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BIOCHEMIE BAN
ERWIN CHAGRAFF Hat herausgefunden, dass:
• Sich die DNA verschiedener Arten unterscheiden → hauptsächlich in der Anzahl der Basen
• In allen DNAs sowohl die Anzahl T-A und C-G gleich sind DNA STRUKTUR/ AUFBAU
→Polymer aus Nucleotiden
(Monomer aus Zucker, Phosphat und Base)
• Information in der DNA wird durch Abfolge der Basen bestimmt
RÜCKGRAD:
Zucker und Phosphate bilden das Rückgrat der DNA
• Zucker kann Ribose oder Desoxyribose sein, die über Phosphodiesterbindungen mit Phosphaten verknüpft sind (DNA: Desoxyribose: 2’-C ist reduziert)
• Negative Ladung der Phosphatbrücken ⇨ DNA/RNA sind negativ geladen! →Schutz vor Hydrolyse durch
nukleophile Spezies
• Die zusätzliche Reduktion der DNA macht sie noch stabiler gegenüber Hydrolyse (im Vergleich zur RNA)
BASEN:
⇨ Pyrimidine: Cytosin, Thymin, Uracil (6-Ring)
⇨ Purine: Adenin, Guanin (5- und 6-Ring)
• RNA: Thymin wird von Uracil ersetzt
➔ NUKLEOTIDE:
• Bestehen aus Phosphat(e) + Zucker + Base
• Können auch andere Funktionen haben z.B. als Energie- oder Gruppenträger
• Nucleoside sind Nucleotide ohne Phosphat und werden entsprechend anders benannt:
⇨ In RNA: Adenosin, Guanosin, Cytidin, Uridin
⇨ in DNA: Deoxyadenosin, …, Thymidin
• Beispiel: Adenosin-5’-triphosphat (Nukleosid + Phosphat
⇒ Nukleotid)
• Monophosphat-Nukleotide bilden Bausteine der
⇨ RNA: Adenylat, Guanylat, Cytidylat, Uridylat
⇨ DNA:Deoxyadenylat, -guanylat, cyticylat, –thymidylat
DNA DIREKTIONALITÄT
• DNA ist nicht symmetrisch, sondern polarisiert
• 5’-Ende mit Phosphatgruppe
• 3’-Ende mit OH-Gruppe
• E. Coli: 1 DNA-Strang bildet ganzes Genom und hat ca.
4.6 Mio. Nukleotide
• Mensch: 3 Bio Nukleotide pro Genom, aufgeteilt auf 24 DNA-Chromosomen
DNA DOPPELHELIX:
→Doppelhelix vereinfacht Replikation:
anstatt einen Strang zuerst zu transkribieren und dann wieder
zurückzuschreiben, können beide Stränge einmal abgelesen und so in einem Schritt in den Schwesterstrang umgewandelt werden.
→James Watson und Francis Crick
Entwickelten das erste DNA-Strukturmodell, das folgende Muster im DNA-Aufbau suggerierte (Watson-Crick-Modell):
1. Zwei antiparallele Stränge sind jeweils zu einer rechtshändigen Helix verdreht.
2. Die Basen liegen im Innern des Helix, das Rückgrad (Zucker + Phosphate) aussen
3. Die Basen stehen im Abstand von ca. 3.4Å im rechten Winkel zum Rückgrat, und die helicale Struktur wiederholt sich ca. alle 34Å (nach ca. 10.4 Basen). Pro Base wird eine Windung von 36° eingegangen (⇨ nach 10.4 Basen volle Drehung)
4. Helixdurchmesser = 20Å
Crick und Watson entdeckten ebenfalls die Regeln der Basenpaarung →entdeckten, dass Guanin und Cytosin gleichhäufig vorkommen, genauso wie Thymin und Adenin.
• Basen sind über H-Brücken verbunden
• Stabilisierung durch die Paarung auf zwei Ebenen:
2 o Hydrophober Effekt wird begünstigt und DNA-
Formation erleichtert (hydrophobe Basen ins Innere geladenes Rückgrat nach aussen zum Wasser) o Van der Waals-Kräfte zw. den Basen führen zu deren
Anziehung, was ebenfalls ihre Clustering erleichtert
→Basen sind im Zentrum des Helix geclusteret.
beide Stränge liegen dichter als beim Major Groove.→Minor Groove:
die
WATSON CRICK BASENPAARUNG:
DNA FORMEN
• DNA tritt in drei Formen auf, die je nach Umfeld bevorzugt werden: A-, B-, Z-Form
• Wir besitzen die B-Form der DNA
Z-Form:
• Linkshändig mit zickzack-Rückgrat
• Funktion noch unbekannt
ZIRKULÄRE DNA UND SU PERCOILS
• Menschliche DNA ist linear
• Ohne Coils = relaxed molecule
• Prokaryotische DNA ist zirkulär und bildet einen sog.
Superhelix, der zahlreiche spiralisierte (= supercoiled) DNA-Abschnitte enthält
⇨ kompaktere Verpackung
⇨ verhindert nachteilhafte Interaktion mit anderen Molekülen
STRUKTUR EINSTRÄNGIGER DNA
• Einzelstränge bilden spezifische Faltstrukturen (besonders häufig in RNA-Komplexen)
• Einfachste Form: stem-loop, wenn komplementäre Basen zusammenlagern und eine Doppelhelix-artige Struktur bilden:
3
• Komplexere Strukturen werden durch Interaktion von Basen gebildet, die sich nicht direkt
gegenüberliegen. Oft werden die Interaktionen durch Ionen (insb. Mg2+) unterstützt.
• Die einsträngige Faltung der RNA erlaubt grössere Funktionsvielfalt als DNA
• Lineare DNA wird als coiled bezeichnet
• Geschlosse, zirkuläre DNA wird sie supercoiled genannt Lk („linking number“): Anzahl Watson- Crick-Windungen in planarem Zustand TW („twisting number“) = wenn es nicht planar liegt
Wr („writhe“) = Anzahl supercoils (negativ, wenn rechtshändig, positiv, wenn linkshändig)
L
k= T
w+ W
r• Solange das Molekül planar bleibt, ist Lk = Tw.
• Durch Entwindung ändert sich Lk
• Ungetwistete DNA ist instabil und wird automatisch supercoils ausbilden. Dadurch muss die Struktur aus der planaren Ebene befördert werden ⇨ Lk ≠ TW.
• Moleküle, die sich nur in LK unterscheiden, sind Topoisomere Sie können durch Einzel- oder
Doppelstrangbruch und Ligierung ineinander überführt werden
• Positives Supercoiling (linkshändig): führt zur DNA Verdichtung, erschwert Auftrennung der Einzelstränge
• Negatives Supercoiling (rechtshändig): kommt häufiger Vor → bereitet DNA auf Trennung der Stränge vor (z.B.
vor Replikation). Dazu werden aber die Supercoils lokal zuerst gelöst (von Topoisomerase)
4 DNA-REPLIKATION
• ist semikonservativ: neugebildete DNA-Moleküle bestehen aus 1 neusynthetisiertem Strang und einem Mutterstrang.
• Der Prozess führt zu zwei Problemen:
PROBLEM I:
→Kopiermechanismus führt aufgrund der Entwindung zu Überspannung, je mehr die Stränge aufgetrennt werden
Lösung:
Topoisomerase löst die Überspannung, indem sie kurzfristig kovalent an die DNA bindet →Ein Strang wird dadurch geschnitten → Dieser rotiert um den anderen herum und baut die Energie der Überspannung ab. Anschliessend wird die DNA wieder geschlossen.
PROBLEM II:
→Polymerase kann nur in 5’-3’-Richtung synthetisieren, aber es müssen beide Stränge repliziert werden.
Lösung:
• leading strand kann kontinuierlich synthetisiert werden
• 5’-3’-Richtung verlaufender Strang (=lagging strand) wird nicht kontinuierlich synthetisiert:
→ stückweise Replikation: Es werden in periodischen Abschnitten RNA-Primer an den template strand geheftet
• Es entstehen ca. 1000 Nuceotide lange Sequenzen
=Okazakifragmente
o Die Primer werden zuerst wieder entfernt und die Primer-Lücken von der Polymerase I ersetzt o Danach werden sie durch die Ligase (unter ATP-
Verbrauch) zusammengefügt
Primer = RNA- oder DNA-Sequenz, die durch die Replikation verlängert wird. Bei der Replikation werden diese RNA-
Einheiten zum Schluss wieder ausgeschnitten und durch DNA ersetzt.
Template = RNA- oder DNA-Sequenz → dient als Vorlage der Replikation und ist komplementär zum Syntheseprodukt DNA POLYMERASE
• Ist ein prozessierendesEnzym = katalysiert mehrere aufeinanderfolgende Reaktionen ohne Freilassung der Intermediate (hier: viele Nukleotide werden angefügt)
• Benötigt folgendes
o 2 Mg2+ →über Asp-Reste im aktiven Zentrum verbrückt, eines stabilisiert das 3’OH des Primers, das andere interagiert mit dem anzufügenden dNTP o Primer mit freiem 3’-OH, an die die Synthese
angebaut werden kann (RNA-Polymerase benötigt keine Primer!)
o aktivierte dNTPs
• besteht u.a. aus drei Domänen, die zusammen wie eine rechte Hand aussehen:
⇨ Daumen
⇨ Finger: schliesst zu enger Kluft, in der die template Base und das komplementäre dNTPs
eingeschlossen werden. Diese Konformationsänderung findet nur statt, wenn das dNTP auch wirklich das richtige ist → hohe Spezifität der Polymerase.
⇨ Handfläche
⇨ Exonuclease → zur Reparatur
• Ist template-directed → heftet nur Nucleotide an, wenn diese zuerst eine Basenpaarung zur Base am template strand eingeht. Achtung: die Basenpaarung hängt weniger von H-Brücken als von der Form der Basen.
• Sie formt Phosphodiesterbindungen zw. Nukleotiden → Mittels Hydrolyse: Wasser wird eingebracht und Pyrophosphat geht aus den aktivierten dNTPs ab.
• Einige DNA Polymerasen (z.B. Polymerase I) haben exonucleäre Eigenschaften →übernehmen Proofreading
5 in 3’-5’-Richtung und Reparatur in 5’-3’- Richtung durch Strangbrüche
REPLIKATIONSMECHANIS MUS
1. Helicase: entwindet Doppelhelix mittels ATP und formt eine Replikationsgabel.
• besteht aus 7 Untereinheiten. die zusammen einen Ring bilden
• Jede Einheit besitzt einen Loop im Ringzentrum, mit dem sie mit der DNA interagieren kann
➔ Die Entwindung führt nun zur Überspannung
2. Topoisomerase: baut Überspannung durch kurzfristige Einzelstrangbrüche ab
3. Primase: bringt ein RNA-Primer am leading strand und kontinuierlich neue Primer am lagging strand an 4. DNA-Polymerase III: besitzt eine DNA-umschliessende
Untereinheit (β2-Dimer), die einen sliding clamp (DNA- Klammer) bildet, durch den die DNA geschleust wird, während kontinuierlich dNTPs angefügt werden
Die DNA wird mithilfe von sogenannten „clamp loaders“ in den sliding clamp eingeschlossen. Sie öffnen die beiden halbringförmigen β2- Einheiten und schliessen sie wieder wie ein Schloss
Ein Polymerase-Holoenzym enthält neben dem clamp loader zwei Kernenzyme (mit je einem β2-Dimer),
von denen jedes einer der beiden Stränge synthetisiert.
→Der gesamte Polymerase-Komplex interagiert direkt mit der Helicase. Zur Synthese wird der lagging strand zusätzlich geloopt, sodass er schön parallel zum leading strand durch die Polymerase geschleust werden kann. Dabei formt sich eine Art trombone slide (= Posaunenschiene). Der Loop wird immer neu geformt, sobald die Polymerase auf den bereits synthetisierten Abschnitt
trifft.
SSBs (single-stranded binding proteins) unterstützen die Replikation
5. DNA Ligase: katalysiert Phosphodiesterbindung zw. dem 3’-OH und dem 5’-Phosphat zweier Nucleotide Dies benötigt ATP (in Bakterien NAD+). Sie kann nur Doppelstränge ligieren, keine Einzelstränge.
LIGASE
6 REPILKATION IN E COL I
1. Replikation beginnt an ORIs (origins of replication) (werden OriC genannt und sind im zirkulären Genom verteilt)
2. 6 DnaA Proteine binden je an einen OriC und lagern zu einem Hexamer zusammen. Der Komplex erleichtert die Entwindung der DNA
3. DnaB (Helicase) wird mithilfe von DnaC rekrutiert und OriC-Regionen (insb. AT-Regionen) aufgetrennt und durch SSBs stabilisiert (⇨ Replikartionsgabeln). All diese Einheiten zusammen bilden den sog. prepriming complex, der den Zugang anderer Proteine ermöglicht
4. Hexamerkomplex wird aufgebrochen und die Synthese schreitet durch die DNA-Polymerase III in beide
Richtungen einer Replikationsgabel fort
5. Termination durch Bindung des Tus-Proteins an eine Terminatorsequenz Zudem wird die Replikation durch die Helicase blockiert.
REPLIKATION IN EUKARYOTEN
• Findet an ca. 30'000 Stellen im DNA-Molekül gleichzeitig statt ⇨ um zu verhindern, dass DANN mehrmals repliziert wird, binden aktive Cyclin-CdK Komplexe an die ORIs und regulieren die Replikation.
• Initiierung findet durch 6 aDNA-Homologe statt und erfordert ebenfalls Helicase-Rekrutierung
• Polymerase-switching: DNA-Polymerase α beginnt
• mit der Replikation (Initiator-Polymerase mit Primase- Subunit), während DNA-Polymerase 𝛿 (prozessiver als α) damit weiterfährt.
TELOMERVERKÜRZUNG
→letzter Primer des diskontinuierlich synthetisierten Strangs kann nicht mehr durch die Polymerase III ersetzt werden → Bei jeder Synthese entsteht Verkürzung DNA-Enden besitzen jedoch repetitive Sequenzen (=Telomere), die durch die Telomerase angefügt werden können → Dadurch wird die DNA wieder verlängert TELOMERASE:
• enthält komplementäre Telomersequenzen → kann mit denen an DNA-Enden binden
• hat Funktion als reverse Transkriptase: ist sie in der Lage, ihre komplementäre RNA-Sequenz in eine DNA-Sequenz
umzuschreiben (Telmere) und diese in die Primerlücke anzufügen
• Die Telomeren bilden Duplex-Loops an den Enden, die Reaktivität senken und schützende Köpfchen bilden
• Telomere sind in normalen Zellen inaktiv → Seneszenz/ Zellalterung
• Krebszellen können Telomerasen aktivieren und ihre exzessive Proliferation erhalten
7 DNA-REPARATUR
➔ Die Anzahl Mutationen würde ohne
Reparaturmechanismen immer weiter zunehmen → würden an alle neusynthetisierten Stränge
weitervererbt werden
MUTATIONEN DURCH MUTAGENE
Risiko spontaner Mutationen wird durch Mutagene erhöht:
o Säuren
o Hitze (entfernt Purine)
o UV-Licht (formt Tyhmindimere)
o Ionisierte radioaktive Strahlung (bildet reaktive OH- Radikale = ROS)
ADENIN-DESAMINIERUNG:
• Durch bestimmte Mutagene können Adenine desaminiert werden (⇨ Hypoxanthine). Dann können sie statt Guanin mit Cytosin Basenpaarung eingehen:
CYTOSIN-DESAMINIERUNG:
• Auch Cytosin kann durch Mutagene desaminiert werden → es entsteht Uracil, welches anstelle von Cytosin eingesetzt wird
• Erinnerung: Uracil kommt nur in der RNA vor (nicht in DNA). Die Reparaturenzyme, welche desaminierte Cytosine (= Uracil) suchen, können Uracil dank der fehlenden Methylgruppe von Thymin unterscheiden
→Fazit: Die Unterscheidung zw. Thymin und Uracil durch eine CH3-Gruppe erhöht die Informationssicherheit in DNA.
THYMIN-DIMERE:
• Durch UV-Licht können benachbarte Thymine kovalent verbunden werden →
führt zu Verkrümmung des Rückgrats
ARTEN VON MUTATIONEN
REPERATURMECHANISMEN PROOFREADING:
1. falsches Nucleotid wird eingefügt → Replikation wird verlangsamt und das falsche Nukleotid bleibt nicht stabil in der Kette, sondern schwankt hin und her → Diese beiden Phänomene ermöglichen es, die DNA aus der aktiven Stelle in die Exonuclease-Einheit der Polymerase zu bringen
2. Nucleotide werden dort durch Hydrolyse entfernt 3. Anschliessend kann die DNA wieder in der aktiven
Tasche weitersynthetisiert werden Weitere wichtige Punkte:
• Läuft parallel zur Replikation ab
• Wird von Polymerase selbst übernommen
• Entdeckt bereits 99% aller Fehler
• Fehler, die nicht durch die DNA-Polymerase erkannt werden, müssen auf andere Weise repariert werden MISMATCH REPAIR:
1. MutS erkennt Mismatch und bindet an alten Strang 2. MutH schneidet den
neusynthetisierten Strang 3. Exonuclease I entfernt ein Stück DNA ausgehend von der Bruchstelle
4. Polymerase III synthetisiert das Stück neu
NUCLEOTID-EXCISION REPAIR:
Kommt bei Thymindimeren zum Einsatz:
1. Proteinkomplex erkennt die „Thyminbeule“
2. Der gleiche Komplex schneidet an zwei Stellen in einigen Nu Abstand zum Dimer
3. Eine Exinuclease entfernt ein 12- Nu-Segment
4. DNA Polymerase I synthetisiert Fragment neu
5. Ligase verknüpft das Segment und die bestehende DNA BASE-EXCISION REPAIR:
Kommt v.a. bei Desaminierungen (verfälschter Basen) vor:
1. Base wird ausgeschnitten →ohne Rückgrat zu verletzen 2. AP-Endonuclease: schneidet
das Rückgrat nun gezielt neben der entnommenen Base 3. Polymerase: fügt die korrekte
Base ein
4. Ligase: schliesst das Rückgrat
8 REKOMBINATION → REPARATURMECHANISMUS
UND DIVERSITÄTSQUELLE
Zwei DNAs können durch Rekombination zwei neue
Tochterstränge bilden (ohne Replikation), indem sie einzelne Abschnitte austauschen (z.B. Crossing Over)
• Rekombination findet zw. DNA-Segmenten statt, die ähnliche DNA-Sequenzen enthalten
• spielt eine wichtige Rolle in vielen Prozessen:
⇨ DNA-Diversität
⇨ Antikörpervielfalt
⇨ Reparatur von Doppelstrangbrüchen
⇨ Viren nutzen Rekombination, um ihre DNA ins Wirtsgenom zu integrieren
REKOMBINATION MIT Cre REKOMBINASE:
Rekombination wird durch die Cre Rekombinase katalysiert → Sie ist eine Topoisomerase
1. Bildung einer Rekombinationssynapse: Vier
Rekombinasen mit zwei DNA-Duplexen mit ähnlicher Sequenz
2. Bildung einer Holliday-Junction: Die ähnlichen DNA- Stränge werden geschnitten. Tyr-Reste in den Enzymen halten dabei die 3’-Phosphat-Enden der Stränge fest, während die 5’-Enden frei werden und mit dem Strang des anderen Duplexes Esterbindungen eingehen.
3. Isomerisierung: Die verbundenen Stränge im Zentrum der HJ werden gedreht und so die DNA Duplexe anders angeordnet.
4. Erneutes Schneiden und Wiederverknüpfen der Stränge, die bis anhin nicht geschnitten wurden, führt zur Bildung von zwei rekombinierten DNA-Duplexen.
HOMOLOGE REKOMBINATION MIT RecA
→Doppelstrangbrüche führen zu reaktiven freien DNA- Enden → Diese interagieren mit anderen DNA-Strängen
• In E.Coli katalysiert das Enzym RecA diese Interaktion
• Im Mensch ist Rad51 dazu zuständig.
1. Invasion: Einzelstrang der DNA mit reaktivem Ende verbindet sich mit der intakten homologen DNA und ersetzt dort einen Strang → dreisträngige Struktur 2. Der invasive Strang mit dem gebundenen 3’-Ende kann
nun als Primer fungieren und die Replikation der abgebrochenen Enden ermöglichen.
9 DNA VS. RNA
• Andere Base: Uracil anstatt Thymin
• Anderer Zucker: Ribose anstatt Desoxyribose
• Struktur:
DNA: Doppelhelix
RNA: Einzelsträngig, sekundär Strukturen können dopplesträngige Regionen zur Folge haben RNA
• Es gibt viele verschiedene RNAs in einer Zelle
• Oft als Einzelstrang
• ACHTUNG: es gibt trotzdem Baseninteraktionen!
• Sekundär Struktur der RNA: Hat die Tendenz, lokal doppelsträngige Formationen auszubilden → Mittels komplementärer Paarung der Basen → Ähnlich wie Proteinfaltung aber durch andere
physikalische Ursachen (Basenpaarung anstatt der Ausbildung eines
hydrophoben Zentrums) mRNA
→Verbindungstück zwischen Genen und Proteinen Gründe, warum Messengers verwendet werden:
o Die Originalinformation (=DNA) bleibt geschützt und erhalten
o Einsträngige Form ist leichter ablesbar und modifizierbar
o mehrere RNA-Intermediate derselben DNA erlauben
„parallele Massenproduktion“ desselben Proteins o schafft eine zusätzliche Regulationsebene o alternatives Splicing ermöglicht Produktvielfalt aus
derselben DANN
o Sekundärstruktur der RNA erlaubt Kontrolle via Stabilität und Lesbarkeit
TRANSKRIPTION
• RNA wird durch RNA Polymerasen hergestellt
• Die Fehlerrate der Transkription ist viel höher als die der Replikation (Rate ist 1 in 10000)
• Doppelsträngige DNA wird zu mRNA abgeschrieben
DNA Vorlagestrang wird von 3’ zur 5’ Richtung abgeschrieben, der mRNA-Strang von 5’ zu 3’ neusynthetisiert
• Komponenten: DNA, NTPs, RNA Polymerase, Promotor und Transkriptionsfaktoren
ABLAUF
1. Inititation: RNA Polymerase bindet zusammen mit Transkriptionsfaktoren an die Promotor Region und separiert die DNA Stränge lokal in Einzelstränge.
NTPs starten, Basenpaarungen mit dem DNA Strang einzugehen 2. Elongation: RNA Polymerase schreitet
voran, Transkriptionfaktoren lösen sich ab, immer mehr NTPs lagern sich an und die Transkriptionsblase wird vorwärtsbewegt
3. Termination: Dissoziation der mRNA
10 UNTERSCCHIED BAKTERIEN UND EUKARYOTEN:
• Lokalisation der Transkription: → Eukaryoten besitzen eine nukleäre Membran → trennt Transkription
(Nukleus) örtlich und zeitlich von Translation (Cytoplasma)
→ erhöht
Regulationsmöglichkeiten
• RNA Polymerase → ähnlich, aber Eukaryoten haben grössere, komplexere RNA Polymerase → hat zusätzliche Untereinheiten, kann nicht ohne Transkriptionsfaktoren an die DNA binden, Eukaryoten haben mehrere Polymerase-Typen
• Promotor → Eukaryoten haben nicht nur einen 3 teiligen Promotor, sondern komplexerer Aufbau → haben viele Regulationseinheiten = CREs→ können viel weiter entfernt von TE liegen als bei Bakterien
Spezifische Genaktivierung → Bakterien haben spezielle Sigma-Untereinheiten, Eukaryoten haben zusätzliche Transkriptionsfaktoren
• Termination: Bakterien haben ein Terminationsignal, Eukaryoten eine PolyA Signal-Sequenz
• Prozessierung: Eukaryotische mRNA wird noch
prozessiert (5’-Capping, 3’-PolyA-Schwanz, alternatives Splicing)
BAKTERIELLE TRANSKRI PTION BAKTERIEN POLYMERASE:
• Haben nur eine RNA Polymerase
• Mehrere Polymerasen können gleichzeitig ein Gen transkribieren
• Die aktive Stelle aller RNA Polymerasen beinhalten zwei Mg2+ Ionen
• Kernenzym: besteht aus 5 Untereinheiten o αI: wichtig für die RNAP Assemblierung o β β’: benötigt für das DNA Binden o : stabilisiert β’ Bindung
o : formt Holoenzym → Gibt dem Komplex eine hohe Affinität für einen Promotor
Core Enzym bildet zusammen mit Sigma-Untereinheiten das Holoenzyme
Sigma-Untereinheiten:
• Bakterien haben verschiedene −Untereinheiten → Verschiedene haben unterschiedliche Affinitäten zu unterschiedlichen Promotoren
→spezifische Promotorbindung
• − System erlaubt das Wechseln zwischen
verschiedenen Strategien: Schnelles Wachstum, Stress Metabolismus, Motalität, Sporulation usw.
(Verwendung eines unterschiedlichen Promotors je nach Strategie)
• Sigma Untereinheiten dissoziieren nachdem Start der Transkription
TRANSKRIPTIONSSTART:
Promoter abhängig: spezifische DNA-Sequenz rekrutiert die RNA- Polymerase und bildet den Startpunkt der Transkription Promotor:
• hoch konservierte hexanukleotid Sequenzen in der -10 und -35 Region «upstream» vom Transkriptionsstart
• -35 upstream: TTGACA und -10 upstream: TATAAT
• wird direkt von RNAP und Assoziierten Faktoren erkannt
Initiation und Elongation:
1. σ–Untereinheit ermöglicht der Polymerase schwach ans 5’-Ende der DNA zu binden und in 3’-Richtung zu gleiten 2. σ –Untereinheit erkennt Promoter, wenn Polymerase
ihn erreicht
3. Nach der Initiationsphase lösen sich die σ–Untereinheit ab, wodurch die RNA Polymerase die Affinität zum Promotor verliert und in 3’ Richtung zu gleiten beginnt 4. Polymerase entwindet DNA → Bildung einer
Transkriptionsblase
5. RNA und freie Nukleotide gelangen ins aktive Zentrum der Polymerase
6. Watson-Crick-Basenpaarung zw. dem eingebrachten RNA-Nukleotid und dem Nukleotid der DNA
7. Phosphodiesterbildung: 3’-OH (aktiviert durch Mg2+- Ionen) greift α-Phosphatgruppe des Nu an und formt eine Bindung unter Abspaltung von PPi. Die Bindung ist exergon und treibt die Elongation weiter an.
TERMINATION:
• Terminator Sequenz liegt weiter downstream
• 30-40 Basenpaar lange Sequenz, mit vielen GC- Einheiten gefolgt von einer Serie aus T-Einheiten
• RNA Polymerase transkribiert diese Terminator Sequenz, wobei die RNA eine stem-loop
Struktur bildet → Dadurch wird die RNAP von der DNA abgelöst und die RNA freigelassen
• RNA Transkript wird nicht weiter modifiziert!
• Oft Translation parallel zur Transkription
11 TRANSKRIPTION BEI EU KARYOTEN
RNA POLYMERASE:
• Es gibt 3 verschiedene RNA Polymerasen!
• Bei der Transkription wird die Polymerase 2 verwendet
• 5 Hauptuntereinheiten (wie Bakterien)
• Zusätzliche 5 Untereinheiten
→ Komplexer und grösser
• Polymerase 2 hat zusätzlich 2 weitere Untereinheiten
• Kann die DNA nicht direkt
binden → Ist auf Transkriptionsfaktoren angewiesen
• α-Amanitin: Giftstoff in Pilz, wodurch die aktive Stelle der Polymerase 2 blockiert wird → Organversagen
PROMOTOR:
• sind sehr divers
• viele Promotoren besitzen eine TATA box (TATAAA) 50 bp upstream der Transkriptions-Startstelle
• TATA Box bindet TATA Box bindende Proteine, welche dabei helfen, einen RNA Transkriptionskomplex zu bilden
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
Präinitiations-Komplex/Basaler Transkriptionskomplex benötigt den Transkriptionsfaktor 2D (TFIID):
• Besteht aus 13 Proteinen
• «2D», da die Polymerase II daran bindet
• Beinhaltet das TBP = TATABox bindende Einheit o TBP bindet zuerst an die DNA, wodurch der TFIID
Komplex gebildet werden kann
o TFIID rekrutiert dann weitere Transkriptionsfaktoren und ermöglicht damit das Binden der RNA-
Polymerase II an die DNA
Weitere (additionale) Transkriptionsfaktoren:
→Spezifische Gene werden mittels zusätzlichen Transkriptionsfaktoren aktiviert → diese binden an sogenannte Enhancer Regionen
• Mediator = Grosser Protein Komplex, welcher als
Verbindungsglied zwischen den additionalen Transkriptionsfaktoren und der RNA Polymerase II wirkt
• Enhancer Regionen:
o Stimulieren die Transkription spezifischer Gene o können weit entfernt von dem eigentlichen
Promotor liegen (upstream, downstream oder zwischendrin)
TERMINATION:
• haben kein Terminationsignal
• haben eine Polyadenylation Signal Sequenz
• Polymerase transkribiert über dieses Signal hinweg → 10-35 Nukleotide nach dem AAUAAA Signal assoziieren Proteine, wodurch die mRNA dann freigesetzt wird («Endonucleoism cut»)
HISTONE:
• Eukaryotische-DNA ist stark verpackt
→ spezieller Startweg:
1. Transkriptionsfaktoren binden
2. Coaktivator bindet und verändert mittels
chemischen Modifikation die Affinität der Histone an die DNA (aktivieren Lys-Reste der Histonfortsätze durch Acetylierung)
3. Umstrukturierungsproteine: können Histone herumschieben und so die Transkriptionsstartstelle freisetzen → Entwickeln die DNA von Histonen 4. Die RNA Polymerase II kann nun binden
12 RNA-PROZESSIERUNG
RNA-PROZESSIERUNGIN BEI BAKTERIEN
• tRNA und rRNA werden als einzelnes Transkript gebildet und erst danach in verschiedene RNAs geschnitten
• Es gibt auch Modifikation der Nukleotide RNA-PROZESSIERUNG BEI EUKARYOTEN rRNA:
• Wird als einzelnes Transkript hergestellt und dann in 3 separate RNA Strukturen geschnitten
tRNA:
1. RNAse P: verarbeitet das 5’ Ende
2. CCA anfügendes Enzym: Modifizieren das 3’ Ende 3. spezielle Introne werden herausgeschnitten
mRNA:
1. Anhängen einer 5’ Cap: Modifizierter Guanin Nukleotid wird ca. nach 20-40 Nukleotiden nach dem
Transkriptionsstart verkehrt herum angelagert
→Schutz vor Exonukleasen
→Macht mRNA erkennbar (Klares Erkennungssignal)
2. Anhängen eines Poly-A Schwanzes: nach dem AAUAAA- Signal werden 50-250 Adenin Nukleotide angehängt
→Als Puffer → Schutz und erleichterter Export
3. Splicing: Vorbereitung der maturen mRNA (Reaktionen müssen extrem genau durchgeführt werden → Ein einziger Nukleotidfehler wäre ein Disaster)
4.) Enzymatischer Nukleotid-Austausch:
→ Enzyme wechseln nach der mRNA-Synthese Sequenzen aus, wodurch die Funktion deines Proteins verändert wird
SPLICEN
• Introns werden herausgeschnitten
• Exons werden beibehalten
• Alternatives Spleissen: aus einer prä-mRNA werden viele verschiedene Protein-
Produkte hergestellt → Exone werden verschiedene miteinander kombiniert
• Spleissmechanismus:
o läuft über eine zweistufige Transveresterung ab o Diese kann:
A) durch die RNA selbst durchgeführt werden = Selfsplicing B) durch ein Spleissosom durchgeführt werden
Spleissosom:
• viel flexibler →Man braucht nur 2 Sequenzen
• Passiert nicht selbst, Introns sind nicht 3D
• Alternatives Spleissen ist nur bei Spleissosom katalysierter Reaktion möglich
13 A) SELFSPLICING (Autokatalysiertes Spleissen) :
• Kann nur von bestimmten Typen Introns vorgenommen werden:
o Typ I: besitzen Guanin-Cofaktor (in Form von GTP, GMP oder GDP)
o Typ II: hier nicht behandelt
1. Intron faltet sich spontan
2. Transesterifizierung I: Ein Guanosin bindet an 5’-Ende des Introns → Bildung einer Phosphodiesterbindung und 3’-OH Gruppe
3. Transesterifizierung II: Die 3’-OH Gruppe greift das 3’- Spleissende an →bildet zweite Phosphodiesterbindung 4. Das Intron wird vom Rest der RNA gelöst und die
zusammengefügten Exons bleiben bestehen
• haben ein Strukturelles Intron → 3D Struktur
• Viel weniger grosse Bandbreite
• →Längenabhängig (nicht zu grosser Abstand zwischen den Exons)
B.) SPLICEOSOM KATALYSIERTES SPLEISSEN:
Spleissosom = Komplex aus 5 snRNPs die je eine snRNA und zusätzliche Proteine enthalten
→snRNPs: U1-U6 ohne U3 =small nuclear Ribonucleoprotein particles
→snRNA= small nuclear RNA
→Besitzt sehr viele Untereinheiten →Kleine nukleare RNAs kommen mit Proteinen zusammen und bilden die Untereinheiten U der snRNPs
Introns brauchen spezielle Sequenzen →besitzen bestimmte Spleissenden, die von Spleissosom erkannt werden:
⇨ AG am 3’-Ende des Introns
⇨ GU am 5’-Ende des Introns
⇨ „Branch site“ im Intron-Innern mit einem Adenosin
1. Spleissosom-Assembly: U1 bindet an die 5’-Spleissstelle und U2 an die Branch site.
2. U4, U5, U6 kommen hinzu → vervollständigen das Spleissosom
3. U1 und U4 werden verdrängt. U6 und U2 bilden durch Basenpaarung katalytisches Zentrum des Spleissosoms 4. Transesterifizierung I: Das Adenosin (resp. dessen OH-
Gruppe) aus der Branch site attackiert das 5’-GU → Bildung eines Lariat-Intermediats
5. Transesterifizierung II: Die 5’-OH Gruppe, die durch die 1. Transesterifizierung entstanden ist, attackiert 3’-Ende 6. Intron geht in Lariat-Form (als Ring) ab und die
gespleisste reife mRNA bleibt zurück
14 TRANSLATION
GENETISCHER CODE
• Übersetzt die DNA-Sequenz (Basenabfolge) in eine Aminosäuresequenz
• 3 DNA-Basen bilden ein Codon
• Am Anfang steht immer ein Methionin → AUG
• Der genetische Code ist
o universell → für alle Lebewesen gültig
o Nicht-zufällig → Hat ein klares Zuordnungsmuster o nicht überlappend → Basen werden in klarer
Reihenfolge abgelesen und in genaue 1 Aminosäure übersetzt
o redundant: Eine Aminosäure kann mehrere Codon- Möglichkeiten haben (Es gibt 43 = 64 mögliche Codons→ 61 (3 sind Stoppcodons, UAG, UGA, UAA), aber nur 20 Aminosäuren)
tRNA
→ist ein Adapter-Molekül
• hat eine Aminosäurebindungsstelle am 3’ Ende und eine Anticodon Loop (3) in der Mitte
• AHTUNG: ist kein Protein, sondern eine RNA!
• Struktur entsteht also durch sekundäre Strukturbildung der RNA und nicht durch Proteinfaltung!
• 3’ OH Gruppe der tRNA bindet an die Carboxylgruppe der Aminosäure)
MODIFIZIERTE NUKELOTIDE IN DER RNA:
• In der tRNA gibt es bestimmte Nukleotide die modifiziert sind:
Wichtiges Beispiel: Inosin (eine Adenin Umwandlung)
AMINOACYL-tRNA SYNTHEASE:
→Enzym, dass bei der Beladung der tRNA mit Aminosäuren hilft
→Aminoacyl-tRNA=
Produkt aus tRNA und Aminosäure
2 Schritt Reaktion: (Ein-Schrittreaktion wäre nicht freiwillig
→ Verwendung von ATP als Energiequelle bzw. als Aktivator)
• Es gibt 2 Gruppen der Aminoacyl Synthetasen:
je nachdem, wo die aktivierte Aminosäure angehängt wird:
o Klasse I: an die 2’ OH Gruppe der tRNA o Klasse II: an die 3’ OH-Gruppe der tRNA
REAKTIONSABLAUF: (Anhängen der Aminosäure an tRNA) 1. AKTIVIERUNG der Aminosäure: ATP wird an die
Aminosäure angehängt: Das Enzym positioniert die 2 Substrate so, dass die Carboxygruppe der Aminosäure die α-Phosphatgruppe nukleophil angreifen kann, um Aminoacyl-AMP zu bilden
2. ANHÄNGEN der Aminosäure an die tRNA:
Die Aktivierte Aminosäure reagiert mit der tRNA → die 3’ OH Gruppe (oder 2’) der tRNA greift die aktivierte Carboxygruppe der Aminoacyl-AMP Gruppe an
→ AMP verlässt die Reaktion als gute Abgangsgruppe
→Alles vom ATP hat die Reaktion wieder verlassen!
15 WOBBLE PAIRING
• 61 verschiedene Codons werden von der tRNA erkannt und in 20 Aminosäuren «übersetzt».
• Es gibt nun aber weder 61 tRNAs, noch nur 20:
Insgesamt gibt es min. 31 tRNAs. WARUM?
→bei der 3. Position gibt es Abweichungen der Regel → Es gibt eine Erweiterung der Paarungsmöglichkeiten (=Wobble) (Dadurch braucht es nur halb so viele tRNAs)
Regeln der 3. Paarung:
→ an der 3.Position werden keine Watson-Crick Basenpaarungen eingegangen Inosin kann drei verschiedene Basen paaren:
→grosse Toleranz
POLYPEPTIDSYNTHESE
1. Polypeptid Synthese: Vom N-Terminus zum C-Terminus Beweis: Radioaktive Aminosäuren werden hinzugefügt → Zu Beginn ist nur der C-Terminale Teil gelablet
2. Kettenverlängerung mittels der Addition aktivierter Aminosäuren an die tRNA
Neue Aminosäure wird an den C-Terminus der tRNA angehängt → an den N-Terminus der bereits vorhandenen Aminosäure
3. Ribosome lesen die mRNA von 5’ → 3’ Richtung
STUFEN DER TRANSLATI ON INITIATION:
• Watson-Crick-Basenpaarungen zwischen der kleinen Untereinheit des Ribosoms und der mRNA
• Beinhaltet 3 Initiationsfaktoren: IF-1, IF-2, IF-3
• IF-1 und IF-3 binden an die kleine Untereinheit (30S) und helfen ihr dabei, an die mRNA zu binden und die richtige Stelle zu finden →helfen bei der Positionierung
• IF-2 braucht GTP und bindet die tRNA, wodurch diese zur kleinen Untereinheit gebracht wird
• Ribosom-Einheit 16S bindet zuerst an die Dalgarno Sequenz, welche sich kurz vor der Startsequenz befindet. Die tRNA (Anticodon) bindet später an den Startcodon
Start-Met wird zuerst bearbeitet:
• Initiator-Met wird formyliert und daher auch fMet genannt.
Zusammen mit einer speziellen Initiator-tRNAf wird die fMet-tRNAf
gebildet. Die Modifikation ermöglicht es der Aminosäure, den Anfang der Polypeptidkette zu bilden, ohne dass es an eine bestehende Kette angehängt werden muss
• N-Terminale Seite der tRNA wird durch den Formyl Cap geschützt
ABLAUF:
1. IF1 und IF3 binden an die kleine ribosomale Untereinheit
2. 16S-RNA der Untereinheit bindet an die Shine-Dalgarno-Seqenz (Stelle vor Startcodon)
3. IF2 bindet GTP und die Initiator-tRNA (fMet tRNAf) und führt diese zur kleinen Untereinheit → vollständiger Initiationskomplex
4. Das Anticodon der tRNA kommt dabei auf dem Startcodon (AUG oder selten auch GUG oder UUC) zu liegen. Diese befindet sich an der A- Stelle im Ribosom.
16 ELONGATION
• Beinhaltet 3 Elongations-Faktoren
• EF-Tu: bringt die tRNAs (braucht GDP)
• EF-Ts: platziert GDP um
• EF-G: verschiebt die tRNA eine Stelle weiter (braucht GTP) → Translokiert das Ribosom zum nächsten Codon 5. Die fMet-tRNAf wird auf die P-Stelle verschoben 6. EF-Tu bindet GTP und eine beladene A-tRNA, führt diese
an die A-Stelle und hydrolysiert sein GTP zu GDP, falls die Basenpaarung der ersten beiden Basen erfolgreich war → Dissoziation
7. EF-Ts tauscht GDP an EF-Tu wieder zu GTP um, sodass dieses weitere tRNAs holen kann
8. Peptidyltransfer: Transfer der Aminosäure aus der P- Stelle an die Peptidkette an der A-Stelle. Die Reaktion ist exergon und wird durch die grosse Untereinheit katalysiert. Durch Nu-Angriff der Aminogruppe in A- Position ans Carbonyl (Teil der Esterbindung) der Peptidkette an der P-Stelle wird diese mit der bestehenden Kette
verbunden. Die P- Stelle ist nun frei und die A-tRNA trägt die Polypeptidkette.
9. Translokation: EF-G (eine Translocase) bewegt die mRNA entgegen des Ribosoms um 3 Basenpaare in 3’- Richtung, sodass die A-tRNA auf der P-Stelle und die P- tRNA auf der E-Stelle zuliegen kommt.
10. EF-Tu kann nun neue A-tRNAs anbringen → Wiederholung der oberen Schritte
11. Die länger werdende Polypeptidkette wir durch den Tunnel in der grossen Untereinheit nach aussen geschoben.
TERMINATION
12. Stopcodons (UAA, UGA, UAG) werden nicht durch eine tRNA besetzt, sondern durch RF1 oder RF2 (Release Factors) erkannt. Einer dieser RF bindet dann an die A-Stelle und bringt Wasser ein, welches die Peptidyl-tRNA auf der P-Stelle hydrolysiert und dadurch das Polypeptid entlässt
(Bindung wird durch Hydrolyse gebrochen) 13. RF3 katalysiert den
Abgang von RF1/2 und
GTP - ENERGIEVERBRAUCH Wie viele GTP werden ca. verbraucht?
Initiation: 1 GTP
Elongation: 2 GTP pro Aminosäure Termination: 1 GTP
Anzahl GTP =2 + 2*Anzahl Aminosäuren
17 RIBOSOME (70S)
• Decodier Zentrum
• Sind Ribozyme
• Protein Bindungszentrum
• Peptidyl transferase Zentrum
• Polypeptid Exit-Tunnel
→Ribosome (70S) bestehen aus einer grossen (50S) und einer kleinen (30S) Untereinheit, welche beide 3 Bindungsstellen für die tRNA beinhalten
S EINHEITEN: (Koeffizienten) sagen etwas darüber aus, wie schnell eine Untereinheit sedimentiert → Abhängig von Grösse und Form/ Struktur
• Nummern verhalten sich nicht additiv
• Bestehen aus 2/3 RNA und 1/3 Proteine →RNA ist Hauptkomponente
• Hauptsächlich RNA-tRNA Interaktionen (Codon- Anticodon Interaktionen)
RIBOSOMALE UNTEREINHEITEN KLEINE UNTEREINHEIT:
• 30S
• Vermittelt die Interaktion zwischen den mRNA-Codons und den tRNA-Anticodons
→Decoding Zentrum
• Ribosomale RNA Struktur
➔ Position 1 und Position 2 haben Watson-Crick-
Basenpaarungen (rRNA hilft dabei, dass nur genau diese Paarungen eingegangen werden können!)
➔ An der Position 3 gibt es Wobble-Basenpaarungen, da das Ribosom hier nicht schaut, dass eine «korrekte»
Interaktion stattfindet
GROSSE UNTEREINHEIT
• 50S
• Ribosomale RNA und Protein Struktur
• Hat 6 Unterdomänen
• Katalysiert die
Peptidbindungs-Bildung
und bindet Initiator-, Elongation- und Release-Faktoren (katalytische Untereinheit)
• Interaktion zwischen Proteinen und rRNAs: rRNA bilden den Kern und «the interface». Proteine befinden sich eher ausserhalb und gleichmässig verteilt (Ausser auf der Vorderseite, wo die kleine Untereinheit bindet, befinden sich nur sehr wenige Proteine)
• Proteine sind speziell: Haben sehr lange «Tentakel» und sind geladen (RNA ist negativ geladen, Proteine sind also positiv geladen)
• CCA-Enden interagieren mit dem single- stranded-Loop der tRNA (tRNAs haben alle dasselbe Ende, um mit dieser CCA zu interagieren zu können)
• Aktive Stelle (23s): besitzt ein spezielles Adenosin, welches dabei hilft, die tRNA festzuhalten
• Ein Tunnel geht von der Aktiven Stelle weg, durch welchen das Polypeptid das Ribosom verlassen kann
→hydrophilischer Tunnel (Tunnel sorgt dafür, dass das Protein im gestreckten, ungefaltenen Zustand bleibt)
• Bestimmte Antibiotikas greifen diesen Tunnel an
18 GEN EXPLORATION
RESTRIKTIONSENZYME
• Wurde in Bakterien entdeckt (E. coli)
• Schneiden die DNA an bestimmten Stellen
• Dienen als Abwehrmechanismus → Bei einer Invasion eines Virus würden diese Enzyme die schädliche DNA schneiden (Enzyme können mittels Mechanismen ihre eigene DNA erkennen und intakt lassen)
• Sind sehr spezifisch
• Schneiden oft palyndromische Sequenzen → gespiegelte Nukleotid Abschnitte, die vorwärts- rückwärts gleich sind
• Hinterlassen entweder sticky-Ends oder blunt-Ends PLASTIDE
= zirkuläre DNA Moleküle, welche oft Antibiotika-Resistenz Gene besitzen und als Vektoren verwendet
werden können Es braucht:
1. Origin →Start für DNA Replikation 2. Selektions-Marker →Enzym, welches eine
Antibiotikaresistenz hervorruft 3. Einzigartige Restriktionsenzym Stellen 4. Muss in einer Zelle in hohen Kopiezahlen
vorhanden sein
5. Sollte so kurz wie möglich sein KLONEN MITTELS PLASTID
1. Produktion und Vorbereitung eines Vektors
2. Eine rekombinierte DNA erstellen → Ziel-DNA in den Plastid einsetzen
3. Transformation auf geeignete Wirtszellen 4. Selektion jener Zellen, die erfolgreich den Vektor
aufgenommen haben RESTRICTION MAPPING
• Man schneidet die DNA mittels verschiedenen Restriktionsenzymen
• Unterscheidung von DNAs:
verschiedene DNAs werden unterschiedlich oft geschnitten und hinterlassen andere Bandenmuster
DNA SEQUENZIERUNG KETTENABBRUCHMETHODE:
Man braucht dafür:
• einsträngiger DNA-Strang
• DNA Polymerase
• Primer
• Deoxynukleotide
• Di-deoxy Nukleotide DNA Polymerase synthetisiert den komplementären Strang von 5’ zu 3’
Richtung und stoppt, sobald sie ein Di-
deoxy Nukeotid einbaut. Durch den Einsatz nur sehr weniger Di- deoxy Nukeotide, welche zudem unterschiedliche markiert sind, stoppt der Strangaufbau verschieden weit und die markierten Nukleotide können der Reihe nach (oft mittels Laser) abgelesen werden
POLYMERASE KETTENREA KTION
➔ Erlaubt die Dublikation/ Vervielfachung einer DNA Sequenz zwischen zwei gewählten Primer Diese Reaktion braucht:
• 2 spezifische Primer
• Thermostabile DNA Polymerase
• dNTPs
Verläuft in drei Schritten:
1. Primer hinzugeben, stark erwärmen und wieder abkühlen, hitzestabile Polymerase hinzugeben → Synthese
2. Aufheizen und separieren, Primer und hitzestabile Polymerase sind noch vorhanden, erneute Synthese
3. Primer entfernen, die kurzen Sequenzen repräsentieren die Zielsequenzen → werden exponentiell amplifiziert!
SOUTHERN BLOG
→Hilft bei der Identifikation eines DNA-Fragmentes in einer grossen Mischung
19 Vorgehen:
1. Separation der DNA-Fragmente in einem Gel
2. DNA denaturieren und auf ein Nitrocellulose-Medium geben, sodass die DNA Einzelsträngig bleibt
3. Die komplementäre DNA-Sequenz kann dann dazu verwendet werden, das gesuchte DNA-Fragment zu finden
➔ Northern Blog= Dieselbe Methode, allerding mit der Verwendung von Ribose
VORBEREITUNG GENOMIS CHER DNA-BIBLIOTHEKEN UND CDNA GEN-BIBLIOTHEKEN
Genomische DNA cDNA Restriktionsnukleasen
schneiden die DNA in Fragmente, welche dann geklont werden
Bestimmte DNA Gene werden Transkribiert und gespliced. Die mRNAs werden mittels Reverser Transkription in DNA
zurückgeführt und dann geklont
DNA KLONEN MITTELS VEKTOREN KOMPLEMENTÄRES DNA KLONEN:
Klonen mittels Plasmid (gut für kleine DNA-Einheiten -10kbp)
→mRNA dient als Ausgangsstrang für cDNAs
• Poly A Schwanz am 3’ Ende der mRNA wird als Startpunkt der Reversen-Transkriptions verwendet
• Nach erfolgreicher Komplementierung wird die mRNA mittels Alkali Verarbeitung entfernt
• Der Einzelsträngige DNA Strang wird mit einem poly-G Ende ausgerüstet und daraufhin mittels poly-C Primer und einer Reversen Transkriptase oder DNA Polymerase repliziert
• Die Doppelsträngige cDNA wird dann in ein Plasmid Vektor eingesetzt
KLONEN MITTELS BAKTERIOPHAGE:
→Gut, sobald die DNA grösser wird Alternative Vektoren:
SHOTGUN METHODEN
→Sequenzierung des menschlichen Genoms Mittels Verwendung eines
Sets von large-insert bacterial artificial chromosomes (oft BACs mit 100-200 kb inserts)
PROTEIN VERGLEICH:
Orthologs: Moleküle mit ähnlicher Sequenz und ähnlicher Funktion in verschiedenen Arten
Paralogs: Moleküle mit ähnlicher Struktur aber anderer Funktion in der selben Art
• Direktvergleich um Ähnlichkeiten und Unterschiede zu finden
• Evolutiv weit entfernte Proteine kann man mit Hilfe einer konservativen Substitution vergleichen, bei welcher man die Aminosäuren
miteinander vergleicht und ihnen Funktionen zuschreibt
PROTEIN EXPRESSION
REGULATION DER GENEX PRESSION
LAC OPERON:
A) Der Repressor (ist ein Dimer) bindet an den Operator des Operons und verhindert damit die Transkription der z,y,a Gene (durch Verdrehung der DNA)
B) Der Repressor wird mittels eines Repressor-Inaktivator gebunden und somit unterdrückt, wodurch seine Bindung an die DNA verhindert wird und dadurch die z,y,a-Gene transkribiert werden können
20 Der Repressor-Inaktivierer wird in der Zelle aus Laktose
hergestellt, oder es werden alternative Inaktivierer verwendet: Isopropylthiogalactoside (IPTG)
GENETISCHE ELEMENTE DER PROTEIN EXPRESSI ON VON E. COLI
