Small‐Molecule Inhibitors of DNA Polymerase Function

S ^MALL ‐M ^OLECULE  I NHIBITORS OF   DNA   P ^OLYMERASE  F ^UNCTION  

D ISSERTATION  

zur Erlangung des Akademischen Grades  des Doktors der Naturwissenschaften  

(Dr. rer. nat.)   

vorgelegt von   

Tobias Strittmatter 

aus Küssaberg‐Kadelburg   

an der Universität Konstanz 

Mathematisch‐Naturwissenschaftliche Sektion  Fachbereich Chemie 

2014 

Tag der mündlichen Prüfung: 05. Dezember 2014  Prüfungsvorsitz:  Prof. Dr. Gerhard Müller  1. Referent:   Prof. Dr. Andreas Marx  2. Referent:   Prof. Dr. Thomas U. Mayer 

„Meinen Eltern”

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von November 2009 bis August 2014 in der  Arbeitsgruppe  von Prof.  Dr.  Andreas  Marx  am  Lehrstuhl  für  Organische und  Zelluläre  Chemie am Fachbereich Chemie der Universität Konstanz. 

Nach diesem Zeitraum geprägt von intensiver Forschungsarbeit liegt nun meine Dissertation  vor und ein weiteres Kapitel meiner beruflichen Karriere kann nun erfolgreich abgeschlossen  werden. Aus diesem Grund ist es jetzt auch an der Zeit, mich bei all denen zu bedanken, die  mich während dieser spannenden Zeit begleitet, unterstützt und gefördert haben. 

Meinem Doktorvater Prof. Dr. Andreas Marx danke ich ganz herzlich für die Überlassung der  sehr interessanten und interdisziplinären Themenstellung, sowie für das in mich gesetzte  Vertrauen, welches mir viel Raum für die selbstständige Bearbeitung und kreative Gestaltung  des Themas erlaubte. Ihm, wie auch den weiteren Mitgliedern meines „Thesis Committee“,  Prof. Dr. Thomas Mayer und Herrn Prof. Dr. Michael Berthold, danke ich zudem für die  anregenden wissenschaftlichen Diskussionen und die geleisteten Hilfestellungen. Prof. Dr. 

Thomas Mayer danke ich außerdem für die Übernahme des Zweitgutachtens und Herrn Prof. 

Dr. Gerhard Müller für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes. 

Natürlich möchte ich mich auch bei allen früheren und jetzigen Freunden und Kollegen der  Arbeitsgruppe Marx und der Graduiertenschule Chemische Biologie für die unvergessliche  Zeit, die tolle Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gilt  hier Dr. Norman Hardt, Magdalena Grzywa, Matthias Drum und Dr. Nina Blatter für die sehr  gute, langjährige Zusammenarbeit und die tolle Laboratmosphäre. Zudem danke ich Dr. Karl‐

Heinz Jung für die interessanten wissenschaftlichen Fachgespräche. Weiterhin danke ich  ganz herzlich meinen sehr talentierten Bachelorstudenten Annika Hantusch, Moritz Pott,  Joos  Aschenbrenner  und  Melina  Hoffmann,  sowie  allen  Mitarbeiterpraktikanten  und  wissenschaftlichen Hilfskräften für ihre Leistung, ihr Engagement und ihr Interesse.  

Bei  Dr.  Thomas  Huhn,  Dr.  Timo  Immel  und  Malin  Bein  bedanke  ich  mich  für  die  Durchführung der ersten Zytotoxizitätsmessungen. Bei Herrn Prof. Dr. Thomas Brunner und  Anette Brockmann möchte ich mich besonders für die  großartige Hilfe bei komplexen  zellbiologischen Fragestellungen und die fruchtbare Zusammenarbeit bei der Durchführung  der Zellassays bedanken. 

Meinen Lektoren Dr. Norman Hardt, Karin Reichardt, Matthias Drum und Joachim Braun  danke ich für die Durchsicht meiner schriftlichen Arbeit. 

Meinen Freunden, meiner Familie und ganz besonders meinen Eltern danke ich für die  liebevolle und bedingungslose Unterstützung in allen Lebenslagen. 

Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in: 

 T. Strittmatter, B. Bareth, T. A. Immel, T. Huhn, T. U. Mayer & A. Marx 

”Small Molecule Inhibitors of Human DNA Polymerase λ” 

ACS Chem. Biol. 2011, 6 (4), 314 – 319   

 T. Strittmatter, J. Aschenbrenner, N. Hardt & A. Marx 

”Synthesis of 4′‐C‐alkylated‐5‐iodo‐2′‐deoxypyrimidine nucleosides” 

ARKIVOC 2013, (ii) Issue in Honor of Prof. Richard R. Schmidt, 46 – 59   

 T. Strittmatter, A. Brockmann, M. Pott, A. Hantusch, T. Brunner & A. Marx  

”Expanding the Scope of Human DNA Polymerase λ and β Inhibitors” 

ACS Chem. Biol. 2014, 9 (1), 282–290. 

Weitere Publikationen: 

 M. Catarinella, T. Grüner, T. Strittmatter, A. Marx & T. U. Mayer  

”BTB‐1: A Small Molecule Inhibitor of the Mitotic Motor Protein Kif18A” 

Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 9072 – 9076  Angew. Chem. 2009, 121, 9236 – 9240   

 B. Reichmann, M. Drexler, B. Weibert, N. Szesni, T. Strittmatter & H. Fischer  

”Amino‐substituted Butatrienes: Unusual η¹Ligands Formed by an Unusual Reaction” 

Organometallics 2011, 30 (5), 1215 – 1223   

 O. B. Gutiérrez Acosta, N. Hardt, S. M. Hacker, T. Strittmatter, B. Schink & A. Marx  

”TPP stimulates acetone activation by D. biacutus as monitored by a fluorogenic ATP analogue” 

ACS Chem. Biol. 2014, 9 (6), 1263 – 1266. 

 A. Brockmann, T. Strittmatter, S. May, A. Marx & T. Brunner 

”Structure‐function relationship of thiazolide‐induced apoptosis in colorectal tumor cells” 

ACS Chem. Biol. 2014, 9 (7), 1520 – 1527. 

 J. Braun, M. M. Möckel, T. Strittmatter, A. Marx, U. Groth & T. U. Mayer  

”Synthesis and Biological Evaluation of Optimized Inhibitors of the Mitotic Kinesin Kif18A”  

ACS Chem. Biol. (DOI: 10.1021/cb500789h), in press.  

Table of Contents 

Introduction ... 3

1) Chemical genetics... 3

2) DNA polymerases... 5

2.1) General...5

2.2) DNA polymerases and the polymerisation reaction...6

2.3) DNA polymerase λ and β...8

2.4) Herpes virus DNA polymerase...11

3) DNA polymerases as drug targets... 12

3.1) General...12

3.2) Screening methods for DNA polymerase inhibitors...14

Concepts and objectives...20

Results and discussions ...22

4) Small‐molecule inhibitors of human pol λ and pol β... 22

4.1) Introduction...22

4.2) Biochemical evaluation of the 1^st small‐molecule generation...24

4.2.1) Conclusion...29

4.3) Establishment of a 2^nd generation compound library of potential active molecules  against pol λ and β...29

4.3.1) Design of the 2^nd small‐molecule generation SM12, 29‐58...29

4.3.2) Synthesis of 2^nd small‐molecule generation SM12, 29‐58...31

4.3.3) Conclusion...34

4.4) Biochemical evaluation 2^nd small‐molecule generation...35

4.4.1) Evaluation of the 2^nd small‐molecule generation...35

4.4.2) Side‐by‐side comparison of SM1 and SM49 with reported inhibitors...38

4.4.3) Discussion and structure‐activity relationships...39

4.4.4) Conclusion...41

4.5) Cellular investigations of the 1^st and 2^nd small‐molecule generation...42

4.5.1) Introduction...42

4.5.2) Cell viability measurements of potential rhodanine probes...43

4.5.3) Co‐treatment experiments with genotoxic agents and probes SM1 or SM49...44

4.5.4) Conclusion...47

5) Synthesis of 4’‐C‐alkylated‐5‐iodo‐2’‐deoxypyrimidine nucleosides as potential  antiviral drugs and synthetic building blocks... 49

5.1) Introduction...49

5.2) Synthesis of 4‐C‐modified carbohydrate building blocks...52

5.3) Synthesis of 4’‐C‐alkylated‐pyrimidine nucleosides...54

5.4) Synthesis of 4’‐C‐alkylated‐5‐iodo‐2’‐deoxypyrimidine nucleosides...54

5.5) Evaluation of the synthons ‐ exemplified by 3’,5’‐di‐O‐acetyl‐2’‐deoxy‐5‐iodo‐4’‐C‐

propyluridine N12c in a Sonagashira test‐reaction...56

5.6) Discussion and Conclusion...57

Conclusion ...59

Zusammenfassung ...65

Materials and methods ...72

6) Chemistry (nucleosides)... 72

6.1) General...72

6.2) Synthesis of 4‐C‐modified carbohydrate building blocks...73

6.3) Synthesis of 4`C‐alkylated‐pyrimidine nucleosides...75

6.4) Synthesis of 4’‐C‐alkylated‐5‐iodo‐2’‐deoxypyrimidine nucleosides...80

6.5) Sonagashira test‐reaction...87

7) Chemistry (small‐molecules)... 90

7.1) General...90

7.2) Synthesis of precursor aldehydes and acetophenon SM59‐84...90

7.3) Synthesis of small‐molecules SM1, 4, 10, 12, 16, 17, 21, 23, 27‐58...102

8) Molecular biological and biochemical methods...123

8.1) Chemicals, reagents, inhibitors and solvents...123

8.2) Expression and purification of pol λ and pol β...123

8.2.1) Nucleotide‐ and amio acid sequences of pol β and pol λ...124

8.3) SDS‐PAGE...126

8.4) Nucleotides and oligonucleotides...126

8.4.1) DNA oligonucletide purification...126

8.4.2) 5’‐Radioactive labelling of DNA oligonucletides...127

8.5) Radiometric primer extension...127

8.5.1) Pol λ PEX assay with variable small‐molecule concentrations...128

8.5.2) Pol λ PEX assay with variable dNTP concentrations...128

8.5.3) Pol λ‐TdT assay with variable small‐molecule concentrations...128

8.5.4) Pol β PEX assay with variable small‐molecule concentrations...129

8.6) Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)...129

8.6.1) Quantitative analysis of gel images...129

9) Cell biological methods...131

9.1) Cell cultivation...131

9.2) AllamarBlue assay...131

9.2) MTT assay...132

References ...133

Introduction 

1) Chemical genetics 

The  illustrious  quotation  from  the  great  chemist  Marcelin  Berthelot  (*1827 ‐ †1907)  

“La chimie crée son objet. Cette faculté créatrice, semblable à celle de l'art lui‐même, la  distingue essentiellement des sciences naturelles et historiques. Les derniers ont un objet  donné  d'avance  et  indépendent  de  la  volonté  et  de  l'action  du  savant.”¹ 

expresses impressively the capability of a synthetic chemist to create and design molecules  with novel molecular  structures and,  in  consequence,  novel  properties  and features.^2,3  Because of the creative passion of synthetic chemists, chemistry has been assigned various  enabling roles and several of its sister disciplines have grown “chemical” branches such as  chemical genetics.^2‐4 

As result from the melting of organic chemistry with cell biology, Timothy J. Mitchison and  Stuart L. Schreiber described for the first time the essential elements of the interdisciplinary  chemical genetics approach at the end of the last century.^4,5 The young discipline took up the  cause of clarifying biological pathways, or rather the functions of genes and gene products,  with the aid of small‐molecule probes (molecular weight < 900 g mol^‐1)⁶.^4,5,7‐11  

Figure 1. Reverse chemical genetics ‐ gene or gene product (e.g. DNA polymerase) to phenotype. 

Figure was adapted from literature ⁹. 

In classical genetics, biological processes are elucidated in living cells by the induction of  dysfunctions, and analysis of the resulting phenotypes of interest. This can be achieved by  manipulation of the genetic information, antibodies, or RNA interference, for example.^8‐11  Traditional forward genetics operates from phenotype to genotype and reverse genetics the  other way round.^8‐11 However, chemical genetics differs fundamentally from the classical  methods and has several advantages:^4,5,7‐11 

 Small‐molecules probes show on cells a fast and strong effect. 

 The biological effect is due to cell metabolism mostly reversible. So, the  dynamic analysis of protein regulation and functions are amenable. 

 The effect can be influenced by small‐molecule concentrations, and hence,  different phenotype characteristics can be achieved.  

 The  phenotype  can  be  studied  in  the  organism  at  any  time  of  its  physiological development stage. For example, gene knockouts cannot be  examined in adult organisms, when they are lethal to the embryonic stage. 

 Small‐molecules can differentiate between proteins, coded on the same  gene. 

 And for conserved targets, one and the same small‐molecule probe can be  used in various organisms and systems.  

As in classical genetics, chemical genetics can be subdivided into two approaches  ‐ the 

“forward” and the “reverse” approach.^4,5,7‐11 Within forward chemical genetics, phenotype  inducing small‐molecules are screened on cells up to multicellular organisms. Identified  compounds  ‐ that induce a phenotype of interest  ‐ are selected and the biological targets  must be examined in later phases of the study.^4,5,7‐11 On the other hand, a selected biological  target is screened in the “reverse” approach (Figure 1). Afterwards, the specificity of the  found probe is investigated, and lastly, phenotypes are examined in a cellular context.^4,5,7‐11  In order to develop powerful molecular probes for dissecting biological processes, diverse  small‐molecule libraries are created^12‐14 and screened under great technical and scientific  effort.^4,7‐11 The compounds are natural products (from plants, animals or micro‐organisms) or  from synthetic origin.^4,8‐11 In both approaches, the effort and complexity of the screening‐

system can vary greatly depending on the type of bio‐assay and method to determine the  phenotype.^4,7‐11 Due to the fact that chemical genetics is closely related to pharmaceutical  research, the discovered molecular tools not only might be of great value for basic science  but also may open up novel avenues for the treatment of diseases.^2,4,5,7‐13 

The  main part of the  work presented herein is based on a reverse chemical genetics  approach.  Therefore,  DNA polymerases  were  selected  as  molecular  targets  to  further  elucidate their respective cellular functions (Figure 1).  

2) DNA polymerases  2.1) General 

The survival and development of each organism relies on the equal distribution of its  genome during cell division. Errors in this process can lead to severe developmental defects,  cancer, or even death.^15‐17 DNA polymerases are key enzymes to pass the exact genomic  information down generations. Over 50 years ago, Kornberg et al. discovered in E. coli the  first  enzyme  (DNA polymerase I  or  Kornberg‐Polymerase),  that  catalyses  the  accurate  replication of DNA.^18,19 Since this and other pioneering discoveries, it was assumed for a long  period of time, that only six “classical” DNA polymerases (pol  α,  β,  γ,  δ,  ε, and terminal  deoxynucleotidyl transferase (TdT)) are responsible for DNA replication and repair in all  mammalian cells.15,17,20,21

 For that reasons, the discovery of several “novel” specialized DNA  polymerases was a real sensation in the last decades.^15,20,22 So far, at least 15 different human  DNA polymerases are known.15,17,20,22

 All enzymes share a common 3D‐structure, that is  reminiscent of a right hand, and can be subdivided into a finger‐, thumb‐ and a highly  conserved palm domain (see also Figure 4).17,20,23,24 With regard to their sequence homology  and structural similarity, the 15 enzymes have been subdivided into six DNA polymerase  families A, B, C, D, X, and Y (Table 1).^20,25,26 

The  basic functions of  the six “classical” DNA polymerases have been elucidated from  catalytic properties, and observation of cell physiology. Pol α catalyses the initiation of  chromosomal DNA replication at origins of replication and at Okazaki fragments on the  lagging‐strand,^27,28 pol β is  involved  in  base  excision  repair  (BER),^29‐31  pol γ  synthesizes  mitochondrial DNA,³² pol δ has a role in lagging‐strand synthesis,^33,34 pol ε participates in the  synthesis of the leading‐strand of chromosomal DNA,³⁵ and TdT facilitates antigen receptor  diversity³⁶.^15,20 

In the course of these and other cellular processes or by environmental conditions, DNA  mutations and  damages occur.¹⁶ To  maintain  the  genetic integrity of  the  genome,  an  elaborate set of sophisticated repair mechanisms have evolved. The set includes, amongst  others, the “novel” specialized DNA polymerases (pol η, θ, κ, λ, μ, ν, ι, ζ, and REV1).15‐17,20,37

  Features of some of these enzymes are known (Table 1), but to understand in depth the task  of a particular enzyme stills await clarification in the majority of the cases. For that reason,  there is a great demand for appropriate methods and reagents (e.g. small‐molecule probes)  to dissect the cellular functions of DNA polymerases. 

Table 1. Human DNA polymerases^a   

DNA polymerase  Gene   Protein size (kDa)  Family  Main Function 

pol α (alpha)  POLA1  166  B  DNA replication priming 

pol β (beta)^b  POLB  38  X  DNA repair 

pol γ (gamma)  POLG1  140  A  Mitochondrial DNA replication and repair  pol δ (delta)  POLD1  124  B  DNA replication (lagging‐strand) 

pol ε (epsilon)  POLE  262  B  DNA replication (leading‐strand)  TdT  DNTT  58  X  DNA repair, V(D)J recombination 

pol η (eta)  POLH  78  Y  Bypass synthesis (inserter) 

pol ι (iota)  POLI  80  Y  Bypass synthesis (inserter) 

pol κ (kappa)  POLK  99  Y  Bypass synthesis (inserter/extender)  pol λ (lambda)^b  POLL  63  X  DNA repair, V(D)J recombination 

pol μ (mu)  POLM  55  X  DNA repair, V(D)J recombination 

pol θ (theta)  POLQ  290  A  DNA repair 

pol ζ (zeta)  POLZ  353  B  Bypass synthesis (extender) 

REV 1  REV1  138  Y  Bypass synthesis (inserter) 

pol ν (nu)  POLN  100  A  DNA repair 

a table was adapted from literature ^15,17,20. 

b see also chapter 2.3) 

2.2) DNA polymerases and the polymerisation reaction 

All  previously  discovered  DNA  polymerases share  a  common,  over  several steps  well‐

coordinated reaction mechanism (Figure 2) for the synthesis of the helical DNA polymer  (composed of a sugar phosphate backbone, to which the four heterocyclic bases adenine (A),  guanine (G), thymine (T), and cytosine (C) are attached³⁸) (Figure 3).^38‐42  

E:DNAn

E

E:DNAn:dNTP

E*:DNA_n:dNTP

E*:DNA_n+1:PP_i

E:DNA_n+1:PP_i E:DNA_n+1

DNA_n+1

PP_i dNTP

DNA_n DNA binding

dNTP binding

conformational change

conformational change

pyrophosphyl transfer

hydrolyosis enzyme

dissociation

processive DNA synthesis 1

2

3

4

5 6

8

7 k_pol

2 P_i pyrophosphate

release

Figure 2. Mechanism of DNA polymerase catalyzed nucleotide incorporation. After binding of a DNA primer  template complex (DNAn), the DNA polymerase (E) binds an incoming dNTP that is afterwards tightly bound  and arranged for the chemical step by a conformational change of the enzyme (E*). After bond formation and  an other conformational change, pyrophosphate (PPi) is released to start another cycle of catalysis. Figure was  adapted from literature ^41‐43. 

N N N

N NH₂ O

O O

PO2-

O

O O

PO₂^- O

O O

PO2-

O

O O

PO₂^- N N N

N O

NH N N

HN

O

N N

O

O

N N N H N N

O O

O PO2-

O OH

O O

OH

O N

N N N O

NH

N N HN

O H

H

H H

H H

H H

3`‐end

3`‐end 5`‐end

5`‐end P OP OP O^-

O O^- O

O^- O

O^-

template

primer A

A C

C G

G

T

synthesis direction

incoming dNTP

-O₂P O

O O

O

HO O

3`‐end 5`‐end

P primer

C

G

incoming dNTP O O O

P P O

-O O O^- O^- O Mg²⁺

Mg²⁺

O H

H O^- O

O^- O

O^- O DNA polymerase

A B

Figure 3. Enzymatic DNA polymerization. (A) Schematic representation of template directed DNA synthesis  catalyzed by a DNA polymerase. (B) Schematic representation of the corresponding trigonal bipyramidal  transition state in the active site of a DNA polymerase (template not shown). Figure was adapted from  literature ^24,44. 

DNA replication proceeds semiconservative. In doing so, DNA polymerases use one DNA  parent strand as a template for synthesis of the exact complementary replica.^18,20,45 During  the  synthesis,  the  single‐stranded  template  dictates  to  the  enzyme  according  to  

Watson‐Crick³⁸,  in  which  sequence  the  four  native  2´‐deoxynucleoside‐5`‐triphosphates  (dNTPs) have to be connected to the 3`‐OH end of the hybridized primer. Thereby, the primer  is always extended in the 5` to 3` direction (Figure 3A).^20,42 

From a chemical point of view, the addition of a dNTP to the primer is performed according  to the mechanism of nucleophilic substitution (SN2). In the active site of the enzyme, the  trigonal bipyramidal transition state is stabilized by two metal ions, e.g. magnesium (II) ions. 

For that reason, the reaction mechanism is also called the “two metal ion mechanism” 

(Figure 3B).²⁴ The SN2 reaction is accompanied by pyrophosphate release. Its subsequent  hydrolysis favors DNA synthesis and prevents the reverse reaction. According to the latest  findings, the rate limiting step of the reaction is a local reorganization step in the active site  of the enzyme.⁴⁶ Nevertheless, the velocity of the polymerisation (kpol) of correct paired  nucleotides achieves 1000 dNTP s^‐1, and the catalytic efficiency (Kd kpol‐1) is in the region of  diffusion control (~10⁷ M^‐1 s^‐1).^41,42 Due  to this facts, DNA polymerases belong to most  powerful enzymes.⁴⁷  

2.3) DNA polymerase λ and β 

Most of the work presented herein covers the “classical” pol β^31,32,48 and  the recently  discovered “novel” pol λ⁴⁹. Both nonreplicative human enzymes are members of the DNA  polymerase X‐family (Table 1).15,17,20,22,37

 The exonuclease‐deficient pol λ (64 kDa) contains all  the structural features required for DNA binding, nucleotide binding and selection, and  catalysis of DNA polymerization, which are conserved in pol β (39 kDa) ‐ the smallest known  human DNA polymerase (Table 1). On this account, the primary sequence and the 3D‐

structure of the catalytic core of both DNA polymerase are highly homologous (Figure 4).^49,50  Because of its ability to remove the 5`‐deoxyribose phosphate (dRP) generated after incision  by an abasic (AP) endonuclease (dRP‐lyase activity) and its DNA synthesis specificity for short  gaps, pol β is the prime DNA polymerase participating in BER (Figure 5).15,17,20,30,37,51

 In  addition, pol β is able to associate with other downstream enzymes of the BER pathway like  DNA ligase I, AP endonuclease, and XRCC1‐DNA ligase III.^30,37 Extensive studies show that  pol β bypasses several DNA lesions via translesion synthesis (TLS), for example, AP sites⁵² and  cisplatin adducts⁵³.  

Figure 4. Family X DNA polymerase λ and β. (A) Schematic representation of pol β (red) and pol λ (green). Pol λ  consists of a nuclear localization signal (NLS), a BRCA1‐C terminal (BRCT) domain (residues 36‐132), a proline‐

rich region (residues 133‐243), and a pol β‐like catalytic core region (residues 244‐575), with a helix‐hairpin‐

helix (HhH) and a DNA polymerase X motif.⁴⁹ (B) Superimposition of the pol β‐like catalytic core region  (residues 244‐575) of pol λ (green) and pol β (red). PDB IDs 2PFN and 2FMP (shown without DNA). 

Pol λ, the other DNA polymerase of interest, is unique in possessing all the enzymatic  activities which are individually present in the other X‐family members.²⁰ Pol λ is capable of  synthesizing DNA de novo as well as template‐dependent, and displays dRP‐lyase and TdT  activity.^54‐60 It is implicated that pol  λ is involved in gap filling during nonhomologous end  joining^36,61,62, TLS^52,63,64, and BER^54,65,66. 

Moreover, studies with chicken DT40 cells⁶⁷, as well as mammalian fibroblasts⁶⁸, showed that  pol  λ has a backup role for pol β in BER. Experiments with reactive oxygen species (ROS)  indicate that pol λ protects cells from oxidative damage^66,69, and there is also evidence that  pol λ is required for cell cycle progression and is functionally connected to the S phase DNA  damage response machinery in cancer cells.⁶⁹ 

Figure 5. Schematic representation of BER imbalance by targeting pol β. BER is a highly coordinated, multistep  pathway, that removes a damaged DNA base and replaces it with the correct base. The genotoxic TMZ induce  the formation of a base damage (e.g. 3‐methyladenine (3meA)), which is excised by DNA glycosylase (AAG) to  produce an apurinic site (AP). Afterwards, an AP endonuclease (APE) incises the DNA backbone (5´ to the AP  site) and generates a single‐strand break. Then, pol  β removes the 5´‐dRP moiety through its intrinsic lyase  activity and fills in the resulting gap. In the final step, the nick is sealed by DNA ligase (LIG) to finish base  excision repair (BER). If BER is inhibited, or downstream steps of BER are limiting, then toxic intermediates  accumulate and can lead to cell death. In this way, the dosage of the DNA‐damaging agent can be reduced. 

Figure was adapted from literature ^16,70. 

It is well known that aberrant levels of specialized DNA polymerases might cause genomic  instability.^15,20,71  A  recent  investigation  of  the  expression  patterns  of  specialized  DNA  polymerases in 68 different tumor samples revealed that in more than 45% of these tumors  at least one specialized DNA polymerase was two‐fold‐enhanced expressed. Of particular  interest was the fact that over 30% of all samples had either pol λ or  β overexpressed.⁷²  Consequently, the regulation of both DNA polymerases could be crucial in cancer treatment,  since many chemotherapeutic regimes in use  depend at  least in part  on  the artificial  induction of DNA damage. If effective, their utility is typically limited by the severity of side  effects caused by the nonselective targeting of cancerous and healthy tissue in addition to  the  potential  to  induce  mutagenic  events  that  can  actually  accelerate  disease 

development.^41,70,73 The clinical efficacy of anticancer drugs like cisplatin and monofunctional  alkylating  agents  (e.g.  temozolomid  (TMZ))  is  often  reduced  by  cellular  DNA  repair  mechanisms.15‐17,20,37,51,70

  Consequently,  both  enzymes  specialized  for  DNA  repair  are  discussed as promising future drug targets, to reduce the dosage of DNA‐damaging agents  while  improving  their  activity  via  targeting  of  their  respective  repair  pathways  (Figure 5).15,17,20,37,51,70,74

  To  date,  several  inhibitors  of  DNA  polymerase λ  and  β  were  developed  and  investigated  (see  also  chapter 4.4.4).37,51,74‐79

  However,  one  remaining  challenge is still to find novel potent small molecule inhibitors that selectively inhibit one of  these enzymes. In addition, a discriminating inhibitor could facilitate the targeting of one of  these DNA polymerases over the other, to probe the enzymes’ respective cellular functions.  

2.4) Herpes virus DNA polymerase 

Viral infections are the leading cause of many critical illnesses. Without exception, all viruses  are obligate, intracellular molecular parasites that replicate only inside the cell of a living  organism.^80,81 For the reproduction of the viral genome, viruses often encode an own DNA  polymerase.²⁰ Due to the importance of these enzymes for the amplification of the genetic  code, viral DNA polymerases are established targets for current chemotherapies.^41,81 These  facts are also relevant for the family of the Herpes viruses (see also chapter 5.1), which  reproduce their genetic code with their own DNA‐dependent DNA polymerase in the nucleus  of  a  host  cell.  Among  the  nine  representatives  of  the  morphologically  very  similar  Herpesviridae, herpes simplex virus‐1 (HSV‐1) is the most researched member.²⁰ For that  reason, the HSV‐1 DNA polymerase serves herein as model enzyme, which is illustrated  briefly. After the HSV‐1 infection of mammalian cells, Keir et al. discovered in 1966 for the  first time DNA polymerase activities that deviated from the features of host enzymes.⁸² Later,  Weissbach et al. purified and characterized a viral DNA polymerase with a high molecular  weight (180 kDa) from HSV‐1 infected human cells.⁸³ It was found, that the enzyme favoured 

‐ very likely due to the composition of the HSV genome (67% GC content)²⁰ ‐ the synthesis of 

GC rich DNA.⁸³ Today, the 3D‐structur of the HSV‐1 DNA polymerase is known. The enzyme is  a heterodimer, composed of a catalytic subunit (UL30), whose structure is similar to B‐family  DNA polymerase structures, and a processivity factor (UL42) that increases the fidelity.^84‐86  The catalytic subunit consists of six domains. The N‐terminal part contains a pre‐N‐terminal, 

an N‐terminal, and an exonuclease domain, that ensures a high fidelity of DNA replication as  well as an RNase H activity.^20,87 The C‐terminal part adopts the usual right hand folding in  palm, fingers and thump domains.⁸⁵ Based on sequence alignments, the replicative HSV DNA  polymerase (UL30) belongs to the B‐family of DNA polymerases (see also chapter 2.1).²⁰   

3) DNA polymerases as drug targets  3.1) General 

As foreshadowed in previous chapters, DNA replication serves not only as a target for  answering chemical genetic issues, but has been tried and tested for decades as prominent  target for life‐saving medicines. Numerous pathological states, like cancer, autoimmune  disease, and many bacterial and viral infections can be traced back to uncontrolled DNA  metabolism.15‐17,20,37,51,70,79

 For that reason, it is one of modern medicine's top priorities to  combat those diseases with novel and innovative drugs. If one wants to specifically interfere  in  DNA  metabolism,  DNA  polymerases  of  humans,  animals,  viruses,  and  bacteria  are  potential key drug targets, which are responsible for the correct synthesis and repair of the  genetic code (see also chapter 2).15‐17,37,41,53,57,80

 Due to the fact, that DNA polymerases share  a similar 3D‐structure, and reaction mechanism to synthesise DNA, it is very challenging to  address a drug molecule for a particular enzyme of interest (see also chapter 2.2). However,  if the drug has a poor selectivity in its mode of action, the therapy is limited and inevitably  associated with severe side effects. Current medicines employed to target the metabolism of  DNA often induce DNA damage (see also Figure 5, and chapter 2.3),⁷⁰ influence the dNTP  pool, that is provided for DNA synthesis by the cell, or inhibit the enzymatic synthesis of  DNA.⁴¹  For  the  last‐mentioned  therapeutic  strategy,  which  is  relevant  for  this  work,  nucleoside analogs are a frequently used type of drug. Nucleosides, that are able to enter a  cell (Figure 6, see also chapter 5.1), function as so called “prodrugs”, which have to be  transformed by specific cellular nucleoside kinases to the actual enzyme substrate analogue; 

the  nucleoside‐5`‐triphosphates.<sup>20,41</sup>  Nucleoside‐5`‐triphosphates  derivatives  that  are  not/hardly able to enter cells cause often complications. In order to be effective, they have  to compete with the natural dNTP substrate pool for the active site of the DNA polymerase  target.^20,41  On  this  account,  the  respective  nucleosides  must  be  administered  in  high 

concentrations to be effective, which can result in turn in selectivity and drug resistance  problems.^20,41 An additional disadvantage  is, that nucleotide analogues and  nucleoside‐ 

5`‐triphosphates can also be utilized, modified, or degraded by a multiplicity of cellular  pathways or other enzymes.13,15,17,20,37,42,70,74,79,81

 Thus, in developing nucleoside analogues, it  is  necessary  to  investigate  not  only  the  optimisation  of  their  interaction  with  DNA  polymerases, but also their ability to be transformed to the 5`‐triphosphates without being  degraded or showing serious side effects.²⁰ 

Figure 6. Chemical structures of approved modified nucleoside analogues. (A) Current antiviral drugs (see also  chapter 5.1). (B) Currant anticancer drugs. Figure was adapted from literature ^20,41. 

To address these problems and other issues, it is an ongoing concern to develop innovative  therapeutic approaches and novel drugs.^88‐91 In the following, some for this work relevant  examples and perspectives are given.  

One current option to open up the way for novel drugs and nucleoside analogues is, for  example, to study certain structural features of various known molecules. Afterwards, the  interesting features are fused together in one novel drug‐like molecule, bearing all desired  properties (see also chapter 5.1).  

Other research approaches proceed towards the development of non nucleosidic small‐

molecule inhibitors, which act on the activity of a respective DNA polymerase. Thereby, the 

small‐molecule could act directly on the active site of the enzyme, induce conformational  changes in further protein domains (e.g. finger or thumb domain) to act indirectly on the  enzymes`  activity,  or  block  protein‐protein  interactions  that  are  important  for  the  processivity.12,13,20,41,92‐94

  In  general,  small‐molecule  DNA  polymerase  inhibitors  have  important advantages over substrate analogues. They are ideally suited to tune for a high  target  selectivity,  they  are  capable  to  enter  a  cell  and  do  not  require  intercellular  activation.^13,20,41  

Many chemotherapeutic regimes in use depend at least in part on the artificial induction of  DNA damage. The clinical efficacy of anticancer drugs is often reduced by cellular DNA repair  mechanisms.15‐17,20,37,51,70,78,79 Consequently, specialized DNA polymerases are discussed as  promising  future  drug  targets,  to  reduce  the  dosage  of  DNA‐damaging  agents  while  improving their activity via inhibition of their respective DNA repair pathways (see also  chapter 4).17,37,51,70,78,79 

3.2) Screening methods for DNA polymerase inhibitors 

In the preceding chapters it was described in detail, that there is a great demand for novel  DNA polymerases inhibitors in basic as well as in the applied sciences. The discovery process  of novel agents against a chosen protein target usually involves high‐throughput screening  (HTS) or high‐content screening (HCS) techniques, wherein large compound libraries are  screened for the desired effect (see also chapter 1).⁹⁵ Apart from emerging in silico based  methods^20,96‐101, one needs for such large‐scale screening campaigns automated, robust,  reliable, and cheap in vitro assays.⁹⁵ DNA polymerase inhibitors generally exert their effects  through interference with  the  enzyme and/or cofactors,  or  the  direct interaction with 

DNA.¹⁰² While there is no simple way to study DNA replication in vitro, the world‐renowned 

polymerase chain reaction (PCR) is an ideally suited enzyme assay, which involves a similar  set of DNA replication transactions.^103‐105 Classic PCR and the respective electrophoresis  techniques^104,105 have been applied previously for the in vitro discovery and characterisation  of  several  inhibitors  of  thermostable  DNA  polymerases.103,106‐110  However,  to  screen  thousands of molecules, the modern real‐time PCR is considerably more favourable, and  hundreds of in vitro reactions could be screened in parallel.^111,112 Real‐time PCR instruments  are able to monitor the concentration of the arising dsDNA products in multi‐well formats by 

measuring for example the emission of sequence‐specific fluorescent oligonucleotide probes  or fluorogenic dsDNA binders like SYBR® Green I.¹¹¹  

Because  the  common  mammalian,  viral,  and  bacterial  target  DNA  polymerases  are  thermolabile,  these  proteins  are  not  applicable  for  modern  PCR  and  other  screening  methods are required that can be performed at moderate temperatures.  

The primer extension reaction (PEX) is an effective and useful way to explore thermolabile  and  thermostable  DNA  polymerases  in the  laboratory.43,44,75,76,113‐119

 To  study the  DNA  template  dependent  DNA  polymerization  function,  a  short  radioactive  or  fluorescence  labeled DNA  primer  strand gets  annealed  to a longer DNA template  strand,  and  gets  elongated by enzymatic dNMP incorporation (Figure 7A). Noteworthy, to analyze TdT enzyme  activities the reaction is performed without the template strand and  is named single‐

stranded  PEX.^59,60,120  However,  after  a  defined  period  of  time,  the  PEX  reactions  are  quenched  and  quantitatively  analyzed  via  polyacrylamide  gel  electrophoresis  (PAGE)  (Figure 7A).  

Figure 7. Generally applicable radioactive PEX assays to characterize and screen small‐molecule inhibitors of  thermolabile DNA polymerases (A) Principle of the radioactive PEX assay to analyze the effect of an inhibitor  on the DNA template‐dependent polymerisation function of a respective DNA polymerase.^75,76 (B) Assay  scheme for inhibitor screening via the scintillation method. DNA polymerase polymerizes isotopic phosphate 

labelled  dNMPs.  The  exact  amount  of  formed  radioactive  DNA  can  be  determined  by  scintillation  measurements. 

Another common technique to analyse the PEX reaction mixtures is the scintillation method. 

Therefore,  the  reaction is  performed with an unlabelled primer template‐complex and  isotopic labelled dNTPs as enzyme substrates. After the reaction, the radioactivity of the  novel synthesized DNA is quantitatively measured by scintillation (Figure 7B).^120‐125 

So far, both PEX methods were implemented for the screening and characterisation of  inhibitors,75,76,100,120,124,126,127

 but to screen huge compound libraries, PAGE analytics and  accordingly  the  usage  of  radioactive  reagents  is  not  practicable.  Therefore,  novel  automatable assay readouts and the respective tailor‐made reagents were evolved. As a first  excellent example, Summerer et al. developed a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)‐

based assay format that translates the proceeding DNA synthesis into a fluorescent signal in  real‐time (Figure 8A).^128,129 The fluorescence signal is generated by the DNA polymerase  triggering opening of a molecular beacon, by extension of the primer strand.^128,129 The  resulting distance alteration is reported by FRET between two dyes introduced into the  molecular beacon stem and enables the quantitative characterization of inhibitors.^128,129  Recently, the elegant real‐time strategy was adopted from others¹³⁰ and successfully utilised  in  a  further  developed  fashion  for  screening  campaigns  of  human  DNA  polymerases  (Figure 8B).^131‐133  

Figure 8. Screening for inhibitors via real‐time FRET methods. (A) The template probe labelled with donor  (grey) and acceptor (brown) has a hairpin extension in closed conformation before start of reaction. While  extension proceeds, the DNA polymerase (blue) opens the stem and prevents re‐annealing by DNA duplex  formation. The increase in the distance between the two labels is reported by restoration of donor emission. 

Figure was adapted from literature ^128,129. (B) Strand displacement DNA synthesis assay. DNA polymerase  incorporates dNTP thereby extending the primer strand and displacing the downstream reporter strand  labelled with a 3`‐fluorophore donor, leading to an increased fluorescence signal. Figure was adapted from  literature ^131‐133. 

To access continuous FRET‐based PEX assays, some researchers focused on the enzymatic  turnover of fluorescently labled dUTP substrates. For that reason, Cauchon et al. desined a  primer‐template  complex,  that  was  labelled  at  the 5`‐template‐terminus  with  a  donor  fluorophore.¹³⁴ Polymerisation mediated by incubation with a DNA polymerase, dNTPs, and  an acceptor labeled dUTP juxtaposes the donor‐acceptor pairs, resulting in donor quenching  (Figure 9A).¹³⁴ On the other hand, Krebs et al. reported an FRET assay that quantifies the  incorporation of complementary pairs of fluorescently labeled dUMP into the DNA product,  and taking advantage, that the dye‐conjugated dNTP pairs in solution do not interact to  produce a FRET signal (Figure 9B).¹³⁵  

Figure 9. Screening for inhibitors using fluorescently labled dUTP substrates. (A) The substrate is a short  DNA/DNA primer/template. The template strand is labelled with a donor fluorophore (grey). Polymerization  mediated by incubation with DNA polymerase (blue), dNTP, and an acceptor‐labelled dUTP (brown) juxtaposes  the donor‐acceptor pairs, resulting in donor quenching. Figure was adapted from literature ¹³⁴. (B) Dye‐

conjugated nucleotide pairs in solution do not interact to produce a FRET signal. DNA polymerase incorporates  the dye‐nucleotides into the DNA. The close proximity of the two dyes in the polymer allows interaction  between the dyes causing the generation of a FRET signal proportional to the amount of DNA produced in the  sample. Figure was adapted from literature ¹³⁵. 

Other interesting examples amenable to automation are fluorometric PEX techniques that  monitor  the concentration  of  the arising dsDNA  products.^75,136‐138  The increase  of  the  fluorescence signal caused by PicoGreen™¹³⁶ or SYBR® Green I^75,137,138 emitting upon binding  to dsDNA was investigated as a fast readout for DNA polymerase activity (Figure 10). PEX  resulted in high concentrations of dsDNA when the respective DNA polymerase was not  inhibited.^75,137,138 On the contrary, when the enzyme was inhibited, the primer was not  extended and the fluorescence signal was low in relation to control reactions.⁷⁵ Using that  simple and economical method, diverse compound libraries were screened and potential 

inhibitors of bacterial¹³⁹ and human⁷⁵ DNA polymerases were identified (Figure 10, see also  chapter 4.1). Recently, Dallmann et al. extended the scope of this readout and established an  in  vitro  assay  for  the  parallel  multiplicative  target  HTS  against  divergent  bacterial  replicases.¹⁴⁰  

Figure 10. Principle of the SYBR® Green I (stars) ‐ based HCS assay.⁷⁵  

Of note, a possible approach could also be the measurement of the arising pyrophosphates  ions (PPi) that are produced by enzymatic dNTP consumtion (see also Figure 2). Reportedly,  PPi release of DNA polymerases was investigated in real‐time for instance by different  colorimetric and/or enzyme coupled assays.^141‐143 

In the recent years, DNA arrayed ultra‐HTS formats for PEX reactions were developed. 

Interestingly, these systems are time and cost efficient, and require only minimal amounts of  reagents. DNA arrays are based on the spatial separation of on a surfaces immobilized or  covalently bound primers.20,53,119,144 The enzymes, templates, screening compounds, buffers,  and natural as well as labelled (e.g. radioactive or fluorescent) dNTP substrates can also be  applied with spatial separation to perform the PEX reactions.^53,119,144 After the reaction, the  surfaces are washed several times  ‐ whereas the primers remain  ‐ and can be analysed by  phosphor imaging¹⁴⁴ or fluorescents measurements^53,119, (Figure 11). By employment of this  time and cost efficient concepts, Boudsocq et al. could identify a variety of natural products  that inhibit the BER enzyme pol β.⁵³ 

Figure 11. Principle of DNA arrayed HTS format ‐ using fluorescently labelled dNTP substrates. 

As one can see in this overview, many automatable techniques to screen DNA polymerase  inhibitors are established and are ready for their application to screen the chemical space. 

These methods have indeed the potential to discover novel interesting molecules that not  only might be of great value for basic science but also may open up novel avenues for the  treatment of diseases related to genome integrity. 

Concepts and objectives 

The survival and development of each organism relies on the equal distribution of its  genome during cell division. DNA polymerases are key enzymes to pass the exact genomic  information down generations.15,17,20,22

 In the last decades several novel DNA polymerases  were  discovered,  and  so,  at  least  15  different  human  DNA  polymerases  are  known  today.15,17,20,22

 Features of some of these enzymes are known, but to understand in depth the  task of a particular enzyme stills await clarification in the majority of the cases. For that  reason, there is a great demand for appropriate methods and molecular tools to dissect the  respective biological functions of DNA polymerases.  

The aim of this work (chapter 4) deals with the discovery and development of tailored small‐

molecule probes in order to gain insights into the functions of human pol λ and β. In previous  surveys several small‐molecule inhibitors of pol λ and few moderate inhibitors of pol β were  discovered.^75,76 Importantly, the rhodanine‐based compounds were the most active inhibitor  class and some of them could even discriminate between the highly homologous pol λ and  β.^75,76 Due to this facts, the rhodanine‐based small‐molecules were seen as an appropriate  starting  point  for  the  development  of  molecular  probes to  specifically  investigate  the  biological functions of pol λ and  β.^75,76 For this purpose, systematic synthetic optimization  should be undertaken in order to further expand the chemical diversity and to find novel and  more potent small‐molecule inhibitors of pol λ and β. The most promising inhibitors of the  first and second generation should be further investigated enzymatically and should be  evaluated in comparison to reference inhibitors. Out of the generated in virto data extensive  SAR should be established and discussed in detail. With the aim to further develop the  molecular probes in a cellular context, the probes should be explored on different human cell  lines. Afterwards, the suited molecular probes should be investigated in proof‐of‐concept  studies to specifically target the pol λ and β in their respective biological pathways. 

In addition, DNA polymerases serve not only as a target for molecular probes to dissect their  biological functions, but have been tried and tested for decades as prominent target for life‐

saving  medicines.15,17,20,22,37,41

  In  the  last  decades,  4’‐C‐modified  nucleoside  analogues  aroused scientific interest, because a couple of derivatives of this interesting compound class  showed antiviral activity^145‐153, even against multi‐drug resistant pathogens.^146,154 Because