Funktionale Analyse des CC-Typ Glutaredoxin ROXY19 in Arabidopsis
thaliana
Dissertation
Zur Erlangung des mathematisch-naturwissenschaftlichen Doktorgrades
“Doctor rerum naturalium”
der Georg-August-Universität Göttingen
Im Promotionsprogramm
„Grundprogramm Biologie“
der Georg-August University School of Science (GAUSS)
vorgelegt von Jan Oberdiek
aus Göttingen, Deutschland
Göttingen 2018
Betreuungsausschuss Prof. Dr. Christiane Gatz
(Abteilung Molekularbiologie und Physiologie der Pflanze) Prof. Dr. Jörg Stülke
(Abteilung Allgemeine Mikrobiologie) Dr. rer. nat. Corinna Thurow
(Abteilung Molekularbiologie und Physiologie der Pflanze)
Mitglieder der Prüfungskomission Referentin: Prof. Dr. Christiane Gatz
(Abteilung Molekularbiologie und Physiologie der Pflanze) Korreferent: Prof. Dr. Jörg Stülke
(Abteilung Allgemeine Mikrobiologie)
Weitere Mitglieder der Prüfungskommission:
Prof. Dr. Volker Lipka (Abteilung Zellbiologie der Pflanze) Prof. Dr. Ivo Feussner (Abteilung Biochemie der Pflanze)
Prof. Dr. Andrea Polle (Abteilung Forstbotanik und Baumphysiologie) PD Dr. Thomas Teichmann (Abteilung Zellbiologie der Pflanze)
Tag der mündlichen Prüfung: 31. Mai 2018
Erklärung
Hiermit bestätige ich, dass ich diese Dissertationsarbeit mit dem Titel „Funktionale Analyse des CC-Typ Glutaredoxin ROXY19 in Arabidopsis thaliana“ selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel genutzt habe. Alle wörtlich oder inhaltlich übernommenen Stellen habe ich als solche gekennzeichnet. Die Experimente wurden größtenteils von mir ausgeführt; Experimente die von meinem Kollaborateur Dr. rer. nat.
Sven Freibert (Philipps-Universität Marburg) durchgeführt wurden, wurden als solche gekennzeichnet.
Ich versichere außerdem, dass ich die beigefügte Dissertation nur in diesem und keinem anderen Promotionsverfahren eingereicht habe und, dass diesem Promotionsverfahren keine endgültig gescheiterten Promotionsverfahren vorausgegangen sind.
Göttingen den,____________ ____________________
(Jan Oberdiek)
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ...1
Summary ...3
Abkürzungsverzeichnis ...5
1 Einleitung ...10
1.1 Glutaredoxine ...10
1.2 Glutaredoxine der CPYC-Klasse in Pflanzen...13
1.3 Glutaredoxine der CGFS-Klasse in Pflanzen ...15
1.4 Glutaredoxine der CC-Klasse in Pflanzen ...17
1.5 Die Bedeutung von Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis thaliana ...20
1.6 ROXY19 interagiert mit TOPLESS ...23
1.7 CC-Typ Glutaredoxine könnten die Bindungseigenschaften von TGA Faktoren beeinflussen...23
1.8 Ziel der Arbeit ...24
2 Material und Methoden ...25
2.1 Material ...25
2.1.1 Organismen ...25
2.1.1.1 Bakterien ...25
2.1.1.2 Pflanzen ...25
2.1.2 Plasmide ...26
2.1.3 Primer...28
2.1.4 Chemikalien, Enzyme, Kits und Antikörper ...29
2.1.4.1 Chemikalien ...29
2.1.4.2 Enzyme...31
2.1.4.3 Kits ...31
2.1.4.4 Antikörper ...32
2.1.5 Antibiotika ...32
2.1.6 Medien und Puffer ...32
2.1.6.1 Medien ...32
2.1.6.2 Puffer ...33
2.1.7 Laborzubehör ...34
2.2 Methoden ...35
2.2.1 Molekularbiologische Techniken ...35
2.2.1.1 Polymerase Kettenreaktion ...35
2.2.1.2 Agarose Gelelektrophorese ...35
2.2.1.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ...35
2.2.1.4 Gel und PCR Reinigung ...35
2.2.1.5 Fragmentierung von DNA mit Restriktionsenzymen ...36
2.2.1.6 Ligation ...36
2.2.1.7 GatewayTM Klonierung ...36
2.2.1.8 Plasmid Reinigung ...36
2.2.1.9 Sequenzierungen...36
2.2.2 Transformationstechniken ...37
2.2.2.1 Herstellung von chemisch kompetenten Escherichia coli ...37
2.2.2.2 Transformation von Escherichia coli ...37
2.2.2.3 Transformation von Agrobacterium tumefaciens ...37
2.2.2.4 Transformation von Arabidopsis thaliana ...38
2.2.3 Kultivierungsmethoden...38
2.2.3.1 Oberflächensterilisation von Arabidopsis thaliana Samen ...38
2.2.3.2 Wachstum von Arabidopsis thaliana Samen auf MS-Platten ...38
2.2.4 Biochemische Methoden ...38
2.2.4.1 Proteinextrakte aus A. thaliana ...38
2.2.4.2 Proteinexpression aus E. coli ...39
2.2.4.3 Proteinreinigung aus E. coli ...39
2.2.4.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinen ...40
2.2.4.5 SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese (SDS-PAGE) ...40
2.2.4.6 Native Gele...40
2.2.4.7 Coomassie Färbung von Acryamid-Gelen...41
2.2.4.8 Protein Immunoblot ...41
2.2.4.9 HED-Assay ...42
2.2.4.10 Rekonstitution von Eisen-Schwefel-Clustern...42
2.2.4.11 Schwefelbestimmung ...43
2.2.4.12 EMSA mit radioaktiv markierter DNA ...43
2.2.4.13 Ellman’s Assay ...43
2.2.4.14 Löslichkeits- und Stabilitätstests ...44
2.2.5 Transkriptionsanalysen ...44
2.2.5.1 RNA Extraktion ...44
2.2.5.2 cDNA-Synthese ...44
2.2.5.3 Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) ...45
2.2.6 Biophysikalische Methoden ...45
2.2.6.1 MicroScale Thermophoresis (MST) ...45
2.2.7 Spektroskopische Methoden ...46
2.2.7.1 Circulardichroismus (CD) Spektroskopie ...46
2.2.7.2 UV-Vis-Spektroskopie ...46
2.2.7.3 Häm-Bestimmung ...47
3 Ergebnisse ...48
3.1 Analyse des CC-Typ Glutaredoxin ROXY19 in vitro ...48
3.1.1 Der Einfluss des Tags und der Co-Expression des Interaktionspartners TGA2 auf die Expression von ROXY19 ...49
3.1.2 ROXY19 besitzt Affinität zu Glutathion ...50
3.1.3 ROXY19 zeigt keine enzymatische Aktivität im HED-Assay...52
3.1.4 ROXY19 inkorporiert eine Eisen-Schwefel-Spezies ...53
3.1.5 Oligomerbildung von ROXY19 in Abhängigkeit des Redoxzustandes ...56
3.1.6 Monomerisierung von ROXY19 ...59
3.1.7 Einfluss von ROXY19 auf die Bindeeigenschaften von TGA2 an das as-1 Element ..62
3.2 Analyse des CC-Typ Glutaredoxins ROXY19 in planta ...69
3.2.1 ROXY19 reprimiert Entgiftungsgene ...69
3.2.2 Einfluss von Eisenmangel auf die Repression von ROXY19 auf TGA-abhängige Gene ...71
3.2.3 Komplementation der roxy18roxy19roxy20 Mutante...73
4 Diskussion...74
4.1 ROXY19 als GSH-abhängige Oxidoreduktase ...74
4.2 ROXY19 bindet eine Eisen Spezies ...76
4.3 Oligomerisierungszustand von ROXY19 ...77
4.4 Der ROXY19-induzierte Supershift des TGA2-as-1* Komplex ...78
4.5 Verstärkung der Bindung von TGA2 an das as-1 Element durch ROXY19...79
4.6 Redundanz innerhalb der CC-Typ Glutaredoxine ...80
4.7 Mögliche Funktionen des CC-Motivs von ROXY19 ...80
5 Literatur ...82
6 Anhang ...90 7 Danksagungen ... 109 8 Lebenslauf ... 110
1 Zusammenfassung
Glutaredoxine sind kleine weit verbreitete Enzyme, die durch die sogenannte Thioredoxin Faltung charakterisiert sind und ein aktives Zentrum besitzen, welches durch Glutathion reduziert werden kann. Die Glutaredoxine werden anhand ihres aktiven Zentrums in drei Klassen eingeteilt: Klasse I CPYC-Typ, Klasse II CGFS-Typ und Klasse III CC-Typ (in Arabidopsis thaliana auch ROXYs genannt). Ihre biochemischen Eigenschaften als Oxidoreduktasen und Gerüstproteine für Eisen-Schwefel-Cluster sind für die CPYC und CGFS Klasse in der Literatur beschrieben. Ihre Funktionen liegen in der Redox-Homöostase der Zelle, der Regulation von Signalprozessen und der DNA-Synthese. Die CC-Typ Klasse ist spezifisch für Landpflanzen. Für Mitglieder dieser Klasse wurde gezeigt, dass sie an Entwicklungs- und Pathogenabwehrprozessen beteiligt sind.
ROXYs interagieren physikalisch und genetisch mit TGA Transkriptionsfaktoren. Ektopisch exprimiertes ROXY19 unterdrückt die Klasse II TGA-vermittelte (TGA2, TGA5 und TGA6) Expression von Ethylen/Jasmonsäure-induzierten Abwehrgenen und der Expression von Klasse II TGA-abhängigen Detoxifikationsgenen. Das Ziel dieser Arbeit war es den Mechanismus dieser ROXY19-vermittelten Repressionen zu untersuchen. Mögliche Mechanismen wären eine enzymatische Aktivität von ROXY19, die eine Redoxmodifikation von Cysteinresten erlauben würde oder die Inkorporation eines Eisen-Schwefel-Clusters als Regulationsmechanismus.
Um diese Glutaredoxin-spezifischen Funktionen zu untersuchen, wurde rekombinant exprimiertes ROXY19 aus Escherichia coli verwendet. Mithilfe der MicroScale Thermophorese konnte eine Glutathion-Bindung, die abhängig vom CCMC Motiv war, nachgewiesen werden.
Die Affinität von ROXY19 zum Glutathion war vergleichbar mit der eines CPYC-Typ Glutaredoxin (GRX370), welches enzymatische Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay besaß. ROXY19 hingegen besaß keine Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay. Eine Mutation des aktiven Zentrums von ROXY19 zum CPYC Motiv war nicht ausreichend, um eine Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay zu beobachten. Die Eisen-Schwefel-Cluster Analysen ergaben, dass ROXY19 eine Eisen-Spezies unbekannten Typs inkorporieren konnte.
Weitere Analysen zeigten, dass rekombinant exprimiertes ROXY19 aus Escherichia coli als Oligomer vorlag. Rekonstitutionsversuche zur Bestimmung des putativen Eisen-Schwefel- Clusters mit dem Oligomer und Monomer waren nicht erfolgreich.
Aufgrund von „Electrophoretic Mobility Shift Assay“-Analysen konnte ein möglicher Mechanismus der Regulation von TGA2 gefunden werden. ROXY19 zeigte einen positiven Einfluss auf die Bindeeigenschaften von TGA2 an ein radioaktiv markiertes activating sequence-1 Promotor Fragment (beinhaltet die TGA Bindesequenz 5’-TGACG‘-3). Diese Eigenschaft war jedoch unabhängig vom aktiven Zentrum und konnte ebenfalls bei dem CPYC-Typ Glutaredoxin GRX370 beobachtet werden. ROXY19 konnte eine zusätzliche Veränderung der Mobilität des TGA2-activating sequence-1 Komplexes in der Gelelektrophorese hervorrufen. Diese Daten sprechen für einen ROXY19-TGA2 Komplex an der DNA. Dieser Komplex könnte die Möglichkeit bieten TOPLESS an Promotor Regionen von Klasse II TGA-kontrollierten Genen zu rekrutieren.
2
Huang et al. (2016) zeigten, dass Pflanzen die im Col-0 Hintergrund ROXY19 ektopisch exprimieren schlechter auf Medium mit dem Xenobiotikum 2,3,5-Triiodobenzoesäure als Col-0 Pflanzen wachsen. Dies konnte auf eine ROXY19-vermittelte Repression von Genen die an der Entgiftung beteiligt sind zurückgeführt werden. Die Repression ist abhängig vom CCMC Motiv des ROXY19, eine Mutation zum SSMS zeigte Wildtyp Wachstum. In dieser Arbeit konnte in planta gezeigt werden, dass der durch das 2,3,5-Triiodobenzoesäure verursachte Wachstumsphänotyp von Pflanzen, die ROXY19 ektopisch exprimierten (Huang et al., 2016), vom ersten Cystein des CCMC Motivs, aber nicht vom zweiten, abhängig war.
Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Eisenverfügbarkeit keinen Einfluss auf die ROXY19-vermittelte Repression von Zielgenen der Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren hatte.
3 Summary
Glutaredoxins are small widespread enzymes that are characterized by the so-called thioredoxin fold. They have an active center which can be reduced by glutathione. The glutaredoxins are divided into three classes according to their active center: class I CPYC- type, class II CGFS-type and class III CC-type (called ROXYs in Arabidopsis thaliana). For class I and II the biochemical properties as oxidoreductases and scaffold proteins for iron-sulfur clusters are described. They contribute to the redox homeostasis of the cell, the regulation of signalling processes, and DNA synthesis. The CC-type class is specific to higher land plants.
It has been found to be involved in developmental processes and pathogen defense responses.
ROXYs interact physically and genetically with TGA transcription factors. Ectopically expressed ROXY19 suppressed class II TGA-mediated (TGA2, TGA5 and TGA6) expression of ethylene/jasmonic acid-induced defense genes and detoxification genes. The aim of this work was to investigate a possible mechanism for this repression. Possibilities are an enzymatic activity of ROXY19, which allows a redox modification of cysteine residues, or the incorporation of an iron-sulfur cluster as a possible regulatory mechanism.
To investigate these glutaredoxin-specific functions, recombinantly expressed ROXY19 from Escherichia coli was used. The affinity to glutathione was detected for ROXY19 with the help of MicroScale Thermophoresis. The affinity was dependent on the CCMC motif and similar to a CPYC type glutaredoxin (GRX370) which had enzymatic activity in the 2-hydroxyethyl disulfide assay. However, ROXY19 had no activity in the 2-hydroxyethyl disulfide assay. A mutation of the active site to the CPYC motif was not sufficient to ensure activity in the 2- hydroxyethyl disulfide assay. The iron-sulfur cluster analysis showed that ROXY19 was able to incorporate an iron species of an unknown type. Further analysis showed that recombinantly expressed ROXY19 from Escherichia coli formed higher molecular oligomers.
Reconstitution experiments to determine the type of iron-sulfur cluster with the oligomer and monomer were unsuccessful.
Based on Electrophoretic Mobility Shift Assay analysis, a possible mechanism of ROXY19 to control TGA2 activity was discovered. ROXY19 showed a positive influence on TGA2 binding on a radioactive labeled activating sequence-1 promoter fragment (including the TGA binding sequence 5'-TGACG'-3). This feature was independent of the active site and was also observed for the CPYC type glutaredoxin GRX370. ROXY19 induced an additional change in the mobility of the TGA2-activating sequence-1 complex in gel electrophoresis. These data support a ROXY19-TGA2 complex bound to the DNA. The complex might be a possibility to recruit TOPLESS to promoter regions of class II TGA-controlled genes.
Huang et al. (2016) observed that plants ectopically expressing ROXY19 in Col-0 background show reduced growth on the xenobiotic 2,3,5-triiodobenzoic acid compared to Col-0 plants.
This was based on the ROXY19-mediated repression of detoxification genes. The repression is dependent on the CCMC motif of ROXY19, a mutation to SSMS showed wild-type-like growth. In this work it was shown in planta that the 2,3,5-triiodobenzoic acid susceptible phenotype of plants expressing ROXY19 (Huang et al., 2016) was depending on the first but not the second cysteine of the CCMC motif. Furthermore it was shown, that iron availability
4
had no influence on the ROXY19-mediated repression of class II TGA transcription factor target genes.
5 Abkürzungsverzeichnis
35S 35S Promotor des CaMV
°C Grad Celsius
Ø Durchmesser
µ Mikro
µF Mikrofarad
µL Mikroliter
α Alpha
A. thaliana und At Arabidopsis thaliana
ACC 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure
ae aerob
AFT (engl.) Activator of Ferrous Transport
anae anaerob
AP2/ERF APETALA2/Ethylene Responsive Factor
APS Ammoniumpersulfat
as-1 (engl.) activating sequence1
attP attachment sites
(m)AU Absorptionseinheiten (engl. absorbance units)
β Beta
β-Me β‐Mercaptoethanol
BAK1 (BRI1)‐assoziierte Rezeptor‐ähnliche Kinase 1 B. cinerea Botrytis cinerea
BolA (engl.) DNA-binding transcriptional regulator BolA
bp Basenpaar(e)
BRI1 BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE 1
BSA Rinderalbumin (engl. Bovine Serum Albumins)
BSO Buthionin‐Sulfoximin
bZIP basic Leucine-Zipper
CaCl2 Calciumchlorid
CaMV Cauliflower Mosaic Virus
CCD Charge-coupled Device
6
CD-Spektroskopie Circulardichroismus-Spektroskopie
ChiP Chromatin‐Immunopräzipitationen
CIA cytosolischen [Fe‐S]‐Montage
cm2 (Quadrat) Zentimeter
COI1 CORONATINE INSENSITIVE1
Col-0 Columbia
cp Chloroplast
CT threshold cycle
CTR1 CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1
Cys Cystein
DMSO Dimethylsulfoxid
(c)DNA (komplementäre) Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate
DTT Dithiothreitol
ε Extinktionskoeffizient
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EIN3 ETHYLENE INSENSITIVE3
EMSA (engl.) Electrophoretic Mobility Shift Assay
engl. Englisch
EPR (engl.) electron paramagnetic resonance
ER Endoplasmatischen Retikulum
ET Ethylen
EtBr Ethidiumbromid
[Fe-S]-Cluster Eisen-Schwefel-Cluster
FPLC Schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie
g Gramm
GeFi Gel-Filtration
GFP Grün fluoreszierendes Protein
GRAS GIBBERELLIC‐ACID INSENSITIVE(GAI), REPRESSOR of GAI (RGA) and SCARECROW (SCR)
7
GSH Glutathion (reduziert)
GSSG Glutathion-Dimer (oxidiert)
GSTs Glutathion‐S‐Transferasen
GR Glutathionreduktase
GRX Glutaredoxin
HA Hämagglutinin
HABA 2- [4'-Hydroxybenzolazo]benzoesäure
HCl Salzsäure
HED 2-Hydroxyethyldisulfid
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Hs Homo sapiens
Ile Isoleucin
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
JA Jasmonsäure
JAZ JASMONATE ZIM DOMAIN
K2HPO4 Dikaliumhydrogenphosphat
kbp Kilobasenpaar
kBq Kilobecquerel
KD Dissoziationskonstante
kDa Kilodalton
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
KOH Kaliumhydroxid
kV Kilovolt
λ Lambda
L Liter
LB-Medium Lysogensäurebrühe (engl. lysogeny broth)
M Molar
mA Milliampere
mbar Millibar
MBP Maltose Bindeprotein
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
MeV Methylviologen
8
mg Milligramm
MgSO4 Magnesiumsulfat
min Minute(n)
mL Milliliter
mM Millimolar
MnCl2 Manganchlorid
MS-Medium Murashige und Skoog Medium
MST MicroScale Thermophorese
MWCO Molecular Weight Cut-Off
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl Natriumchlorid
NADPH β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduziert
NADP+ Oxidierte Form des NADPH
NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat
NaOH Natriumhydroxid
NF‐YC11/NC2α (engl.) Nuclear Factor Y Subunit C11/NegativeCofactor 2α
ng Nanogramm
nm Nanometer
nM Nanomolar
NPR1 NONEXPRESSER OF PATHOGENESIS‐RELATED GENES 1
NTD N‐terminale Domäne
OD Optische Dichte
O/N Über Nacht (engl. over night)
ORA59 OCTADECANOID‐RESPONSIVE ARABIDOPSIS AP2/ERF‐domain protein 59
Ω Ohm
PAGE Polyacrylamid Gel Elektrophorese
PAN PERIANTHIA
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (engl. polymerase chain reaction)
PDF1.2 Plant Defensin 1.2
PDIs Proteindisulfidisomerasen
Pipes Piperazin-N, N'-bis (2-ethansulfonsäure)
9
Poly(dI-dC) Poly (deoxyinosinic-deoxycytidylic) acid
PR-1 Pathogenesis related-1
Pt Populus tremula
PTL PETAL LOSS
PTT DL-Phosphinothricin
RGLG (engl.) RING DOMAIN LIGASE
rml rootmeristem-less
RNAi Ribonukleinsäure-Interferenz
roGFP Redox-sensitives grün fluoreszierendes Protein
ROS reaktive Sauerstoffspezies
rpm Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute)
RT Raumtemperatur
SA Salicylsäure
SAR systemisch erworbeneResistenz
SDS Natriumlaurylsulfat (engl. Sodium Dodecyl Sulfate)
sek Sekunde(n)
TBS(-T) Tris-buffered saline (+Tween)
TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin
TEMED Tetramethylethylendiamin
TIBA 2,3,5-Triiodobenzoesäure
TPL TOPLESS
TR Thioredoxinreduktase
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TRX Thioredoxin
U Einheiten (engl. units)
UV(B) Ultraviolett (im Wellenlängenbereich von 280 bis 315 nm)
(v/v) (Volumen/Volumen)
Vis Sichtbar (engl. visible)
(w/v) (Gewicht/Volumen)
XVE Fusion der DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA (X), der sauren transaktivierenden Domäne von VP16 (V) und der regulatorischen Region des humanen Östrogenrezeptors (E; ER)
10 1 Einleitung
1.1 Glutaredoxine
Glutaredoxine (GRXs) sind kleine weit verbreitete Enzyme, die an der Redox-Homoöstase beteiligt sind. Sie sind in vielen Organismen vertreten und können in den verschiedensten zellulären Kompartimenten angetroffen werden (Ströher and Millar, 2012). Charakteristisch für die Glutaredoxine ist die sogenannte Thioredoxin (TRX) Faltung (Abbildung 1.1). Dieses Strukturmotiv, bestehend aus 4 β-Faltblättern und 3 α-Helices (β1-α1-β2-α2-β3-β4-α3), findet man in den TRXs, Proteindisulfidisomerasen (PDIs), Glutathion-S-Transferasen (GSTs), Glutathionperoxidasen und den GRXs (Lu and Holmgren, 2014; Ströher and Millar, 2012). Die GRXs werden anhand ihres aktiven Zentrums in drei Hauptklassen unterteilt (Rouhier et al., 2004). Die erste Klasse besitzt ein aktives Zentrum bestehend aus Cys-Pro-Tyr-Cys (CPYC).
Die zweite Klasse besteht aus Monothiol-GRXs, die ein Cys-Gly-Phe-Ser (CGFS) aktives Zentrum besitzen. Die dritte Klasse, auch CC-Typ genannt (in A. thaliana auch als ROXYs bezeichnet), ist eine für Pflanzen spezifische Klasse der GRXs, mit einem Cys-Cys-Met/Leu- Cys/Ser (CCM/LC/S) Motiv im aktiven Zentrum (Lillig et al., 2008).
Abbildung 1.1 (A) Architektur von GRXs; α-Helices sind als Rechtecke gezeichnet, β-Blätter als Pfeile. N- und C-terminal konservierte Regionen der TRX-Faltung sind in Farbe angegeben. (B) Struktur von HsGrx2 (PDB-Code 2FLS). Gleiche Farbcodes wie in (A), der N- und C-Terminus sind angegeben.
(Text und Abbildung aus Ströher und Millar, 2012)
11
Glutathion (GSH) wird von den meisten GRXs als Co-Faktor verwendet. Die Glutathionbindung wird durch mehrere Aminosäuren stabilisiert. Dies geschieht durch die Wechselwirkung eines konservierten Lysins (Klasse I) und einem zweiten Rest in der α2- Helix, vorwiegend Glutamin (Klasse I) oder Arginin (Klasse II) mit der Carboxylgruppe des Glycinrests von Glutathion. Zudem über eine Interaktion mit dem Cysteinrest des GSH durch Aminosäurereste, die dem cis-Prolin des Konsensus TVP (Klasse I) oder TFP (Klasse II) Motivs vorausgehen. Die letzte Wechselwirkung mit der Glutamyl-Gruppe des Glutathion geschieht über eine polare Aspartat-Gruppe nach einem charakteristischen GG-Motiv.
Einige GRXs verwenden GSH als Reduktionsmittel, um die Reduktion von Proteindisulfidbrücken oder Glutathionylierungen zu katalysieren. Proteinglutathionylierung ist die Bildung eines gemischten Disulfids zwischen einem Cystein des Proteins und GSH (Klatt and Lamas, 2000). Diese Modifikation des Proteins kann sowohl regulatorische Funktionen in einer Zelle haben, als auch ein Mittel zur Speicherung von GSH sein und ebenso dem Schutz eines Proteins vor oxidativem Stress (durch die Verhinderung der irreversible Oxidation von Thiolen) dienen (Dalle–Donne et al., 2008). Die Reduktion der Proteinglutathionylierung, auch Deglutathionylierung genannt, wird häufig durch GRXs katalysiert (Dalle–Donne et al., 2008). GRXs können die Deglutathionylierung durch zwei verschiedene Mechanismen katalysieren (Fernandes and Holmgren, 2004; Lillig et al., 2008).
Dies ist zum einen der Monothiol-Mechanismus und zum anderen der Dithiol-Mechanismus.
Der Monothiol-Mechanismus erfordert nur das N-terminale Cystein und wird daher von GRXs der CGFS-Typ Klasse verwendet (Ströher and Millar, 2012). Das N-terminale Cystein des GRX führt hierbei einen nukleophilen Angriff auf das glutathionylierte Protein aus und formt bei der Reduktion des Proteins selbst ein gemischtes Disulfid mit GSH. Die Reduktion von Proteindisulfiden erfordert die Anwendung des Dithiol-Mechanismus, bei dem zwei Cysteine im aktiven Zentrum benötigt werden (Lillig et al., 2008). Auch hier führt zunächst das N- terminale Cystein einen nukleophilen Angriff auf das Proteindisulfid aus, was zu einem gemischten Disulfid zwischen dem GRX und dem Protein führt. Im nächsten Schritt, greift das zweite Cystein im aktiven Zentrum das GRX-Protein-Intermediat an (Lillig et al., 2008).
Dies führt zum reduzierten Protein und einem oxidierten GRX mit einer intramolekularen Disulfidbrücke im aktiven Zentrum. Das glutathionylierte bzw. oxidierte GRX wird durch ein (Monothiol) bzw. zwei (Dithiol) weitere(s) Molekül(e) GSH reduziert, welche zusammen ein oxidiertes Glutathion (GSSG) bilden. Das oxidierte Glutathion wird durch die NADPH- abhängige Glutathionreduktase (GR) reduziert. TRXs verwenden einen dem Dithiol- Mechanismus ähnlichen Mechanismus, werden jedoch enzymatisch durch sogenannte Thioredoxinreduktasen (TRs) wieder reduziert.
12
Abbildung 1.2. Reaktionsmechanismen von Glutaredoxinen. Glutaredoxine katalysieren die reversible Reduktion von Proteindisulfiden, unter Verwendung ihrer beiden aktiven Cysteinylreste (Reaktionen 1-4).
Gemischte Disulfide zwischen Glutathion und Proteinen oder niedermolekularen Verbindungen werden durch den Monothiol-Mechanismus reduziert, der nur das N-terminale Cystein benötigt (Reaktionen 6 und 4). In beiden Fällen bildet sich ein Glutathiondisulfid, welches durch die Glutathionreduktase, auf Kosten von NADPH, reduziert wird (Reaktion 5) (Abbildung und Text aus (Lillig et al., 2008))
Neben dieser enzymatischen Funktion einiger GRXs, sind andere GRXs am Aufbau von [Fe-S]- Clustern in der mitochondrialen Matrix oder der Übertragung von [Fe-S]-Clustern an Zielproteine beteiligt. Die Funktion solcher [Fe-S]-Cluster besteht in der Übertragung von Elektronen (z.B. in der Atmungskette). Möglicherweise dienen [Fe-S]-Cluster auch in der Pflanze als Regulatoren der Genexpression auf sich verändernde Umweltbedingungen (z.B.
Eisenmangel). Ein gut beschriebenes Beispiel für eine Regulierung der Genexpression durch GRXs mit inkorporiertem [Fe-S]-Cluster ist die Regulierung von AFT1 und AFT2 in Saccharomyces cerevisiae (Pujol-Carrion et al., 2006).
[Fe-S]-Cluster sind weit verbreitete und evolutionär uralte prosthetische Gruppen. Sie sind strukturierte Anordnungen von Eisen- und Schwefelatomen, die auf Gerüstproteinen assembliert werden. Die am häufigsten auftretenden Cluster bilden die 2[Fe-S]- und 4[Fe-S]- Cluster und das etwas seltenere [3Fe-4S]-Cluster (Abbildung 1.3). Das GRXC1 aus Pappel (PtGRXC1) ist ein Beispiel für ein GRX mit gebundenem 2[Fe-S]-Cluster. PtGRXC1 bildet ein Dimer und koordiniert mit jeweils dem ersten Cystein des aktiven Zentrums und der Hilfe von 2 GSH Molekülen das 2[Fe-S]-Cluster (Feng et al., 2006).
Abbildung 1.3. Die häufigsten [Fe-S]-Cluster in Organismen. Gezeigt sind die drei häufigsten [Fe-S]-Cluster und wie sie von ihren Gerüstproteinen koordiniert werden. (Abbildung aus (Fontecave, 2006))
13
Das Genom von Arabidopsis thaliana kodiert für sechs Mitglieder der CPYC-Klasse (GRXC1, GRXC2, GRXC3, GRXC4, GRXC5 und GRXS12), vier Mitglieder der CGFS-Klasse (GRXS14, GRXS15, GRXS16 und GRXS17) und 21 Mitglieder der CC-Klasse (ROXY1-ROXY21) (Li et al., 2009; Rouhier et al., 2004) (Abbildung 1.4).
Abbildung 1.4 Ein phylogenetischer Baum der Arabidopsis- Glutaredoxin-Familie.
Der phylogenetische Baum wurde aus Vergleichen von Proteinsequenzen, unter Verwendung der
„neighbor-joining“- Methode in Clustal Omega (EMBL-EBI) erstellt. Die Proteinsequenzen jedes Locus wurden aus TAIR entnommen.
Die Gennamen wurden nach Rouhier et al.
(2004) oder Li et al.
(2009) vergeben.
1.2 Glutaredoxine der CPYC-Klasse in Pflanzen
Die Glutaredoxine der Klasse I (CPYC) sind in Pflanzen gut charakterisiert. Die katalytische Aktivität der CPYC-Typ GRXs in Pflanzen wurde zuerst anhand von gereinigtem Protein aus Reis im 2-Hydroxyethyldisulfid (HED)-Reduktionstest nachgewiesen (Sha et al., 1997). Später zeigten Meyer et al. (2007), dass rekombinantes GRXC1 in der Lage ist, die Disulfidbrücke von roGFP, einem künstlich hergestellten Zielprotein, zu reduzieren. roGFP ist ein redoxsensitives Protein, das durch die Substitution von zwei Aminosäuren, durch redoxaktive Cysteine aus GFP hergestellt wurde (Hanson et al., 2004). Neben der enzymatischen Oxidoreduktase Aktivität, wurde gezeigt, dass GRXs dieser Klasse als Gerüstproteine für [Fe-S]-Cluster dienen können (Rouhier et al., 2007).
AtGRXC1 ist eines von zwei bekannten CPYC-Typ GRXs in Arabidopsis thaliana, welches eine Holodimer-Struktur bilden kann, die ein [Fe-S]-Cluster inkorporiert (Riondet Christophe et al., 2012). Das nächst verwandte AtGRXC2 ist dazu nicht in der Lage. Auch für das Pappel PtGRXC1 wurde gezeigt, dass es ein [Fe-S]-Cluster inkorporieren kann (Feng et al., 2006;
Rouhier et al., 2007). AtGRXC2 wurde als ein interagierendes Protein von BRASSINOSTEROID
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INSENSITIVE 1 (BRI1)-assoziierter Rezeptor-ähnlicher Kinase 1 (BAK1) isoliert. In-vitro biochemische Assays zeigten, dass AtGRXC2 die BAK1-Glutathionylierung katalysiert und die BAK1-Peptidkinaseaktivität hemmt (Bender et al., 2015). BAK1 ist das erste beschriebene Zielprotein, welches von GRXC2 glutathionyliert werden kann. Mutationen in GRXC1 und GRXC2 sind aphenotypisch, die grxc1 grxc2 Mutante jedoch letal (Tabelle 1.1).
Über AtGRXC3 und AtGRXC4 ist bisher nichts bekannt. Für AtGRXC5 wurde gezeigt, dass es in zwei Formen in Escherichia coli exprimiert wird (Couturier et al., 2011). Das monomere AtGRXC5 Apoprotein besitzt eine Deglutathionylierungsaktivität, während das dimere Holoprotein einen 2[Fe-S]-Cluster enthält (Couturier et al., 2011). Ortsspezifische Mutageneseexperimente und die Auflösung der Röntgenkristallstruktur in der Holoform von AtGRXC5 zeigten, dass, obwohl nicht an seiner Ligation beteiligt, das Vorhandensein des zweiten aktiven Cysteins (Cys32) für die Clusterbildung erforderlich ist (Couturier et al., 2011).
Die Aktivität von AtGRXC5 beruht ausschließlich auf einem Monothiol-Mechanismus (Couturier et al., 2011).
Um neue Zielproteine von GRXs zu finden, werden neuartige Proteomics-Technologien entwickelt. Einer dieser Ansätze basiert auf der Annahme, dass ein intermediärer Komplex zwischen dem Dithiol GRX und seinem Zielprotein gebildet wird (Abbildung 1.2). Solche intermediäre Komplexe wurden für TRXs und ihre Zielproteine gezeigt. Eine Mutation des C- terminalen Cysteins des TRX aktiven Zentrums stabilisiert einen solchen intermediären Komplex (Brandes et al., 1993). Daraus ergibt sich die Möglichkeit, eine markierte Mutante dieses Cysteins von TRXs oder GRXs zu exprimieren, um Zielproteine, die kovalent an das TRX/GRX gebunden sind, zu identifizieren. Mithilfe dieses Verfahrens wurden 94 mögliche Zielproteine (darunter viele PRXs) in der Pflanze für PtGRXC4 identifiziert (Rouhier et al., 2005). Viele dieser Proteine sind auch bekannte Zielproteine von TRXs.
Tabelle 1.1. Zusammenfassung der Glutaredoxine der CPYC-Klasse. Gezeigt sind die bekannten Funktionen der CPYC Glutaredoxine in Arabidopsis thaliana und bekannte Phänotypen der dazugehörigen Mutanten.
GRX Funktion Mutante Phänotyp Quelle
GRXC1 Holodimer bindet [Fe-S]
Cluster
grxc1 Aphenotypisch,
Abnahme der globalen GRX Aktivität
(Riondet
Christophe et al., 2012)
GRXC2 Interaktion mit und
Glutathionylierung von BAK1
grxc2 Aphenotypisch,
Abnahme der globalen GRX Aktivität
(Riondet
Christophe et al., 2012)
GRXC1 und GRXC2 teilen redundante und
lebenswichtige Funktionen
grxc1 grxc2 letal (Riondet
Christophe et al., 2012)
GRXC3 Nicht beschrieben grxc3 Nicht beschrieben /
GRXC4 Nicht beschrieben grxc4 Nicht beschrieben /
GRXC5 Lokalisation im Chloroplasten, Apoprotein besitzt
Deglutathionylierungsaktivitä t, Holoprotein bindet 2[Fe-S]- Cluster
grxc5 Nicht beschrieben (Couturier et al., 2011)
15 1.3 Glutaredoxine der CGFS-Klasse in Pflanzen
In Arabidopsis thaliana sind vier CGFS-Typ GRX vorhanden (GRXS14, GRXS15, GRXS16 und GRXS17). Cheng et al. (2006) isolierten ein Chloroplasten-lokalisiertes GRX des CGFS-Typs (AtGRXcp; GRXS14), dessen in planta Expression in jungen Keimblättern, grünen Geweben und Leitbündeln erhöht ist (Cheng et al., 2006). Die Analyse von Pflanzen die GRXS14 exprimimieren zeigte Defekte im frühen Keimlingswachstum unter oxidativen Stressbedingungen und eine erhöhte Proteincarbonylierung in Chloroplasten (Cheng et al., 2006). Pflanzen, die GRXS14 ektopisch exprimieren zeigen zudem einen reduzierten Chlorophyllgehalt unter Kontroll- und Hochlicht, sowie unter Hochsalzbedingungen (Rey Pascal et al., 2017). Für das Pappel PtGRXS14 ist die Struktur bekannt (Wang et al., 2014). Für GRXS14 wurde gezeigt, dass es ein 2[Fe-S]-Cluster (Bandyopadhyay et al., 2008) mit BolA inkorporieren kann (Roret et al., 2014). BolA-Proteine sind als stressabhängige Transkriptionsregulatoren definiert, die aber auch am Eisenstoffwechsel beteiligt sind.
Das mitochondriale Monothiol-Glutaredoxin S15 ist essentiell für die Reifung von Eisen- Schwefel-Proteinen in Arabidopsis thaliana. Rekombinantes GRXS15 ist in der Lage ein [Fe- S]-Cluster mithilfe von GSH zu koordinieren und zu übertragen (Moseler et al., 2015). Ströher et al. (2016) zeigten, dass GRXS15 am [Fe-S]-Cluster-Transfer in den Mitochondrien beteiligt ist. Dies hat Einfluss auf Liponsäure-abhängige Enzyme, Pflanzenwachstum und Arsen- Toleranz in Arabidopsis. Rekombinantes GRXS15 hat eine sehr geringe Deglutathylierungs- und Dehydroascorbat-Reduktase-Aktivität (Ströher et al., 2016).
Auch für das mitochondriale GRXS16 wurde gezeigt, dass es ein 2[Fe-S]-Cluster inkorporieren kann (Bandyopadhyay et al., 2008). GRXS16 umfasst zwei funktionale Domainen, eine N- terminale Domäne (NTD) mit einem Gly-Ile-Tyr-Tyr-Ile-Gly (GIY-YIG)-Endonuklease Motiv und eine C-terminale GRX-Domäne, um die Redox-Regulierung und DNA-Spaltung in Chloroplasten zu koordinieren. GRXS16-NTD ist in der Lage λDNA und Chloroplasten- genomische DNA zu spalten, die Nukleaseaktivität ist in GRXS16 durch die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den beiden Domänen reduziert (Liu et al., 2013).
Das atypische nukleo-zytoplasmatische GRXS17 besteht aus vier Domänen, einer N- terminalen TRX-ähnlichen Domäne, gefolgt von drei CGFS-Domänen und interagiert mit BolA (Couturier et al., 2014). GRXS17 kann glutathionyliertes BolA2 vollständig reduzieren (Couturier et al., 2014). Daher ist die Hypothese, dass GRXS17 den Redoxzustand von BolA2 regulieren und als Redoxschalter für die Aktivierung oder Inaktivierung der BolA-DNA- Bindungsaktivität in Reaktion auf Stressbedingungen dienen könnte (Couturier et al., 2014).
GRXS17 befindet sich als Reaktion auf Temperaturstressbedingungen im Zytoplasma und im Zellkern (Cheng et al., 2011). GRXS17 zeigt eine erhöhte Expression in den Sprossmeristemen und reproduktiven Geweben (Knuesting et al., 2015). Rekombinantes GRXS17 inkorporierte mehrere 2[Fe-S]-Cluster (Knuesting et al., 2015). Der Nuclear Factor Y Subunit C11/Negative Cofactor 2α (NF-YC11/NC2α) wurde als Interaktionspartner von GRXS17 identifiziert. GRXS17 könnte durch die Interaktion mit NF-YC11/NC2α ein von der Photoperiode erzeugtes Redoxsignal weiterleiten, um die Meristemfunktion aufrechtzuerhalten (Knuesting et al., 2015). GRXS17 ist ein Zielprotein der Arabidopsis-E3-Ubiquitin-Ligasen RING DOMAIN LIGASE
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3 (RGLG3) und RGLG4 (Nagels Durand et al., 2016). GRXS17 assoziiert mit den meisten bekannten cytosolischen [Fe-S]-Montage (CIA) Komponenten (Iñigo et al., 2016).
Mutationen der CGFS-Klasse GRXS haben vor allem Auswirkung auf die Reifung von [Fe-S]- Proteinen (Tabelle 1.2).
Tabelle 1.2. Zusammenfassung der Glutaredoxine der CGFS-Klasse. Gezeigt sind die bekannten Funktionen der CGFS Glutaredoxine in Arabidopsis thaliana und bekannte Phänotypen der dazugehörigen Mutanten.
GRX Funktion Mutante Phänotyp Quelle
GRXS14 (AtGRXcp)
Lokalisation im Chloroplasten grxs14 Kein Wachstumsdefekt Cheng et al. (2006) grxs14 grxs16 Langsameres
Wachstum, bei
längerer Dunkelheit ein erhöhter
Chlorophyllverlust und Abnahme von
Proteinen die an der Reifung von [Fe-S]- Proteinen beteiligt sind
(Rey Pascal et al., 2017)
GRXS15 Lokalisation in Mitochondrien, Reifung von [Fe-S]-Proteinen, bindet [Fe-S]-Cluster mit GSH, geringe
Deglutathionylierungsaktivität
Teilweise Entfernung aus den
Mitochondrien
Verlangsamtes
Wachstum und Atmung
(Moseler et al., 2015)
(Ströher et al., 2016)
GRXS16 Lokalisation in Mitochondrien, bindet 2[Fe-S]-Cluster
grxs16 Nicht beschrieben (Bandyopadhyay et al., 2008) (Liu et al., 2013) GRXS17 Nukleo-zytoplasmatische
Lokalisation, Interaktion mit BolA, Reduktion von glutathionyliertem BolA2, bindet mehrere 2[Fe-S]-Cluster, Interaktion mit NF-YC11/NC2α, Assoziation mit cytosolischen [Fe-S]-Montage Komponenten, Zielprotein für RGLG3 und 4
grxs17 Geringe Abnahme der Aktivitäten von [Fe-S]- Enzymen, sensitiver gegenüber hohen Temperaturen und langen Photoperioden (längliche Blätter, kompromittiertes Sprossapikalmeristem und verzögerte Verschraubung), sensitiver gegenüber DNA-Schäden, erhöhte Expression von DNA- Schadensmarkergenen
(Cheng et al., 2011)
(Couturier et al., 2014)
(Knuesting et al., 2015)
(Iñigo et al., 2016) (Nagels Durand et al., 2016)
17 1.4 Glutaredoxine der CC-Klasse in Pflanzen
Die CC-Typ Klasse umfasst 21 Mitgliedern in Arabidopsis. Allerdings ist über diese Mitglieder weniger bekannt als über die anderen beiden Klassen. Dies könnte daran liegen, dass CC-Typ GRXs aufgrund ihres hydrophoben C-Terminus (GALWL) schwierig in E. coli zu exprimieren sind (Couturier et al., 2010). Durch die Veränderung des C-terminalen Endes von PtGRXS7.2, einem CC-Typ GRX der Pappel, konnten einige Holoproteine gereinigt werden, die typische Merkmale eines [Fe-S]-Clusters (bräunliche Färbung der Eluate und ein spezifisches UV/Vis Absorptionsspektrum), sowie eine sehr geringe Aktivität im HED-Test zeigten (Couturier et al., 2010). Bei einem alternativen Ansatz wurde das CGYC aktive Zentrum des PtGRXC1 bzw.
CPYC des PtGRXC4 durch ein CCMC bzw. CCMS Motiv ersetzt. Das mutierte GRXC1 inkorporierte ein 2[Fe-S]-Cluster als Holodimer und das mutierte GRXC4 besaß eine geringe GSH-abhängige Reduktase Aktivität in der monomeren Apo-Form (Couturier et al., 2010).
Aufgrund dieser Studie kann angenommen werden, dass GRXs des CC-Typs möglicherweise ebenfalls [Fe-S]-Cluster und/oder Oxidoreduktase Aktivität besitzen könnten.
Genetische Untersuchungen an den CC-Typ GRXs führten zu der Umbenennung zur „ROXY“- Klasse in A. thaliana. Die roxy1 Mutante zeigt während der Blütenentwicklung nur durchschnittlich 2,5 Blüttenblätter anstatt der üblichen vier und auch in späteren Stadien der Entwicklung ist die Blütenmorphogenese betroffen (Xing et al., 2005). ROXY1 (GRXC7) und ROXY2 (GRXC8) sind redundant bezüglich ihrer Funktion in der Antherenentwicklung.
Die roxy1 und roxy2 Mutanten sind fruchtbar und produzieren normale Antheren, die roxy1 roxy2 Doppelmutante ist steril und produziert keine Pollen (Xing and Zachgo, 2008).
Komplementationsexperimente zeigten, dass der erste, aber nicht der letzte Cysteinrest im putativen aktiven Zentrum für die ROXY1-Funktion in der Blütenblattentwicklung entscheidend ist (Xing et al., 2005). Zudem ist ein konservierter Glycinrest, der für die GSH- Bindung wichtig ist, für die ROXY1-Funktion kritisch (Xing and Zachgo, 2008). Das konservierte Proline100 des TVP Motivs war jedoch für die ROXY1 Funktion entbehrlich (Xing and Zachgo, 2008).
ROXY1 und ROXY2 können mit TGA-Transkriptionsfaktoren interagieren (Li et al., 2009;
Murmu et al., 2010). In Betracht auf den roxy1 Phänotypen ist besonders die Interaktion mit dem TGA Transkriptionsfaktor PERIANTHIA (PAN), der an der Festlegung der Blütenorganzahl beteiligt ist (Chuang et al., 1999), interessant. Die pan Mutante bildet ein zusätzliches fünftes Blütenblatt. Eine roxy1 pan Doppelmutante zeigte ebenfalls ein fünftes Blütenblatt. Dies bedeutet, dass ROXY1 „upstream“ von PAN lokalisiert ist. Für die ROXY1-Funktion sind die Kernlokalisation und die Interaktion mit PAN erforderlich. Dabei ist nur einer (Cys340) von sechs Cystein Resten von PAN erforderlich um den pan Phänotypen zu komplementieren (Li et al., 2009). Durch den Austausch von Cysteinen zu Serinen wird ein permanenter reduzierter Zustand simuliert. Deshalb kann spekuliert werden, dass für das Cys340 ein oxidierter (Zwischen-) Zustand für die PAN Aktivität benötigt wird, wohingegen die anderen Cysteine permanent reduziert sein können. Daher könnte die Aktivität von PAN durch eine ROXY1-katalysierte post-translationale Redox-Modifikation negativ reguliert werden.
Auch die ptl (PETAL LOSS) Mutante führt zu einer reduzierten Anzahl von Blütenblättern (Griffith et al., 1999). Vor Kurzem wurde gezeigt, dass der Verlust von Blütenblättern in der
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ptl Mutante von der ROXY1 Funktion abhängig ist (Quon et al., 2017). ROXY1 konnte in dieser Studie mit PTL interagieren und hier wurde vorgeschlagen, dass ROXY1 unter reduzierenden Bedingungen PTL bindet und es aktiviert, indem es spezifische konservierte Cysteine reduziert, was zu einer Wachstumsunterdrückung zwischen Sepalen und den Sepalenrändern führt.
Murmu et al. (2010) zeigten, dass die tga9 tga10 Doppelmutante einen ähnlichen Phänotypen wie die roxy1 roxy2 Doppelmutante hinsichtlich der Antherenentwicklung zeigt.
Das TGA9 und TGA10 Expressionsmuster überschneidet sich mit dem von ROXY1 und ROXY2, wo sie vermutlich einen gemeinsamen Satz von Genen regulieren, um die Antherenentwicklung zu fördern. ROXY1 und ROXY2 könnten auch hier die TGA9 und TGA10 Transkriptionsaktivität durch Redox-Modifikationen beeinflussen.
ROXY11 (GRXS3), ROXY13 (GRXS4), ROXY12 (GRXS5), ROXY14 (GRXS7) und ROXY15 (GRXS8) gehören zu einer Gruppe von CC-Typ GRXs, deren Expression in Arabidopsis thaliana Sprossen und Wurzeln durch Nitrat, aber nicht durch Ammonium induziert werden (Patterson et al., 2016; Walters and Escobar, 2016). ROXY11/12/13/14/15 sind in einem
„Tandem-Array“ auf Chromosom 4 angeordnet und zeigen eine sehr hohe Sequenzähnlichkeit. ROXY11/12/13/14/15 haben praktisch identische Sequenzen, regulatorische Muster und Funktionen (Walters and Escobar, 2016). RNAi Linien von ROXY11 zeigten ein verlängertes Wachstum der Primärwurzel (Patterson et al., 2016) im Vergleich zu Col-0. Somit ergibt sich eine vermutliche Funktion für ROXY11-15 als negative Regulatoren des primären Wurzelwachstums durch eine mögliche Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nitrat im Boden.
Für die CC-Typ GRXs wurde ebenfalls gezeigt, dass sie bei Reaktionen der Pflanze auf Umwelteinflüsse eine Rolle spielen. Es wird spekuliert, dass das Abwehrhormon Salicylsäure (SA) den Ethylen/Jasmonat (ET/JA) Signalweg negativ durch Manipulation der Transkriptionsaktivität von Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren (TGA2, 5 und 6) regulieren könnte. Die Expression von ROXY19 (GRX480, GRXC9), welches als Interaktionspartner von TGA2 in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Screen gefunden wurde, wird durch SA in einer Klasse II TGA-abhängigen Weise induziert (Ndamukong et al., 2007). Transgene Arabidopsis Pflanzen, die ektopisch ROXY19 exprimieren, zeigen nahezu eine Wildtyp-ähnliche Expression von Standard-Markergenen für SA-induzierbare Antworten. Im Gegensatz dazu werden der JA/ET Signalweg und die durch Xenobiotika induzierbaren Antworten reprimiert (Huang et al., 2016; Ndamukong et al., 2007). Eine direkte Wechselwirkung zwischen ROXY19 und Klasse- II-TGAs legt wiederum nahe, dass SA-induziertes ROXY19 die ET/JA-abhängige Transaktivierungskapazität von Klasse-II-TGA über Redox-Modifikation inaktivieren könnte.
Die Klasse II TGA TFs-abhängige Expression des Hauptregulators des ET/JA-Signalwegs ORA59 (OCTADECANOID-RESPONSIVE ARABIDOPSIS AP2/ERF-domain protein 59), wird durch Expression von ROXY19 in A. thaliana, reprimiert. Nur ROXYs mit einem C-terminalen ALWL- Motiv können die ORA59-Promotoraktivität in transient transformierten Pflanzenprotoplasten reprimieren (Zander et al., 2012). Das ALWL-Motiv ist ebenfalls wichtig, um den roxy1 Phänotyp zu komplementieren, was darauf hindeutet, dass die ROXY- abhängigen Funktionen in Entwicklungs- und Verteidigungs-assoziierten Prozessen durch
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denselben Mechanismus ausübt werden könnten (Li et al., 2011; Zander et al., 2012).
Ektopische Expression von ROXY1 oder ROXY19 in A. thaliana resultiert in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber nekrotrophen Pathogenen (wie Botrytis cinerea) (Wang et al., 2009; Zander et al., 2012). Dies kann der Repression der ORA59-vermittelten Abwehr durch die GRXs und einer Akkumulation von Wasserstoffperoxid (förderlich für Infektionen mit B.
cinerea) zugeschrieben werden.
Herrera-Vásquez et al. (2015) zeigten, dass die ROXY19 Expression durch UVB-Exposition induziert werden kann. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass TGA2 und TGA3, aber nicht TGA1, konstitutiv an die Promotorregion des ROXY19 gebunden sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine ektopische Expression von ROXY19 die endogene ROXY19 Expression reprimiert. ROXY19 reguliert somit seinen endogenen Promotor negativ. Nähere Untersuchungen dieser Regulation ergaben, dass ROXY19 mit dem TGA2/TGA3 Komplex am endogenen ROXY19 Promotor assoziiert. Dies legt nahe, dass ROXY19 seine eigene Genexpression durch Bindung an TGA-Faktoren reguliert, während diese an die DNA gebunden sind.
Eine Mutation in ROXY18 (GRXS13), dem nächsten Homolog von ROXY19, führt zu einer erhöhten Resistenz gegenüber B. cinerea. Die Expression der Markergene für die nekrotrophe Pathogenabwehr PDF1.2 und biotrophe Pathogenabwehr PR-1 sind in der roxy18 Mutante unverändert (La Camera et al., 2011). Die erhöhte Resistenz ist demnach auf keine erhöhte Expression von Genen des nekrotrophen/biotrophen Abwehrprozesses zurückzuführen. Infektionen mit diesem nekrotrophen Pilz führen zu einer erhöhten Expression von ROXY18 und Induktion der Synthese von JA und SA. Der Mechanismus, wie ROXY18 die nekrotrophe Pathogeninfektion erleichtert, ist bisher nicht geklärt. „Knock- down“ Linien von ROXY18 zeigen erhöhte Basalspiegel von Superoxidradikalen und vermindertes Pflanzenwachstum, sowie eine verminderte Toleranz gegenüber Methylviologen (MeV) und Hochlichtbehandlungen (beides Zustände photooxidativer Belastung durch Superoxidionen) (Laporte et al., 2012). Linien, die ROXY18 (GRXS13.2) ektopisch exprimieren, zeigen reduzierte MeV und Hochlicht-induzierte Schäden, sowie eine Erhöhung des Superoxidspiegels und des Ascorbat/Dehydroascorbat-Verhältnisses nach Hochlicht-induziertem Stress. Somit ist ROXY18 entscheidend für die Begrenzung der basalen und photooxidativen Stress-induzierten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und ein Mitglied des ROS-Auffang-/Antioxidationsnetzwerkes, das eine besonders geringe funktionelle Redundanz mit anderen ROXYs zeigt (Laporte et al., 2012).
Eine Zusammenfassung der Funktionen aller beschriebenen ROXYs und die Phänotypen der dazugehörigen Mutanten sind in Tabelle 1.3 dargestellt.
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Tabelle 1.3. Zusammenfassung der Glutaredoxine des CC-Typs. Gezeigt sind die bekannten Funktionen der CC- Typ Glutaredoxine in Arabidopsis thaliana und bekannte Phänotypen der dazugehörigen Mutanten.
GRX Funktion Mutante Phänotyp Quelle
ROXY1 Normale
Antherenentwicklung
roxy1 Nur 2,5 Blüttenblätter, fruchtbar, normale Antheren
(Xing et al., 2005) (Xing and Zachgo, 2008)
ROXY2 Normale
Antherenentwicklung
roxy2 Fruchtbar, normale Antheren
(Xing and Zachgo, 2008)
roxy1 roxy2 Steril, keine Pollen (Xing and Zachgo, 2008)
ROXY11 ROXY12 ROXY13 ROXY14 ROXY15
negative Regulatoren des primären Wurzelwachstums
RNAi ROXY11 längeres Wachstum der Primärwurzel
(Patterson et al., 2016)
(Walters and Escobar, 2016) ROXY18 Begrenzung der basalen und
photooxidativen Stress- induzierten Produktion von ROS und ein Mitglied des ROS-Auffang-
/Antioxidationsnetzwerkes
roxy18
knock down roxy18
erhöhten Resistenz gegenüber B. cinerea erhöhter Basalspiegel von Superoxidradikalen und vermindertes Pflanzenwachstum, verminderte Toleranz gegenüber (MeV) und Hochlichtbehandlunge n
(La Camera et al., 2011)
(Laporte et al., 2012)
ROXY19 Repression von Zielgenen der Klasse II TGA
Transkriptionsfaktoren
(Ndamukong et al., 2007) (Zander et al., 2012) (Huang et al., 2016)
1.5 Die Bedeutung von Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis thaliana
Wie bereits angemerkt, interagieren CC-Typ GRXs mit TGA-Transkriptionsfaktoren (TGAs).
TGAs sind Transkriptionsfaktoren mit einer basischen DNA-bindenden Region und einem Leucin-Zipper-Motiv (bZIP) zur Dimerisierung (Ellenberger, 1994). Sie sind notwendig für Hormonsignaltransduktionsprozesse (SA und ET/JA), für die Aktivierung des Programms zur Entgiftung von Xenobiotika und für eine normale Blütenentwicklung. Das Arabidopsis thaliana Genom kodiert für insgesamt zehn Mitglieder der TGA Familie. Diese werden in fünf Klassen unterteilt: Klasse I umfasst TGA1 und TGA4, Klasse II TGA2, TGA5 und TGA6, Klasse III TGA3 und TGA7, Klasse IV TGA9 und TGA10 und Klasse V PERIANTHIA (PAN) (Abbildung 1.5).
TGAs binden an Varianten der palindromischen DNA Sequenz 5’-TGACGTCA-3‘, wobei die 5‘- TGACG-3‘ Sequenz ausreichend für die Bindung ist. Diese wurde zuerst im Blumenkohl- Mosaik-Virus („Cauliflower Mosaic Virus“, CaMV) 35S Promotor beschrieben (Katagiri et al., 1989).
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Abbildung 1.5. Ein phylogenetischer Baum der Arabidopsis TGA-Familie.
Proteinsequenzen wurden von TAIR erhalten und unter Verwendung von Clustal Omega (EMBL-EBI) der phylogenetische Baum erstellt (von Dr. Li Jun Huang).
Diese Arbeit konzentriert sich auf die Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6, die positive Regulatoren der Pflanzenabwehrreaktion „systemisch erworbene Resistenz (SAR)“ sind (Zhang et al., 2003). Diese langanhaltende und breite Immunantwort gegen biotrophe und hemi-biotrophe Pathogene wird in den distalen Pflanzenteilen nach lokaler Infektion mit einem biotrophen Pathogen ausgeprägt. Für die Etablierung der SAR benötigt die Pflanze das Phytohormon SA. Die SA-Signaltransduktion wird durch den Transkriptions-Co-Aktivator NPR1 (NONEXPRESSER OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 1) kontrolliert. Die NPR1-Homologe NPR3 und NPR4 wurden als SA-Rezeptoren und Regulatoren der NPR1 Stabilität nachgewiesen (Fu et al., 2012). NPR1 liegt im nicht induzierten Zustand im Cytosol als Oligomer vor. Dieses wird durch intermolekulare Disulfidbindungen gebildet (Mou et al., 2003). Nach der SAR-Induktion tritt eine biphasische Veränderung des zellulären Reduktionspotentials auf. Dies führt zu einer Reduktion von NPR1 und damit zur monomeren Form. Monomeres NPR1 akkumuliert im Zellkern, wo es im Zusammenspiel mit Klasse-II TGA Faktoren die Genexpression aktiviert.
ET/JA-induzierte Abwehrreaktionen gegen nekrotrophe Pathogene sind ebenfalls von TGAs der Klasse II abhängig (Zander et al., 2010). Steigende ET-Konzentrationen inaktivieren die am Endoplasmatischen Retikulum (ER)-lokalisierten ET-Rezeptoren, dies führt zu einer Inaktivierung der CTR1 (CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1) Kinase und zur folglichen Stabilisierung von EIN3 (ETHYLENE INSENSITIVE3). EIN3 ist ein Transkriptionsfaktor, der die ORA59 (OCTADECANOID-RESPONSIVE ARABIDOPSIS AP2/ERF-domain protein 59) Expression aktiviert. EIN3 wird ebenfalls über den JA-Signaltransduktionsweg gesteuert (Zhu et al., 2011). Dies geschieht durch die Interaktion mit JASMONATE ZIM DOMAIN (JAZ) Proteinen, die als negative Regulatoren der Transkription fungieren (Chini et al., 2007; Pauwels and Goossens, 2011; Pauwels et al., 2010; Thines et al., 2007). Akkumulierendes Jasmonoyl- Isoleucin (JA-Ile) bindet an das F-Box Protein CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1), dies erleichtert die COI1-JAZ Bindung. COI1 vermittelt durch die Poly-Ubiquitinierung den Abbau von JAZ (Chini et al., 2007; Thines et al., 2007). Die Aktivierung von ORA59 kann somit durch zwei Mechanismen vermittelt werden: (1) Durch die ET-induzierte Stabilisierung von EIN3 und (2) durch den JA-induzierten Abbau der JAZ Repressoren (Abbildung 1.6). Der Promotor von ORA59 besitzt ein TGACGT-Element, an das die Klasse II TGAs binden können, um so die
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ORA59 Transkription und weiterer ET/JA-regulierter Zielgene wie PDF1.2 zu induzieren. TGA- Faktoren spielen jedoch nur bei erhöhten ET-Konzentrationen eine Rolle für die PDF1.2 Expression (Zander et al., 2010).
Die SA und ET/JA-vermittelten Abwehrreaktionen können nicht gleichzeitig aktiviert werden und je nach Zeitpunkt und Intensität der Infektionen mit biotrophen und nekrotrophen Pathogenen, wird einer der beiden Wege priorisiert (Pieterse et al., 2009). Hierdurch ergibt sich die Notwendigkeit, dass sich der SA-Signalweg und der JA/ET-Signalweg gegenseitig reprimieren müssen. Zander et. al (2014) zeigten, dass die Aktivität des ORA59 Promotor negativ durch SA über Klasse II TGA Faktoren reguliert werden kann. Zudem wird der Abbau des ORA59 Proteins durch SA eingeleitet (Van der Does et al., 2013).
Chromatin-Immunopräzipitationen (ChIP) entschlüsselten, dass Klasse II TGAs direkt an den ORA59 Promotor binden können (Zander et al., 2014). Ein möglicher Mechanismus für die Inaktivierung von TGA2 am ORA59 Promotor wurde nach der Identifizierung von ROXY19 postuliert, welches im Hefe-Zwei-Hybrid Test mit Klasse II TGAs physikalisch interagieren kann. Ektopisch exprimiertes ROXY19 reprimiert die ET/JA-induzierte ORA59 und PDF1.2 Expression auf eine Klasse II TGA-abhängige Weise (Ndamukong et al., 2007; Zander et al., 2012) (Abbildung 1.6).
Abbildung 1.6. Vereinfachte Schemazeichnung der ROXY19- abhängigen Regulierung von ORA59. ROXY19 Expression wird durch JA und SA induziert. Die negative Regulierung des Transkriptionsfaktors ORA59 durch ROXY19 ist TGA2-5-6- abhängig. Der Mechanismus ist derzeit nicht bekannt. ORA59 wird durch den ET und JA stabilisierten ERF Transkriptionsfaktor EIN3 positiv reguliert. ORA59 ist ein Hauptregulator der JA/ET-induzierten Pathogenabwehr und reguliert unter anderem das Markergen PDF1.2 positiv.
TGAs der Klasse II sind zudem an der Aktivierung von Entgiftungsgenen nach Behandlungen mit Oxylipinen oder Xenobiotika beteiligt (Fode et al., 2008; Mueller et al., 2008).
Eine Microarray-Anaylse zeigte, dass 56% (250/446) der Herbizid Safener-induzierten und 60% (247/411) der Phytoprostan-PPA1-induzierten Gene in der tga256 Mutante (in der alle TGAs der Klasse II fehlen) niedriger exprimiert werden. Weitere Analysen zeigten, dass 60%
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bzw. 42% dieser Gene ein TGACG-Motiv in ihren Promotoren enthielten (Behringer Carina et al., 2011; Mueller et al., 2008). Folglich können xenobiotische Stressfaktoren diese Gene durch die Aktivierung von Klasse II TGAs induzieren. Die Aktivierung einer Untergruppe der Entgiftungsgene erfordert das TGA-interagierende GRAS (GIBBERELLIC-ACID INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR of GAI (RGA) and SCARECROW (SCR)) Protein SCL14 (einem Interaktionspartner von TGA2) (Fode et al., 2008). Kürzlich wurde gezeigt, dass ektopisch exprimiertes ROXY19 (und ROXY18) den Entgiftungsweg negativ reguliert (Huang et al., 2016). Ähnlich wie die tga256 Mutante sind 35S:ROXY19-Pflanzen anfälliger für die xenobiotische Chemikalie TIBA. Die repressive Funktion ist abhängig vom putativen aktiven Zentrum (CCMC), welches auch zum CPYC mutiert werden kann, aber nicht zum SSMS.
Eine Vielzahl von Xenobiotika zeigt eine Induktion von gemeinsamen Genen (Behringer Carina et al., 2011; Mueller et al., 2008). Dies weist auf eine geteilte Signaltransduktion der Chemikalien hin. Es ist bekannt, dass verschiedene xenobiotische Stressfaktoren eine ROS- Akkumulation hervorrufen und oxidativen Stress verursachen (Ramel et al., 2012). Das as-1- ähnliche Promotorelement kann durch oxidativen Stress induziert werden. Der ROS Induktor MeV aktiviert das as-1-ähnliche Promotorelement, während Antioxidantien (wie Dimethylthioharnstoff und butyliertes Hydroxyanisol) SA-induzierte oxidative Schäden verhindern und SA-aktivierte as-1-ähnliche Elemente inhibieren (Garretón et al., 2002). Ein möglicher Signaltransduktionsweg des xenobiotischen Entgiftungswegs könnte sein, dass Xenobiotika die Akkumulation von ROS induzieren, dies kann durch TGA Transkriptionsfaktoren wahrgenommen werden. Dies führt zur Bindung der TGAs an as-1- ähnliche Elemente von Xenobiotika-induzierbaren Genpromotoren, deren Expression hierdurch aktiviert wird.
1.6 ROXY19 interagiert mit TOPLESS
Uhrig et al. (2017) zeigten, dass ROXYs mit Transkriptions-Co-Repressoren der TOPLESS (TPL) Familie, die mit TUP1 in Pilzen und GROUCHO/TLE in Tieren verwandt sind interagieren können. Diese Interaktion wird durch das am Ende des C-Terminus konservierte Ala- (Leu/Ile)-Trp-(Leu/Val) Motiv vermittelt. Es konnte zudem ein ternärer Komplex zwischen TGA2, ROXY19 und TPL in Hefe nachgewiesen werden. Somit könnten CC-Typ GRXs als Adapterproteine für den Zusammenbau von Transkriptionsrepressor-Komplexen an TGA- regulierten Promotoren fungieren. Die repressive Funktion des ROXY19 könnte demnach durch „Chromatin Remodelling“ verursacht werden.
1.7 CC-Typ Glutaredoxine könnten die Bindungseigenschaften von TGA Faktoren beeinflussen
Eine weitere Möglichkeit für eine Funktion der CC-Typ GRXs könnte ein Einfluss auf die Bindeaktivität der TGA TFs sein. Für PAN wurde gezeigt, dass die Bindung an einen Promotor eines Zielgenes unter oxidierenden Bedingungen stark reduziert ist (Gutsche and Zachgo, 2016). Die redox-sensitive DNA-Bindung wird über einen nur in PAN vorkommenden N- Terminus vermittelt, der in anderen Arabidopsis TGA TFs nicht vorhanden ist und fünf Cysteine umfasst. Zwei N-terminale PAN-Cysteine, Cys68 und Cys87, bilden eine
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Disulfidbrücke und Cys340, lokalisiert in einer C-terminalen putativen Transaktivierungsdomäne, kann möglicherweise S-glutathionyliert sein (Gutsche and Zachgo, 2016). Mutationen der einzelnen Cysteine im N-Terminus von PAN waren jedoch in der Lage die pan Mutante zu komplementieren, womit die Disulfidbrücke keinen Einfluss auf das Bindeverhalten von PAN hat (Li et al., 2009). Nur die Cys340Ser Mutante war nicht in der Lage pan zu komplementieren. Cys340 ist daher der einzige Cysteinrest, welcher wichtig für die Funktion von PAN ist. Dieses Cystein könnte ein spezifisches Ziel für Redoxmodifikationen durch ROXY1 und/oder ROXY2 sein.
1.8 Ziel der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Eigenschaften von ROXY19 in vitro zu untersuchen.
Insbesondere wurden Glutaredoxin-spezifische Eigenschaften, wie die Glutathionbindung, enzymatische Aktivität als Oxidoreduktase und die Eisen-Schwefel-Cluster Inkorporation adressiert. Es sollte geklärt werden, ob das Pflanzen-spezifische hoch konservierte CCMC/S Motiv der CC-Typ Klasse GRXs dieselben biochemischen Eigenschaften wie die CPYC-Typ oder CGFS-Typ GRXs hat. Dies könnte einen Hinweis auf einen möglichen Mechanismus der Repression von TGA Klasse II kontrollierten Genen ergeben.
In planta sollte der TIBA anfällige Phänotyp von Pflanzen, die ROXY19 exprimieren (Huang et al., 2016), einem der Cysteine im putativen aktiven Zentrum zugeordnet werden.
Desweiteren sollte der Einfluss der Eisenverfügbarkeit in planta auf die ROXY19-vermittelte Repression von TGA Klasse II kontrollierten Genen getestet werden.
25 2 Material und Methoden
2.1 Material 2.1.1 Organismen 2.1.1.1 Bakterien Bakterien
Stamm
Beschreibung (Genotyp) Verwendung Referenz Escherichia coli
DH5α
F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA
supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ
Vermehrung von Plasmiden ohne
„Gateway“ Kassette
Thermo Fisher Scientific
Escherichia coli DB3.1
F– gyrA462 endA1 Δ(sr1- recA) mcrB
mrr hsdS20(rB–, mB–) supE44 ara-14
galK2 lacY1 proA2 rpsL20(SmR) xyl-5 λ– leu mtl1
Vermehrung von Plasmiden mit
„Gateway“ Kassette
Thermo Fisher Scientific
Escherichia coli BL-21(DE3)
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Proteinexpression NEB, USA
Escherichia coli BL-21 star (DE3)
fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS λ DE3 = λ sBamHIo ΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1) i21 Δnin5
Proteinexpression NEB, USA
Agrobacterium tumefaciens GV3101
PMP90RK rifr, gmr Transformation von Pflanzen
Koncz und Schell, 1986
2.1.1.2 Pflanzen
Pflanze Beschreibung Referenz
Col-0 Arabidopsis thaliana Columbia-0 TAIR 35S:HA-ROXY19 Col-0 Überexpressionslinie, exprimiert
ROXY19 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
AG Gatz und diese Arbeit
35S:HA-ROXY19 SCMC
Col-0 Überexpressionslinie, exprimiert ROXY19 SCMC unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
Diese Arbeit
35S:HA-ROXY19 Col-0 Überexpressionslinie, exprimiert Diese Arbeit
