Untersuchung von Th17-Zellen als Biomarker für die Prognosestellung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen

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Untersuchung von Th17-Zellen als Biomarker für die Prognosestellung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Annika Birthe Kämpe

Neumünster

Hannover 2019

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Hochschule Hannover

2. Dr. med. vet. Jasmin Neßler, Dipl. ECVN Klinik für Kleintiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Dipl. ECVN

Klinik für Kleintiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker- Trautwein

Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2019

Diese Dissertation wurde finanziell durch die Gesellschaft zur Förderung Kynologischer Forschung e.V. unterstützt.

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Für meine Familie

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Flashposter- und Posterpräsentationen:

1. A. Kämpe¹, A. Knebel¹, R. Carlson¹, K. Rohn², A. Tipold¹

1Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany

2Department of Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany

Evaluation of the involvement of Th17-cells in the pathogenesis of canine spinal cord injury

32^nd ECVN-ESVN Annual Symposium, Wroclaw – Poland, 13 -14 September 2019

2. A. Kämpe¹, A. Knebel¹, R. Carlson¹, A. Tipold¹

Adaption of a flow cytometric analysis method to measure Th17-cells to investigate their significance in neurological diseases in dogs

31^st Annual Symposium of the ESVN-ECVN Congress Center Scandic Copenhagen – Denmark, 20 - 22 September 2018

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1. A. Kämpe , A. Knebel , R. Carlson , K. Rohn , A. Tipold

2Department of Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany

Evaluation of the involvement of Th17-cells in the pathogenesis of canine spinal cord injury

2. A. Kämpe¹, A. Knebel¹, R. Carlson¹, A. Tipold¹

Adaption of a modified protocol to measure Th17-cells in canine blood by flow cytometry to investigate their significance in neurological diseases in dogs

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2 Literaturübersicht ... 4

2.1 Bandscheibenvorfälle ... 4

2.1.1 Allgemeines ... 4

2.1.2 Anatomie ... 5

2.1.3 Pathogenese ... 6

2.1.4 Diagnose ... 7

2.1.5 Therapie ...11

2.1.5.1 Konservative Therapie ...12

2.1.5.2 Chirurgische Therapie ...12

2.1.6 Prognose ...13

2.2 Biomarker ...15

2.2.1 Biomarker – Bisherige Forschungsergebnisse ...15

2.3 Immunsystem ...17

2.3.1 Angeborenes Immunsystem ...18

2.3.2 Adaptives Immunsystem ...18

2.4 Lymphozytendifferenzierung ...18

2.4.1 Naive T-Zellen und Thymusreserve (CD3+, CD4+, CD45RA+, CD31+) ...20

2.4.2 T-Zellen (CD3+ Lymphozyten) ...20

2.4.2.1 T-Helferzellen (CD4+ Lymphozyten) ...21

2.4.2.2 Zytotoxische T-Zellen (CD8+ Lymphozyten)...24

2.4.3 Zytokine ...25

2.4.3.1 IL-17 ...27

2.4.4 Th17-Zellen – Bisherige Forschungsergebnisse in der Human- und Veterinärmedizin ...27

2.5 Hypothese ...30

3 Material und Methoden ... 31

3.1 Material ...31

3.1.1 Klinikbedarf ...31

3.1.2 Labor-Equipment ...31

3.1.2.1 Pipetten ...31

3.1.2.2 Röhrchen ...32

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3.1.2.6 Sonstige Labormaterialien ...35

3.1.2.7 Messgeräte ...37

3.1.3 Computer-Software ...38

3.2 Vorversuche zur Th17-Zell-Bestimmung ...39

3.3 Patienten und Studiendesign der vorliegenden Studie ...42

3.3.1 Neurologische Untersuchung ...44

3.3.2 Probenentnahme ...46

3.3.2.1 Blutentnahme ...46

3.3.2.2 Liquorentnahme ...46

3.4 Methoden ...47

3.4.1 Th17-Messung im EDTA-Vollblut ...47

3.4.2 IL-17-Messung im Serum und Liquor cerebrospinalis mit ELISA ...54

3.5 Auswertung ...54

3.6 Statistik ...58

4 Publikation ... 59

5 Übergreifende Diskussion ... 92

6 Zusammenfassung ... 100

7 Summary ... 102

8 Literaturverzeichnis ... 104

9 Abkürzungsverzeichnis ... 123

10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 126

11 Anhang ... 130

12 Danksagung ... 152

13 Erklärung ... 153

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1 Einleitung

Der Bandscheibenvorfall (Intervertebral Disc Herniation; IVDH) gehört zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen in der Veterinärmedizin und ist die häufigste Ursache für Rückenmarksverletzungen beim Hund (FLUEHMANN et al.

(2006)). Die klinischen Symptome reichen von Hyperästhesie über Paresen bis hin zur vollständigen Lähmung der Gliedmaßen mit Verlust des Tiefenschmerzes (COATES (2000), SHARP u. WHEELER (2005)). Um das Ausmaß eines Bandscheibenvorfalls beurteilen zu können, ist man in den meisten Fällen auf weitergehende Diagnostik angewiesen (DE LAHUNTA u. GLASS (2009)).

Goldstandard ist hierfür die Magnetresonanztomographie (ROBERTSON u. THRALL (2011), DE LAHUNTA u. GLASS (2009)). Eine zuverlässige Prognose bezüglich einer vollständigen klinischen Erholung ist schwierig, insbesondere wenn es bereits zum Verlust des Tiefenschmerzes gekommen ist (JEFFERY et al. (2013), JEFFERY et al. (2016)). Hierfür fehlen bislang objektivierbare Parameter, die die Prognosestellung und Entscheidungsfindung für die weiterführende Therapie erleichtern würden (STRIMBU u. TAVEL (2010)).

Die Behandlung eines Bandscheibenvorfalls muss immer individuell entschieden werden. Die Therapiemöglichkeiten reichen von einem konservativen Behandlungsversuch mit strikter Boxenruhighaltung über mehrere Wochen und der Applikation von Schmerzmitteln bis hin zur chirurgischen Behandlung (COATES (2000)). Die Prognose wird derzeit vor allem aufgrund des Vorhandenseins des Tiefenschmerzes gestellt (JEFFERY et al. (2016)). WANG-LEANDRO et al.

verglichen mehrere Methoden zur Prognosestellung, um die Regeneration von Hunden mit IVDH nach Operation vorauszusagen. Hierbei zeigte sich, dass das Vorhandensein des Tiefenschmerzes bei Hunden mit Paraplegie eine bessere Vorhersagekraft der funktionellen Wiederherstellung hat als messbare Parameter mittels Magnetresonanztomographie (WANG-LEANDRO et al. (2017)). Zur Einschätzung der Prognose kann zudem die Einteilung der Schweregrade nach

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SHARP u. WHEELER (2005) genutzt werden. Hierbei haben Hunde mit Paraplegie und Verlust des Tiefenschmerzes den höchsten Schweregrad und somit die ungünstigste Prognose. Jedoch haben verschiedene Studien gezeigt, dass es dennoch bei 52,1% - 78% der Hunde mit Schweregrad 5 zur Wiederherstellung der Gehfähigkeit kommen kann (JEFFERY et al. (2016), AIKAWA et al. (2012), OLBY et al. (2003), RUDDLE et al. (2006), BULL et al. (2008), SCOTT u. MCKEE (1999)).

Aufgrund dieses breiten Schwankungsbereiches kann daher keine verlässliche Prognose gestellt werden. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit von verlässlicheren Parametern, die eine genauere Prognose ermöglichen (STRIMBU u. TAVEL (2010)).

Derzeit fehlen solche objektivierbaren Parameter für die Prognosestellung bei Bandscheibenvorfällen. Gerade bei hochgradigen neurologischen Defiziten wären Biomarker essentiell, um die Regenerationsfähigkeit des Rückenmarkes individuell beurteilen und eine zuverlässige Prognose stellen zu können. Ein solcher Parameter müsste leicht und schnell messbar/zugänglich sein, da es bei Hunden mit Bandscheibenvorfall zu einer raschen Verschlechterung des neurologischen Zustands kommen kann (CRUZ et al. (2015)). Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang messbare Parameter im Blut, Liquor cerebrospinalis (CSF) und biologisches Material, das schnell und unkompliziert gewonnen werden kann (STRIMBU u. TAVEL (2010), CRUZ et al. (2015)).

Th17-Zellen, spezifische T-Helferzellen des adaptiven Immunsystems (MURPHY et al. (2018)), die 2005 erstmals entdeckt worden sind (HARRINGTON et al. (2005), BETTELLI et al. (2006)), könnten ein solcher Biomarker sein (STRIMBU u. TAVEL (2010)). Humanmedizinische Studien belegen bereits, dass Th17-Zellen am Pathomechanismus von Bandscheibenvorfällen beteiligt sind (SHAMJI et al. (2010)).

Interleukin-17 (IL-17) produzierende T-Helferzellen (Th17-Zellen) übernehmen eine zentrale Rolle innerhalb der Immunantwort bei infektiösen oder autoimmunen Erkrankungen (beispielsweise bei Psoriasis, Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, Inflammatory Bowel Disease (IBD), Asthma und Multipler Sklerose) (CHEN u. KOLLS (2017), KORN et al. (2009), SAHIN et al. (2014) , TIZARD (2018)). Stromazellen werden durch IL-17A und IL-17F zur Produktion des Faktors G-CSF angeregt,

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welcher die Bildung der neutrophilen Granulozyten stimuliert (MURPHY et al.

(2018)). Des Weiteren wird vermutet, dass Th17-Zellen an der Schmerzentstehung und den sekundären entzündlichen Reaktionen maßgeblich beteiligt sind (SHAMJI et al. (2010), LUCHTING et al. (2014)).

Neueste Studien in der Humanmedizin legen die Vermutung nahe, dass der Grund für die Schmerzentstehung bei einem Bandscheibenvorfall nicht auf die Kompression der Nerven, sondern auf eine Immunreaktion bzw. Entzündung zurückzuführen ist (SHAMJI et al. (2010)). Hierbei wird vermutet, dass das Immunsystem die austretende Flüssigkeit des Nucleus pulposus als körperfremdes Material erkennt und eine Entzündungsreaktion auslöst (SHAMJI et al. (2010)). Insbesondere bei Bandscheibenextrusionen konnten in einer humanmedizinischen Studie von CHENG et al. sowohl erhöhte Th17- als auch IL-17-Werte gemessen werden (CHENG et al.

(2013)). Die erhöhten Werte korrelierten zudem mit einer erhöhten Schmerzintensität (CHENG et al. (2013))

Ziel der vorliegenden Studie war, eine Beteiligung des adaptiven Immunsystems an der Pathophysiologie eines Rückenmarkstraumas (Spinal Cord Injury; SCI) bzw.

Bandscheibenvorfalls (IVDH) zu untersuchen und zu prüfen, ob ein Zusammenhang zwischen Th17-Zellen und dem Genesungsverlauf eines Bandscheibenvorfalls beim Hund besteht und somit Th17-Zellen potenzielle Biomarker für die Prognose darstellen können. Hierfür wurden bei Vorstellung eines Hundes mit akutem/subakutem oder chronischem Bandscheibenvorfall Th17-Zellen im Vollblut untersucht. Die Werte wurden nach Besserung um einen Schweregrad nach SHARP u. WHEELER (2005) nochmals kontrolliert und erneut nach sechs weiteren Monaten gemessen. Alle Werte wurden in Beziehung zum jeweiligen Outcome gesetzt.

Zusätzlich wurden die Interleukin-17-Werte im Serum sowie im Liquor cerebrospinalis bestimmt und in Bezug zu den ausgewerteten Th17-Zell-Werten im Vollblut gesetzt.

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2 Literaturübersicht

2.1 Bandscheibenvorfälle

2.1.1 Allgemeines

Bei degenerativen Veränderungen der Bandscheibe kann es zum Bandscheibenvorfall (Diskusprolaps) durch partielles bzw. vollständiges Einreißen des Faserknorpelrings (Anulus fibrosus) kommen und infolgedessen zum Vorfall des zentral gelegenen Gallertkerns (Nucleus pulposus). Der dadurch entstehende Druck auf das Rückenmark führt zu neurologischen Ausfallserscheinungen unterschiedlichen Schweregrades (HANSEN (1952), SHARP u. WHEELER (2005)).

Es gibt kompressive und nicht-kompressive Bandscheibenvorfälle: Zu den kompressiven Rückenmarkserkrankungen zählen der Hansen Typ I (Nucleus pulposus extrusion) und Hansen Typ II (Anulus fibrosus protrusion) (HANSEN (1952)). Bei der Acute Non-compressive Nucleus Pulposus Extrusion (ANNPE) hingegen kommt es durch ein Trauma zu einer perakuten Extrusion des nicht degenerierten Nucleus pulposus, ohne dass hierbei das Rückenmark komprimiert wird (DE RISIO (2015)).

Bandscheibenvorfälle machen in der Veterinärmedizin bei Hunden, die jünger als 12 Jahre sind, insgesamt 3,5 % der tiermedizinischen Erkrankungen aus (BERGKNUT et al. (2012)) und sind bei anderen Tierarten eher selten (LORENZ et al. (2011)). Die Erkrankung kann akut, subakut oder chronisch-progressiv verlaufen. Es kommt zu zahlreichen neurologischen Ausfällen, angefangen mit Schmerzen im Bewegungsapparat, Propriozeptionsdefiziten, bis hin zur Parese oder Plegie mit oder ohne vorhandenen Tiefenschmerz (COATES (2000)). Die Therapie eines Bandscheibenvorfalls besteht bei Schmerzen ohne neurologische Ausfälle oder bei geringgradigen neurologischen Ausfällen aus einer Kombination von Ruhighaltung, Physiotherapie und medikamentöser Versorgung mit Schmerzmitteln (vorwiegend nicht steroidale Antiphlogistika (NSAIDs), ggf. Opiaten) und ggf. zusätzlichen Medikamenten bei neurogenen Miktionsstörungen. Bleibt eine Besserung der

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Symptome aus oder ist es bereits zu hochgradigen neurologischen Ausfällen gekommen, ist eine chirurgische Entfernung des Bandscheibenmaterials indiziert.

Die besten Ergebnisse werden mit einer Kombination aus medikamentöser und chirurgischer Versorgung sowie nachfolgender Physiotherapie erzielt (bis zu 95 %, abhängig vom jeweiligen Schweregrad) (SHARP u. WHEELER (2005)).

2.1.2 Anatomie

Die Wirbelsäule des Hundes setzt sich aus insgesamt sieben Halswirbeln, dreizehn Brustwirbeln, sieben Lendenwirbeln, drei Sakralwirbeln (welche zum Kreuzbein verschmolzen sind) und um die zwanzig Schwanzwirbel zusammen (FLÜCKINGER et al. (2008), SHARP u. WHEELER (2005)). Die Zwischenwirbelscheiben (Disci intervertebrales) liegen jeweils zwischen den benachbarten Wirbelkörpern.

Abweichend hiervon sind die Zwischenwirbelbereiche des ersten und zweiten Halswirbels sowie die zum Kreuzbein verschmolzenen Wirbelkörper, zwischen denen keine Bandscheiben liegen (SHARP u. WHEELER (2005)).

Die Rückenmarkssegmente entsprechen topografisch nicht den einzelnen Wirbeln, da sich die Wirbelsäule schneller entwickelt als das Rückenmark. Das Rückenmark endet im Conus medullaris im Bereich des vierten bis sechsten Lendenwirbels des Hundes. Die jeweiligen Nervenfasern verlaufen weiter nach kaudal und treten aus dem Rückenmarkskanal aus. Dieses auch als Ascensus medullae spinalis bezeichnete Phänomen wird vor allem im Bereich der Lumbalschwellung (L4-L7) ersichtlich (SCHMIDT et al. (2015)). Ein Hund hat normalerweise insgesamt 36 Rückenmarkssegmente: acht zervikale, dreizehn thorakale, sieben lumbale, drei sakrale und fünf kaudale Segmente (DE LAHUNTA u. GLASS (2009)). Das Rückenmark wird in vier Abschnitte eingeteilt: hoch zervikal (C1-C4), tief zervikal (C5-T2), thorakolumbal (T3-L3) und lumbosakral (L4-S3). Die graue Substanz liegt zentral im Rückenmark und wird peripher vollständig von der weißen Substanz umgeben (SHARP u. WHEELER (2005)).

Eine Bandscheibe (Discus intervertebralis) besteht von innen nach außen physiologisch aus einem mukösen, gelkissenartigen, elastischen Gallertkern

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(Nucleus pulposus), einer Transitionszone und dem ringförmig umgebenen äußeren Faserring (Anulus fibrosus) (HANSEN (1952), NICKEL et al. (2004)). Die Zwischenwirbelscheiben dienen dazu, Bewegungen der Wirbelkörper gegeneinander abzufangen und verleihen der Wirbelsäule ihre Flexibilität (HANSEN (1952), NICKEL et al. (2004), SHARP u. WHEELER (2005)).

Der physiologische Nucleus pulposus besteht hauptsächlich aus Wasser und hygroskopisch wirksamen Proteoglykanen, wodurch er seine gelatinöse Konsistenz erhält (SCHMIDT u. KRAMER (2015)).

2.1.3 Pathogenese

Der Verlust an Wassergehalt und Proteoglykanen im Alter führen beim Menschen zur Degeneration der Bandscheiben und können zur Bandscheibenherniation führen (HANSEN (1952)). Beim Hund kommt es zu ähnlichen altersabhängigen, chondroiden oder fibroiden Veränderungen der Bandscheiben (COLE et al. (1986), BRAY u. BURBIDGE (1998), SCHMIDT u. KRAMER (2015))).

Grundsätzlich werden Bandscheibenvorfälle nach HANSEN (1952) in zwei Formen eingeteilt:

HANSEN-Typ-1 (Extrusion des Nucleus pulposus):

Beim HANSEN-Typ-1 (Diskusprolaps) rupturiert der Anulus fibrosus vollständig, wodurch es zur Extrusion des Nucleus-pulposus-Materials kommt. Dieser Typ betrifft vorwiegend chondrodystrophe Rassen wie Dackel, Pekinese und Mops (HANSEN (1952)). Die chondroiden, degenerativen Veränderungen der Bandscheibe treten in den ersten zwei Lebensjahren auf. Bereits im Alter von einem Jahr verliert der Nucleus pulposus bei chondrodystrophen Hunderassen seine mukoide Konsistenz, dehydriert und es kommt zur dystrophischen Kalzifizierung (JEFFERY et al. (2013), HANSEN (1952)). Durch die veränderte Beschaffenheit des Nucleus pulposus wird der Anulus fibrosus mechanisch stärker beansprucht, wodurch es zum Einreißen des Faserrings kommt und dadurch das Bandscheibenmaterial in den Rückenmarkskanal vorfallen kann (JEFFERY et al. (2013)).

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Am häufigsten treten Bandscheibenextrusionen im thorakolumbalen Rückenmarksbereich (Th3-L3) auf (FLUEHMANN et al. (2006)). Der klinische Verlauf geht meist mit akuter Symptomatik einher (plötzlich auftretende Schmerzhaftigkeit und neurologische Ausfallserscheinungen).

HANSEN-Typ-2 (Protrusion des Anulus fibrosus):

Fibroide Degeneration des Anulus fibrosus tritt vorwiegend bei nicht- chondrodystrophen, größeren Rassen wie beim Labrador und Deutschem Schäferhund im mittleren Alter auf (HANSEN (1952)). Hierbei kommt es – im Gegensatz zu Typ 1 – zu degenerativen Veränderungen des Anulus fibrosus, wodurch es zu einer Vorwölbung des Anulus fibrosus in den Rückenmarkskanal kommt (JEFFERY et al. (2013)). Ursächlich hierfür ist eine, insbesondere dorsale, Faserverdickung des Anulus fibrosus (JEFFERY et al. (2013)). Der klinische Verlauf ist chronisch und langsam progressiv.

Beide Formen können sich aber auch überschneiden und ebenfalls bei allen Rassen vorkommen (CUDIA u. DUVAL (1997)).

Traumatischer Bandscheibenvorfall

Beim sogenannten „explosiven Bandscheibenvorfall“, dem bereits erwähntem ANNPE, handelt es sich um eine gesunde Bandscheibe, bei der es durch ein Trauma zu einer perakuten Extrusion des Nucleus pulposus kommt. Hierbei werden Bestandteile des Nucleus pulposus mit hoher Geschwindigkeit in den Rückenmarkskanal transportiert und das Rückenmark mit unterschiedlicher Schwere geschädigt (JEFFERY et al. (2013), HANSEN (1952)).

2.1.4 Diagnose

Für die Diagnosestellung eines Bandscheibenvorfalls wird eine neurologische Untersuchung vorgenommen, mit Hilfe derer der Bandscheibenvorfall neuroanatomisch lokalisiert und graduell eingeschätzt werden kann. Das

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Rückenmark wird in vier Abschnitte eingeteilt: C1-C5, C6-T2, T3-L3 und L4-S3 (SHARP u. WHEELER (2005)). Die Läsion kann mittels Überprüfung der spinalen Reflexe sowie Haltungs- und Stellreaktionen näher eingegrenzt werden (JAGGY u.

SPIESS (2007)).

Abb.1: Neuroanatomische Einteilung des Rückenmarks (modifiziert nach SHARP u. WHEELER (2005))

Zur Einteilung des Schweregrades eines Bandscheibenvorfalls kann das Schema nach SHARP u. WHEELER (2005) genutzt werden. Je höher der Schweregrad, desto vorsichtiger ist die Prognose (AIKAWA et al. (2012), BULL et al. (2008)).

Einteilung der Schweregrade nach SHARP u. WHEELER (2005):

• Grad 1: Schmerzhaftigkeit der Wirbelsäule ohne neurologische Ausfallserscheinungen

• Grad 2: Gering- bis mittelgradige Parese, Ataxie und

Propriozeptionsdefizite, selbstständig steh- und gehfähig

• Grad 3: Hochgradige Parese, nicht selbstständig steh- und gehfähig

• Grad 4: Plegie mit erhaltenem Tiefenschmerz

• Grad 5: Plegie ohne Tiefenschmerz

Differentialdiagnostisch kommen bei einer akuten Rückenmarksläsion neben Bandscheibenvorfällen auch Traumata (Frakturen, Luxationen), entzündliche

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Prozesse (Diskospondylitis, Meningomyelitis), auf- und absteigende Myelomalazie und Neoplasien in Betracht (SHARP u. WHEELER (2005)).

Neben einer ausführlichen allgemeinen und neurologischen Untersuchung müssen weitere diagnostische Mittel hinzugezogen werden, um den Verdacht eines Bandscheibenvorfalls zu bestätigen und um das Ausmaß beurteilen zu können.

Hierzu werden zuerst Röntgenbilder im laterolateralem und ventrodorsalem Strahlengang des betroffenen Wirbelsäulenabschnittes erstellt (LAMB et al. (2002)).

Erste Hinweise im Röntgenbild auf einen vorliegenden Bandscheibenvorfall sind verengte Intervertebralspalten, zusammengeschobene Facettengelenke, Einengungen oder verstärkte Opazität im Foramen intervertebrale und mineralisiertes Bandscheibenmaterial. Eher selten tritt ein sogenanntes intravertebrales Vakuum-Phänomen auf, hierbei handelt es sich um Gasansammlungen (Stickstoff) in der geschädigten Bandscheibe (TIPOLD et al.

(2011), LAMB et al. (2002)). Außerdem können mittels Röntgenaufnahme bereits einige Differentialdiagnosen bzw. Nebenbefunde wie Diskospondylitis, Missbildungen, Frakturen oder Luxationen im Bereich der Wirbelsäule, Spondylosen, Spondylarthrosen, Wirbelfusionen und Missbildungen wie Keilwirbelbildungen ermittelt bzw. ausgeschlossen werden (LORENZ et al. (2011)). Spondylosen im Bereich der Wirbelsäule sind ein häufiger Nebenbefund, welche sich aufgrund einer erhöhten Beweglichkeit im betroffenen Gebiet entwickeln. Diese sind jedoch meistens klinisch unbedeutend und nicht der Grund für eine Rückenmarkssymptomatik. LEVINE et al. vermuteten einen Zusammenhang von Spondylosen und Hansen Typ II-Vorfällen, nicht jedoch beim Hansen Typ I (LEVINE et al. (2006)). Bei Betrachtung der Röntgenbilder muss beachtet werden, dass die Abstände zwischen den Bereichen C2/3, C7/Th1 sowie Th10/11 physiologisch enger sind als die der angrenzenden Zwischenwirbelräume (HECHT (2012)).

Die röntgenologische Untersuchung liefert demnach bereits erste Hinweise auf einen Bandscheibenvorfall und kann den betroffenen Bereich eingrenzen, ist jedoch nicht ausreichend für eine gesicherte Diagnose. Um das Ausmaß und die Menge des vorgefallenen Bandscheibenmaterials sowie das Vorhandensein weiterer

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Rückenmarksläsionen beurteilen zu können, sind weitere bildgebende Verfahren wie Myelographie, Myelo-Computertomographie oder Magnetresonanztomographie nötig (LAMB et al. (2002), DENNISON et al. (2010)).

Magnetresonanztomographie (MRT)

Die Magnetresonanztomographie gilt heutzutage als Goldstandard sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin für die Diagnosestellung eines Bandscheibenvorfalls und ist unverzichtbar, um den Bandscheibenvorfall genau zu lokalisieren und das Ausmaß sowie die Schwere der Rückenmarksläsion sicher beurteilen zu können (ROBERTSON u. THRALL (2011)). Des Weiteren können so vor einer geplanten Operation nicht-invasiv die statischen bzw. dynamischen Beschaffenheiten der Rückenmarkskompression vorab beurteilt werden, was zu einer besseren Planung der Operationsbedingungen führt und wodurch eventuell auftretende Komplikationen, wie z.B. Instabilitäten, im Voraus erkannt werden können (DA COSTA et al. (2006), ROBERTSON u. THRALL (2011)).

Die Befunde im MRT bei einem Bandscheibenvorfall ähneln denen, die man in der Humanmedizin sieht (LEVINE et al. (2011)). Hypointensität des Nucleus pulposus in T2-gewichteten Aufnahmen werden häufig beobachtet, sind jedoch unspezifisch (SHARP u. WHEELER (2005), KUNZE et al. (2019)). Die Verlagerung von epiduralem Fett durch das vorgefallene Bandscheibenmaterial, sowie die Verformung des Rückenmarks sowohl in der sagittalen als auch in der transversalen Ebene liefern die eindeutige Diagnose eines Bandscheibenvorfalls (LEVINE et al. (2011), TOBIAS u. JOHNSTON (2012)).

Im Vergleich zur Computertomographie (CT) erzielte das MRT mit einer Sensitivität von 98,5 % (CT: 88,6 %) überragende Ergebnisse (COOPER et al. (2014)).

Liquor cerebrospinalis

Mit Hilfe der Untersuchung des Liquor cerebrospinalis (Cerebrospinal Fluid; CSF) können weitere Differentialdiagnosen ausgeschlossen werden. Insbesondere können mittels CSF entzündliche Erkrankungen ausgeschlossen oder näher differenziert werden. CSF wird vom Plexus choroideus gebildet und ist eine klare, farblose,

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protein- und zellarme Flüssigkeit (SHARP u. WHEELER (2005), PLATT u. OLBY (2013)), die in Narkose mittels Liquorpunktion subokziptal aus der Cisterna Magna (atlanto-occipital) oder lumbal gewonnen werden kann (TOBIAS u. JOHNSTON (2012), PLATT u. OLBY (2013)). Physiologischer CSF enthält nur wenig Zellen (0 - 4 Zellen/µl) und ebenfalls wenig Proteine: < 25 mg/dl (atlanto-occipital) bzw. < 40 mg/dl (lumbal) (PLATT u. OLBY (2013)). Häufige Laborbefunde im Zusammenhang mit einem Bandscheibenvorfall sind eine erhöhte Zellzahl (Pleozytose) und Proteinkonzentration, welche auf eine sekundäre Entzündungsreaktion im zentralen Nervensystem hindeuten (WINDSOR et al.

(2008), TOBIAS u. JOHNSTON (2012)). Durch das vorgefallene Bandscheibenmaterial wird eine Entzündung initiiert, die für den Abbau der vorgefallenen Substanzen sorgt (SHAMJI et al. (2010)). Die Liquorentnahme sollte möglichst nah an der Lokalisation des Bandscheibenvorfalls erfolgen (SHARP u.

WHEELER (2005), TOBIAS u. JOHNSTON (2012)).

SRUGO et al. zeigten in einer retrospektiven Studie mit Hunden mit einem akuten thorakalen Bandscheibenvorfall (IVDH) und einer nicht gehfähigen Parese eine positive Assoziation einer Pleozytose ( > 5 Zellen/µl, insbesondere neutrophile Granulozyten) im CSF mit der Schwere der Rückenmarksschädigung und der Dauer der Regeneration der Gehfähigkeit nach Operation (SRUGO et al. (2011)). Hunde mit Plegie und ohne Tiefenschmerz, die ihre Gehfähigkeit nicht wiedererlangten, hatten im CSF einen signifikant höheren Prozentanteil an Makrophagen (SRUGO et al. (2011)).

SRUGO et al. schlussfolgerten daraus, dass ein Anteil von mehr als 13 % an Makrophagen im Liquor cerebrospinalis für eine schlechtere Prognose der Wiedererlangung der Gehfähigkeit spricht (SRUGO et al. (2011)).

2.1.5 Therapie

Die Therapie ist abhängig von den erhobenen Befunden und hängt insbesondere von der Schwere der neurologischen Defizite ab. Bei geringgradigen Ausfällen ist ein konservativer Behandlungsversuch mit strikter Ruhighaltung über vier bis sechs

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Wochen, Schmerzmedikation (NSAIDs, Opioide), ggf. Medikamenten zur Unterstützung der Blasenfunktion und engmaschigen neurologischen Verlaufskontrollen möglich. Bei Verschlechterung des neurologischen Zustands ist eine chirurgische Therapie indiziert (COATES (2000)).

2.1.5.1 Konservative Therapie

Bei Schmerzhaftigkeit ohne neurologische Ausfälle oder geringgradigen neurologischen Defiziten (Schweregrad 1-2 nach SHARP u. WHEELER (2005)) wird ein konservativer Behandlungsversuch angeraten (LORENZ et al. (2011), COATES (2000), SHARP u. WHEELER (2005)). Hierbei muss der Patient ruhig gehalten werden und die Bewegung sollte für mindestens vier bis sechs Wochen auf ein Minimum reduziert werden. Um das Auftreten von Dekubitalstellen zu vermeiden, sollte der Hund ein weiches Lager haben und gegebenenfalls regelmäßig gewendet werden. Des Weiteren ist es notwendig, auf einen regelmäßigen und ausreichenden Harnabsatz zu achten, da bei Ausbleiben des Urinabsatzes ein lebensbedrohlicher Zustand entstehen kann. Um Muskelabbau vorzubeugen und die Beweglichkeit zu erhalten, sind physiotherapeutische Übungen ein wichtiger Bestandteil während der Rehabilitation (LORENZ et al. (2011)). Eine analgetische Versorgung ist unerlässlich, der Einsatz von Glukokortikosteroiden wirkt sich Studien zufolge negativ auf die Genesung aus und geht mit einer erhöhten Komplikationsrate post operationem einher und beeinträchtigt zudem die Lebensqualität des Tieres (LEVINE et al.

(2007), OLBY et al. (2016), BOAG et al. (2001)).

2.1.5.2 Chirurgische Therapie

Bei Ausbleiben einer Besserung, rezidivierender Schmerzhaftigkeit oder Verschlechterung des neurologischen Zustands ist eine chirurgische Versorgung des Bandscheibenvorfalls indiziert (COATES (2000)).

Chirurgische Therapiemöglichkeiten bei thorakolumbalen Bandscheibenvorfällen sind die Hemilaminektomie, Laminektomie oder Pedikelektomie (TOBIAS u. JOHNSTON

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(2012)). Zervikale Bandscheibenvorfälle werden in erster Linie mittels Ventral Slot behoben (PLATT u. OLBY (2013)). Prophylaktische Fenestrationen der Bandscheiben verringern das Risiko von Rezidiven (JEFFERY u. FREEMAN (2018), FREEMAN u. JEFFERY (2017)). Die postoperative Nachsorge gleicht der konservativen Therapie, wobei aufgrund des invasiven Eingriffs eine analgetische Versorgung mit Opioiden anzuraten ist (LORENZ et al. (2011)).

2.1.6 Prognose

Im Allgemeinen ist die Prognose bei frühzeitiger Erkennung und Therapie des Bandscheibenvorfalls als relativ günstig anzusehen. Hierbei kommt es jedoch vor allem auf die Schwere der neurologischen Defizite an (GIBSON u. MCCURNIN (1977), AIKAWA et al. (2012), BULL et al. (2008)). Mit zunehmendem Schweregrad verschlechtert sich die Prognose. Milde neurologische Ausfallserscheinungen haben in der Regel eine gute Prognose. Bisher gilt vor allem das Vorhandensein des Tiefenschmerzes als aussagekräftig für die Prognosestellung (JEFFERY et al.

(2016)). Hierbei haben die Hunde, die die Tiefenschmerzsensibilität innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Operation wieder zurückgewinnen, die besten prognostischen Aussichten auf funktionelle Wiederherstellung (SCOTT u. MCKEE (1999), OLBY et al. (2003), BULL et al. (2008)). Hunde mit einer Läsion im zervikalen Rückenmarksbereich erholten sich außerdem deutlich schneller als solche mit Läsionen im thorakolumbalen Wirbelsäulenbereich (BULL et al. (2008)). BULL et al.

untersuchten in einer retrospektiven Studie den Behandlungserfolg von 238 operierten Hunden mit Bandscheibenvorfall (BULL et al. (2008)). Sowohl das Vorhandensein der Tiefenschmerzsensibilität als auch das Gewicht stellten sich hierbei als für die Prognose bedeutsame Parameter heraus. Je höher die Schwere der neurologischen Ausfälle war, desto länger dauerte die Genesungsphase. Hunde mit zervikaler Rückenmarkskompression erholten sich in der Regel deutlich schneller als Patienten mit thorakolumbaler Kompression. Die Regeneration von Patienten mit

(22)

14

chirurgisch behandelten Bandscheibenvorfällen verlief generell schneller als die von konservativ therapierten Patienten (BULL et al. (2008)).

In einer Langzeitstudie von AIKAWA et al. wurde bei 831 Hunden mit IVDH das Resultat nach einer Operation ermittelt (AIKAWA et al. (2012)). 85,3 % aller Hunde hatten einen positiven Verlauf nach einer operativen Behandlung. 14,7 % besserten sich nicht nach Therapie. Das Ergebnis war bei Hunden mit vorhandenem Tiefenschmerz mit 97,7 % deutlich höher als bei Hunden ohne Tiefenschmerz.

Jedoch waren 52,1 % auch in dieser Gruppe nach der Operation wieder gehfähig (AIKAWA et al. (2012)). Diese Ergebnisse stimmen mit denen ähnlicher Studien überein (FERREIRA et al. (2002), OLBY et al. (2003), JEFFERY et al. (2016)).

Je länger die neurologischen Ausfälle bestehen, desto länger fällt die Rehabilitationszeit aus (FERREIRA et al. (2002)). Ein prognostisch schlechtes Zeichen ist es außerdem, wenn sich die neurologische Symptomatik perakut verschlechtert und es innerhalb von weniger als einer Stunde zum Verlust der Gehfähigkeit kommt (SCOTT u. MCKEE (1999)).

Eine schlechtere Prognose haben ebenso Hunde, bei denen sich die Läsion neuroanatomisch in der zervikalen (C6 - T2) und lumbalen Intumeszenz (L4 - S3) befindet, im Gegensatz zu Hunden, bei denen die Läsion in den Rückenmarkssegmenten von C1 - C5 und T3 - L3 lokalisiert wurde (JAGGY (2007)).

Die Prognosestellung basiert bislang hauptsächlich auf subjektiven, nicht messbaren Parametern. Für eine zuverlässige, objektive Einschätzung der Prognose fehlen derzeit messbare Parameter wie sogenannte Biomarker (STRIMBU u. TAVEL (2010)). Im Rahmen dieser Studie wurden Th17-Zellen im Hinblick auf ihre Wertigkeit als potenzielle Biomarker für die Prognosestellung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen untersucht.

(23)

15

2.2 Biomarker

Biomarker („biological marker“) werden in der Medizin als objektiv messbare und reproduzierbare Parameter (Substanzen, Strukturen, Prozesse) im Körper bezeichnet, mit Hilfe derer man unabhängig vom subjektiven Eindruck den Krankheitsverlauf bewerten kann (STRIMBU u. TAVEL (2010)). Diese können, aber müssen nicht mit dem klinischen Bild korrelieren. Biomarker werden für diagnostische oder prognostische Zwecke genutzt und können Indikatoren sowohl für physiologische als auch pathologische Prozesse sein, die sich während des Krankheitsverlaufs verändern können (STRIMBU u. TAVEL (2010)). Parameter, die sich als Biomarker eignen, sollten schnell und leicht nach dem Insult in messbaren Konzentrationen im Blut, Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin freigesetzt werden und nicht durch andere Substanzen oder Prozesse beeinflussbar sein (CRUZ et al.

(2015)). Die Aufgabe von Biomarkern ist es, die Krankheitsschwere und/oder den Krankheitsverlauf in einem frühen Stadium der Erkrankung prognostizieren zu können. Im Idealfall sollten die benötigten Messmethoden reproduzierbar, nicht invasiv, schnell durchführbar und kostengünstig sein (CRUZ et al. (2015), NISHIDA (2014)).

2.2.1 Biomarker – Bisherige Forschungsergebnisse

Biomarker werden vielfach eingesetzt und sind heutzutage in der Medizin unverzichtbar geworden. Inzwischen wurden zahlreiche strukturelle oder entzündliche Biomarker für verschiedene Erkrankungen gefunden. Strukturelle Biomarker sind Substanzen wie Proteine des neuronalen und glialen Zytoskeletts oder zelluläre Metabolite, die bei Zellschädigung freigesetzt werden (CRUZ et al.

(2015)). Hierzu zählt zum Beispiel das Tau-Protein, ein zytosolisches Mikrotubuli- assoziiertes Protein, welches für den Zusammenbau und die Stabilität von Mikrotubuli sorgt (SHAHANI u. BRANDT (2002)). ROERIG et al. untersuchten in einer retrospektiven Studie bei Hunden mit IVDH die Tau-Protein-Konzentration im Liquor cerebrospinalis und verglichen die gemessenen Werte mit dem Schweregrad

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16

der Erkrankung und dem jeweiligen Genesungsverlauf (ROERIG et al. (2013)).

Hierbei wurde festgestellt, dass die Tau-Protein-Konzentration bei Hunden mit Plegie signifikant höher war, als bei Hunden mit Parese oder bei gesunden Hunden. Auch im Verlauf zeigten diejenigen Hunde mit Plegie, die sich innerhalb einer Woche um einen Schweregrad (nach SHARP u. WHEELER (2005)) verbesserten, eine signifikant niedrigere Tau-Protein-Konzentration im Vergleich zu Hunden mit Plegie, die eine längere Genesungsphase benötigten oder keine Verbesserung zeigten.

ROERIG et al. stellten demnach eine positive Korrelation zwischen Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis und dem Schweregrad der Rückenmarksverletzung fest (ROERIG et al. (2013)). In einer nachfolgenden Studie von WICHA wurden sowohl das Tau-Protein, Macrophage inflammatory protein-3ß (MIP-3ß) als auch das saure Gliafaserprotein (Glial fibrillary acidic protein; GFAP) als potenzielle Biomarker bei Hunden mit Rückenmarksschädigung untersucht und auf ihre prognostische Aussagefähigkeit hin beurteilt (WICHA (2016)). Hunde mit akuter/subakuter Plegie (insbesondere Schweregrad 5) wiesen hierbei signifikant höhere Konzentrationen von Tau-Protein, MIP-3ß und GFAP im Liquor cerebrospinalis auf als Hunde mit chronischer Rückenmarksverletzung oder gesunde Hunde. Im Genesungsverlauf wurde bei den Hunden, deren neurologische Symptomatik sich verbesserte, eine signifikant niedrigere Tau-Protein-Konzentration gemessen. Demzufolge stellte WICHA bei allen drei gemessenen Substanzen Korrelationen zum Genesungsverlauf fest, wodurch sich diese Substanzen als Biomarker bei Hunden mit Rückenmarksverletzungen eignen (WICHA (2016)).

Bei Hunden mit vollständiger Rückenmarksverletzung (complete SCI) konnten OLBY et al. eine Korrelation zwischen im Serum gemessenen GFAP-Konzentrationen und dem Genesungsverlauf herstellen (OLBY et al. (2019)). OLBY et al. identifizierten GFAP als einen, im Serum messbaren, prognostischen Parameter bei Hunden mit Schweregrad 5 (SHARP u. WHEELER (2005), OLBY et al. (2019)). Bei Messung der GFAP-Werte im Serum, die nur innerhalb der ersten drei bis vier Tage messbar waren, zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den Genesungsverläufen. Bei Hunden, die ihre Gehfähigkeit innerhalb von sechs Monaten wiedererlangten, war

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17

der GFAP-Wert nicht messbar. Im Gegensatz dazu war der GFAP-Wert bei Hunden, die sich nicht erholten, erhöht (OLBY et al. (2019)).

Entzündliche Biomarker wie proinflammatorische Zytokine und andere entzündliche Mediatoren (z.B. Interleukine (IL), tumor necrosis factor (TNF)) wurden bei Rückenmarksverletzungen sowohl im Liquor cerebrospinalis als auch im Serum gefunden (BARTELS et al. (2014), CRUZ et al. (2015), WICHA (2016)) und könnten mit der Schwere und Regeneration von Rückenmarksverletzungen korrelieren.

Aufgrund dessen, dass sich die Expression von einigen Zytokinen im Verlauf neuroinflammatorischer Prozesse bei Rückenmarksverletzungen verändern kann, könnten diese Zytokine als Biomarker für diagnostische und prognostische Zwecke dienen (CRUZ et al. (2015)). Für den Krankheitsverlauf von Bandscheibenvorfällen fehlen bislang solche Parameter, die eine zuverlässige Einschätzung der Prognose ermöglichen könnten. Die Prognose basiert bisher vor allem auf dem Schweregrad und dem Vorhandensein des Tiefenschmerzes sowie der Dauer bzw. dem Verlauf der Erkrankung (SHARP u. WHEELER (2005)). WANG-LEANDRO et al. zeigten, dass das Vorhandensein des Tiefenschmerzes im Hinblick auf die funktionelle Wiederherstellung eine bessere Vorhersagekraft hat als die Magnetresonanztomographie (WANG-LEANDRO et al. (2017)).

2.3 Immunsystem

Die Aufgabe des Immunsystems ist es, den Körper vor Pathogenen zu schützen.

Hierbei unterscheidet man zwischen einem angeborenen (unspezifischen) und einem erworbenen bzw. adaptiven (spezifischen) Abwehrsystem (MURPHY et al. (2018)).

Im folgenden Abschnitt wird ein kurzer Überblick über das Immunsystem sowie seine Funktionsweise gegeben und insbesondere auf die Zelldifferenzierung von Lymphozyten, im Speziellen auf die Th17-Zelldifferenzierung, näher eingegangen.

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18 2.3.1 Angeborenes Immunsystem

Zellen des angeborenen Immunsystems können unmittelbar auf Krankheitserreger reagieren, zu ihnen zählen Makrophagen, Granulozyten, natürliche Killerzellen und dendritische Zellen (MURPHY et al. (2018)). Makrophagen und dendritische Zellen bilden hierbei die wichtigsten Vermittler zwischen der angeborenen und spezifischen Immunantwort, indem sie auf ihrer Oberfläche spezifische Antigene präsentieren, die T-Zellen aktivieren können (MURPHY et al. (2018)). Das angeborene Immunsystem wird auch als unspezifisches Immunsystem bezeichnet, da die Zellen nicht zielgerichtet auf bestimmte Krankheitserreger reagieren (MURPHY et al. (2018)).

Weitere Bestandteile des unspezifischen Immunsystems sind unter anderem physiologische Barrieren wie intakte Epithelien und ein pH-Milieu, welches ungeeignet für Bakterien ist (MURPHY et al. (2018)).

2.3.2 Adaptives Immunsystem

Das adaptive Immunsystem, auch spezifisches oder erworbenes Immunsystem genannt, hat sich aus dem angeborenen Immunsystem entwickelt. Im Gegensatz zu diesem richten sich die Zellen des adaptiven Immunsystems gezielt gegen bestimmte Pathogene und bilden außerdem ein immunologisches Gedächtnis, durch welches das Immunsystem bei einer Reinfektion schneller und effizienter reagieren kann (RESTIFO u. GATTINONI (2013), ANTIA et al. (2005)). Zu der zellulären Abwehr zählen die T-Zellen mit all ihren Untergruppen, die man anhand spezifisch ausgebildeter Oberflächenrezeptoren (CD = cluster of differentiation) differenzieren kann, auf die im folgenden Abschnitt (2.4.) näher eingegangen wird. Die B-Zellen gehören zu der humoralen Immunabwehr, aus ihnen entwickeln sich Antikörper- sezernierende Plasmazellen oder B-Gedächtniszellen (MURPHY et al. (2018)).

2.4 Lymphozytendifferenzierung

Lymphozyten gehören zu der Gruppe der Leukozyten und umfassen die T-Lymphozyten (T-Zellen), B-Lymphozyten (B-Zellen) und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). T-Lymphozyten werden im Thymus (hauptsächlich im Cortex)

(27)

19

differenziert, B-Lymphozyten bilden sich im Knochenmark (MURPHY et al. (2018)).

Beide Zellpopulationen entwickeln sich aus multipotenten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark (MURPHY et al. (2018)). Lymphozyten zählen zum adaptiven (erworbenen) Immunsystem und haben eine zentrale Aufgabe in der Immunabwehr durch die Freisetzung von Zytokinen und Produktion von Antikörpern (MURPHY et al. (2018)).

Während sich B-Zellen und NK-Zellen aus dem Knochenmark direkt in die Peripherie begeben, wandern T-Zellen aus dem Knochenmark ins lymphatische System, vor allem in den Thymus, jedoch zum Teil auch in die Milz, Lymphknoten und Mucosa assoziierten lymphatischen Gewebe (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT), um dort eine positive und negative Selektion zu durchlaufen (MURPHY et al. (2018)).

Anschließend exprimieren die T-Zellen spezifische Oberflächenrezeptoren und gelangen in die periphere Blut- und Lymphbahn (MURPHY et al. (2018)). T-Zellen mit exprimierten CD4+ Rezeptoren werden als T-Helferzellen bezeichnet und tragen die MHC-Klasse-II-spezifischen Rezeptoren (MURPHY et al. (2018)). CD8+ T-Zellen sind zytotoxische T-Zellen mit MHC-Klasse-I-spezifischen Rezeptoren, welche infizierte Zellen erkennen und eliminieren (MURPHY et al. (2018)). Naive T-Zellen reifen erst nach Antigenkontakt aus und differenzieren sich – je nach Antigen – zu T-Effektorzellen (MURPHY et al. (2018)). Anhand der spezifisch exprimierten Oberflächenrezeptoren ist es möglich, die Lymphozytensubgruppen mittels monoklonaler, Fluorochrom markierter Antikörper im Durchflusszytometer zu identifizieren und zu differenzieren (KOL et al. (2016), MURPHY et al. (2018), TIZARD (2018)).

Die Subpopulationen von T-Lymphozyten lassen sich in zwei T-Zell-Linien unterteilen: eine größere Population der α:β-Linie und eine kleinere Population der γ:δ-Linie, die sich aufgrund ihres Reifegrades und ihrer Funktionsweise unterscheiden lassen (MURPHY et al. (2018)). Aus den α:β-T-Zellen entwickeln sich die CD4+ und CD8+ T-Zellen (MURPHY et al. (2018)). Die Population der γ:δ-Linie exprimiert auch im reifen Zustand weder CD4+ noch CD8+ Corezeptoren (MURPHY et al. (2018)). Im Gegensatz zu den α:β-T-Zellen gehören die meisten γ:δ-T-Zellen

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zum angeborenen und nicht zum adaptiven Immunsystem und befinden sich in Epithelien und Schleimhäuten des Körpers (MURPHY et al. (2018)). Ein Teil der γ:δ-T-Zellen sezerniert nach Aktivierung IL-17 und gehört zu einer Untergruppe der T_γ:δ-17-Zellen, die Entzündungssignale bei einer auftretenden bakteriellen oder parasitären Infektion aussenden (MURPHY et al. (2018)).

2.4.1 Naive T-Zellen und Thymusreserve (CD3+, CD4+, CD45RA+, CD31+) Eine erhöhte Anzahl an naiven T-Zellen, also reife T-Zellen, bei denen noch kein Antigenkontakt stattgefunden hat, findet sich bei jungen Lebewesen (MURPHY et al.

(2018)). Die Ausdifferenzierung der T-Zellen erfolgt im Thymus (MURPHY et al.

(2018)). Mit zunehmendem Alter sinkt die Thymusaktivität und dadurch die Anzahl der CD4+ Zellen (KILPATRICK et al. (2008), TIZARD (2018)). Das Verhältnis an CD4+/CD8+ Zellen verändert sich, indem der relative Anteil an Lymphozyten und CD4+ Zellen abnimmt und der Anteil an Granulozyten und CD8+ Zellen steigt (TIZARD (2018)). Anhand der Bestimmung von T-Zellen (CD3+, CD4+, CD45RA+, CD31+), die aus dem Thymus migrieren (recent thymic emigrant (RTE)), kann die Fähigkeit des Thymus, neue naive T-Zellen in die Peripherie zu senden und damit die Zellregenerationsfähigkeit, abgeschätzt werden (KOHLER u. THIEL (2009)).

2.4.2 T-Zellen (CD3+ Lymphozyten)

Im Allgemeinen werden vermehrt T-Zellen (CD3+ Lymphozyten) bei viralen oder bakteriellen Infektionen gebildet (REN u. CROWLEY (2019)). CD3+ Lymphozyten lassen sich in CD4+ oder CD8+ Zellen (einfach positive Zellen) bzw. in CD4-CD8- Zellen (doppelt negative Zellen) einteilen (REN u. CROWLEY (2019)).

Naive CD4+ T-Zellen differenzieren sich zu verschiedenen Untergruppen von Effektorzellen (MURPHY et al. (2018), REN u. CROWLEY (2019)). CD8+ Zellen entwickeln sich zu zytotoxischen T-Zellen (REN u. CROWLEY (2019)).

(29)

21 2.4.2.1 T-Helferzellen (CD4+ Lymphozyten)

CD4+ T-Zellen sind eine heterogene Untergruppe der T-Lymphozyten bzw. T-Zellen (CD3+ Lymphozyten) und lassen sich in verschiedene Subpopulationen von T-Effektorzellen unterteilen, die unterschiedliche immunologische Funktionen haben:

T-Helferzelle Typ 1 (Th1), T-Helferzelle Typ 2 (Th2), T-Helferzelle Typ 17 (Th17), regulatorische T-Zellen (T_reg), Th9 oder follikuläre T-Helferzellen (Tfh) (MOSMANN et al. (1986), HARRINGTON et al. (2005), BETTELLI et al. (2006), MURPHY et al.

(2018), DELVES et al. (2017), REN u. CROWLEY (2019)). Th1-, Th2- und Th17-Zellen werden anhand der jeweiligen Zytokine, die sie sezernieren, unterschieden (REN u. CROWLEY (2019)).

T-Zellen bilden zusammen mit den B-Lymphozyten die adaptive Immunantwort im Körper (MURPHY et al. (2018)).

Th1-Lymphozyten sind an der zellulären Immunantwort beteiligt und benötigten unter anderem IL-12 zur Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th1-Lymphozyten (DELVES et al. (2017)). Th1-Lymphozyten produzieren IL-2, IL-3, Interferon-γ (IFN-γ), GM-CSF sowie den Tumornekrosefaktor α (TNF-α) (MOSMANN et al.

(1986), REN u. CROWLEY (2019)). Ihre Hauptaufgabe liegt in der Beseitigung intrazellulärer pathogener Erreger wie Viren, Protozoen oder intrazellulärer Bakterien, indem sie Makrophagen, Granulozyten und T-Lymphozyten aktivieren (DELVES et al. (2017)).

Th2-Lymphozyten werden unter anderem durch IL-4 differenziert und induzieren die humorale Immunantwort in Interaktion mit den B-Zellen, indem sie die Antikörperbildung stimulieren (MURPHY et al. (2018)). Th2-Lymphozyten synthetisieren hauptsächlich folgende Interleukine: IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 und IL-13 (MOSMANN et al. (1986), TIZARD (2018), DELVES et al. (2017)). Th2-Lymphozyten sind zum Beispiel an der Bekämpfung von Parasiten, insbesondere Helminthen und anderen extrazellulären Pathogenen, sowie bei atopischen Erkrankungen wie Asthma und anderen Allergien beteiligt (MURPHY et al. (2018), DELVES et al.

(2017)).

(30)

22

Th17-Lymphozyten sind eine Untergruppe der CD4+ Zellen und wurden erst 2005 erstmalig identifiziert (HARRINGTON et al. (2005), BETTELLI et al. (2006)).

Th17-Lymphozyten produzieren die Zytokine IL-17 (auch: IL-17A), IL-17F, IL-21 und IL-22 (LIANG et al. (2006), DELVES et al. (2017)).

Die höchste Sequenzhomologie beim Menschen zeigen hierbei IL-17A und IL-17F auf (WEAVER et al. (2007)). Bei diesen beiden Interleukinen wird eine proinflammatorische Wirkung bei Psoriasis und der rheumatoiden Arthritis beim Menschen vermutet (MARTIN et al. (2013), RUSSELL et al. (2014), CHABAUD et al.

(1999)). CHABAUD et al. wiesen in der Synovia von Patienten, die an rheumatoider Arthritis erkrankten, erhöhte IL-17-Konzentrationen nach (CHABAUD et al. (1999)).

Damit sich naive T-Zellen zu Th17-Zellen entwickeln, sind die Zytokine IL-6 und TGF-ß (transforming growth factor-ß) sowie der Transkriptionsfaktor STAT3 erforderlich (MURPHY et al. (2018)). Sie übernehmen wichtige Aufgaben bei der Regulierung von (chronischen) Entzündungsvorgängen, Bekämpfung exogener Pathogene und bei Autoimmunerkrankungen (MURPHY et al. (2018)).

2006 wurden in drei unabhängig voneinander laufenden Studien herausgefunden, dass die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th17-Zellen ein eigenes Zytokinmuster aufweist (BETTELLI et al. (2006), MANGAN et al. (2006), VELDHOEN et al. (2006))). Es konnte nachgewiesen werden, dass die Differenzierung der T-Zellen durch das Vorhandensein von Transforming growth factor (TGF)-ß, akute Phase Proteine und das proinflammatorische Zytokin Interleukin-6 (IL-6), die in den Zellen die stabilisierenden Transkriptionsfaktoren (STAT3, ROR γt, ROR α) aktivieren, reguliert wird (BRUCKLACHER-WALDERT et al. (2017), BETTELLI et al.

(2006), MANGAN et al. (2006), VELDHOEN et al. (2006)) . IL-21 (gehört zu der IL-2-Familie) kann in einigen Fällen IL-6 ersetzen (KORN et al. (2009)). TGF-ß ist jedoch erforderlich, um Th17-Zellen zu differenzieren (BETTELLI et al. (2006)).

TGF-ß und IL-6 werden von verschiedenen Zelltypen, wie beispielsweise dendritischen Zellen, Makrophagen, Mastzellen und vielen weiteren, exprimiert (VAN SNICK (1990)). IL-21 wurde erstmals 2000 von PARRISH-NOVAK et al. identifiziert

(31)

23

(PARRISH-NOVAK et al. (2000)). Es wird von aktivierten T-Zellen und natürlichen Killerzellen produziert (PARRISH-NOVAK et al. (2000)). Aufgrund dessen, dass Th17-Zellen selbst IL-21 produzieren, können die Zellen über diesen Weg ihre eigene Differenzierung vorantreiben (KORN et al. (2009)). Zudem kann IL-21 die Exprimierung von IFN-γ hemmen, wodurch andere Differenzierungswege verhindert werden und naive T-Lymphozyten bevorzugt zu Th17-Zellen differenziert werden können (SUTO et al. (2006), WEI et al. (2007)). Umgekehrt unterdrückt IFN-γ die Entwicklung zu Th17-Zellen, wodurch IL-17 vermittelte Entzündungsreaktionen verhindert werden (TIZARD (2018)). Zellulärer Stress kann zudem TGF-ß ersetzen (BRUCKLACHER-WALDERT et al. (2017)).

Zusammenfassend können naive T-Zellen nur in Kombination von TGF-ß (oder zellulärem Stress) und IL-6/IL-21 zu Th17-Zellen differenziert werden (Abb. 2).

Abb.2: Th17-Zell-Differenzierungswege (modifiziert nach MURPHY et al. (2018))

(32)

24

Regulatorische T-Zellen (auch: Treg-Zelle, T-Suppressorzelle, T-Unterdrückerzelle) Die Hauptaufgabe von regulatorischen T-Zellen (T_reg, CD4+, CD25+, CD127-), liegt in der Regulation der Intensität der aktiven Immunantwort und Verhinderung autoimmuner Prozesse (MURPHY et al. (2018)). T_reg-Zellen unterdrücken demnach die T-Zell-Antwort und verhindern dadurch eine pathologische Autoimmunreaktion (MURPHY et al. (2018)). Weitere Aufgaben liegen in der Steuerung des Verlaufs von Allergien, Autoimmunerkrankungen, Tumorwachstum und Transplantationen. Eine erhöhte Anzahl an regulatorischen T-Zellen findet man in der Spätphase von Infektionen sowie bei Tumoren, Parasitosen und in der Schwangerschaft (FIGUEIREDO u. SCHUMACHER (2016), CURIEL et al. (2004)). Sie wirken bei Infektionen, wie zum Beispiel mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder bei Candida-Pilzinfektionen protektiv (WHIBLEY u. GAFFEN (2014), KLEINMAN et al.

(2018)). Eine verminderte Anzahl dieser Zellen findet man bei Allergien, Autoimmunerkrankungen und Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen (WANG et al. (2019)).

Sogenannte B- und T-Gedächtniszellen einer abgelaufenen Immunantwort können noch jahrelang nach einer überstandenen Infektion im Blut verbleiben und dafür sorgen, dass bei einer Reinfektion das Immunsystem schneller eingreifen kann. Die CD4+ und CD8+ Zellen des adaptiven Immunsystems sind demnach lern- und anpassungsfähig (MURPHY et al. (2018)).

2.4.2.2 Zytotoxische T-Zellen (CD8+ Lymphozyten)

Zytotoxische T-Zellen, eine Subgruppe der CD3+ Lymphozyten, erkennen Antigene von viral infizierten Zellen und Tumorzellen und lösen in diesen durch die Freisetzung von Perforinen und Proteasen den programmierten Zelltod (Apoptose) der betroffenen Zelle aus (MURPHY et al. (2018)).

(33)

25 2.4.3 Zytokine

Zytokine sind kleine, circa 25 kDa große, lösliche Proteine, die zu der Gruppe der Peptide gehören und für die Regulation von Proliferation und Differenzierung von Zellen verantwortlich sind (MURPHY et al. (2018)). Zytokine werden von verschiedenen Zelltypen sezerniert und können autokrin, parakrin oder endokrin wirken (MURPHY et al. (2018)). Es gibt Zytokine, die als Wachstumsfaktoren bezeichnet werden und Zytokine, die wichtig für immunologische Reaktionen und Entzündungsprozesse sind und als Mediatoren dienen. Werden Zytokine im Gewebe freigesetzt, wird eine Entzündungsreaktion ausgelöst und im Blut zirkulierende Zellen des Immunsystems zu den Infektions- und Entzündungsherden angelockt (MURPHY et al. (2018)).

Im Allgemeinen gibt es fünf Gruppen von Zytokinen, die sich aufgrund ihrer Struktur in Familien einteilen lassen: Interferone (IFN), Chemokine, kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Tumornekrosefaktoren (TNF), Transforming Growth Factor (TGF) und Interleukine (IL) (MURPHY et al. (2018)). Im Folgenden wird nur auf die für diese Studie relevanten Zytokine näher eingegangen.

Chemokine sind Signalproteine, die für die Chemotaxis von bestimmten Zellen verantwortlich sind. Es sind die ersten Zytokine, die direkt zu Beginn einer Infektion in dem betroffenen Gewebe freigesetzt werden, Monozyten und neutrophile Zellen anlocken und die Entzündungsreaktion auslösen (MURPHY et al. (2018)).

Bei Entzündungsreaktionen aktivieren und dirigieren Chemokine zusammen mit Integrinen, Selektinen und Proteinen die Wanderung von Phagozyten und Lymphozyten. Zu unterscheiden sind CXC-Chemokine und CC-Chemokine (MURPHY et al. (2018)). Unter anderem sind CXCL 8 Chemokine für die Wanderung von neutrophilen Zellen, CXCL 12 Chemokine für die Wanderung der naiven T-Zellen und CXCL 13 für die Chemotaxis der naiven B-Zellen und aktivierten CD4+ T-Zellen verantwortlich (MURPHY et al. (2018)). CC-Chemokine sind vor allem in die

(34)

26

Wanderung von Monozyten und Lymphozyten (T-Zellen) involviert (MURPHY et al.

(2018)).

Tumornekrosefaktoren (TNF) sind inflammatorische Zytokine, welche hauptsächlich von Makrophagen und T-Zellen während akuter Entzündungsreaktionen ausgeschüttet werden (DELVES et al. (2017), TIZARD (2018)). Sie übernehmen sowohl in der adaptiven als auch in der angeborenen Immunantwort wichtige Aufgaben bei lokalen oder systemischen Entzündungen und leiten unter anderem die Apoptose von Zellen ein (MURPHY et al. (2018)). Des Weiteren sind sie an der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Ausschüttung anderer Zytokine beteiligt. Überwiegend handelt es sich, im Gegensatz zu anderen Zytokinen, bei den Tumornekrosefaktoren um Transmembranproteine (HEHLGANS u. PFEFFER (2005)).

Eine Vielzahl an Studien haben nachgewiesen, dass einige der TNF als Mediatoren an dem Krankheitsprozess von Autoimmunerkrankungen (Rheumatoide Arthritis, Inflammatory Bowel Disease (IBD), Psoriasis, Lupus-like Syndromes) beteiligt sind (HEHLGANS u. PFEFFER (2005)).

Der Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß) ist ein regulatorisches Zytokin, welches pleiotropische Funktionen in der T-Zell-Entwicklung hat und unter anderem für die Differenzierung von Zellen und Geweben von Bedeutung ist (LI et al. (2006)).

Die Hauptfunktion von Interleukinen (IL-x) ist die Kommunikation der Immunabwehrzellen (Leukozyten) untereinander. CD4+ T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen produzieren Interleukine, welche in mehrere Untergruppen eingeteilt werden und unterschiedlich wirken (TIZARD (2018)). Hierbei steuern bestimmte Interleukine wie beispielsweise IL-1ß und IL-6 gemeinsam mit dem Tumornekrosefaktor α Entzündungsreaktionen und systemische Wirkungen. Je nach Interleukin werden bestimmte Zellen des Immunsystems zur Proliferation und Differenzierung angeregt oder daran gehindert (TIZARD (2018)).

(35)

27 2.4.3.1 IL-17

Das von den Th17-Zellen sezernierte Interleukin-17 gehört zu der Interleukin-17 Familie der Zytokine, welche folgende Zytokine beinhaltet: IL-17A (sog. IL-17, mCTLA-8), IL-17B, IL-17C und IL-17D (AGGARWAL u. GURNEY (2002), KAWAGUCHI et al. (2004)). Das IL-17E (oder IL-25) wird hingegen von Th2-Zellen produziert (FORT et al. (2001)). Sowohl IL-17A als auch IL-17F unterstützen die Expression proinflammatorischer Mediatoren (Zytokine, Chemokine, Metalloproteinasen) (KOLLS u. LINDEN (2004)). IL-17A und IL-17F beeinflussen insbesondere Stromazellen, die sie zur Produktion des Faktor G-CSF anregen, wodurch im Knochenmark myeloische Zellen (bspw. Neutrophile) gebildet werden und diese anschließend zum Infektionsherd gelangen (GHILARDI u. OUYANG (2007), MURPHY et al. (2018)). IL-17 Zytokine sind potente, proinflammatorische Zytokine, welche die Produktion von einer Vielzahl von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen, hämatopoetischen Wachstumsfaktoren und Stromazellen induzieren (KORN et al. (2009)). Diese Parameter sind in Entzündungsprozessen involviert und führen unter anderem zu Fieber, systemischen Entzündungen, erhöhter Produktion von Granulozyten, Makrophagen und außerdem zur Aktivierung von T-Zellen (KORN et al. (2009)).

Jedoch werden die IL-17 Zytokine nicht nur von Th17-Zellen und anderen CD4+

Lymphozyten produziert, sondern auch von zahlreichen anderen Immunzellen, einschließlich CD8+ Zellen (T_c17), γδ-T-Zellen, NKT cells, NK cells, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten (KOL et al. (2016), KORN et al. (2009)).

2.4.4 Th17-Zellen – Bisherige Forschungsergebnisse in der Human- und Veterinärmedizin

Bislang ist die Rolle, die Th17-Zellen in der Immunabwehr übernehmen, noch ungeklärt. Sie scheinen jedoch bei der Abwehr von bestimmten extrazellulären Bakterien und Pilzen eine Rolle zu spielen (CURTIS u. WAY (2009), MURPHY et al.

(2018), CHEN u. KOLLS (2013), DELVES et al. (2017)). Hierzu gehören unter anderem Infektionen mit Salmonella und Citrobacter rodentium (CURTIS u. WAY

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(2009)) sowie Bacteroides fragilis (CHUNG et al. (2003)) und Candida albicans (HUANG et al. (2004), CURTIS u. WAY (2009)).

Zudem haben Studien gezeigt, dass naive T-Zellen nicht nur durch Zytokine, sondern auch durch Bakterien in aktive Th17-Zellen differenziert werden können (IVANOV et al. (2008), IVANOV et al. (2009).

Des Weiteren wird vermutet, dass das von Th17-Zellen produzierte IL-17A an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen beteiligt ist (KORN et al. (2009)).

Sowohl bei Psoriasis, IBD, rheumatoider Arthritis und Asthma als auch bei Multipler Sklerose wurden erhöhte IL-17A Werte nachgewiesen (CHEN u. KOLLS (2017), KORN et al. (2009)).

Eine verminderte Anzahl an Th17-Zellen hingegen tritt beispielsweise beim B-Zell Non-Hodgkin’s Lymphom (LU et al. (2016)) und zellulären Immundefekten (z.B.

idiopathische CD4 Lymphopenie, HIV) auf (SALEM et al. (2013), BROOKS u.

GHAFFARI (2016)).

BURCHILL et al. wiesen nach, dass bei einer Infektion mit Borrelia burgdorferi die Entstehung einer reaktiven Arthritis durch Hemmung der IL-17 Produktion verhindert werden kann (BURCHILL et al. (2003)).

KOL et al. bestätigten die Vermutung, dass Th17-Zellen im peripheren Blut von Hunden messbar sind (KOL et al. (2016)). Da es sich bei den Th17-Zellen um eine sehr kleine Population handelt, entwickelten KOL et al. ein Verfahren, um die Zellen zu stimulieren und für die Durchflusszytometrie messbar zu machen (KOL et al.

(2016)). Die vorliegende Studie baut auf diesem Protokoll auf und wurde nach dem Protokoll von KOL et al. (2016) modifiziert. KOL et al. wiesen Th17-Zellen bzw. IL-17 sowohl bei gesunden Hunden als auch bei Hunden mit chronischen, idiopathischen entzündlichen Erkrankungen wie IBD, Gingivitis, chronisch idiopathischer Rhinitis, chronischen Dermatosen und nekrotisierender Meningoenzephalitis im Blut bzw. in Geweben nach (KOL et al. (2016)). Die höchsten IL-17 Werte konnten in entzündlich veränderter Darmschleimhaut von Hunden mit IBD und im Zahnfleisch von Hunden mit chronischer Gingivitis gemessen werden. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass IL-17 in einer Vielzahl von Geweben vorkommt und leicht zu identifizieren ist (KOL et al. (2016)).

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SHAMJI et al. wiesen sowohl in degeneriertem als auch in vorgefallenem Bandscheibenmaterial von Menschen eine hohe Expression von IL-17, vor allem im Vergleich zu gesunden Kontrollproben, nach und vermuteten anhand ihrer Ergebnisse einen Th17-vermittelten Prozess in der Pathologie eines Bandscheibenvorfalls (SHAMJI et al. (2010)). In über 70 % der veränderten Bandscheiben wurde IL-17 identifiziert, insbesondere in denen von herniierten Bandscheiben. In der Kontrollgruppe war IL-17 nahezu abwesend (SHAMJI et al.

(2010)). Die Ergebnisse dieser Studie unterstützen die Hypothese, dass das Immunsystem (Lymphozytenaktivierung) bei austretendem Nucleus pulposus Material aktiviert wird.

In der humanmedizinischen Studie von CHENG et al. wurde der Zusammenhang von Th17-Lymphozyten und IL-17 im peripheren Blut bzw. im chirurgisch entfernten Bandscheibenmaterial mit der Schmerzintensität von Patienten mit rupturierten bzw.

nicht-rupturierten lumbalen Bandscheibenvorfällen untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen (CHENG et al. (2013)). Hierbei wiesen die Patienten mit rupturiertem Anulus fibrosus die höchste Schmerzintensität auf und hatten zugleich signifikant höhere Prozentwerte an Th17-Zellen im Vergleich zu den Messwerten der anderen beiden Gruppen. Die Werte der Gruppe mit nicht- rupturiertem Bandscheibenvorfall wiesen höhere Th17-Werte als die der gesunden Kontrollgruppe auf (CHENG et al. (2013)). Auch die gemessenen IL-17-Werte im Bandscheibenmaterial selbst waren in den Gruppen mit erkrankten Bandscheiben signifikant höher als im Gewebe der gesunden Kontrollgruppe (CHENG et al.

(2013)).

Die Schmerzintensität war demnach positiv korreliert mit einer erhöhten Prozentzahl an Th17-Zellen und einer erhöhten Expression an IL-17 (CHENG et al. (2013)). Die Ergebnisse dieser Studie führen zu der Vermutung, dass Th17- Zellen bzw. das von diesen Zellen produzierte IL-17 bei einem Bandscheibenvorfall eine Entzündungsreaktion auslöst und an der Schmerzentstehung beteiligt ist.

Um einen Zusammenhang zwischen Th17-Zellen und der Pathogenese von Bandscheibenvorfällen zu prüfen, wurden in dieser Studie bei Hunden mit IVDH

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unterschiedlichen Schweregrades Th17-Zellen im Vollblut mittels Durchflusszytometer zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (vor Behandlung, nach Besserung um einen Schweregrad und nach sechs Monaten) sowie IL-17 im Serum und Liquor cerebrospinalis durch einen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen.

2.5 Hypothese

In der vorliegenden Studie sollte folgende Hypothese untersucht werden:

Th17-Zellen sind an der Pathogenese bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen beteiligt und können als Biomarker für die Prognosestellung dienen. Der Einfluss der Zellen ist sowohl im Blut als auch im Liquor cerebrospinalis messbar.

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3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Klinikbedarf

Produktname Firma Referenznummer

Terumo® Agani™ Needle

(20G x 1 ½ (0,9 x 38 mm) Shanghai International Holding Corp.

GmbH, Hamburg, Deutschland AN*2038R1

Röhre 5 ml (1.6 mg

EDTA/ml) Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,

Deutschland 32.332

Probengefäß 1,1 ml Z-Gel Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,

Deutschland 41.1500.005

BD Spinal Needle Quincke Type Point (0,7 x 38 mm, 22 GA 1.50 IN)

Fa. Becton Dickinson S.A., Madrid,

Spanien 405254

Röhre 3,5 ml Polystyrol,

steril Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,

Tab. 1: Material Klinikbedarf

3.1.2 Labor-Equipment 3.1.2.1 Pipetten

Diverse Transferpipetten®

(0,1 - 1000 µl) Fa. Brand, Wertheim, Deutschland -

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Serologische Pipette 5 ml Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,

Serologische Pipette 10 ml Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland 86.1254.001

Pipettierhilfe Accu-jet® pro Fa. Brand, Wertheim, Deutschland 01L78731 Pipettierhilfe HandyStep Fa. Brand, Wertheim, Deutschland 06T3855

Pipettenspitzen

(verschiedene Größen) Fa. Brand, Wertheim, Deutschland -

Tab. 2: Material Labor-Equipment: Pipetten und Pipettenspitzen

3.1.2.2 Röhrchen

CryoPure Gefäß 1,0 ml Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,

Reagiergefäß 1,5 ml Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,

Mikroröhre 2 ml mit

Verschluss Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,

Deutschland 72.694

Röhre 5 ml Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht,