag ... 37
7.13 SDS-Gelelektrophorese ... 38
7.14 BDNF Protokoll 1 Anti-Flag... 38
7.15 BDNF Protokoll 2 Anti-BDNF ... 38
7.16 Protokoll 3 trkB/ptrkB... 38
8. Methoden - Teil 2 ... 40
8.1 Embryopräparation von transgenen TH-GFP Mäusen... 40
8.2 Kultivierung von TH-GFP-positiven Neuronen... 40
8.3 Vorbereitungen für elektrophysiologische Untersuchungen TH-EGFP-positiver Neurone in vitro... 40
8.4 Präparation von Hirnschnitten der Ratte nach intrastriataler Transplantation mit EGFP- Flag transfizierten VM-Vorläuferzellen am embryonalen Tag E12 ... 41
8.5 Elektrophysiologische Untersuchung von intrastriatal transplantierten Gehirndickschnitten ... 42
8.6 Messung und Auswertung der Spontanaktivität... 43
8.7 Messungen der hyperpolarisations-aktivierten Rektifizierung in der Spannungsklemme und der Stromklemme ... 43
8.8 Ermittlung der Frequenzadaptation nach stufenweiser Depolarisation... 44
8.9 Charakterisierung einzelner Aktionspotentiale ... 45
8.10 Nachweis der gepatchten Zelle mit Biocytin ... 45
8.11 Immunhistochemischer Nachweis dopaminerger Neurone... 45
9. Ergebnisse –Teil 1 ... 47
9.1 Colayer versus Monolayer ... 47
9.2 Screening von Faktoren... 51
9.2.1 Screening von Faktoren in der Monolayer-Kultur ... 51
9.2.2 Screening von verschiedenen Faktoren in der Colayer-Kultur ... 52
9.3 BDNF-Flag versus EGFP-Flag transfizierter Colayer-Kulturen... 54
9.4 Sezernierung von BDNF ... 57
9.5 Phosphorylierung des trkB-Rezeptors... 59
III
9.6 Kolokalisation von transfizierten Zellen ... 60
10. Ergebnisse - Teil 2... 63
10.1 Immunzytochemische Untersuchung von in vitro VM-Kulturen aus transgenen TH- EGFP Mäusen ... 63
10.2 Untersuchung von TH-GFP Neuronen mittels stufenweiser Hyperpolarisation in der Stromklemme ... 63
10.3 Frequenzadaptation von TH-GFP-positiven Neuronen nach Depolarisation ... 66
10.4 Untersuchung der Spontanaktivität in den TH-GFP-positiven Neuronen ... 68
10.5 Charakterisierung einzelner Aktionspotentiale von TH-GFP-positiven Neuronen ... 69
10.6 Zusammenfassende Charakterisierung TH-GFP-positiver Neurone... 70
10.7 Immunhistochemische Untersuchung von Hirnschnitten nach intrastriataler Transplantation von EGFP-Flag transfizierten VM-Progenitorzellen ... 70
10.8 Charakterisierung intrastriatal transplantierter VM-Progenitorzellen der Ratte mittels stufenweiser Hyperpolarisation... 72
10.9 Frequenzadaptation von rektifizierenden Neuronen in akuten Hirnschnitten der Ratte ... 77
10.10 Spontanaktivität in den intrastriatal transplantierten Neuronen ... 80
10.11 Charakterisierung einzelner Aktionspotentiale von intrastriatal transplantierten Neuronen im Vergleich zu kultivierten TH-GFP-positiver Neuronen... 83
11. Diskussion - Teil 1 ... 86
11.1 Colayer versus Monolayer ... 87
11.2 Kolokalisation von transfizierten Zellen ... 89
11.3 Screening von Faktoren... 90
11.4 BDNF Colayer versus NT EGFP-Flag Colayer ... 92
11.5 Fazit ... 94
12. Diskussion - Teil 2 ... 95
12.1 Hyperpolarisations-Aktivierte Rektifizierung... 97
12.2 Frequenzadaptation ... 98
12.3 Spontanaktivität... 100
12.4 Aktionspotentiale ... 102
12.6 Fazit ... 103
13. Anhang ... 105
13.1 Zu 9.1 Colayer versus Monolayer ... 105
13.2 Zu 12.1 Diskussion –Teil 2 ... 107
14. Literaturverzeichnis... 108
Danksagung... 115
VI Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Da-Neurone in der adulten Ratte (Karkos, 1988)... 1
Abbildung 2: Drei Da Systeme im menschlichen Gehirn (Gerlach et al., 2007)... 2
Abbildung 3: Direkter und indirekter Weg des motorischen Systems der Basalganglien... 6
Abbildung 4: Mögliche Zellquellen bei der Zellersatztherapie... 9
Abbildung 5: Das ventrale Mesenscephalon eines murinen Pitx3-GFP Embryos... 30
Abbildung 6: Darstellung der Colayer-Kultur... 32
Abbildung 7: In vitro Kultur von TH-GFP-positiven Neuronen... 41
Abbildung 8: Begasungsvorrichtung für die akuten Gehirndickschnitte... 42
Abbildung 9: Auswertung des biphasischen Membranpotentialverlaufs in der Stromklemme... 44
Abbildung 10: Charakterisierung einzelner Aktionspotentiale... 45
Abbildung 11: TH-positive Zellen in Co- versus Monolayer... 48
Abbildung 12: Monolayer versus Colayer (n=4)... 49
Abbildung 13: EGFP-transfizierte Zellen in Co- und Monolayer... 50
Abbildung 14: Prozentuale Darstellung der Anzahl der Da-Neurone nach Transfektion mit verschiedenen überexprimierenden neurotrophen Faktoren. Normiert wurden die Da-Neurone auf die Anzahl der EGFP-Flag transfizierten Gruppe. Die empty-transfizierte Gruppe dient als Kontrolle. Signifikanzen wurden mit dem gepaartem t-Test ermittelt... 52
Abbildung 15: Vergleich der Anzahl Da-Neurone von Colayer-Kulturen nach Transfektion mit verschiedenen überexprimierenden neurotrophen Faktoren... 53
Abbildung 16: Western Blot von Medien aus Colayer-Kulturen transfiziert mit verschiedenen neurotrophen Faktoren nach zwei und vier Tagen Differenzierung... 54
Abbildung 17: EGFP-Flag und BDNF-Flag transfizierte Zellen in der Colayer... 55
Abbildung 18: Ermittlung TH-positiver Neurone in EGFP-Flag und BDNF-Flag transfizierten Zellen in der Colayer nach 4-6Tagen Differenzierung... 57
Abbildung 19: Western Blot Proben aus Überständen nach zwei Tagen Differenzierung von EGFP-Flag und BDNF-Flag überexprimierenden Zellen in der Colayer... 58
Abbildung 20: Induktion von Zellen mit Überständen aus EGFP-Flag und BDNF-Flag transfizierten Zellen der EP 7 nach zwei Tagen Differenzierung... 60
Abbildung 21: Überlagerung von EGFP-Flag (Grün) transfizierten Zellen... 61
Abbildung 22: Das prozentuale Verhältnis EGFP-Flag transfizierter Da-Neurone... 62
Abbildung 23: TH-GFP positive Neurone in vitro nach 6 Tagen Differenzierung... 63
Abbildung 24: Biphasischer Membranpotentialverlauf in der Current-Clamp Konfiguration. 65 Abbildung 25: Hyperpolarisations-aktivierter IH-Strom der Da-Neurone in der Spannungsklemme... 66
Abbildung 26: Frequenzadaptation TH-GFP-positiver Neurone... 68
Abbildung 27: Spontanaktive TH-GFP-positive Neurone in vitro... 69
Abbildung 28: EGFP-Flag transfizierte Transplantate nach intrastriataler Transplantation... 71
VII
Abbildung 29: Biocytin markierte Neurone nach Ganzzellableitung in akuten
Hirnschnitten... 72 Abbildung 30: Hyperpolarisation in der Current-Clamp und der Voltage-Clamp
Konfiguration für intrastriatal transplantierte VM Neurone... 74 Abbildung 31: Auswertung des biphasischen Membranspannungsverlauf von 83 intrastriatal transplantierten Neuronen nach Wartezeiten von 3 bis 19 Wochen nach Transplantation... 76 Abbildung 32: Biphasisches Membranpotential hyperpolarisierter Neurone abgeleitet in Hirnschnitten intrastiatal transplantierter VM-Progenitorneurone... 77 Abbildung 33: Frequenzadaptation intrastriatal transplantierter Neurone... 79 Abbildung 34: Spontanaktivitäten intrastriatal transplantierter Neurone mit
hyperpolarisations-aktivierten einwärtsgerichtetem Strom... 81 Abbildung 35: Spontanaktivitäten nicht-rektifizierender, intrastriatal transplantierter Neurone... 82 Abbildung 36: Zusammenstellung der Aktionspotentialeigenschaften für TH-GFP- positive Neurone in vitro, intrastriatal transplantierte rektifizierende und nicht-
rektifizierende Neurone... 85
VIII Tabellenverzeichnis
Tabelle 1. Zusammenstellung ausgewählter BDNF Experimente in vivo und in vitro und deren Effekte auf das Überleben, die Plastizität und Differenzierung Da-Neurone. ... 15 Tabelle 2: Neurotrophe Faktoren überexprimierende Plasmide zur Nukleofektion von
Progenitorzellen in den Colayer-Kulturen. ... 34 Tabelle 3: Neurotrophe Faktoren überexprimierende Plasmide zur Lipofektamintransfektion von Progenitorzellen. ... 35 Tabelle 4. Einteilung von Signifikanzen nach p-values. ... 36 Tabelle 5: Antikörper zur Identifizierung verschiedener Zelltypen im
Kolokalisationsexperiment zu EGFP-positiven Zellen. ... 37 Tabelle 6: Auflistung der transfizierten Zellen relativ zu der Gesamtzellzahl in der Colayer oder Monolayer. ... 50 Tabelle 7: Auflistung der Colayer Experimente mit BDNF-Flag und EGFP-Flag... 56 Tabelle 8: Quantitative Auswertung von sezerniertem BDNF-Flag Protein in Überständen nach 2 Tagen Differenzierung... 59 Tabelle 9: Eigenschaften der Aktionspotentiale TH-GFP-positiver Neurone. ... 70 10.6 Zusammenfassende Charakterisierung TH-GFP-positiver Neurone... 70 Tabelle 11: Auflistung der Zellzahlen der unterschiedlichen Kulturmethoden in vier
verschieden Experimenten, sowie der Proliferationsrate nach drei Tagen in Differenzierung.
... 105 Tabelle 12: Zusammenfassung der Ergebnisse. ... 107
IX Abkürzungsverzeichnis
6-OHDA 6-Hydoxydopamine
AHP Afterhyperpolarisation
anti-GFAP Glial fibrillary acidic protein
AP Aktionspotentiale
APS Ammonium Persulfat
ART Artemin
ATP Adenosintriphosphat
BDNF Brain derived neurotrophic factor
BG Basalganglien
BSA Bovine serum albumin
Ca2+ Calcium
CaCl2 Calciumchlorid
COMT Catechol-O-Methyl-Transferasen
CDNF Conserved dopamine neurotrophic factor
Da dopaminerger
DA Dopamin
DAPI 4', 6-diamidino-2-phenylindole
DAT DA-Transporter
DMEM Dulbecco’s Modifizierte Medien
E Embryonaler Tag
EDTA Ethylendiamin-tetraacetat
EGFP Enhanced green fluorescent protein EGTA Ethylenglycol –tetraessigsäure
ERK Extracellular-signal Regulated Kinases
EP Embryonenpräparation
ES Embryonale Stammzellen
FCS Fetal calf serum
FGF Fibroblast Growth Factor
GABA Gamma-aminobutyric acid
GDNF Glial cell-derived neurotrophic factor
X
GFRα GDNF family receptor
GFAP Glial fibrillary acidic protein GFP Green fluorescent protein
GDNF Glial cell-derived neurotrophic factor GPi Globus pallidus internus
GPe Globus pallidus externus
GTP Guanisintriphosphat
HCN Hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-modulated HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl) - 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HMW High molecular weight
Hrp Horseradish peroxidise; Meerrettichperoxidase
Hz Hertz
I Strom
IH -Strom Hyperpolarisations-aktivierter Einwärtsstrom IV-Kurven Strom-Spannungskurven
IPS idiopathische Parkinson Syndrom
K+ Kalium
KCl Kaliumchlorid
L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine
MANF Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor
MAO Monoamin-Oxidase
MAP mitogen-activated protein
Mg2+ Magnesium
MgCl2 Magnesiumchlorid
MPTP 1-Methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridin
MPP 1-methyl-4-phenylpyridine
mV Millivolt
Na+ Natrium
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat
XI NeuN Neuronal nuclear antigen
NGF Nerve growth factor
n.s. Nicht signifikant
NT Neurotrophin
NTN Neurturin
NGS Normal goat serum
PBS Phosphatpuffer
PFA Paraformaldehyd
PPN Pedunculopontiner Nucleus
PSP Persephin
rBDNF rekombinantes BDNF
R Widerstand
RMP Ruhemembranpotenzial
SN Substantia nigra
SPRD Sprague-Dawley
STN Nucleus subthalamicus
TBS Tris- gepufferte Saline
TH Tyrosinhydroxylase
TrkB Tyrosine-related kinase B trk-Rezeptor tropomyosin receptor kinase
U Spannung
VM ventralen Mesencephalon
VTA ventralen Tegmentum; ventral tegmental area
VMZ Vorläuferzellen aus dem fötalen ventralen Mesencephalon
XII
Zusammenfassung
Charakterisierung genetisch modifizierter dopaminerger Progenitorzellen in vitro und in situ – immunzytochemische, biochemische und elektrophysiologische Untersuchungen Meltem Özer
Morbus Parkinson ist gekennzeichnet durch den Verlust dopaminerger (Da) Neurone in der Substantia nigra (SN). Dadurch kommt es zu motorischen Störungen wie Tremor (Zittern), Akinese (Verlust von Bewegung), Bradykinese (verlangsamte Bewegung) und Rigor (Muskelsteifheit). Bei der Zellersatztherapie werden die degenerierten Neurone ersetzt, wodurch das Da System restauriert und regeneriert wird. Embryonale Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon (VM) wurden in verschiedenen in vivo Studien in das Striatum transplantiert und zeigten Verbesserungen der motorischen Fähigkeiten. Trotzdem ist die Zellersatztherapie mit diesen Zellen durch ihre geringe Verfügbarkeit umstritten, da bei einer Transplantation in das Striatum eines Parkinson-Patienten sechs bis acht Föten benötigt werden. Ein weiteres Problem stellt das geringe Überleben der transplantierten Zellen, das nur 1-5 % beträgt, dar.
Ziel der Arbeit war es, embryonale Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon in vitro zu expandieren und zu differenzieren, so dass die Zellen vor der Transplantation eine erhöhte Anzahl von Da-Neuronen und ein verbessertes Überleben nach der Transplantation aufweisen. Mittels Nukleofektion wurden VM-Vorläuferzellen mit BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) überexprimierenden Plasmiden transfiziert. Als Reportersequenz enthielt das Plasmid ein Flag-Epitop, welches mit einem Antikörper detektiert werden konnte.
Nukleofektion ist eine effektive, nicht-virale Transfektionsmethode, bei der allerdings 60 % der dopaminergen Neurone in der Kultur absterben. Die sogenannte Colayermethode erlaubt es, nur ein Drittel der Zellen abzulösen und zu transfizieren, wodurch zwei Drittel der Zellen in der Kultur unberührt bleiben. Die Anzahl der Da-Neurone unterscheidet sich dann nicht mehr von unbehandelten Zellen. Auch wenn nur ein Drittel der transfiziert wurde, wirkt das sezernierte BDNF-Flag Protein positiv auf das Überleben und die Differenzierung der Da- Neurone, da dieser an den trkB-Rezeptor der Da-Neurone bindet und Signalwege induzieren kann. Die anderen neurotrophen Faktoren, GDNF (Glial cell-line derived neurotrophic factor), MANF (Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor) und CDNF (Cerebral dopamine neurotrophic factor) unterschieden sich in der Anzahl der Da-Neurone nicht
XIII
signifikant von der Kontrolle. Gemeinsam bietet die Colayerkultur mit der Transfektion von BDNF-Flag eine Möglichkeit, die Anzahl der Da-Neurone in vitro um ca. 30 % zu erhöhen.
Die Transplantation der Da-Neurone resultiert in einer Verbesserung der motorischen Fähigkeiten, welche durch eine Überkompensation in Amphetamin-Induzierten Rotationsexperimenten verdeutlicht wird. (Ratzka A, 2012) Dennoch ist wenig über die elektrophysiologischen Eigenschaften der Da-Neurone nach Transplantation bekannt. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften intrastriatal transplantierter Da-Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) lädierte Sprague Dawley Ratten intrastriatal mit transfizierten fötalen mesencephalen Progenitorzellen transplantiert. Mit Hilfe von Enhanced green fluorescent protein (EGFP)-Flag Transfektion ist es möglich, die Transplantate auch noch bis zu 19 Wochen nach Transplantation zu detektieren. Vergleichend wurden Tyrosinhydroxylase (TH)-EGFP Vorläuferzellen aus transgenen Mäusen untersucht, die eine direkte Ableitung von markierten Da-Neuronen in dissoziierten Kulturen erlauben.
Zusammengefasst kann man sagen, dass Da-Neurone charakteristische Merkmale aufweisen.
Besonders kennzeichnend ist der hyperpolarisations-aktivierte Einwärtsstrom der bei einem Membranpotential ab -100 mV und darunter auftritt. Dieser konnte sowohl für TH-GFP Neurone in vitro als auch für intrastriatal transplantierte Neuronen gezeigt werden. Die Gruppe der Neurone mit hyperpolarisations-aktivierten rektifizierendem Strom zeigen Frequenzadaptation, die denen der TH-GFP positiven ähneln, aber in ihrer Ausprägung stärker variieren. In vitro und in intrastriatal transplantierten Neuronen konnten relativ deutliche Schrittmachereigenschaften gemessen werden, welches ein weiteres Merkmal für Da-Neurone darstellt. In den intrastriatal transplantierten Neuronen konnten insgesamt mehr spontan aktive Neurone abgeleitet werden als in vitro. Die TH-GFP positiven Neurone in vitro waren gekennzeichnet durch breite Aktionspotentiale mit großen Nachhyperpolarisationsamplituden. Diese konnte auch für alle intrastriatal transplantierten Neurone nachgewiesen waren.
Zusammengefasst kann man sagen, dass die analysierten Neurone in den Hirnschnitten ähnliche elektrophysiologische Eigenschaften zeigen wie Da-Neurone der TH-GFP Kultur in vitro. Zudem stimmen die Eigenschaften der untersuchten intrastriatal transplantierten Neurone mit denen der Literatur über Da-Neurone in der SN in vivo überein (Richards et al.,
XIV
1997). Unsere Daten zeigen die elektrophysiologische Funktionalität transplantierter Da- Neurone noch 3-19 Wochen nach Transplantation.
XV
Abstract
Characterisation of genetically modifies dopaminergic progenitor cells in vitroand in situ- immunocytochemical, biochemical and electrophysiological study
Meltem Özer
Parkinson’s disease is characterized by a severe loss of Da-neurons in the SN, resulting in Tremor, Akinesia, Bradykinesia, and Rigor. Cell transplantation represents a possibility to restore and repair the DA system. Embryonic progenitor cells derived from the VM and grafted to the striatum, improved motor skills in vivo and clinical studies, though cell replacement therapy is debatable, because six to eight foetuses are required for grafting and the survival rate is rather low (1-5 %).
The aim of my study is to increase the number of Da-neurons by different methods in vitro, to achieve a higher number of surviving Da-neurons in grafts in vivo. Nucleofection is an effective, non-viral transfection method, because it leads to an increased cell number compared to other methods. The colayer method allows the transfection of only one third of the cells while the rest stays untouched. The amount of Da-neurons doesn’t differentiate from the other cells. The transfection with BDNF-flag plasmid increases the number of Da-neurons through binding to the trkB-receptor. No differences in the cell number where seen compared to other neurotrophic factors like GDNF, MANF, and CDNF.
So far, there is only little data on the electrophysiological characteristics of Da-neurons after grafting. Therefore I transplanted transfected mesencephalic progenitor cells into the striatum of 6-OHDA lesioned rats. With EGFP-flag transfection it is possible to detect the grafts for up to 19 weeks post grafting. We analyzed TH-EGFP progenitor cells of transgenic mice, which allow a direct recording of marked Da-neurons in dissociated cultures, and compared these results to the previous ones.
Da-neurons have characteristic properties including the hyperpolarisation-activating IH- current, which shows membrane potentials of -100 mV and less. I detected this IH –current for TH-GFP neurons in vitro and for the intrastriatal grafted neurons. The neurons with hyperpolarisation-activated rectifying current show frequency adaptation and are similar to the TH-GFP-positive neurons. However, they variegate more. I determined pacemaker activity in vitro and in the intrastriatally grafted neurons, which is another characteristic of
XVI
Da-Neurons. The grafted neurons showed more spontaneously active neurons than those in vitro. The TH-GFP-positive neurons had wider APs with large AHPs.
To conclude, the analyzed neurons in the brain slices in vivo had similar characteristics to the cultured TH-GFP-positive neurons (Richards et al., 1997). My data displays the electrophysiological functionality of grafted Da-neurons between 3 and 19 weeks after grafting.
1 1. Einleitung – Allgemein
1.1 Morbus Parkinson
Morbus Parkinson ist gekennzeichnet durch den Verlust dopaminerger (Da-) Neurone in der Substantia nigra (SN). Das führt zu einer Störung des nigrostriatalen Signalwegs, welcher hauptsächlich an der Kontrolle willkürlicher Bewegungen beteiligt ist. Charakterisiert ist Morbus Parkinson durch die beschriebenen Symptome von Tremor (Zittern), Akinese (Verlust von Bewegung), Bradykinese (verlangsamte Bewegung) und Rigor (Muskelsteifheit). Erst nach Degeneration von 60-80 % der Da-Neurone der SN kommt es zur Ausprägung der ersten Symptome, beginnend mit einem einseitigen Tremor welcher sich über den weiteren Verlauf der Krankheit auch auf die andere Seite ausdehnt. Anschließend folgt ein vorne hinüber gebeugter Gang, eine generalisierte Verlangsamung, Kleinschrittigkeit und schließlich Rigor.
Abbildung 1: Da-Neurone in der adulten Ratte (Karkos, 1988).
Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es verschiedene Da Zellgruppen. Im Mesencephalon entspringen die Da-Neurone der Gruppe A8 der Formatio reticularis lateralis, die Gruppe A9 aus der SN pars compacta sowie die Gruppe A10 aus dem ventralen Tegmentum (VTA, ventral tegmental area).
Im Diencephalon gibt es die Gruppen A11 bis A15. A11 liegen in dem lateralen und posterioren Hypothalamus, A12 im Nucleus infundibulus, A13 in der Zona incerta und A14 und 15 im medialen und vorderen Hypothalamus. A16 sind die Da-Neurone des Bulbus olfactorius sowie A17 der Retina (Karkos, 1988). Diese bilden verschiedene Da Systeme, die in Abbildung 2 sichtbar gemacht sind.
Abbildung 2: Drei Da Systeme im menschlichen Gehirn (Gerlach et al., 2007).
In rot dargestellt ist die Projektion des nigro-striatalen Weges von der SN in das Striatum. Ausgehend von der VTA ist, hier in Grün dargestellt, der meso-limbische und meso-kortikale Weg, sowie der tubero-infundibulare Weg, der im Hypothalamus mündet, zu sehen.
Die Da-Neurone im nigro-striatalen Weg haben ihren Ursprung in der SN pars compacta und projizieren in das Striatum, welches unterteilt ist in Nucleus caudatus und Putamen. Dieses System spielt eine Rolle in der Motorik.
Im meso-limbischen und meso-kortikalen System projizieren Da-Neurone von der VTA in den Nucleus accumbens, den Tractus olfactorium, den frontalen und enthorinalen Kortex, sowie den Gyrus cinguli. Über letzteren wird eine Beteiligung an Lern- und
Gedächtnisfunktionen angenommen. Das tubero-infundibulare System innerviert den Hypothalamus und kontrolliert die Freisetzung der Hypophysenhormone (Gerlach et al., 2007).
Neben dem Verlust der Da-Neurone in der SN, ist das Auftreten von sogenannten Lewy Körperchen charakteristisch für die Parkinson Erkrankung. Lewy Körperchen bestehen aus intermediären Filamenten. Diese beinhalten Ubiquitin und α-Synuclein. Allerdings ist es nicht geklärt, wie die Ablagerungen mit dem Verlauf der Krankheit im Zusammenhang stehen. Die Arbeitsgruppe von (Braak et al., 2003) teilte das Auftreten und die Verteilung der Lewy Körperchen in den verschiedenen Stadien der Parkinson Erkrankung ein. Somit beginnt die Bildung von Ablagerungen noch vor Auftreten der ersten Symptome im Bulbus olfactorius und der Medulla oblangata. Nach dem Eintreten der ersten Symptome sind die Lewy Körperchen im Mittelhirn und dem basalen Vorderhirn anzutreffen. Im Endstadium verteilen sich die Ablagerungen auch auf den telenzephalen Kortex. Vorhergehende Arbeiten zeigten, dass auch die Neurodegeneration entsprechend der Plaquebildung im Bulbus olfactorius beginnt, im weiteren Verlauf sich auf das Stammhirn ausdehnt und erst im relativ späten Stadium das Mittelhirn erreicht (Arenas, 2010).
Aufteilen lässt sich die Krankheit in das idiopathische Parkinson Syndrom (IPS), sowie das sekundäre Parkinson Syndrom (Pseudoparkinson). IPS ist die primäre Form von Parkinson und beginnt eher im Alter zwischen 50 und 60 Jahren. 95 % der Morbus Parkinson Fälle treten sporadisch auf. Die Hintergründe der Neurodegeneration sind nicht im Detail geklärt.
Jedoch wird angenommen, dass oxidativer Stress, Mitochondrien-Dysfunktion, gestörte/r Proteinfaltung und -abbau durch einen fehlerhaften Ubiquitin-Proteosom Komplex sowie Mangel an neurotrophen Faktoren zu Neurodegeneration beim Parkinson führen (Hawkes et al., 2009).
Bei Pseudoparkinson handelt es sich um eine Erkrankung die motorische Symptome von Morbus Parkinson aufweist aber nicht zwangsweise von der Degeneration dopaminerger Neurone verursacht wird. Gründe für das Auftreten können zum einen die Einnahme von Medikamenten wie beispielweise Neuroleptika (bei psychischen Erkrankungen) oder Antiemetikum (gegen Übelkeit) sein. Diese wirken sich auf das dopaminerge System aus indem sie zum Beispiel als Dopaminrezeptorantagonisten wirken und so Pseudoparkinson auslösen (Gerlach et al., 2007). Pseudoparkinson kann auch durch Traumata induziert werden,
die durch Mikrohämatome in den Basalganglien, und der einhergehenden Störung, hervorgerufen werden. Zum anderen tritt Pseudoparkinson auch als Folge von Vergiftungen auf. Ein Beispiel ist das Neurotoxin MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3,6-tetrahydropyridin) wobei es um ein Nebenprodukt einer Designerdroge-MPPP handelt. MPTP wird durch das Enzym Monoamin-Oxidase (MAO) in eine reaktive Form 1-Methyl-4-phenylpyridin (MPP) umgewandelt. Monoaminoxidasen wirken speziell auf catecholaminenergen Neurone, da sie dort vorkommen, so auch auf die catecholaminergen Da-Neurone (Javitch et al., 1985). MPTP wird neben 6-Hydoxydopamin (6-OHDA), welches in Abschnitt 1.3 weiter ausgeführt wird, als selektives Neurotoxin zur Generierung eines Rattenmodels für Morbus Parkinson genutzt (Gerlach et al., 2007).
1.2 Motorisches System
Wie vorhergehend erwähnt, kommt es erst nach Degeneration von 60-80% der Da-Neurone der SN zur Ausprägung der ersten Symptome. Der Grund ist die Fähigkeit der verbleibenden Da-Neurone den Mangel an Dopamin (DA) durch erhöhte Ausschüttung des Transmitters zu kompensieren. Kommt es durch die weitere Degeneration schließlich zu einem DA-Mangel, wird das motorische System stark beeinträchtigt. Bei der Synthese von DA wird Tyrosin im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt mittels der Tyrosinhydroxylase (TH) zu der Dopaminvorstufe L-Dopa umgewandelt. Eine Decarboxylase bildet aus dieser Vorstufe dann DA, welches in synaptischen Vesikeln gespeichert wird. Bei Stimulation wird DA Kalzium- abhängig in den synaptischen Spalt entlassen. An der Postsynapse aktivieren sie G-Protein abhängige Dopaminrezeptoren (D1, D2) welche intrazelluläre Signalwege induzieren. Die Inaktivierung von DA erfolgt hauptsächlich über die Wiederaufnahme aus dem synaptischen Spalt durch den DA-Transporter (DAT) oder den Abbau von Dopamin im synaptischen Spalt über Catechol-O-Methyl-Transferasen (COMT) und MAO (Kandel ER and JH, 1996, Gerlach et al., 2007).
Die Basalganglien (BG) stellen im motorischen System ein Level in der Kontrolle der willkürlichen Bewegungen dar. Hier wird über Bewegung entschieden und diese gefiltert. Die Basalganglien induzieren über den Thalamus den motorischen Kortex, der die Bewegungsausführung weiter umsetzt und letztlich durch die Stimulation der Motoneurone des Stammhirns und des Rückenmarks ausführen lässt. Somit sind die BG eine wichtige Stufe
bei der Generierung von willkürlichen Bewegungen. Zu den BG gehören Striatum (Nucleus caudatus und Putamen), Globus pallidus internus (GPi) und externus (GPe) und Nucleus subthalamicus (STN). Funktionell zählt man die SN pars reticulata und den Thalamus hinzu.
Die Basalganglien erhalten Informationen aus dem cerebralen Kortex und senden ihrerseits über den Thalamus Impulse zurück zum cerebralen Kortex. Dieser Regelkreis wird reguliert über einen direkten und einen indirekten Signalweg (Abbildung 3).
Durch den indirekten Signalweg wird der Thalamus tonisch über den GPi und die SN gehemmt. Wird das Striatum phasisch erregt, aktiviert das den direkten Signalweg. Tonisch aktive Neurone des GPi werden vom Striatum inhibiert, wodurch die Inhibierung des Thalamus aufgehoben wird, was zu einer Aktivierung des Kortex führt. Aktivierung des indirekten Weges verstärkt wiederum die Inhibierung des Thalamus, was eine erniedrigte Erregung des Kortex zur Folge hat. Somit führen die Aktivierung des direkten Wegs zu Bewegung und die Aktivierung des indirekten Wegs zu Inhibierung von Bewegungen.
Die Da-Neurone der SN pars compacta haben eine unterschiedliche Wirkung auf das Striatum. Die D1- Rezeptoren sind exzitatorisch und fördern die Signalweiterleitung über den direkten Signalweg. Der exzitatorische Stimulus im Striatum führt zu der Inhibierung des GPi, wodurch die Inhibierung des Thalamus gehemmt wird, der in Folge dessen aktiv werden kann, und seinerseits den Kortex aktiviert. Die D2-Rezeptoren haben über den indirekten Signalweg einen inhibierenden Effekt auf die Signalweiterleitung. Durch die Hemmung des Striatums wird die Hemmung des GPe aufgehoben. Dadurch kommt es zu einer verstärkten Inhibierung des STN und damit zu einer verringerten Erregung des GPi. Dadurch wird die Inhibierung des Thalamus über den GPi aufgehoben und der Kortex wird aktiviert (Kandel ER and JH, 1996, Cesnulevicius et al., 2006) wenn die Da-Neurone unterschiedlich auf das Striatum einwirken, haben sie letztlich dieselbe aktivierende Wirkung auf den Kortex. In Abbildung 3 ist sowohl der gesunde, als auch der gestörte Regelkreis bei Morbus Parkinson dargestellt.
Abbildung 3: Direkter und indirekter Weg des motorischen Systems der Basalganglien.
Die Stimulation des direkten Weges und die Inhibierung des indirekten Weges durch die Da-Neurone der SN pars compacta führen in beiden Fällen letztlich zur Aufhebung der Inhibition des Thalamus und zur Aktivierung des Kortex. Kommt es wie beim Morbus Parkinson zu Depletion von DA, resultiert das in einer verstärkten Aktivierung des indirekten und Inhibierung des direkten Wegs, was zu einer erhöhten Inhibition des Thalamus und daher einer reduzierten Stimulation des cerebralen Kortex führt.
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Beim Morbus Parkinson fehlt die exzitatorische Stimulation des direkten Signalweges über D1-Rezeptoren und die Inhibition des indirekten Signalweges über den D2-Rezeptor.
Dadurch kommt es zu einer Überaktivierung des indirekten Weges und einer verminderten Aktivität des direkten Wegs. Folge ist eine verstärkte Stimulation des GPi durch den überaktiven STN, was zu einer verstärkten Inhibition des Thalamus führt, wodurch die Stimulation des motorischen Kortex reduziert wird. Das führt dann zu den Symptomen wie Bradykinese und Akinese (Kaji et al., 2005).
1.3 6-OHDA-Rattenmodell zur Untersuchung von Morbus Parkinson
6-OHDA ist ein Neurotoxin, das eingesetzt wird um im Rattenmodel die Erkrankung Morbus Parkinson nachzuahmen (Ungerstedt, 1968).
Durch die Injektion von 6-OHDA in das Vorderhirnbündel wird dieses durch den Monoamin- Transporter spezifisch in präsynaptische Da-Neurone transportiert. Durch die Inhibierung von Enzymen der Atmungskette werden selektiv Da-Neurone zerstört. In der Regel erfolgt die 6- OHDA Läsion einseitig, wodurch ein Ungleichgewicht der zwei Hemisphären hinsichtlich ihrer DA-Konzentration auftritt. Zudem kommt es in der lädierten Seite zu einer verstärkten Exprimierung des D2-Rezeptors. Das führt nach einer Induktion mit Amphetamin, welches zu
einer DA-Freisetzung im innervierten Striatum führt, zu einer Drehbewegung der Ratte in Richtung der Läsion (ipsilateral), während die Verabreichung eines DA-Agonisten (Apomorphin) zu einer kontralateralen Rotation der lädierten Ratte (von der lädierten Seite weg) führt (Gagnon et al., 1991). Dieses Medikamenteninduzierte Drehverhalten der Ratte wird ausgenutzt um den Grad der Läsion zu charakterisieren. Nach Transplantation von Da- Neuronen in das dopamindenervierte Striatum kann durch reduziertes Rotationsverhalten außerdem der Grad der Erholung Striatum gemessen werden. Nach Transplantation wird das reduzierte DA durch die transplantierte Neurone ersetzt, wodurch es zu einer Reduktion in der Medikamenteninduzierten Rotation kommt. (Hudson et al., 1993).
1.4 Therapie des Morbus Parkinson
Es gibt verschiedene Therapiemöglichkeiten beim Morbus Parkinson. Die medikamentöse Therapie kommt standardmäßig zum Einsatz; die Tiefe Hirnstimulation ist inzwischen ebenfalls ein gängiges klinischen Verfahren, während die Zellersatztherapie sich noch im experimentellen Stadium befindet.
1.4.1 Medikamentöse Therapie
Bei der medikamentösen Therapie erreicht man eine Linderung motorischer Symptome wie Tremor und Akinese mit der Verabreichung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), einer Dopaminvorstufe, die die Blut-Hirnschranke passieren kann. L-DOPA wird dann durch die Dopadecarboxylase in DA umgewandelt und ersetzt so das fehlende DA. Häufige Nebenwirkungen sind das Auftreten von Übelkeit und in seltenen Fällen neuropsychiatrische Symptome, wie Halluzinationen. Die Nebenwirkungen sind Folge der peripheren Umwandlung der Dopaminvorstufe in DA. Gegenwärtige Präparate enthalten daher einen Decarboxylasehemmer, welcher die Bluthirnschranke nicht passieren kann, wodurch eine periphere Umwandlung des L-DOPA verhindert wird. Problematischer als die direkt eintretenden Nebenwirkungen sind die verzögerten Effekte. Innerhalb von 5-10 Jahren, nach der sogenannten “honey-moon“-Phase, kommt es zu immer kürzeren Wirkphasen (wearing off-Phase) bis zur einer vollständigen Wirkungslosigkeit (end of dose-effect) von L-DOPA.
Zusätzlich kommt es zu einem vermehrten Auftreten von Dyskinesien (Gerlach et al., 2007).
Zu einer anderen Wirkstoffgruppe gehören MAO-B-Hemmer, welche allein oder in
Kombination mit L-DOPA verabreicht werden. Diese hemmen den Abbau von DA und sorgen so für eine längere Verfügbarkeit von DA (Diaz and Waters, 2009).
COMT-Hemmer werden gemeinsam mit L-DOPA verabreicht. Sie hemmen das Enzym Catechol-O-Methyl-Transferase, welches DA und L-DOPA abbaut. Auch hier ist L-DOPA dadurch länger verfügbar. Vorteil der Kombinationstherapien ist vor allem die Möglichkeit, die L-DOPA Gabe zu reduzieren und dadurch das Auftreten von Dyskinesien zu verzögern.
Durch die geringere Fluktuation von L-DOPA und die gleichmäßigere DA-Verfügbarkeit werden Dyskinesien zusätzlich reduziert (Hametner et al., 2010, Yuan et al., 2010) . Als Nebenwirkung von COMT-Hemmern tritt allerdings häufig Diarrhö auf. Auch Leberschädigungen zählen zu den möglichen Nebenwirkungen (Yuan et al., 2010, Diaz and Waters, 2009).
In der Frühphase des Morbus Parkinson werden auch DA-Rezeptoragonisten verabreicht, welche die DA-Rezeptoren (D1 oder D2) stimulieren. Durch die Verabreichung von DA- Rezeptoragonisten verhindert man die übermäßige Produktion von DA in den verbleibenden Da-Neuronen. Die DA-Synthese führt durch die Bildung von Radikalen zu erheblichem oxidativen Stress, welches die weitere Degeneration der Da-Neurone noch beschleunigt.
Somit wirken die Agonisten antioxidativ und bis zu einem gewissen Grad neuroprotektiv, wodurch der Krankheitsverlauf abgemildert werden könnte. Auch die durch L-DOPA eintretenden Nebenwirkungen werden verzögert, da L-DOPA weitaus später im Krankheitsverlauf verabreicht werden kann. Allerdings können auch bei DA-Agonisten enorme Nebenwirkungen wie Hypersexualität, Übelkeit und Schwindel auftreten (Gerlach et al., 2007, Diaz and Waters, 2009).
1.4.2 Tiefe Hirnstimulation
Die Tiefe Hirnstimulation kommt in der späten Parkinsonphase zum Einsatz, wenn die medikamentöse Behandlung keine Wirkung mehr zeigt und der Patient nicht über 75 Jahre alt ist. Bei der Tiefen Hirnstimulation werden bestimmte Hirnareale elektrisch stimuliert. STN und GPi sind Hauptzielorte für die Behandlung. Durch die Stimulation des STN zeigen sich Verbesserungen der Symptome Tremor, Rigor und Bradykinese. Die Gabe von L-DOPA kann verringert werden, sodass die Reduktion von L-DOPA auch das Auftreten von Dyskinesien stark reduziert. Die Auswahl der Patienten ist allerdings sehr wichtig, da es in manchen Fällen
nach Behandlung zu Depressionen, Verwirrtheit und andere Veränderungen kommen kann (Hamani and Nóbrega, 2010, Gerlach et al., 2007, Diaz and Waters, 2009).
1.4.3 Transplantation von Stammzellen
Die Zellersatztherapie bietet, im Gegensatz zu den bisher erwähnten Therapien, nicht nur eine Behandlung von Symptomen wie Akinese, Tremor und Rigor, sondern auch eine restaurierende und regenerierende Wirkung auf das DA System. Verschiedene klinische Studien zeigen eine verbesserte Symptomatik bei Dyskinesien nach Transplantationen. Die Behandlung von L-DOPA konnte stark reduziert und in manchen Fällen sogar vollständig eingestellt werden (Freed et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass es nach Transplantation von Zellen aus dem embryonalen ventralen Mesencephalon (VM) zu einer Innervierung des Striatums kommt und zu der Ausschüttung von DA. Als Zellquelle gäbe es neben den embryonalen VM Zellen noch weitere Möglichkeiten. Wie in Abbildung 4 gezeigt, gibt es neben der Zellen aus fötalem VM, embryonale Stammzellen, Stammzellen aus dem adulten Knochenmark sowie aus bestimmten adulten Gehirnarealen, wie Gyrus dentatus des Hippocampus und Bulbus olfactorius. Alle Zellquellen haben gemeinsam, dass es sich dabei um proliferierende Zelltypen handelt, die zu Da-Neuronen differenziert werden können.
Abbildung 4: Mögliche Zellquellen bei der Zellersatztherapie.
Proliferierende undifferenzierte Zellen können als Quelle für die Zellersatztherapie dienen. ES aus Blastozyten sind pluripotent und können daher zu jedem Zelltyp differenziert werden. Vorläuferzellen aus dem VM haben den Vorteil, dass sie als neuronale Vorläuferzellen vordeterminiert sind, sich zu Neuronen und Gliazellen zu differenzieren. Adulte Stammzellen stellen eine leicht zugängliche Alternative für ES dar. Jeder Zelltyp birgt neben den Möglichkeiten auch Risiken wie Tumorbildung, vor allem bei ES, aber auch Abstoßungsreaktionen.
1.4.3.1 Embryonale Stammzellen (ES) und adulte Stammzellen
Embryonale Stammzellen werden aus Blastozyten gewonnen. Sie sind in der Lage, zu proliferieren und zu jedem Zelltyp zu differenzieren, also auch in neuronale Vorläuferzellen.
Zur Differenzierung werden Faktoren genutzt wie Fibroblast Growth Factor (FGF) 8 und Sonic hedgehoc. Allerdings birgt die Transplantation von ES, die enorme Proliferationsfähigkeit, sowie Pluripotenz aufweisen, die Gefahr von Tumorformationen (Laguna Goya et al., 2008). Auch das adulte Gehirn besitzt Gehirnareale wie den Bulbus olfactorius, die subventrikuläre Zone und den Gyrus dentatus des Hippocampus, die weiterhin multipotente, proliferierende Zellen aufweisen. Diese neuronalen Stammzellen differenzieren zu Neuronen, aber auch zu Gliazellen. Leichter zugänglich sind somatische Stammzellen, beispielsweise aus dem Knochenmark. Gewonnen aus Parkinsonpatienten würden Da- Neurone, differenziert aus somatischen Stammzellen, den Vorteil leicht zugänglicher und nicht immunreaktiver Zellquellen darstellen (Hermann et al., 2004).
Allerdings ist die Differenzierung von somatischen Stammzellen zu Da-Neuronen noch nicht völlig verstanden (Barzilay et al., 2008) und es ist noch unklar, ob die Transplantation somatischer Stammzellen, ähnlich wie ES, Tumore bildet.
1.4.3.2 Vorläuferzellen aus dem fötalen ventralen Mesencephalon (VMZ)
Embryonale Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon wurden in vielen verschiedenen Studien in das Striatum transplantiert und zeigten Verbesserungen der motorischen Fähigkeiten (Dunnett et al., 1981). Das Transplantat innerviert das Striatum und sorgt mit einer durchgehenden Dopaminausschüttung für eine gleichmäßige Stimulation der Dopaminrezeptoren (Olanow et al., 1996). Die Transplantation von VMZ bietet den Vorteil, dass bisher keine Tumorbildung beobachtet wurde und es bisher auch nicht zu Abstoßungsreaktionen kam. Verschiedene Studien konnten auch zeigen, dass die transplantierten Zellen bis zu 16 Jahre nach Transplantation überleben (Mendez et al., 2008).
Trotzdem ist die Zellersatztherapie mit Zellen aus dem embryonalen VM durch deren limitierte Verfügbarkeit umstritten, da für eine Transplantation sechs bis acht Föten benötigt werden(Winkler et al., 2005, Barker et al., 1996). Auch stellt das geringe Überleben der transplantierten Zellen mit nur 1-5 % ein Problem dar. Daher ist es wichtig, die
Vorläuferzellen aus dem VM in vitro zu expandieren und zu differenzieren (Barker et al., 1996, Timmer et al., 2006). (Timmer et al., 2006) konnten zeigen, dass es möglich ist, Vorläufer des VM bis zu 40fach zu expandieren. Nach 4-5 Tagen Differenzierung sind schon 70 % der Neurone bzw. 30 % der Gesamtzellpopulation TH-positiv.
Ein anderes Problem zeigte sich nach klinischen Studien am Patienten; nach Transplantation von Zellen aus dem embryonalen VM traten bei manchen Patienten starke Dyskinesien auf, die möglicherweise durch sogenannte „hot spots“ verursacht wurden. Dabei handelt es sich um Bereiche in denen eine Anhäufung von transplantierten Zellen und somit eine lokal verstärkte Reinnervation stattfindet, bei der ohnehin erhöhten striatalen Sensibilität durch die erhöhte Expression von DA-Rezeptoren. Auch bestimmte Zellkompositionen mit nicht dopaminergen, vor allem serotonergen Neuronen, können zu Dyskinesien führen (Carta et al., 2010). Der gestörte Ubiquitin Proteosom Komplex, oxidativer Stress sowie die reduzierte Menge von neurotrophen Faktoren führen zu der Pathologie, die auch bei den Transplantaten zumindest teilweise gefunden werden konnte. In Transplantaten von Patienten nach ihrem Ableben wurden Lewy Körperchen entdeckt. In einem 14 Jahre alten Transplantat wurden Ablagerungen identifiziert, die sowohl α-Synuclein als auch Ubiquitin positiv waren(Kordower and Brundin, 2009).
Zusammengefasst lässt sich konstatieren, dass Transplantate aus fötalem VM eine wichtige Quelle für eine Zellersatztherapie darstellen. Die längerfristige Innervation des Striatums und die DA-Ausschüttung führen zur Verbesserungen der motorischen Symptome bei Parkinson.
Dennoch sind die geringe Verfügbarkeit und die geringe Überlebensrate sowie das Fortschreiten der Krankheit in den transplantierten Zellen problematisch. Neurotrophe Faktoren fördern das Überleben der Zellen und können möglicherweise gegen das Fortschreiten der Krankheit entgegenwirken.
2. Einleitung – Teil 1
2.1 Neurotrophe Faktoren
Neurotrophe Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Nervensystems.
Sie regulieren das Überleben von Neuronen, ihre Differenzierung und die Bildung von neurotrophen Fortsätzen. In spezifischen Regionen werden neurotrophe Faktoren von neuronalen und nicht neuronalen Zellen produziert; Neurone projizieren in diese Regionen und konkurrieren um die limitierte Anzahl von neurotrophen Faktoren. Diese binden an ihre Rezeptoren, werden aufgenommen und retrograd zum Perikaryon transportiert (Peterson LA and JG, 2008 (Peterson LA and JG, 2008). Verschiedene neurotrophe Faktoren zeigen eine spezifische Wirkung auf Da-Neurone des Mesencephalon und sind damit Kandidaten für die Behandlung von Morbus Parkinson (Evans and Barker, 2008, Peterson LA and JG, 2008).
Im Zusammenhang mit dem Überleben und der Plastizität der von Da-Neuronen spielen hauptsächlich zwei große Proteinfamilien eine große Rolle. Die Neurotrophin (NT)-Familie und die Glial cell line -derived neurotrophic factor (GDNF)-Superfamilie. Zwei weniger gut beschriebene Faktoren in diesem Kontext sind zusätzlich zu nennen, Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) und Cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF).
2.1.1 CDNF und MANF
CDNF und MANF sind sezernierte neurotrophe Faktoren. Sie bestehen aus zwei Domänen, einer „Saposin-like“ Domäne, welche an Lipide und Membranen bindet und einer Carboxy- terminalen Domäne, welche möglicherweise vor endoplasmatischem Stress schützt (Lindholm and Saarma, 2010). Die C-terminale Domäne ist ebenfalls beschrieben als anti- apoptotisch, bei BAX induzierter Apoptose (Hellman et al., 2011). CDNF zeigte sich auch im 6-OHDA Model für Da-Neurone neuroprotektiv (Lindholm et al., 2007). Injektion von MANF sechs Stunden vor 6-OHDA-Injektion schützt Da-Neurone vor dem Absterben. Auch 6 Stunden und 4 Wochen nach einer partiellen Läsion durch 6-OHDA, welches das progressive Fortschreiten der Degeneration von Da-Neuronen nachahmen soll, konnten nach
einer MANF Applikation, im Vergleich zur Kontrolle aber auch im Vergleich zu GDNF, mehr überlebende Da-Neurone in der SN identifiziert werden (Voutilainen et al., 2009).
2.1.2 GDNF-Superfamilie
Zu der GDNF-Superfamilie gehören GDNF, Neurturin (NTN), Persephin (PSP) und Artemin (ART). Die GDNF-Superfamilie wirkt über die Bindung an seinen GDNF family receptor (GFRα), einem Gylcosylphosphoinositol-verankerten Membranrezeptor und dem Tyrosinkinase-Rezeptor (ret) (Evans and Barker, 2008). Außer ART, welches eine Rolle bei der Schmerzempfindung zu haben scheint, zeigen alle übrigen neurotrophen Faktoren einen positiven Effekt auf das Überleben und die Differenzierung Da-Neurone.
2.1.2.1 GDNF
Es gibt verschiedene in vitro und in vivo Experimente, die zeigen, dass GDNF einen positiven Effekt auf das Überleben und die Differenzierung von Da-Neuronen in der SN hat(Evans and Barker, 2008). GDNF hatte vor Neurotoxin–Läsion protektive Wirkung sowohl bei Injektion in das Striatum, als auch in die Substantia nigra (Tomac et al., 1995). Dafür scheint GDNF eine positive Wirkung auf die Bildung von Neuriten zu haben (Feng et al. 1999). die vor allem eine neuroprotektive Wirkung von GDNF bei toxischer Einwirkung, wie MPTP- oder 6-OHDA Behandlung, zeigten (Rosenblad et al., 2000) (Georgievska & Kirik 2003; Tomac et al. 1995).
2.1.3 NT-Familie
Zu den Mitgliedern der NT-Familie gehören Nerve growth factor (NGF), Neurotrophin 3-6 (NT3-6) und Brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
Sie binden an zwei Rezeptortypen. Zum einen an den p75 Neurotrophinrezeptor der p75NTR (tumor necrosis receptor)-Superfamilie. Die Rezeptoren haben eine extrazelluläre Domäne mit vier Cystein-reichen Motiven und eine transmembrane sowie eine cytoplasmatische Domäne, die “death Domäne“. Dieser Rezeptor spielt im Gegensatz zu dem zweiten, hoch- affinen trk-Rezeptor (tropomyosin receptor kinase) eher eine Rolle bei der Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose). Der trk-Rezeptor hat eine extrazelluäre Domäne, ebenfalls mit Cystein-reichen Motiven, Leucin-reichen Motiven und erneut einem Cystein- reichen Motiv, sowie zwei Immunoglobin-ähnlichen Domänen. Es gibt zwei Formen der trk-
Rezeptoren, eine verkürzte Form ohne Tyrosinkinase-Aktivität und die ungekürzte mit Tyrosinkinase-Domänen. Über die Bindung an den ungekürzten trk-Rezeptor werden verschieden Signalwege aktiviert. Dazu gehören MAP-Kinase Kaskaden, ERK (Extracellular- signal Regulated Kinases) 5- Signalwege und Phosphinositol-3-Kinasekaskaden (Pezet and Malcangio, 2004). Diese Signalwege spielen eine wichtige Rolle beim Zellüberleben durch Aktivierung von Transkription und Proteinexpressionen. Sie sind beteiligt an der Regulierung von neuronalem Überleben, Differenzierung und synaptischer Plastizität (Reichardt, 2006) (Binder and Scharfman, 2004)..
2.1.3.1 BDNF
BDNF bindet mit hoher Affinität an den trkB-Rezeptor und mit geringer Affinität an den p75- Rezeptor.
In geringerer Konzentration wird BDNF in Da-Neuronen der SN, der VTA und im Striatum exprimiert. BDNF wird zunächst als inaktives Preproneurotrophin synthetisiert;
posttranslationale Modifikationen sind erforderlich, um die Vorstufe in das reife Homodimer umzuwandeln. ProBDNF wird im endoplasmatischen Reticulum produziert, in den Golgi Apparat transportiert und akkumuliert letztlich im trans-Golgi. Im Golgi bindet die reife Domäne von proBDNF an Carboxypeptidase E wodurch die Sekretion reguliert wird (Carvalho et al., 2008). Interessanterweise wurde bei Parkinson Patienten im Vergleich zu gesunden Patienten postmortem eine geringere BDNF–Proteinmenge in der SN gefunden.
In frühen Stadien der Parkinson Erkrankung ist BDNF auch im Serumlevel reduziert, wie eine Studie an 47 Patienten gezeigt hat. In späten Stadien wurde hingegen ein erhöhter BDNF - Serumlevel festgestellt, möglicherweise um das fehlende BDNF zu kompensieren (Scalzo et al., 2010).
BDNF fördert das Überleben und die Differenzierung von Da-Neuronen. So erhöht zum Beispiel BDNF das Überleben von kultivierten Neurotoxin-behandelten Da-Neurone(Hyman et al., 1991)
Auch in vivo vermindert BDNF nach intraventrikulärer 6-OHDA Injektion die Zellverlustrate um 20 % (Krobert et al., 1997). Auch nach Injektion von Neurotoxin bei Affen (Macaca fuscata) zeigen BDNF-behandelte Affen einen milderen Krankheitsverlauf als unbehandelte.
Die Da-Neurone der SN wiesen eine reduzierte Degeneration auf (Tsukahara et al., 1995).
Allerdings treten verschiedene Probleme bei Infusionen von rekombinatem BDNF (rBDNF) auf. Das Protein hat eine geringe Halbwertzeit in vivo und die Bindung von BDNF an gekürzte trkB Rezeptoren vermindert die Diffusion von rBDNF im Gewebe, was zu einer sehr hohen lokalen Konzentration führt. Die gleichmäßige Produktion von BDNF und ihre Sekretion durch virale Vektoren oder transfizierte Zellen könnten diesem Problem entgegenwirken (Zuccato and Cattaneo, 2009).
Im Tierexperiment wurden bereits Transplantationen mit viralem humanen BDNF durchgeführt. Dazu wurden Fibroblasten mit humanem BDNF transfiziert eine Woche vor intrastriataler Neurotoxin Injektion in das Striatum adulter Ratten transplantiert. Sie verringerten die Degeneration der Da-Neurone in der SN (Levivier et al., 1995) 1995;(Frim et al., 1994)
Tabelle 1. Zusammenstellung ausgewählter BDNF Experimente in vivo und in vitro und deren Effekte auf das Überleben, die Plastizität und Differenzierung Da-Neurone.
Experimente Effekt
(Levivier et al., 1995)Transplantation von humanem BDNF exprimierenden Fibroblasten in das Striatum. (Rattenmodel)
Neuroprotektive Wirkung auf Da-Neurone nach partieller 6-OHDA Läsion.
(Frim et al. 1994 ) Transplantation von humanem BDNF exprimierenden Fibroblasten in SN-Nähe. (Rattenmodel)
Neuroprotektive Wirkung auf Da-Neurone im MPTP-Model.
(Scalzo et al., 2010)Untersuchung der BDNF Konzentration im Blutserum . (Klinische Studie an Parkinson Patienten)
Verringerte Konzentration in frühen Parkinson Stadien – dafür erhöhte Konzentration in späten Parkinsonstadien.
(Yurek et al., 1996)Infusion von rBDNF direkt nach Transplantation von VMZ ins Striatum 1,875µg/h / 1,5 µg/h für 28 Tage.
(Rattenmodel)
Erhöhte Dopaminausschüttung, erhöhte Innervation der transplantierten Da-Neurone im Striatum.
(Krobert et al., 1997)Astrozyten nach Transduktion mit einem retroviralem Vektor mit BDNF; Sequenz wurde in vitro und in vivo auf den Effekt auf Da-Neurone getestet. (E15 Ratte)
Erhöhtes Überleben in vitro, neuroprotektive Wirkung nach 6-OHDA Behandlung in vitro und in vivo.
(Hyman et al. 1991) Behandlung von embryonalen ventralen mesencephalen Kulturen in vitro. (E14 Ratte)
Neuroprotektive Wirkung auf Da-Neurone in Kultur auch nach MPTP Behandlung.
Im Rahmen eines umfangreichen Versuchs haben wir embryonale Vorläuferzellen aus dem VM mit einem BDNF-Flag überexprimierenden Plasmid transfiziert. Zusätzlich kultivierten wir die transfizierten Zellen in einer neuen Zellkulturmethode, der sogenannten Colayerkultur, um dem negativen Effekt der Transfektion durch Nukleofektion entgegenzuwirken und eine verbesserte Differenzierung der Da-Neurone in vitro zu erzielen.
Anschließend wurden die Zellen in das Rattenmodell des Morbus Parkinson transplantiert.
Im Rahmen meiner Arbeit habe ich in vitro Studien durchgeführt, um die Effekte der Transfektion und der Kulturmethode auf die Zusammensetzung der Kulturen zu charakterisieren und das Überleben der Da-Neurone zu evaluieren. Weiterhin habe ich biochemisch die Bindungseigenschaft des von den transfizierten Zellen sezernierten BDNF- Flag an den trkB-Rezeptor untersucht.
3. Einleitung - Teil 2
3.1 Whole cell (Ganzzell) Patch-Clamp Messverfahren
Die Patch-Clamp Methode bietet eine Möglichkeit, elektrophysiologische Eigenschaften einer Zelle allein und im Zellverband zu untersuchen. Nach Anlegen der Ableitelektrode auf die Zellmembran erhält man unter leicht negativ angelegtem Druck eine hochohmige Verbindung, Gigaseal (über 1 GΩ), zwischen der Patchpipette und der Zellmembran. In dieser sogenannten cell-attached-Konfiguration erhält man durch weitere Ausübung des negativen Drucks die sogenannte whole–cell Konfiguration. Dabei wird das Stück Membran an der Spitze der Elektrode aufgerissen. Die whole-cell Messung kann sowohl in der Voltage–
Clamp (Spannungsklemme) als auch in der Current-Clamp (Stromklemme) Konfiguration durchgeführt werden. In der Voltage-Clamp Methode werden Ströme bei konstantem Potential gemessen. Diese Form der elektrophysiologischen Messung eignet sich vor allem für die Messung von Öffnungs- und Schließeigenschaften von Kanälen. In der Current-Clamp Methode werden hingegen die elektrischen Ströme konstant gehalten und die Änderungen des Membranpotentials beobachtet. Diese Form der Messungen gibt Auskunft über die Erregbarkeit einer Zelle. Auch exzitatorische und inhibitorische Antworten auf einen präsynaptischen Impuls können beobachtet werden.
3.2 Elektrophysiologische Eigenschaften von Neuronen
Die Bewegung von geladenen Teilchen durch die Membran, über Kanäle und Poren nennt man elektrischen Strom. Dieser ist abhängig von dem Membranpotential und der Leitfähigkeit einer Zelle. Die Beziehung zwischen Widerstand, Strom und Membranpotential wird durch das Ohm‘sche Gesetz beschrieben, wobei die Spannung (U) proportional zum Strom (I) und Widerstand (R) ist. Das heißt auch, je geringer der Widerstand, desto höher ist der benötigte Strom um dieselbe Spannung zu erhalten.
Das Membranpotential gibt Auskunft über den Unterschied der Ladungsverteilung innerhalb und außerhalb der Zelle. Es ist von elektrochemischen Triebkräften für Ionen und deren Permeabilitäten durch die Zellmembran abhängig. Eine Ionensorte befindet sich im elektrochemischen Gleichgewicht, wenn chemische und elektrische Triebkräfte ausgeglichen sind, d.h. wenn die elektrische Membranspannung gerade die chemische Triebkraft
kompensiert, die durch einen Konzentrationsunterschied des Ions zwischen Zellinnerem und Zelläußerem gegeben ist. Gemäß der unterschiedlichen Konzentrationsgradienten existiert für jede Ionensorte ein eigenes Gleichgewichtspotenzial. Die Lage des Ruhemembranpotenzials ist v.a. durch eine hohe Kaliumpermeabilität der Zellmembran bestimmt und liegt daher in der Nähe des Kalium-Gleichgewichtspotenzials. Da Zellen aber auch in Ruhe für andere Ionen wie Natrium und Calcium geringfügig permeable sind, liegt das Ruhemembranpotenzial (RMP) von Neuronen z.B. bei etwa -70mV, wobei Ruhemembranpotentiale zwischen -40 und -95 mV möglich sind. Die Signalweiterleitung ist abhängig von einer schnellen Änderung des Membranpotentials. Aktionspotentiale (AP) sind die Folge elektrischer oder chemischer Stimulation einer Zelle. Bei einer Reizung strömt Natrium (Na+) in die Zelle, das Zellinnere wird im Vergleich zum extrazellulären Milieu weniger negativ. Erreicht die Depolarisation einen bestimmten Schwellenwert, wird ein Aktionspotential generiert. Mehr und mehr Na+- Kanäle öffnen sich, wodurch das Membranpotential immer positiver wird und sich in Richtung Na-Gleichgewichtspotenzial verschiebt. Mit einer kurzen zeitlichen Verzögerung öffnen sich Kalium (K+)-Kanäle, gleichzeitig inaktivieren Na+-Kanäle und es kommt zu einer schnellen Repolarisation der Zelle. Nach Erreichen des Ruhemembranpotentials sind deutlich mehr K+-Kanäle offen als Na+-Kanäle, wodurch es zu einer Hyperpolarisation des Membranpotentials kommt. Nach Ablauf eines APs dauert es einige Millisekunden bis ein neues Aktionspotential generiert werden kann. In dieser sogenannten Refraktärzeit sind die Natriumkanäle inaktiviert.
3.3 Elektrophysiologische Eigenschaften von dopaminergen Neuronen
Dopaminerge Neurone der SN pars compacta bilden das nigro-striatale System und sind Teil des motorischen Systems. Sie nehmen als Kontrollinstanz Einfluss auf die Ausführung komplexer Bewegungen (Schiebler, 2005). Nach 6-OHDA Läsion zeigen striatale Neurone eine erhöhte Rate spontaner Entladungen die sich nach intrastriataler Transplantation normalisieren(Di Loreto et al., 1996) .
Da-Neurone der SN zeigen typische elektrophysiologische Eigenschaften, zum Beispiel triphasische APs mit breitem Verlauf, denen nach Repolarisation ausgeprägte Nachhyperpolarisationen folgen (Rohrbacher et al., 2000) (Richards et al., 1997). Zum anderen zeichnen sich Da-Neurone durch sogenannte Schrittmacheraktivitäten, spontane
regelmäßige Entladungen, aus. Schrittmacherzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Generierung von rhythmischen APs. Zu denen zum Beispiel auch Neurone des Herzens, der Retina und des motorischen Systems gehören. Die Aktionspotenziale entstehen nach langsamer Depolarisation in niedriger Frequenz zwischen 1 - 4 Hz (Grace and Bunney, 1983).
Zusätzlich feuern Da-Neurone in vivo unregelmäßig und in wiederkehrenden, schnellen Gruppen von Entladungssalven (bursts) (Fisher et al., 1991). Die Spontanaktivität von Da- Neuronen spielt eine wichtige Rolle in der motorischen Kontrolle. Sie sorgen im Striatum für eine konstante Ausschüttung von DA, und regulieren so die Muskelspannung und die Bereitstellung willkürlicher Bewegungen. Burstartige Entladungen entstehen bei schnellen Bewegung und sorgen für phasisch abgegebenes DA (Guzman et al., 2009, Guatteo et al., 2009). Eine besonders auffällige Eigenschaft von Da-Neuronen ist der durch Hyperpolarisation hervorgerufene, einwärtsgerichtete IH-Strom (Rohrbacher et al., 2000), welcher durch sogenannte HCN (hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-modulated) – Ionenkanäle bei Hyperpolarisation eine entgegen gerichtete Depolarisation bewirkt. (Santoro and Baram, 2003, Accili et al., 2002). APs, die einer anhaltenden Hyperpolarisation folgen, erscheinen bei Da-Neuronen verzögert (Richards et al., 1997). Diese Verzögerung wird durch die Aktivierung eines weiteren Kanals, IA-Kanal initiiert, welcher durch einen auswärtsgerichteten Strom das Membranpotential zunächst unterhalb der AP-Schwelle stabilisiert, so dass die Entladung verzögert auftritt (Liss et al., 2001). Beide Kanäle habe eine Schlüsselrolle bei der Generierung von regelmäßigen Entladungen und damit einhergehender DA-Ausschüttung. Das freigesetzte DA bindet an die D1- oder D2-Rezeptoren striataler Neurone. (Carrillo-Reid et al., 2011). Spontan aktive striatale Neurone von lädierten Tieren zeigen eine erhöhte Entladungsfrequenz, welche durch die intrastriatal Transplantation von Da-Neuronen normalisiert werden kann. (van Horne et al., 1990) (Strömberg et al., 2010) (Calabresi P, 1993 ). Während D1-Rezeptoren hauptsächlich postsynaptisch exprimiert werden, exprimieren Da-Neurone zudem D2-Autorezeptoren, durch die eine Herabsetzung der AP-Frequenz durch negative Rückkopplung bewirkt werden kann. Die Da-Neurone der SN in vivo werden durch glutamaterge Neurone des STN, exzitatorischen Neurone des pedunculopontinen Nucleus (PPN) und GABAerge Neurone der Substantia nigra innerviert (Rohrbacher et al., 2000). In in vitro Versuchen konnte gezeigt werden, dass vermutlich durch das Fehlen von synaptischen Inputs neben stillen Neuronen, nur solche mit tonischen AP-
Folgen beobachtet werden können (Jomphe et al., 2005). Somit beeinflussen Afferenzen die Spontanaktivität der Da-Neurone trotz der Autogenerierung von APs. Bisher gibt es wenige Ableitungen über die neurophysiologischen Eigenschaften transplantierter Neurone. Die typischen Eigenschaften der Da-Neurone wurden schon zur Identifizierung der Da-Neurone der SN genutzt. (Richards et al., 1997)
4. Material – Allgemein
4.1 Chemikalien
Material Firma
30 % Acrylamid/Bis Lösung Bio Rad cat.1610-0146
Ammonium Persulfat (APS) Sigma A-3678
L-Ascorbinsäure 2-Phosphat Magnesiumsalz Sigma A-8960-5G
Biocytin Sigma B4261
B27-Supplement Gibco 17504/44
Bromphenol-Blau Sigma B8026
BSA (bovine serum albumin) PAA K31-011
Calciumchlorid (CaCl2) Sigma C-7902
Dulbecco’s modifizierte Medien (DMEM)/F12
Gibco E15-012
DNAse Roche 11284932
Ethylenglycol -tetraessigsäure (EGTA) Roth Art-Nr. 3054.1 Ethylendiamin-tetraacetat (EDTA) Roth Art.8043,1
Ethanol 70 % BÜFA Chemikalien GmbH & Co.
Fetal calf serum (FCS)-gold PAA A15151
FGF2 Preprotech 100-18B
Glycin Roth Art.3908,2
H2O steril Ampuwa Spülllösung
Hepes GIBCO 15630-049
Hank´s w/o Magnesium (Mg2+), Kalzium (Ca2+)
PAA Cat.H15-10
Isofluran Baxter HDG 9623
Kaliumchlorid (KCl) Merck Art 4936
K-Gluconat Sigma 64500
Laminin BD Biosciences 3542332
D (+)- Glucose Sigma 49139
L-Glutamin PAA M11-004
