Differenzierung von neutrophilen Granulozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen des gemeinen Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus)

Aus dem Institut für Transfusionsmedizin Leiter: Prof. Dr. med. Rainer Blasczyk

Zentrum Laboratoriumsmedizin Medizinische Hochschule Hannover

Differenzierung von neutrophilen Granulozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen des gemeinen Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus)

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

David Christopher Schrimpf

aus Hannover Hannover 2017

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 01.11.2017

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum

Betreuer der Arbeit: PD Dr. rer. nat. Thomas Müller Prof. Dr. med. Hans-Gert Heuft

1. Referentin: Prof.´in Dr. med. Christine Falk 2. Referent: Prof. Dr. med. Thomas Moritz

Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2017

Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof. Dr. med. Michael Klintschar

1. Prüfer: Prof.´in Dr. med. Anette Solveig Debertin

2. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer

Inhaltsverzeichnis S. 1

Abkürzungsverzeichnis S. 3

1 Einleitung S. 5

1.1 Neutrophile Granulozyten S. 5

1.2 Gemeiner Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) S. 7

1.3 Stammzellen S. 8

1.3.1 ESC S. 9

1.3.2 ASC S. 11

1.3.3 iPSC S. 14

1.4 Fragestellung S. 16

2 Ergebnisse S. 19

Schrimpf C, Wrede C, Glage S, Hegermann J, Backhaus S, Blasczyk R, Heuft HG, Müller T. Differentiation of induced pluripotent stem cell-derived neutrophil granulo- cytes from common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Transfusion 2016; [Epub ahead of print] PMID: 27888517 DOI: 10.1111/trf.13909.

3 Originalarbeit S. 20

4 Diskussion S. 30

5 Zusammenfassung S. 38

6 Literaturverzeichnis S. 40

Anhang

7 Erklärung S. 61

8 Lebenslauf S. 63

9 Danksagung S. 65

Abkürzungsverzeichnis

ASC Adulte Stammzellen

BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4

CD11b Cluster of Differentiation 11b (Integrin αM) CD128 Cluster of Differentiation 128 (IL-8-Rezeptor) CD34 Cluster of Differentiation 34

CD64 Cluster of Differentiation 64 (Fcɣ-Rezeptor 1)

Cj-iPSC Callithrix jacchus – induzierte pluripotente Stammzellen ESC Embryonale Stammzellen

FcɣR1 Fcɣ-Rezeptor 1 (CD64)

G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor

GvHD Graft versus Host Disease (Wirt-gegen-Empfänger-Reaktion) IL-2 Interleukin 2

IL-3 Interleukin-3 IL-8 Interleukin 8

IL-8-R Interleukin-8-Rezeptor (CD128, CXCR1) IPSC Induzierte pluripotente Stammzellen

LTF Lactoferrin

MEF Mouse embryonic feeder cells (Embryonale Mausfibroblasten) MMP2 Matrix Metalloproteinase 2 (Kollagenase IV)

MMP9 Matrix Metallopeptidase 9 (Gelatinase B) NET Neutrophil Extracellular Trap

rhVEGF recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor

SCF Stem Cell Factor

TPO Thrombopoetin

VEGFR2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2

1 Einleitung

1.1 Neutrophile Granulozyten

Neutrophile Granulozyten sind etwa 12-15 µm große, mehrsegmentkernige Zellen, die während der Hämatopoese unter anderem neben basophilen und eosinophilen Granulozyten sowie Erythrozyten und Megakaryozyten der myeloischen Zellreihe entspringen. Sie gehen in der fortschreitenden hämatopetischen Entwicklung zu- sammen mit Monozyten aus gemeinsamen Vorläuferzellen hervor und entwickeln sich dann von monomorphkernigen Myeloblasten und Promyelozyten über Myelozy- ten zu Metamyelozyten und schließlich über stabkernige Neutrophile hin zu seg- mentkernigen neutrophilen Granulozyten ¹. Sie werden im Körper etwa in einer Men- ge von 1 × 10¹¹Zellen pro Tag gebildet und besitzen eine durchschnittliche Lebens- erwartung von zwei bis fünf Tagen.

Mit 50-65 % Anteil der gesamten Leukozyten im Blut bilden Neutrophile vor Makro- phagen und NK-Zellen den wesentlichen Bestandteil des angeborenen Immunsys- tems. In der Verteidigung des Organismus gegen Pathogene wie Bakterien und Pilze steht ihnen ein großes Repertoire an Abwehrmechanismen zur Verfügung: Die Pha- gozytose, die mit antimikrobiellen Substanzen gefüllten Granula sowie die Neutrophil Extracellular Traps (NETs), extrazelluläre Ausstülpungen, die das „Einfangen“ von Bakterien ermöglichen^2-4.

Um diesen Funktionen nachgehen zu können, spielt die Fähigkeit der Chemotaxis – und in diesem Rahmen insbesondere der Interleukin (IL)-8-Rezeptor - für das Auf- spüren und Identifizieren von Pathogenen eine entscheidende Rolle ⁵. Zudem verfü- gen Neutrophile mittels eines ausgeklügelten Netzes von Oberflächenproteinen über die Möglichkeit der Diapedese, um extravasal wirken zu können ⁶. Anschließend

können die bereits angesprochenen Abwehrmechanismen der neutrophilen Granulo- zyten eingesetzt werden, um pathogene Eindringlinge im Gewebe zu bekämpfen ^2,7. Die hierbei stattfindende Phagozytose hat neben der direkten Beseitigung der Erre- ger zudem noch den Effekt der Sensibilisierung des erworbenen Immunsystems. So werden signifikante Bruchstücke der Pathogene über Rezeptoren den Zellen des er- worbenen Immunsystems präsentiert, wodurch schließlich eine Adaptation des Im- munsystems erzielt werden kann ⁸. Somit bekleiden sie auch die Rolle eines Binde- glieds zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem.

Die Bedeutung der neutrophilen Granulozyten für die Immunabwehr wird klinisch auf- fällig, wenn ihre Funktion gestört oder ihre Anzahl stark vermindert ist ^5,9,10. So sind angeborene Funktionsstörungen bei Knochenmarkerkrankungen ein Grund für eine schwere Immundefizienz, die bereits im frühen Kindesalter auftritt (z.B. bei der septi- schen Granulomatose oder bei der Leukozyten-Adhäsionsdefizienz) ^9,10. Ionisierende Strahlen, zellschädigende Chemikalien oder zellschädigende Medikamente (Chemotherapeutika) können Reifungsstörungen der myeloischen Zellreihe mit kon- sekutivem Mangel an reifen Granulozyten im peripheren Blut (Granulozytopenie, u. u.

Agranulozytose) auslösen. Diese klinische Konstellation kann spontan im Rahmen hämatologischer Erkrankungen auftreten. Häufig entwickelt sie sich iatrogen durch Chemotherapie im Rahmen der Behandlung maligner Erkrankungen ^11-13.

In all diesen Fällen besitzt der Organismus nur noch eine deutlich abgeschwächte Immunantwort. Im schlimmsten Fall ist er dem Mikrobiom seiner Umwelt schutzlos ausgeliefert. Das kann so weit gehen, dass selbst vergleichsweise harmlose Umwelt- keime (wie z.B. Hefepilze) schwerste, septisch verlaufende Infektionen hervorrufen können, die ein frühzeitiges diagnostisches und therapeutisches Eingreifen erfordern.

Wenn in diesen Fällen die medikamentöse Standardtherapie versagt, kann - speziell

in der pädiatrischen Hämato-/Onkologie – eine Zellersatztherapie mittels Granulozy- tentransfusion eine wertvolle therapeutische Ergänzung sein ^14-17.

1.2 Gemeiner Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus)

Der gemeine Weißbüschelaffe ist inklusive Schwanz eine etwa 40 cm große und 300-350 g schwere Affenart aus der Familie der Krallenaffen, die im Nordosten Brasi- liens beheimatet ist.

Diese damit zu den kleinsten Vertretern der höheren Primaten zählenden Affen sind tagaktiv und leben auf Bäumen. Ihre Ernährung ist vielseitig und besteht aus Baum- säften, Früchten und Pilzen sowie Insekten und anderen Kleintieren. Sie leben in Gruppen von drei bis 15 Tieren, die meist jeweils um ein Zuchtpaar, das sich als ein- ziges der Gruppe fortpflanzt, organisiert sind. Die Tragzeit der Weibchen beträgt in der Regel 145 Tage. Nach Niederkunft obliegt die Fürsorge um den Nachwuchs je- doch nicht den Weibchen allein, sondern wird von der gesamten Gruppe vorgenom- men.

Als Versuchstiere werden Weißbüschelaffen seit den 1960er Jahren eingesetzt. An- fänglich dienten die Tiere vor allem verhaltenspsychologischen sowie biosozialen Experimenten ^18,19. Später wurden sie in der klinischen Forschung, und hier in den Gebieten der Toxikologie und Neurologie eingesetzt^20-24. In der infektiologischen und immunologischen Grundlagenforschung hat sich Callithrix jacchus seit einigen Jah- ren als Tiermodell bewährt. So dient er der Erforschung diverser Infektionskrankhei- ten wie dem Lassavirus²⁵,dem Denguevirus²⁶, der Familie der Herpesviren²⁷ sowie weiterer Viruserkrankungen ^28-31. Hierunter sind die Hepatitis C Infektion sowie das

Anfang der 2000er Jahre aufgrund seiner hohen Sterblichkeit gefürchtete SARS- Virus zu nennen ^32-34.

In der Erforschung autoimmunologischer Prozesse und Erkrankungen sowie deren Therapie – und hier insbesondere für neurologische Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose – hat der Weißbüschelaffe ebenfalls einen festen Platz eingenommen

23,35,36

.

Für den Zweck dieser Doktorarbeit ist der Callithrix jacchus von besonderem Interes- se, da das angeborene zelluläre Immunsystem des Weißbüschelaffen dem des Men- schen stärker ähnelt als bspw. das der Maus ³⁷. Auch wenn der Weißbüschelaffe anscheinend keine CD3-/CD56+ NK-Zellen besitzt ³⁸, so ähnelt doch die übrige Zu- sammensetzung des peripheren Blutes, hierunter insbesondere die Beschaffenheit der neutrophilen Granulozyten, stärker dem Menschen als dies bei anderen Tiermo- dellen der Fall ist (z.B. Maus)³⁷. Somit ist der Weibüschelaffe als Tiermodell für die Forschung im Bereich hämatologischer Erkrankungen inklusive supportiver Therapie bzw. Zellersatztherapie prädestiniert.

1.3 Stammzellen

Lange Zeit bestand für den Begriff der Stammzelle keine einheitliche Definition ^39,40. Eine sicherlich sinnvolle Begriffserklärung gab 1997 die Arbeitsgruppe um Sean J.

Morrison, die für Stammzellen zwei grundlegende Kriterien festlegte: Sie müssen die Fähigkeit besitzen, Selbsterneuerung zu betreiben und zudem in der Lage sein, in spezialisierte somatische Zellen ausdifferenzieren zu können ⁴¹.

Stammzellen lassen sich nach ihrem Differenzierungspotenzial in drei Gruppen un- terteilen: (1) totipotente, (2) pluripotente sowie (3) multipotente Stammzellen.

Totipotente Stammzellen besitzen die Fähigkeit, zu einem kompletten Organismus auszudifferenzieren. Ein Beispiel hierfür sind die Blastomere, d. h. Abschnürungen der Zygote, aus denen sich dann im Lauf der Entwicklung die Blastozyste entwickelt

42. Die Blastozyste beinhaltet in der inneren Zellmasse pluripotente Stammzellen – die ESC, die potenziell die Fähigkeit der unbegrenzten Selbsterneuerung sowie Tei- lungsfähigkeit besitzen ⁴³.

Während die pluripotenten ESC nur im Embryo anzutreffen sind ⁴³, findet man nach der Geburt vorrangig organspezifische multipotente Zellen, die der Reparatur und Selbsterneuerung entsprechender Organe dienen: die ASC ^44-47. Multipotente Zellen weisen ein eingeschränktes Differenzierungspotenzial im Vergleich zu pluripotenten Zellen auf. Mesenchymale Zellen differenzieren meist bspw. innerhalb des Keimblat- tes ihres Ursprungsgewebes ^48,49.

Das Repertoire dieser natürlich vorkommenden pluripotenten Stammzellen (ESC) und multipotenten Stammzellen (ACS) wurde in den Jahren 2006 und 2007 durch die im Labor „künstlich“ erzeugten iPSC erweitert. IPSC sind pluripotente Zellen, die ESC in ihrer Beschaffenheit stark ähneln und wie diese in alle drei Keimblätter diffe- renziert werden können ^50-53. Im Folgenden werden die drei genannten Zellarten (1) ESC, (2) ASC sowie (3) iPSC genauer beleuchtet.

1.3.1 ESC

Erstmals gelang es 1981, ESC aus befruchteten Eizellen von Mäusen zu gewinnen

54. In dem mittlerweile etablierten Verfahren wurden sie aus der Blastozyste – der

Keimblase – von Mäusen isoliert⁵⁴und einige Jahre später dann auch aus Rhesusaf- fen ⁵⁵. Letztlich wurden sie sogar aus humanen Blastozysten gewonnen ⁵⁶. ESC be- sitzen die Fähigkeit der Selbsterneuerung und sind theoretisch unbegrenzt teilungs- fähig ^43,57 wogegen somatische Stammzellen in ihrer Teilungsfähigkeit limitiert sind und eine natürliche Seneszenz aufweisen ⁵⁸. Zudem zeichnen sich ESC durch ihre Eigenschaft aus, in Zellen aller drei Keimblätter (1) Ektoderm, (2) Mesoderm und (3) Entoderm sowie in Keimzellen differenzieren zu können ^42,59.

Zu bedenken ist hierbei jedoch, dass eine erfolgreiche Isolierung von ESC durch die Ausbildung von Teratomen nach Implantation in ein Versuchstier nachgewiesen wird

54. Somit ist ein generell teratogenes Potenzial von ESC anzunehmen. Seit der ers- ten Isolierung von ESC konnten entscheidende Fortschritte erzielt werden, die ent- nommenen Zellen in diverse Zell- und Gewebearten, wie Hepatozyten oder endokri- ne Pankreaszellen sowie funktionsfähige Pneumozyten, zu differenzieren ^60-64. Nicht zuletzt wurden aus ESC im Beisein bestimmter Zytokine CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen⁶⁵und weitere hämatopoetische Zellen⁶⁶ generiert.

Aus ESC differenzierte Zelltypen bieten folglich ein generell großes Potenzial als Therapieansatz für eine Vielzahl von Krankheitsbildern und sind ein interessantes Feld für die medizinische Grundlagenforschung sowie Forschung im Bereich der Zell- ersatztherapie. Studien mit ESC sind eng verbunden mit der Hoffnung für die zukünf- tig erfolgreiche Behandlung bisher nicht hinreichend therapierbarer Erkrankungen (z.B. M. Parkinson). Neben aller Euphorie im Rahmen der Forschung mit ESC bleibt jedoch zu bedenken, dass für jede Gewinnung von ESC die Blastozyste zerstört werden muss ⁵⁴. Dies bedeutet unausweichlich die Verhinderung der Entwicklung eines Embryos und folglich Verhinderung neuen Lebens. Hieraus ergeben sich mora- lische, ethische und nicht zuletzt rechtliche Probleme. Für die Forschung mit ESC – mit all ihren Möglichkeiten – muss man bereit sein, sich entwickelndes Leben zu be-

enden. Dies erscheint für manche vertretbar, solange man an Tiermodellen forscht.

Nun hat sich die Forschung jedoch auf humane ESC ausgedehnt ⁵⁶, wodurch eine frühzeitige juristische Regelung zu treffen war.

Zu der Frage, ab wann juristisch von einem Embryo zu sprechen ist, gab das Bun- desverfassungsgericht 1990 ⁶⁷ eine klare Aussage. So gilt jede „befruchtete, ent- wicklungsfähige…Eizelle“, die sich „zu einem Individuum zu entwickeln vermag“ als Embryo. Als solche verfügen embryonale Zellen in Deutschland durch das Embryo- nenschutzgesetz über besonderem Schutz. Eine kommerzielle Nutzung humaner ESC wurde unter Strafe gestellt ⁶⁸. Zwar dürfen nach Beschluss des Bundestages ESC, die vor dem 01. Mai 2007 gewonnen wurden, für Forschungszwecke genutzt werden ⁶⁹. Ihre Verwendung ist jedoch weiterhin an hohe Auflagen gekoppelt und nur unter der Maßgabe „hochrangiges Forschungsziel“ erlaubt ⁷⁰.

Trotz der juristisch – unter gewissen Vorgaben – genehmigten Nutzung von ESC für die medizinische Grundlagenforschung verbleiben große moralische wie ethische Hürden. Diese Hürden können aber umgangen werden, da es mit (1) ASC und (2) iPSC alternative Stammzellen gibt, die für die medizinische Grundlagenforschung herangezogen werden können und für die kein zukünftiges Leben vorzeitig beendet werden muss.

1.3.2 ASC

Bereits 1909 formulierte Alexander Maximov die These von Lymphozyten als ge- meinsame Stammzelle für hämatopoetische Zellen ⁷¹. Bewiesen wurde die Existenz hämatopoetischer Stammzellen in den Jahren 1961/1962 ^72,73. Hämatopoetische Stammzellen sind ein Beispiel für multipotente Stammzellen, ⁷⁴ die ASC. ASC finden

sich nach der Geburt in sämtlichen Geweben des Körpers ^42,75 Sie kommen sowohl organständig ⁷⁶ wie auch im peripheren Blut zirkulierend vor ⁴²und dienen in vivo der Zellerneuerung wie auch der Reparatur von Organen^42,44-47. Multipotente Zellen be- sitzen generell die Fähigkeit, ausgehend von ihrem Ursprungsgewebe, zu differenzie- ren ⁷⁶. Ihr Differenzierungspotenzial ist im Vergleich zu den totipotenten Stammzellen oder den pluripotenten ESC jedoch sehr begrenzt: Einen neuen Organismus oder verschiedene Gewebe oder Organe können sie nicht entstehen lassen ⁴².

Allerdings bieten ASC gegenüber ESC den Vorteil, dass sie technisch relativ einfach (bspw. mittels Punktion aus dem Knochenmark ^77,78 oder aber alternativ mittels so genannter Stammzellapherese nach mehrtägiger Behandlung („Mobilisation") mit Stammzellfaktor oder anderen Wachstumsfaktoren [z.B. GM-CSF, G-CSF]) aus dem peripheren Blut ^79-81 gewonnen werden können. Diese Verfahren gelten insgesamt als sicher ⁸². Sie bergen zwar gewisse Risiken und Nebenwirkungen ^83-86. Diese sind jedoch in der Regel selten und/oder überschaubar und in aller Regel nicht dauerhaft

83-87

. Im Vergleich zu ESC muss kein werdender Organismus für ihre Gewinnung zerstört werden.

In der medizinischen Grundlagenforschung konnten bereits Erfolge bezüglich der Transdifferenzierung von ASC erzielt werden. So wurden multipotente ASC neben gezielter Differenzierung in osteogenes Material ⁸⁸ sowie hämatologische Vorläufer- zellen ⁸⁹ bereits in Zellen und Gewebe aller drei Keimblätter differenziert ^90-92. Diffe- renzierungen in das ektodermale Blatt verliefen hierbei besonders vielversprechend für die Zellersatztherapie neurologischer Grunderkrankungen wie dem M. Parkinson

91-93. Zudem konnte gezeigt werden, dass von ihnen nicht die Gefahr der Entstehung von Teratomen ausgeht ^91,92, wie dies bei ESC der Fall ist ⁵⁴.

Im klinischen Einsatz werden ASC bereits seit Jahren für die Zellersatztherapie ver- wendet. Die gewonnen Zellen kommen im Sinne einer allogenen oder autologen

Stammzelltransplantation in einer Vielzahl hämatologischer Erkrankungen wie Leu- kämien ^79,94, dem Multiplen Myelom ⁹⁵ oder bspw. Hodgkin- oder Non-Hodgkin- Lymphomen ^96,97zum Einsatz. Sie haben sich innerhalb der letzten Jahrzehnte in den Therapieschemata diverser weiterer maligner hämatologischer Erkrankungen etab- liert ^98-100. Auch in der Therapie nicht-hämatologischer, solider onkologischer Neopla- sien wie z.B. dem Neuroblastom ^101,102werden sie verwendet.

Zu beachten ist jedoch, dass die allogene Stammzelltransplantation mit dem Risiko des Transplantatversagens ¹⁰³ sowie der Spender-gegen-Wirt-Reaktion (Graft versus Host Disease, GvHD) vergesellschaftet ist ^103-105. Die Wahrscheinlichkeit einer GvHD ist bei allogener Stammzelltransplantation mittels Stammzellapherese aus periphe- rem Blut höher als bei der Knochenmarktransplantation ¹⁰⁶. Die Häufigkeit wie Inten- sität einer solchen GvHD ist hierbei in erster Linie abhängig vom HLA-Mismatch

103,105

. Das statistische Gesamtüberleben sinkt mit Ausmaß des HLA-Mismatches ¹⁰³. Die autologe Stammzelltransplantation birgt nicht das Risiko einer GvHD, da patien- teneigene ASC zum Einsatz kommen. Außerdem ist die Gefahr einer Transplantat- abstoßung geringer ¹⁰⁷, weswegen sie auch älteren Patienten zugute kommen kann

108. Ihre Limitation liegt jedoch darin, dass die patienteneigenen ASC keinen direkt heilenden Effekt induzieren (so genannten „Graft versus Leukemia [GvL] Effekt“) und dass sie bei primärem Knochenmarkversagen wie der aplastischen Anämie oder bei genetischen Erkrankungen wie der Sichelzellanämie ^109,110 oder der ß-Thalassämie

111nicht verwendet werden können, da sie keinen Heilungserfolg versprechen.

Eine weitere Gruppe von Stammzellen war folglich erforderlich, die die positiven Ei- genschaften der bisher existierenden Zellen kombiniert ohne deren offensichtliche Nachteile zu übernehmen: die iPSC.

1.3.3 IPSC

Seit 2006 wurde das Repertoire der natürlichen Stammzellen um die Gruppe künst- lich erzeugter Zellen mit stammzellähnlichen Fähigkeiten erweitert: den iPSC ^50-53. Diese Zellen wurden aus adulten Maus-Fibroblasten und anderen Zelltypen unter Verwendung von vier Transkriptionsfaktoren (Oct3/4, Sox2, c-Myc und Klf4) generiert

50-53

.

Die gewählten Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2 sowie Nanog kommen in ESC vor und sind in diesen sowohl für die Selbsterneuerung wie auch Erhalt der Pluripotenz verantwortlich ^56,112-114. Zellen, die einen Mangel an Oct4 aufweisen, verlieren ihre Pluripotenz und beginnen zu differenzieren ^112-115. Ebenso ist Sox2 wichtig für den Erhalt der Pluripotenz von Zellen ¹¹³. Nanog scheint zwar unerlässlich für den Erhalt des Stammzellcharakters von Zellen zu sein ¹¹⁶, für die Erzeugung von iPSC er- scheint es hingegen nicht zwangsläufig notwendig ⁵⁰. Unerlässlich für die Generie- rung für iPSC hingegen waren hingegen c-Myc, ein Faktor mit komplexen Aufgaben in der Regulation des Wachstums und der Reifung von Zellen, sowie Klf4, ein Zink- Finger-Transkriptionsfaktor ^50-53, die sich gegenseitig stark im Rahmen der Kontrolle des Zellwachstums beeinflussen ¹¹⁷. Zudem besitzen beide – u.a. über Acetylierung von Histonen - regulatorische Funktionen gegenüber den Faktoren Sox2 und Oct3/4

118,119

.

In der medizinischen Grundlagenforschung konnten bereits diverse Erfolge im Be- reich der Zelldifferenzierung mit iPSC verzeichnet werden.

Neben Hepatozyten ¹²⁰ und Nephronen ¹²¹ sind bereits glatte Muskelzellen ¹²² aus ihnen differenziert worden. Nicht zuletzt konnten iPSC ihr Potenzial in der Differen-

zierung zu hämatopoetischen Zellen unter Beweis stellen^123-125. Es existieren zudem bereits u.a. Studien über die Differenzierung humaner iPSC inklusive deren Trans- plantation im Tiermodell (z.B. retinaler Zellen ¹²⁶) mit vielversprechendem Ergebnis.

In der Behandlung traumatischer Rückenmarkschäden setzt man große Hoffnungen in iPSC ^127,128. IPSC bergen also ein großes Potenzial in der medizinischen Grundla- genforschung sowie der Zellersatztherapie und der regenerativen Medizin und bieten somit eine Alternative zu ESC und ASC. Vergleichbar zu ESC bilden IPSC zwar ih- rerseits nach Transplantation ebenfalls Teratome aus, womit anfänglich ihre stamm- zellähnlichen Fähigkeiten nachgewiesen wurden ^51,52. Es wird jedoch aktuell an We- gen geforscht, die Bildung von Teratomen und anderen Tumoren nach Transplanta- tion von iPSC zu unterbinden und den Gebrauch von iPSC somit sicherer zu gestal- ten ^129,130.

Da iPSC ein identisches Differenzierungspotenzial wie ESC aufweisen ^50-53, sind sie den ASC deutlich überlegen. Anzumerken hierbei ist jedoch, dass die Differenzierung von iPSC aus bspw. Knochenmark eine komplexe und zeitaufwendige Prozedur dar- stellt ^50-53, während die kurzfristige Verfügbarkeit von ASC aus bspw. Knochenmark

77,78

oder peripherem Blut ^79-81 in der Behandlung z.B. diverser hämatologischer Er- krankungen deutliche Vorteile bietet. Diesen iPSC Nachteil durch kürzere Repro- grammierungs- wie Differenzierungsphasen zu reduzieren, sollte Aufgabe kommen- der Studien sein.

IPSC bilden aktuell eine Art goldenen Mittelweg für die Stammzellforschung. Sie sind ethisch unbedenklich zu gewinnen und bieten durch ihr nahezu unbegrenztes Diffe- renzierungspotenzial eine Fülle an Möglichkeiten für die medizinische Grundlagen- forschung sowie Forschung auf dem Feld der Zellersatztherapie - und hier nicht zu- letzt der Zellersatztherapie bei hämatologischen Erkrankungen. Ihr Potenzial ist je-

doch weiterhin zu erforschen, die Sicherheit ihrer Anwendung weiter zu überprüfen und zu verbessern (z.B. durch Ausschalten ihres teratogenen Potenzials).

1.4 Fragestellung

IPSC sind, wie bereits erwähnt, ein Erfolg versprechender Ansatz in der medizini- schen Zellersatztherapie. Sie werden mittels lentiviralem Konstrukt, bestehend aus vier Transkriptionsfaktoren (Oct3/4, Klf4, Sox2 und c-Myc) besteht, erzeugt ^50-53. Bis- her ist es bereits gelungen, hämatopoetische Zellen aus iPSCs zu generieren und diese weiterzudifferenzieren ^123-125.

Im Bereich der Transfusionsmedizin bergen sie eine besonders große Hoffnung, da sie nach der Differenzierung der entsprechenden Zelllinie in die Zielzellen mittels ein- facher Therapiemaßnahmen, nämlich nach Transfusion der erzeugten Blutbestand- teile, einen raschen und signifikanten Therapieerfolg erzielen können.

Neutrophilen Granulozyten kommt hier als zentralem Bestandteil des angeborenen Immunsystems eine besondere Rolle zu ^2-7. Im Falle einer absoluten Neutropenie mit Zellzahlen unter 500/µl kann eine Transfusion neutrophiler Granulozyten als einzige therapeutische Option verbleiben, um eine ausreichende Immunabwehr des Patien- ten zu gewährleisten.

2011 gelang es erstmals, funktionsfähige neutrophile Granulozyten aus humanen iPSCs zu differenzieren ¹²³, was einen großen Erfolg darstellte, jedoch Probleme aufwarf. Denn die Zellen konnten aufgrund ihrer humanen Herkunft nicht unter realen Bedingungen in vivo, d.h. als Granulozytentransfusion getestet werden, weswegen

Ihre Eigenschaften lediglich ex vivo dokumentiert werden konnten. Aus diesem Grund war die Adaptation der bisherigen Differenzierung humaner neutrophiler Gra- nulozyten auf ein Tiermodell mit einem dem Menschen möglichst ähnlichen Immun- system erforderlich. Hier bot sich der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) als Alterna- tive zu den gängigen Tiermodellen an, da er bereits in der infektiologischen Grundla- genforschung überzeugen konnte ^25-30, in der Grundlagenforschung autoimmunologi- scher Erkrankungen sowie deren Therapie seinen festen Stellenwert hat ^22,35,36 und sein zelluläres Immunsystem stärker dem des Menschen ähnelt als das der meisten aktuell verwendeten Versuchstiere ³⁷.

An diesen Punkt knüpft die Fragestellung meiner Dissertation an. Diese wurde auf- einander aufbauend in zwei Fragen unterteilt:

1. Ist es möglich, ein Kultivierungssystem zur Generierung von hämatopoeti- schen Stammzellen aus iPSCs des gemeinen Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) zu etablieren?

2. Kann man aus den gewonnenen hämatopoetischen Stammzellen funktionsfä- hige, reife neutrophile Granulozyten generieren? Und wenn ja: Welche Funkti- onen lassen sich in diesen Zellen nachweisen?

Beide Fragen werden im Folgenden abgehandelt und sind zentraler Bestandteil un- serer Veröffentlichung in der amerikanischen Fachzeitschrift TRANSFUSION¹³¹. Die Arbeit wurde der Ethikkommission der MHH am 07.11.2012 unter der Referenz- Nummer 1660-2012 vorgelegt und am 20.12.2012 als ethisch-rechtlich unbedenklich erklärt. In den Versuchsreihen zu meiner Dissertation wurden ausschließlich Zellen des Knochenmarks sowie des peripheren Bluts des Weißbüschelaffen verwendet.

Diese wurden vom Center für Reproduktionsmedizin und Andrologie (CeRA) Münster bereitgestellt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit fanden explizit keine Versuche an lebenden Tieren statt; das Zellmaterial wurde von überschüssigen Proben bei veteri- närmedizinischer Diagnostik oder anderen Experimenten post mortemgesammelt.

2 Ergebnisse

Schrimpf C, Wrede C, Glage S, Hegermann J, Backhaus S, Blasczyk R, Heuft HG, Müller T. Differentiation of induced pluripotent stem cell-derived neutrophil granulo- cytes from common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Transfusion 2016; [Epub ahead of print] PMID: 27888517 DOI: 10.1111/trf.13909¹³¹

3 Originalarbeit

O R I G I N A L R E S E A R C H

Differentiation of induced pluripotent stem cell–derived neutrophil granulocytes from common marmoset monkey

(Callithrix jacchus)

Christopher Schrimpf,¹Christoph Wrede,^2,3Silke Glage,⁴Jan Hegermann,^2,3Samantha Backhaus,¹ Rainer Blasczyk,¹Hans-Gert Heuft,¹and Thomas M€uller^1,3,5

BACKGROUND:Inherited and acquired marrow failure syndromes most commonly lead to defect in myeloid and/or neutrophil differentiation and/or function. Besides this, neutropenia induced by cancer-adjusted chemotherapy is a frequent clinical problem. In both cases, cell replacement therapy is a well-established, but due to necessity of donors limited and perilous procedure. Therefore, autologous cell replacement from patients’ own marrow-derived cells lowers risk and bares new possibilities for therapy. Since the immune system of the marmoset monkey is known to show high similarity to humans, preclinical studies with these animals bare high hopes for immunologic research and cell replacement therapy.

STUDY DESIGN AND METHODS:Marmoset- induced pluripotent stem (iPS) cells (cj-iPSC) were first cultivated on mouse embryonic feeder cells in medium containing recombinant human vascular endothelial growth factor. After 13 days, CD341/vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2)– cells were sorted, treated with interleukin (IL-3), thrombopoietin, and stem cell factor for 20 days and further cultivated with granulocyte–colony-stimulating factor (G-CSF) and IL-3 for 10 days.

RESULTS:CD341/VEGFR2– cells could be generated in high amounts (39.6566.01%; 2.31310⁵cells).

Afterward, these hematopoietic progenitors could be successfully differentiated into mature cj-iPSC–derived neutrophils showing similar morphology, specific surface antigens, and neutrophil-specific gene products and in vitro phagocytic activity.

CONCLUSION:cj-iPSC–derived neutrophils bare high hopes in hematologic cell replacement therapy. They exhibit high morphologic similarity to native neutrophils and present neutrophil-specific surface antigens, antimicrobial proteins, and gene products yielding an auspicious approach for continuative experiments including tests in living animals.

I

ABBREVIATIONS:cj-iPSC5marmoset-induced pluripotent stem cells; ESC(s)5embryonic stem cell(s); iPS cell(s)5 induced pluripotent stem cell(s); LTF5lactoferrin;

MEF(s)5mouse embryonic fibroblast(s); TPO5 thrombopoietin; VEGFR-25vascular endothelial growth factor receptor-2.

From the¹Institute for Transfusion Medicine, the²Institute of Functional and Applied Anatomy, and the⁴Institute for Laboratory Animal Science and Central Animal Facility, Hannover Medical School; and the³REBIRTH Cluster of Excellence, Hannover, Germany; and⁵Synlab Medical Care Centre Weiden Ltd, Weiden, Germany.

Address reprint requests to: Thomas M€uller, Synlab Medical Care Centre Weiden Ltd, Zur Kesselschmiede 4, 92637 Weiden, Germany; e-mail: thomas.mueller@synlab.com.

This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs License, which permits use and distribution in any medium, provided the original work is properly cited, the use is non- commercial and no modifications or adaptations are made.

This work is supported by funding from the German Research Foundation (DFG) for the Cluster of Excellence REBIRTH (From Regenerative Biology to Reconstructive Thera- py) and from the Institute for Transfusion Medicine of the Hannover Medical School.

Received for publication August 12, 2015; revision received July 20, 2016; and accepted July 21, 2016.

doi:10.1111/trf.13909

VC 2016 The Authors Transfusion published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of AABB

TRANSFUSION2016;00;00–00

Volume 00, October 2016 TRANSFUSION 1

caused by marrow failure syndromes or caused by cancer- adjusted chemotherapy typically leads to a deficient immune system. Both cases are frequent clinical problems in hematology and transfusion medicine and seek for cell replacement^2,3but might be limited in available number of matched donors. Also allogeneic cell transplantation always implies risk of contingent immune reaction like graft-versus-host disease.^4-6 Therefore, experimental research of individualized cell replacement therapy in hematologic diseases is of growing importance.

Although embryonic stem cells (ESCs) are known as the gold standard of cellular plasticity, induced pluripo- tent stem (iPS) cells represent an excellent way for con- structive research along with overcoming ethical problems and possible allogenicity. These reprogrammed autologous somatic cells hold qualities like ESCs procreat- ed by application of a composite of specific transcription factors^7,8providing an invaluable tool for individualized research in pathophysiology and cell replacement therapy and already exhibited their potential in various studies.^9-11 Also they bare hopes of solving present-day problems in clinical cell replacement therapy: In case of required neutrophil transfusion caused by marrow failure syn- dromes or any other reason cells could be obtained from the patient or HLA-compatible allogeneic donor via mar- row puncture or apheresis from peripheral blood in amount of approximately 2310⁸cells. Afterward, cells can be separated into healthy and diseased cells, using genetic analysis, and finally could, via reprogramming into iPS, be cultured, expanded in number, and differenti- ated into hematopoietic cells. In addition to genetic analy- sis after separation, cells always get screened for karyotyping after procedure of reprogramming, before they get either cryopreserved or differentiated into favored cell type. In addition, lentiviral vectors can be excluded from reprogrammed cells whenever wanted.

Since experiments with human cells always present the investigator with ethical problems and strictly limited possibilities, in research of hematologic diseases, animal models are indispensable. Murine models of hereditary and acquired diseases, however, provide only limited rep- resentation of human pathophysiology since they seldom convincingly mimic human diseases. The common mar- moset monkey in contrast is known as a reliable model of human pathophysiology with a very similar immune sys- tem and reflects human disease faithfully.^12,13Also mar- moset-induced pluripotent stem cells (cj-iPSCs) show high potential to first mimic hematopoietic differentiation and assess the function and possibilities of in vitro gener- ated immature and mature blood cells under in vivo conditions.

MATERIALS AND METHODS Maintenance of cells

cj-iPSCs were generated previously in our group from marrow-derived mesenchymal cells by lentivirus-

mediated transfection of four (Oct3/4, Klf4, Sox2, and c- Myc) transcription factors and analyzed for typical ESC- like qualities.⁸Maintenance of cells took place on six-well plates (Greiner Bio-One GmbH), covered with a 30-g gam- ma-irradiated CD1 mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder layer. The culture medium was exchanged daily and composed of hESM knockout Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 containing 20% knockout serum replacement, 1% minimum essential medium with nonessential amino acids, 1% penicillin/streptomycin, 0.5%L-glutamine, and 50mmol/Lb-mercaptoethanol (Life Technologies). Cell colonies were passaged to new MEFs every 5 to 7 days. One day before passaging thiazovivin (TAV, 10mmol/L, Selleck Chemicals Co. Ltd) was added to the medium.

Differentiation of cells

Differentiation and sorting of cells was based on previous reports. Fourteen to 16 undifferentiated iPSCs were cul- tured in six-well plates on MEFs and differentiated with medium containing 20 ng/mL recombinant human vas- cular endothelial growth factor 3 (R&D Systems). After 13 days cells were harvested using collagenase IV and sorted for CD341/vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2)– cells, which were transferred onto new MEFs in a concentration of 3.2 310⁴cells/well. Sorted cells were treated with DMEM with 4.5 g/L glucose,L-gluta- mine (Lonza Group AG), 10% fetal bovine serum, 50 mmol/Lb-mercaptoethanol, 20 ng/mL interleukin (IL)23, 10 ng/mL thrombopoietin (TPO, PeproTech GmbH), 100 ng/mL stem cell factor (SCF, R&D Systems) for 25 days.

Medium contained 1% ciprofloxacin for the first 5 days, which was changed into 1% penicillin/streptomycin on Day 6. On Day 25 after cell sorting cytokines were changed to 10 ng/mL granulocyte–colony-stimulating factor (G- CSF, R&D Systems), 20 ng/mL IL-3, and 10 ng/mL TPO (PeproTech GmbH) for a minimum of 10 days (n55).

Antibodies

Antibodies used for flow cytometric analysis and immu- nofluorescence staining included CD34 (Beckman Coulter GmbH), VEGFR-2, CD11b (integrin aM), CXCR1 (IL- 8 receptora), and CD64 (FccR1, Santa Cruz Biotechnolo- gy). The primary antibodies used for immunocytochemi- cal analysis included lactoferrin (LTF, Santa Cruz Biotechnology) and gelatinase B/92-kDa gelatinase/92- kDa Type IV collagenase (MMP9, Abcam). Biotinylated horse anti-goat or horse anti-rabbit antibodies (Vector Laboratories) were used as secondary antibodies (Tables 1 and 2).

Flow cytometric analysis and cell sorting

Cells were relieved from MEFs by collagenase IV treat- ment and stained with monoclonal antibodies. Samples were analyzed for CD341/VEGFR2– cells in the Core SCHRIMPF ET AL.

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Facility Cell Sorting of Hannover Medical School using an air-cooled solid-state laser MoFlo XDP (Beckman Coulter GmbH).

Cytostaining

Cells from floating culture were fixed in phosphate-free Thermo Scientific fixatives zinc Formal-Fixx (Thermo Sci- entific) at defined time points, dried, preserved in paraffin, and cut into 5-mm slides. Afterward slides were stained with Pappenheim’s staining and analyzed by microscopy (Biozero BZ-8100, Keyence GmbH). In the following, cells were incubated with primary antibodies, washed, and covered with biotinylated immunoglobulins. Afterward streptavidin-peroxidase was added following the distribu- tors protocol (substrate chromogen solution), and stained cells were analyzed by microscopy.

Immunofluorescence staining

For the examination of significant neutrophil surface markers, differentiated cj-iPSCs were fixed with 4% para- formaldehyde and kept in phosphate-buffered saline (PBS). Unspecific binding was minimized by treatment with 1% bovine serum albumin (Sigma) before incubating with primary antibodies. The corresponding secondary antibody linked to Alexa dye 488 or 546 was diluted in PBS. Afterward, cells were washed and nuclei were stained with Hoechst 33258 (1:10,000). The cells were delivered on a slide covered with poly-L-lysine (Sigma) and analyzed using the fluorescence (Olympus CKIX71, Olympus). All

antibodies utilized and their respective dilutions are listed in Table 2.

Cytostaining of native blood cells

In parallel to generated neutrophil granulocytes, native blood cells were fixed in phosphate-free Thermo Scientific fixatives zinc Formal-Fixx as controls, dried, and stained with Pappenheim’s staining and morphologically analyzed as described previously.

Electron microscopy

Cell cultures were fixed in 150 mmol/L HEPES, pH 7.35, containing 1.5% glutaraldehyde and 1.5% paraformalde- hyde at room temperature for 30 minutes and an addi- tional 24 hours at 48C. Postfixation was done in 1%

osmium tetroxide for 2 hours and in 4% uranyl acetate overnight (both solutions in water), followed by dehydra- tion in acetone and embedding in EPON. Fifty-nanometer ultrathin sections were poststained with uranyl acetate and lead citrate.¹⁴Sections were imaged in a transmission electron microscope (Morgagni, FEI) at 80 kV. Images were taken with a 2K side-mounted camera (Veleta, Olym- pus GmbH).

Reverse-transcriptase–polymerase chain reaction Total RNA was extracted from miPS cells and differentiat- ed cells using an RNA isolation kit (RNeasy mini kit, Qia- gen) following the manufacturer’s protocol. Contaminant DNA was removed by DNase treatment using RNase-free TABLE 1. Oligonucleotide overview

Gene Sequence 5⁰!3⁰

Annealing

temperature (8C) Fragment (bp) Reference RPS29 CGA AAA TTC GGC CAG GGT TC

TGC CCC GGA TAA TCC TCT GA

60 109 XM_002753872

VEGFR2 GTA ACC CGG AGT GAC CAA GG CAC AGG GAT TCT GAC ACG CT

60 168 XM_002745820.2

MMP2 TCG CCC ATC AAG TTC CC TCT GGG GCA GTC CAA AGA AC

60 110 XM_002761017.2

CD34 ACC AGT CTG ACC TGA GAA AG AGG AAA TAG CCT GTG ATG CC

60 145 ENSCJAT00000007273

LTF AGA AAA GTG GGT GGC CCT TC ATC AAA CCG CCA TCA AGG GT

60 204 XM_002758283

TABLE 2. Antibody overview

Antibody Company Species Cat. no. Dilution

CD34 Abcam Beckman Coulter PN IM1167 1:50

VEGFR2 Abcam Mouse anti-rat ab225 1:50

CXCR1/CD128 Santa Cruz Biotechnology Rabbit anti-human Sc-988 1:50

FcceR1/CD64 Santa Cruz Biotechnology Goat anti-human Sc-7642 1:50

IntegrinaM/Cd11b Santa Cruz Biotechnology Mouse anti-human Sc-1186 1:50

LTF Santa Cruz Biotechnology Mouse anti-human Sc-14434 1:50

MMP9 Abcam Rabbit anti-human Ab76003 1:100

Alexa Fluor 488 Life Technologies Donkey anti-mouse A21202 1:400

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DNase set (Qiagen). One microgram of RNA was used for reverse transcription with a high-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems). By adding oligonu- cleotide primers (TIB Molbiol) only mRNA was transcribed.

For analysis of neutrophil-specific genes, polymerase chain reaction (PCR) of 30mL including 23.5mL of DEPC- water, 3.0mL of buffer, 1.0mL of dNTP, 0.5mL of forward primer, 0.5mL of reverse primer, 0.5mL ofTaq,and 1.0mL of synthesized DNA was initiated. All oligonucleotides uti- lized and their respective fragment sizes are listed in Table 1. A ribosomal housekeeper gene named RPS29 (ribosom- al protein S29) was utilized as cDNA control; gDNA con- tamination control was performed with -RT sample lacking reverse transcriptase during cDNA production.

Phagocytosis assay

Differentiated neutrophils were examined for phagocyto- sis function using Phagotest (Glycotope Biotechnology).

The protocol was carried out to the manufacturer’s speci- fications with slight adaptations. Briefly, 30 mL of

opsonizedEscherichia coliwas added to 100mL of cell- containing differentiation medium and incubated for 120 minutes at 378C. Afterward, samples were quenched on ice and treated with lysing and fixation solution. The last step was staining of cell DNA. Adjacent neutrophils were analyzed using both flow cytometry and microscopy.

RESULTS Hematopoietic progenitor differentiation from cj-iPSCs

A new culture system for differentiation of hematopoietic progenitor cells (HPCs) from cj-iPSCs using a cocktail of specific cytokines was established based on previous reports^15-18and cultivated on MEFs.¹⁹After 5 days of cul- turing, cj-iPSCs started forming small colonies, which were growing in both number and size (Figs. 1A and 1B).

After 13 days of recombinant human VEGF treatment, cells were analyzed for hematopoietic progenitor markers CD34 and VEGFR2^16,20 by fluorescence-activated cell Fig. 1. cj-iPSC differentiation into hematopoietic progenitors on gamma-irradiated MEFs. After 5 days, iPS colonies turned into small round-shaped cells (A), which rapidly proliferated and also grew in size until sorting on Day 13 (B; bar5100mm). (C) Paraformaldehyde-fixated sorted CD341/VEGFR2– also displayed strong CD34 signal on protein level (green, CD34, Alexa 488;

blue, Hoechst 33258; bar5100mm). FACS analysis showed well-defined fractions of CD341/VEGFR2– and CD341/VEGFR21 (log scale, D). The cell fraction with CD341/VEGFR2– features formed the largest group of sorted cells (E, n55).

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sorting (FACS) and sorted. The amount of sorted CD341/

VEGFR2– cells corresponded to a percentage of 39.6566.01%, which is 2.31310⁵cells, in five indepen- dent experiments, whereas CD341/VEGFR21cells were only represented by a small fraction (5.4164.36%; Figs.

1D and 1E). In addition, differentiated CD341/VEGFR2–

cells were collected and stained (Fig. 1C). CD341/ VEGFR2– cells were used for further differentiation into cj-iPSC–derived neutrophils.

Neutrophil differentiation from cj-iPSC–derived hematopoietic progenitors

Sorted CD341/VEGFR2– cells were seeded on six-well plates (Greiner Bio-One) on fresh MEFs and cultured for neutrophil differentiation. First, cells were treated with IL- 3, TPO, and SCF for 20 days. On Day 10 after cell sorting (Day 13110) small colonies started to be formed (Fig. 2A) and increased within the following days in both number and size on Day 20 (Day 13120). On Day 30 (Day 13130) six-well plates were crowded with cell colonies (Figs. 2B and 2C). In addition first floating cells appeared around Day 20 (Day 13120). These cells were saved dur- ing changing procedure of medium and were passed back to six-well plates, used for genetic analysis, or stained with Pappenheim’s staining for morphologic examination.

This procedure offered a development of undifferentiated hematopoietic progenitors on Day 13110 showing one single big nucleus and bright cytosol (Fig. 2D). During maturation, nucleus started forming and cytosol became more dense on Day 13120 (Fig. 2E) and on Day 13130 approximately 45.75%69.95% (1.1310⁵cells) of mature differentiated neutrophils showed neutrophil specific lob- ulated nucleus (Fig. 2F). Finally differentiated cells showed considerable similarity to native neutrophils from marmosets and humans (Figs. 2G and 2H). In addition, cj- iPSC–derived neutrophils were analyzed for neutrophil- specific genes and protein synthesis as well as for the expression of common neutrophil surface markers and for antimicrobial proteins stored in granules. Therefore, cj- iPSC–derived neutrophils were analyzed for a selection of most functionally relevant structures: IL-8 receptor (CXCR1/2, CD128), integrin aM (CD11b), and FccR1 (CD64).

CXCR1/2 is highly relevant for chemotaxis of neutro- phils.²¹Integrin aM is part of the Mac-1/complement receptor Type 3 domain of neutrophils acting with ICAM- 1 of endothelium for transition of the vascular wall²²and FccR1 initiates phagocytosis of pathogens by docking at opsonized microorganisms.²³Tantamount to functional ability of differentiated cells, all of these surface markers^24-26could be entirely detected in immune fluo- rescence microscopy (Figs. 3A-3C). On the other hand neutrophils also exhibit antimicrobial proteins stored in granules. Three kinds of those granules are known in

neutrophils: peroxidase-positive primary granules contain MPO, whereas peroxidase-negative secondary and tertiary granules contain LTF and gelatinase.^27-29While primary granules decrease during development of neutrophils, secondary and tertiary granules increase.³⁰In immunocy- tochemical analysis mature cj-iPSC–derived neutrophils showed high content of secondary and tertiary granules storing antimicrobial proteins LTF and gelatinase (Figs.

3D and 3E).^31,32

These results were reflected in RT-PCR analysis of neutrophil-specific genes (Fig. 3F). CD34 appears to be relatively late (Day 32), whereas VEGFR1 is already expressed from Day 0. Interestingly, lactotransferrin seems to be expressed in later stages of differentiation (Day 56), whereas MMP9 is present through the whole differentia- tion process (Fig. 4F).

Phagocytosis assay and electron microscopy Furthermore physiologic activity of differentiated neutro- phils was examined by assessing phagocytosis. Therefore, opsonized bacteria were added to differentiated cells fol- lowing modified constructer’s protocol. After incubation, cells were separated and prepared for immune fluores- cence. In this assay, differentiated neutrophils show high phagocytic potential. As shown in Fig. 3G phagocytosed bacteria are attached to the cell (1), starting to phagocytize (2), and lysed inside of the cytosol of cj-iPSC–derived neu- trophils (3). In addition cells also were assessed for typical neutrophil structures by electron microscopy. Matured cells showed neutrophil specific multilobulated nuclei (Fig. 4E). Additionally, electron dense granules and multi- vesicular as well as multilamellar inclusions were observed (see Figs. 4C and 4D).

Regarding the structure and density, granules show morphologic details as known from literature^27,28 and similar to the control cells (Figs. 4A and 4B). In all described neutrophil-specific structures, mature differen- tiated neutrophils (Figs. 4C, 4D, 4E, and 4G) show high similarity to native blood derived cells from the marmoset (Figs. 4A, 4B, and 4F).

DISCUSSION

Neutrophils play an important, indispensable role in innate immune response. Several inherited and acquired marrow failures interrupt both differentiation and func- tion of neutrophils, which are commonly connected with severe immune defect. As the immune system of the com- mon marmoset perfectly mimics the human immune sys- tem,^12,13cj-iPSC–derived neutrophils bare hopes in cell replacement and regenerative medicine. cj-iPSCs were cultured on MEFs during whole differentiation.

The first issue of this study was to establish a reliable culturing system for the differentiation of HPCs. Therefore COMMON MARMOSET MONKEY (C. JACCHUS)

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cj-iPSCs were cultured with VEGF, which is essential for hematopoietic differentiation.³³For HPCs out of an abun- dance of surface proteins at least two of them are known to be indispensable: VEGFR2 and CD34.^16,20Caused by a despised yield of CD341/VEGFR21cells and based on previous studies that show expression of CD34 either simultaneously or subsequently to the expression of VEGFR2.³⁴CD341/VEGFR2– cells were sorted in adequate

number after 13 days and additionally analyzed by PCR and immunofluorescence microscopy. It remains unclear why the CD34 mRNA signal is still detectable in the very late stages of differentiation, whereas VEGFR2 is detect- able surprisingly early.

The leading and final goal of this study was the fur- ther differentiation of these HPCs into mature functional neutrophils by the usage of well-known cytokines IL-3, Fig. 2. Cell cultures of CD341/VEGFR2– cells grew in colonies on MEFs. Colonies on Day 13110 (A), forming hemogenic endo- thelium on Days 13120 (B) and 13130 (C) with segregating cells (arrows; bars5200mm), which were separated from cell cul- ture and stained for Pappenheim’s staining after 13110 days (D), after 13120 days (E), and at the end of differentiation after 13130 days (F; bars510mm). cj-iPSC–derived neutrophils showed lobulated nucleus and similar morphology to mature neu- trophils fromC. jacchus(G) andHomo sapiens(H; bars510mm).

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TPO, SCF, and G-CSF.^18,35,36Since G-CSF is both relevant for final differentiation of cells into mature neutrophils and activation of resting mature neutrophils, it was used for the final step of the differentiation.^36-38

Besides antimicrobial function, surface proteins also affect each other: integrinaM cooperates with the mem- brane linked FccR1 in maturation of phagosomes.³⁹Even though FccR1 is not exclusively expressed in neutrophil Fig. 3. cj-iPSC–derived neutrophils were assessed for relevant surface proteins needed for the ability of chemotaxis, diapedesis, and phagocytosis by usage of immunofluorescence staining. Thus differentiated cells were stained for (A) CD64/Fcc-receptor 1 (FccR1), (B) CD11b/integrinaM as relevant part of complement receptor Type 3 in diapedesis, and (C) CD128/IL-8 receptora (CXCR-1). Furthermore, differentiated cj-iPSCs were also analyzed for antimicrobial proteins as (D) LTF and (E) gelatinase B (MMP9) by usage of immunohistochemical staining (bar525mm). Interestingly, RT-PCR analysis (F) showed late signals for CD34, VEGFR, and LTF while the MMP2 signal decreased over time (d56; -RT5DNA contamination control; HK5ribosomal protein 29). Besides, terminally differentiated cells were analyzed for as relevant part of phagocytosis of opsonized GFP-positive bacteria (G). Arrows: (1) attached bacteria, (2) starting lysis, and (3) intracellularly lysed bacteria (bar510mm).

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Fig. 4. Electron microscopic analysis. Matured cells ofC. jacchuswith both neutrophil-specific multilobulated nucleus (E) and electron-dense granules as well as multivesicular and multilamellar inclusions were observed (C and D). In comparison, native neutrophil granulocytes derived from marmoset blood are shown (A and B). Overviews are shown in F and G. Boxed areas in A and D are displayed in B and D in higher magnification. N5nucleus; M5mitochondria; arrows5granules; arrowheads5 vesicular content; asterisks5multilaminated inclusions. Bars: A, C, E-G52mm; B, D50.5mm.

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