Th17-Messung im EDTA-Vollblut

Für die Bestimmung des Th17-Anteils im Vollblut wurde das Protokoll nach KOL et al. angewendet und modifiziert (siehe 3.2) (KOL et al. (2016)).

Reagenzien, Blutproben und Zentrifuge wurden vor Beginn auf Raumtemperatur gebracht. Die Bearbeitung der Proben erfolgte stets in einer sterilen Werkbank.

PBMC - Separation (peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen im Blut) Separation: Die Isolierung der mononukleären Zellen aus Vollblut (1 - 3 ml EDTA-Blut) erfolgte mittels PMBC 24+ Spin Medium (pluriSelect Life Science – Worldwide, Leipzig, Deutschland; Dichte: 1,072 g/ml). Hierfür wurde entsprechend des Protokolls des Herstellers das Blut in ein 15 ml Röhrchen gegeben und mit der doppelten Menge an PBS-Puffer verdünnt. Ein zweites 15 ml Röhrchen wurde mit der der Blutmenge entsprechenden Menge an Medium befüllt. Anschließend wurde das mit PBS verdünnte Blut langsam und vorsichtig auf das Medium gegeben, sodass das verdünnte Blut als zweite Schicht auf dem PMBC 24+ Spin Medium (pluriSelect Life Science – Worldwide, Leipzig, Deutschland; Dichte: 1,072 g/ml) lag.

Nach der Zentrifugation (30 Minuten, 800 x g, Bremse 0, Beschleunigung 4,

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Raumtemperatur) konnten die mononukleären Zellen als sichtbare Schicht zwischen Plasma und Dichtegradienten mit einer sterilen Pipette entnommen und in ein neues 15 ml Röhrchen mit 8 ml PBS-Puffer übertragen werden (Abb. 3).

Die Zellsuspension wurde erneut zentrifugiert (10 Minuten, 300 x g, Bremse 1, Beschleunigung 4, 4 °C) und der Überstand abpipettiert und verworfen, sodass nur die mononukleären Zellen in Form eines Zellpellets am Röhrchenboden verblieben.

Eine hypotone Lyse wurde bei noch sichtbarem Vorhandensein von Erythrozyten durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen für 10 Sekunden in 5 ml Aqua bidestillata geschwenkt und anschließend wurde 5 ml doppelt konzentrierter PBS-Puffer hinzugegeben, um wieder eine isotonische Lösung zu erhalten. Nach Zentrifugation (10 Minuten, 300 x g, Bremse 1, Beschleunigung 4, 4 °C) und Entfernung des Überstands wurden die Zellen mit 10 ml PBS resuspendiert und wiederum zentrifugiert (10 Minuten, 300 x g, Bremse 1, Beschleunigung 4, 4 °C). Danach wurde der Überstand abgenommen und das verbleibende Zellpellet mit 1 ml PBS-Puffer resuspendiert. Für die Zellzählung mit dem Lichtmikroskop wurden 10 µl entnommen und mit 90 µl Trypanblau gefärbt. Die verbleibende Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (10 Minuten, 300 x g, Bremse 1, Beschleunigung 4, 4 °C).

Abb. 3: Schichtung nach Zentrifugation des EDTA-Blutes mit dem PMBC 24+ Spin Medium (pluriSelect Life Science, Deutschland)

PBMC = peripheral blood mononuclear cells;

mononukleäre Zellen im Blut

(Modifiziert nach pluriSelect Life Science – Worldwide, Leipzig, Deutschland)

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Für die manuelle Zellzählung mit dem Lichtmikroskop wurde eine Zellzählkammer verwendet. Anhand der gezählten Zellen pro Milliliter konnte die benötigte Puffer- und Antikörpermenge berechnet werden.

Entfernung unerwünschter Zellen mithilfe magnetischer Zellsortierung Um eine möglichst reine Zellpopulation zu

erhalten, wurde die Anzahl anderer Zellen im Blut reduziert, indem unerwünschte Zellen mit Antikörpern markiert und mithilfe des autoMACS® Pro Separators (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) über magnetische Säulen aussortiert wurden.

Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und die Zellen entsprechend der zuvor ermittelten Zellmenge in definiertem

Volumen PEB resuspendiert (Zellmenge/ml x 100). Die Zellen wurden nachfolgend mit Human TruStain FcX™ (1:20) geblockt und die berechnete Antikörpermenge wurde hinzugefügt:

Mouse anti Dog CD8 alpha (1 : 5 mit PEB) Mouse anti Dog CD11b (1 : 11 mit PEB)

Mouse anti Canine CD21 (1. Verdünnung: 1 : 5 mit PEB, 2. Verdünnung: 1 : 11 mit PEB) Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4 °C wurden die ungebundenen Antikörper durch zweimaliges Waschen mit jeweils 2 ml entgastem PEB entfernt (Zentrifugation: 10 Minuten, 300 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 10 °C). Beim

Abb. 4: autoMACS® Pro Separator (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland)

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zweiten Waschen wurde die Zellsuspension durch ein Zellsieb (Meshgröße 40 µm) in ein 2 ml Röhrchen gegeben.

Anschließend wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet mit 80 µl entgastem PEB resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 20 µl Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads hinzugefügt und für 15 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die überschüssigen Antikörper durch Waschen mit 2 ml PEB entfernt (Zentrifugation: 10 Minuten, 300 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 10 °C) und nach Entfernung des Überstands das Zellpellet in 500 µl entgastem PEB resuspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension über die magnetischen Säulen des autoMACS® Pro Separator (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) gegeben und mit Hilfe des Programmes „Deplete“ konnten die Zellsuspension in gefärbte („positive Fraktion“) und nicht-gefärbte Zellen („negative Fraktion“) getrennt werden. Die negative Fraktion beinhaltete die Zielzellen. Die positive Fraktion mit den markierten Zellen (CD11b, CD8, CD21) wurde verworfen. Die Zellsuspension der negativen Fraktion wurde anschließend zentrifugiert (10 Minuten, 300 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 10 °C), mit 1 ml PEB resuspendiert und es wurden erneut 10 µl für die Zellzählung entnommen und mit 90 µl Trypanblau gefärbt. Der Anteil der CD3+ und CD4+ Zellen wurde mikroskopisch ausgezählt.

Da Th17-Zellen physiologisch nur zu einem geringen Anteil im Blut vorhanden sind, wurden die Zellen zur Regeneration mit 400 µl eines speziellen Lymphozytenmediums (siehe im Anhang „ Medium-Herstellung“) resuspendiert und in zwei Wells einer 96-well-Platte aufgeteilt und über Nacht in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) belassen (KOL et al. (2016), FREUNDT-REVILLA et al. (2017)).

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Triggern der Zellen nach Aufreinigung mithilfe des autoMACS® Pro Separators und einer Nacht in Kultur

Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen nach der Inkubation (37 °C, 5 % CO₂) zuerst zentrifugiert (10 Minuten, 300 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, Raumtemperatur), der Überstand vorsichtig abpipettiert und die beiden Zellpellets mit 200 µl Lymphozytenmedium bzw.

Stimulationsmedium resuspendiert (siehe im Anhang „Medium-Herstellung“). Die beiden Wells wurden entsprechend mit „unstimuliert“

(resuspendiert im Lymphozytenmedium) bzw.

„stimuliert“ (resuspendiert im Stimulationsmedium) markiert und für drei Stunden

in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2) gegeben. Das im Stimulationsmedium enthaltene PMA (Phorbol 12-Myristate 13-acetate) stimuliert zusammen mit Ionomycin die intrazelluläre Produktion von Zytokinen wie IL-17. Nach den drei Stunden Inkubationszeit wurden zu beiden Wells jeweils 2 µl Brefeldin A (1:100 mit Lymphozytenmedium verdünnt) hinzugefügt und die Zellen erneut für drei Stunden im Inkubator belassen (37 °C, 5 % CO₂). Nach der Inkubation wurde die Zellkulturplatte zentrifugiert (5 Minuten, 500 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C), dekantiert und anschließend zweimal mit jeweils 200 µl PBS gewaschen (Zentrifuge:

5 Minuten, 500 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C). Um tote Zellen für das Durchflusszytometer sichtbar zu machen, wurden die Zellpellets in 110 µl PBS resuspendiert und 1 µl Viobility Fixable Dye 405/520 hinzugefügt und 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit und anschließender Zentrifugation (5 Minuten, 500 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C) wurde die Platte dekantiert und die Zellen mit 200 µl PEB gewaschen und erneut zentrifugiert (5 Minuten, 500 x g, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C). Danach wurde der Überstand abgesaugt und jedes Pellet mit 150 µl PEB gründlich resuspendiert, mit je 7,5 µl Human TruStain FcX™ geblockt und die Zellsuspension so aufgeteilt, dass

Abb. 5: MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland)

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sowohl von den ungetriggerten als auch von den getriggerten Zellen jeweils drei Wells vorhanden waren.

Abb. 6: Layout-Beispiel für eine 96-Well-Platte mit drei Proben. Pro Probe wurden die Zellen in insgesamt sechs Wells aufgeteilt: drei Wells mit unstimulierten (Nativ, Isotyp, Test) und drei Wells mit stimulierten (Nativ, Isotyp, Test) Zellen.

Bis auf die Nativkontrollen wurden alle Wells mit je 5 µl Mouse anti Dog CD3:FITC und 5 µl Anti-Canine CD4 PE-Cyanine7 gefärbt und anschließend 30 Minuten bei 4

°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit je 200 µl PEB (Zentrifuge: 5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C) wurde die Zellkulturplatten dekantiert und die Zellen wurden mit je 200 µl Fixation-Buffer fixiert (Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur). Die Platte wurde nachfolgend abzentrifugiert (5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C), dekantiert und danach mit jeweils 200 µl Saponin-Puffer gewaschen und zentrifugiert (5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C). Durch das Saponin (bestehend aus Terpenoid-Molekülen und Glycosiden) wird die Zellmembran permeabilisiert, wodurch der monoklonale Antikörper IL17A-Biotin (Clone: 403D100.01/mAb5 Biotin conjugated, Dendritics SAS, Frankreich) in die Zellen eindringen kann.

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Nach Absaugung des Überstands wurden die Zellen der Nativkontrollen mit jeweils 50 µl Saponin-Puffer resuspendiert. Für die intrazelluläre Färbung der Zellen mit Primärantikörpern wurden zu den Isotypkontrollen jeweils 50 µl Biotin mouse IgG1, k isotype Ctrl (1:100 verdünnt mit Saponin-Puffer) und zu dem Test je 50 µl Mouse monoclonal antibody IL17A-Biotin (1:100 verdünnt mit Saponin-Puffer) hinzugefügt und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit je 200 µl Saponin-Puffer gewaschen (Zentrifuge: 5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C), dekantiert und mit je 50 µl Saponin-Puffer (Nativkontrolle) bzw. die Isotypkontrolle und der Test mit je 50 µl Streptavidin-APC (1:100 verdünnt mit Saponin-Puffer) resuspendiert und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Abschließend wurde die Zellkulturplatte abzentrifugiert (5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C), dekantiert und mit je 200 µl Saponin-Puffer gewaschen (Zentrifuge: 5 Minuten, Bremse 4, Beschleunigung 9, 4 °C).

Für die Messung mittels Durchflusszytometer wurden die Zellpellets in je 200 µl PEB resuspendiert.

Messung mit multicolour flow cytometry (Durchflusszytometer)

Für die Messung der gefärbten Zellen wurde das klinikeigene Durchflusszytometer (MACSQuant® Analyzer 10; Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) verwendet. Hierbei fließen die Fluorochrom-markierten Zellen mit hoher Geschwindigkeit an Laserstrahlen vorbei, wodurch die Zellen anhand des entstehenden Streulichts vom Detektor charakterisiert und analysiert werden können (MURPHY et al. 2018)). Der Forward Scatter (FSC; Vorwärtsstreulicht) ist abhängig vom Zellvolumen, der Side Scatter (SSC; Seitwärtstreulicht) wird beeinflusst von der Zellgranularität sowie der Beschaffenheit des Zellkerns. Über die Bindung der Fluorochrom-markierten, monoklonalen Antikörper können die exprimierten Oberflächenproteine der jeweiligen Zellen charakterisiert werden (MURPHY et al. (2018)). Zur Auswertung der Messergebnisse der Durchflusszytometrie wurde die MACSQuantify™ Software genutzt.

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