die Zell-Zell-Kommunikation und -Fusion in Neurospom crassa

Definierte strukturelle Merkmale

von

Sterolen beeinflussen die Zell-Zell-Kommunikation und -Fusion in Neurospom

^crassa

Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

der Technischen Universität

Carolo-Wilhelmina

zu

Braunschweig

zur

Erlangung

^des

Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

(Dr.

^rer.

nat.) genehmigte

Dissertation

von

Martin

^Weichert

aus

Stendal

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

VII

Abbildungsverzeichnis

IX

Tabellenverzeichnis _XV

1 EINLEITUNG 1

1.1 Zell-Zell-Fusionensind

Grundlage

^{für die}

Entwicklung

^höherer

eukaryotischer

Lebensformen ₁

1.2 Der filamentösePilz

Neurospora

^crassa

eignet

^{sich zur}

Untersuchung

^der

Kommunikation und

Fusion

zwischen

eukaryotischen

^{Zellen 3}

1.2.1 N.crassaistein

typischer

Vertreter der

filamentösen Ascomyceten

⁴

1.2.2 Der

Lebenszyklus

^{vonN. crassa}umfasst sowohl

vegetative

als auch sexuelle

Fusionsereignisse

7

1.3 Die

Kommunikation

und Fusion zwischen

vegetativen

^{ZellenvonN.crassa}

erfolgt

über einen

ungewöhnlichen Signalmechanismus

⁹

1.3.1

Die

MAP-Kinase MAK-2 und das

Signalprotein

SO werden oszillierendandie

Zellspitzen

von

Keimlingen

^rekrutiert 9

1.3.2 Die

Interaktion

zwischen

Keimlingen

schließt eine Reihe vonMembran-assoziierten

Signaltransduktionsprozessen

^{ein 12}

1.4 Sterole

tragen maßgeblich

^zur

Signaltransduktion

ⁱⁿ

eukaryotischen

^{Zellen bei 16}

1.4.1 Sterole modifizieren die

physikalischen Eigenschaften eukaryotischer

Membranen und

bilden

dynamische

Membrandomänenaus 17

1.4.2 Die Plasmamembranvon

Ascomyceten

^enthält

Ergosterol

¹⁸

1.4.3

Störungen

^der

Biosynthese

^von

Ergosterol beeinträchtigen ^die

Zell-Zell-Kommunikation

und -Fusion in

Ascomyceten

20

1.5

Zielsetzung

dieser Arbeit 24

2

MATERIALIEN

& METHODEN 27

2.1 Materialien 27

2.1.1

Stämme

₂₇

2.1.2

Plasmide

₃₂

2.1.3

Oligonukleotide (Primer)

33

I

2.1.4

Enzyme

^{• 36}

2.1.5

Antikörper

³⁶

2.1.6

Chemikalien,

^{Puffer und}

Lösungen

³⁷

2.1.7 Wachstumsmedien 43

2.1.8 Geräte 45

2.2 Methodenzur

Kultivierung

^und

^Analyse

^{vonN. crassa 45}

2.2.1

Vegetative Vermehrung

^{vonN. crassa 45}

2.2.2

Untersuchung

^der

Keimlings-

^und

Hyphenfusionen

^{vonN. crassa 46}

2.2.3

Bildung heterokaryotischer

^{Stämme 50}

2.2.4

Untersuchung

^der

Stresstoleranz

^{vonN. crassa-Stämmen 50}

2.2.5

Kultivierung

^und

Analyse

^{von sexuellen}

Vermehrungsstrukturen

^{vonN. crassa 51}

2.3 Methoden zur

Kultivierung

^und

^Analyse

^{vonB. cinerea 54}

2.3.1

Vegetative Vermehrung

^{vonB.cinerea 54}

2.3.2

Untersuchung

^der

Keimlingsfusionen

^{vonB. cinerea 54}

2.4

Herstellung

^vonDauerkulturen und

Lagerung

^{von Stämmen 55}

2.5 Hellfeld- und

Fluoreszenzmikroskopie

⁵⁶

2.6

Molekularbiologische

^{Methoden 57}

2.6.1 Extraktion

genomischer

^{DNAausN. crassa 57}

2.6.2

Polymerase-Kettenreaktion ^(PCR)

⁵⁸

2.6.3

Agarose-Gelelektrophorese

⁵⁸

2.6.4

Klonierung

^von

^Plasmiden

⁵⁹

2.6.5 Yeast

recombinational cloning

⁶³

2.6.6 TransformationvonN. crassa 65

2.6.7

Einzelsporisolation

^vonPrimärtransformanten 66

2.6.8

Sequenzierung

^von

Nukleotid-Sequenzen

⁶⁶

2.7 Biochemische Methoden 67

2.7.1 ProteinextraktionausKulturenvonN.crassa 67

2.7.2 SDS-PAGE und

Coomassie-Färbung

⁶⁹

II

2.7.3 Western

Blotting, Ponceau-Färbung

^und

Hybridisierung

^vonPVDF-Membranen 70

2.8 Extraktion und

Analyse

^{vonSterolen 72}

2.9 Statistische

Datenauswertung

^{, 73}

3 ERGEBNISSE 75

3.1 Mutanten der

Ergosterol-Biosynthese

^{vonN. crassa}weisen Defekte während der

vegetativen

Zell-Zell-Kommunikation und -Fusion auf. 75

3.1.1 Die meisten

erg-Mutanten

^{sind dem}

Wildtyp makroskopisch

^{ähnlich 75}

3.1.2 Eine

spezifische Gruppe

^von

erg-Mutanten

weist Defekte während der Kommunikation

zwischen

Keimlingen

^{auf 77}

3.1.3 Eine veränderte

Sterol-Zusammensetzung

kann die Zell-Zell-Fusion zwischen

Keimlingen

stören 79

3.2 Die

Ergosterol-Biosynthese-Mutante Aerg-2

^{weist eine}

spezifische Beeinträchtigung

vonFaktoren des

MAK-l-Signaltransduktionswegs

^{auf 83}

3.2.1

Keimlinge

^der

Aerg-2-Mutante

^setzendas

gerichtete

Wachstum nach Zell-Zell-Kontakt fort83

3.2.2 Die Deletionvon

erg-2

stört die Fusionzwischen

vegetativen Hyphen

⁸⁵

3.2.3 DerC-terminale BereichvonERG-2bestimmt dessen Funktionalität 87

3.2.4 Die Deletionvon

erg-2 beeinträchtigt

die subzelluläre

Lokalisierung

^des

Signalproteins

^SO

während der Zell-Zell-Kommunikation 90

3.2.5 Interaktionenmit

Aerg-2

^{stören die}

Lokalisierung

^{von SO in}

WT-Keimlingen

⁹⁵

3.2.6 Die

Manipulation

des Proteins SO

provoziert Aerg-2-ähnliche

Defekte während der

Keimlingsinteraktionen

¹⁰¹

3.2.7 Die MAP-Kinase MAK-1 weist eine verminderte

Aktivierung

ⁱⁿ

Aerg-2-Keimlingen

^{auf... 107}

3.2.8 Die Deletionvon

erg-2

^störtdie

Rekrutierung

^vonMAK-1 nach Zell-Zell-Kontakt 110

3.2.9 Die chemische

Inhibierung ^der

^{MAP-KinaseMAK-1}

provoziert

Defekte ähnlichzudenen

von

Aerg-2-Keimlingen

¹¹⁴

3.2.10 MAK-1 und SO kolokalisieren

vorübergehend

^am

Fusionspunkt

¹²³

3.2.11 Die verminderte

Expression

^vonFaktoren des MAK-1

-Signalwegs provoziert Aerg-2-

ähnliche Defekte in

Keimlingen

^und

Hyphen

¹²⁶

3.2.12 Die

Deletion

von

erg-2 beeinträchtigt

nicht die mit

Zellwand-

und Zellmembran-Stress

assoziierten FunktionenvonMAK-1 undSO 132

III

3.3 DiePlasmamembran-Fusion zwischen

Keimlingen

^ist

spezifisch

in den Mutanten

Aerg-lOa \erg-10b

^und

Aerg-1 gestört

¹³⁹

3.3.1 Die reduzierte Fusionsrate der

Keimlinge

^von

Aerg-lOa Aerg-lOb

ist auf Defekte während

der Plasmamembran-Fusion zurückzufuhren 139

3.3.2 MAK-2 fehllokalisiert

entlang

der nicht miteinander fusionierenden Plasmamembranen

von

Aerg-lOa Aerg-lOb

^{und APrml 145}

3.3.3 DieMutante

Aerg-lOa Aerg-lOb

^störtim

Gegensatz

^zuAPrml nicht die Zell-Zell-Fusion

während des

Matings

¹⁴⁷

3.3.4

Keimlinge

^von

Aerg-1

^{weisen mit}

Aerg-lOa Aerg-lOb vergleichbare

Defekte während der

Plasmamembran-Fusion auf ¹⁵¹

3.4 Eine veränderte

Sterol-Zusammensetzung beeinträchtigt

^die

geschlechtliche

Entwicklung

^{vonN. crassa 155}

3.4.1 Die meisten Mutanten der

Ergosterol-Biosynthese

weisen zueinander ähnliche

Fertilitätsdefekte auf ¹⁵⁵

3.4.2 Die durch eineveränderte

Sterol-Zusammensetzung

verursachten Fertilitätsdefekte nach

Karyogamie ^werden

^{durch den}

Suppressor

^ASad-1

kompensiert

¹⁶⁴

3.5 Das sich in

Aerg-2

akkumulierende Sterol-Intermediat beeinflusst die Membran-

Fluidität ¹⁶⁹

3.5.1 Die

Gesamtmenge

^anSterolen wird durch

Aerg-2

^nicht

signifikant

beeinflusst 169

3.5.2 Erhöhte

Temperaturen

blockieren die Interaktionen zwischen

Aerg-2-Keimlingen

¹⁷¹

3.5.3 Der

Ergosterol-Biosynthese-Inhibitor

^Fluconazol

beeinträchtigt

^das

vegetative

^Wachstum

vonN. crassa 174

3.5.4 Fluconazol mindert die Zell-Zell-Kommunikationvon

Keimlingen

und verursacht ein

Aerg-2-ähnliches

^{VerhaltenvonWT-Zellen 177}

3.5.5 Die

Gegenwart

^{vonFluconazolstört}die subzelluläre

Lokalisierung

^von SO und MAK-2

in

WT-Keimlingen

¹⁸²

3.5.6 Die DeletionvonGenen der

Sphingolipid-Biosynthese

hat keinen Einfluss auf die

vegetative

Zell-Zell-Kommunikation und -Fusion 185

3.6 Die

vegetative

Zell-Zell-Kommunikation und -Fusion in filamentösen Pilzen wird

durch ROS

reguliert

¹⁸⁹

3.6.1

Keimlingsinteraktionen

^{in N.crassa}

werden

durch ROS kontrolliert 189

IV

3.6.2

Keimlinge

^von

Botrytis

^cinerea

interagieren

^{über einenvonROS}

abhängigen

Mechanismus

miteinander 192

3.6.3

Keimlinge

^{vonN. crassaundB. cinerea}kommunizieren

über

^die

Spezies-Grenze ^hinweg

miteinander 197

4 DISKUSSION 201

4.1 Die

gestörte

Kommunikation und Fusion zwischen

A^rg-2-Keimlingen

^beruhtauf

einer

Beeinträchtigung

^{von SO unddamit}assoziierten Proteinen 202

4.2 SO

agiert

während des

Zelldialogs

^als

potenzielles Scaffold-Yrotem

^desMAPK-

ModulsumMAK-1 207

4.3 Die

kontaktabhängige Zell-Zell-Erkennung

erfordert die

Aktivierung

^{von MAK-1}

über

Membran-ständige Oberflächenproteine

²¹²

4.4 Einezusätzliche

Doppelbindung

in der Seitenkettevon

Ergosterol

^{könnte die}

Membran-Fluidität

^{erhöhen 217}

4.5 Die Struktur des

Ringsystems

^vonSterolen

trägt

^zur

Verschmelzung

^von

Plasmamembranen währendder

vegetativen

Zell-Zell-Fusion bei 224 4.6 Das Modell der

vegetativen

Zell-Zell-Interaktionen in N. crassa scheintauf andere

filamentöse Pilz

übertragbar

^{zu sein 231}

4.7 Sterole üben einen

allgemeinen

Einfluss aufdie

Reifung

^und

Entwicklung

^von

Fruchtkörpern

^{in N. crassa aus 235}

4.8 Inhibitoren der

Ergosterol-Biosynthese beeinträchtigen

die FunktionvonProteinen

der

vegetativen

Zell-Zell-Interaktionen 242

5 ZUSAMMENFASSUNG 247

6 LITERATURVERZEICHNIS 249

7 ANHANG 265

7.1

Anhang

^zuAbschnitt 3.1 265

7.2

Anhang

^{zuAbschnitt3.2 267}

7.3

Anhang

^{zuAbschnitt3.3 289}

7.4

Anhang

^zuAbschnitt 3.4 293

7.5

Anhang

^zuAbschnitt 3.5 ²⁹⁷

7.6

Anhang

^zu Abschnitt 3.6 ³¹⁶

Danksagungen

³²¹

V