In-vitro-Methoden in der Reproduktionstoxikologie

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In-vitro-Methoden in der Reproduktionstoxikologie

Männliche und weibliche Fertilität

A b s c h l u s s a r b e i t

Postgradualstudium Toxikologie der Universität Leipzig

Dr. Natascha Moschallski, Dipl.-Chem.

Freiburg, den 02.07.2011

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Ich möchte mich herzlich bei Annett J. Roi und Lucia Farina von ECVAM (JRC, Ispra, Italien), bei Klaus Schneider, Martin Hassauer und Ulrike Schuhmacher-Wolz

von FoBIG (Freiburg) und bei Ralf Gerhard und Adelgunde Graefe von der Universität Leipzig für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit bedanken.

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1 Inhalt

1.1 Inhaltsverzeichnis

1 Inhalt ... 3

1.1 Inhaltsverzeichnis ... 3

1.2 Kurz-Zusammenfassung... 4

1.3 Abkürzungsverzeichnis ... 4

2 Einleitung... 6

3 In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf die männliche Fortpflanzungsfähigkeit ... 9

3.1.1 Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)... 9

3.1.2 ReProComet ... 10

3.1.3 Kulturen von Leydig-Zellen... 11

3.1.4 Kulturen von Samenleitern ... 12

3.1.5 Kulturen von Sertoli-Zellen ... 12

3.1.6 Organ- und Gewebekulturen von Testes ... 13

4 In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf die weibliche Fortpflanzungsfähigkeit ... 15

4.1.1 Follicle Culture Bioassay (FBA)... 15

4.1.2 Granulosa- und Theca-Zellkultursysteme... 16

4.1.3 Der Ishikawa- Test ... 17

4.1.4 In-vitro-Reifung von Eizellen (IVM-assay) ... 17

4.1.5 Kultur von Ovarien ... 18

5 Eine übergreifende Methode: DerIn-vitro-Fertilisationstests (IVF) ... 20

6 Diskussion ... 21

7 Zusammenfassung ... 22

8 Literaturverzeichnis ... 23

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1.2 Kurz-Zusammenfassung

Ein breites Spektrum an publizierten in-vitro-Methoden als Ergänzung oder Alternative zu Tierversuchen wird von dem Europäischen Zentrum zur Validierung alternativer Methoden (ECVAM) in der regelmäßig aktualisierten Datenbank DB-ALM (Database Service on Alternative Methods) der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt.

In dieser Arbeit wird der 2010 bis Anfang 2011 aktualisierte Inhalt der Teilbereiche männliche und weibliche Fortpflanzungsfähigkeit des Datenbanksektors Reproduktionstoxikologie zusammenfassend präsentiert. Eine Auswahl an verfügbaren in-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf die zur Fortpflanzung unabkömmlichen Prozesse in den Reproduktionsorganen beider Geschlechter wird vorgestellt.

1.3 Abkürzungsverzeichnis

BSA Bovine Serum Albumin

DB-ALM ECVAM Database Service on Alternative Methods to Animal Experimentation

DFI DNA Fragmentation Index

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DNA Desoxyribonucleinsäure

EC50 Effective Concentration 50%

ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods

EIA Enzyme Immunoassay

EU Europäische Union FBA Follicle Culture Bioassay FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum

FSH Follicle-stimulating Hormone hCG human Chorionic Gonadotropin

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HPLC High Performance Liquid Chromatography IC50 Inhibitory Concentration 50%

ICH International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

ITS Integrated Testing Strategies IVF In-vitro-Fertilisation

IVM In-vitro Maturation LH Luteinizing Hormone MEM Minimal Essential Medium mRNA messenger-Ribonucleinsäure

MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulphophenyl)2H-tetrazolium bromide

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide PAGE Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis

PBS Phosphate-buffered Saline

OECD Organization for Economic Co-operation and Development QSAR Quantitative Structure-Activity Relationships

REACH Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals r-EGF recombinant Epidermal Growth Factor

ReProComet Repair Proficient Comet (Assay)

r-hCG recombinant human Chorionic Gonadotrophin

RIA Radioimmunoassay

RT-PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction SCSA Sperm Chromatin Structure Assay TCM Tissue Culture Medium

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling

WHO World Health Organization

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2 Einleitung

Tierversuche sind aus Tierschutzgründen sehr bedenklich und zudem oft langwierig, aufwendig und teuer (Scialli, 2008; Spielmann, 2009). Beispielsweise werden für eine Zwei-Generationen-Studie der Reproduktionstoxizität einer Substanz nach OECD- Richtlinie 416 etwa 2600 Tiere „verbraucht“ (Moore et al., 2009). Dennoch müssen die Auswirkungen von Chemikalien, die auf den Markt gelangen und zu den verschiedensten Produkten verarbeitet werden, auf Mensch und Umwelt gut untersucht werden, um schädliche Auswirkungen zu vermeiden. Dies wird z.B. von dem Gesetzwerk REACH (Regulation (EC) No. 1907/2006) verlangt, welches zugleich die Gesamtbetrachtung und Verwendung bereits bestehender Daten, von in-vitro-Testergebnissen, von Teststrategien (ITS) und von Abschätzungen aus Computermodellen (z.B. QSAR) fördert, mit dem Ziel, der Durchführung von unnötigen Tierversuchen entgegenzuwirken.

Um das Wissen über aktuelle Alternativmethoden zu verbreiten, so dass diese häufiger zur Anwendung gelangen, stellt das Europäische Zentrum zur Validierung alternativer Methoden (ECVAM) der Öffentlichkeit eine Datenbank an Methoden (DB- ALM) als Ergänzung oder Alternative zu Tierversuchen zur Verfügung. Diese Methodenbeschreibungen wurden nach wissenschaftlichen Gesichtspunkten aus der publizierten Literatur erarbeitet.

In dieser Arbeit wird der 2010 bis Anfang 2011 aktualisierte Inhalt des Datenbanksektors „Reproduktionstoxikologie“ in den Bereichen männliche und weibliche Fortpflanzungsfähigkeit zusammenfassend präsentiert. Eine Auswahl des verfügbaren Inventars anin-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf den männlichen und weiblichen Fortpflanzungsprozess bis einschließlich zur Einnistung eines Embryos in die Gebärmutterschleimhaut wird vorgestellt. Die in DB-ALM aufgeführten Tests zur Bestimmung der Auswirkungen von Chemikalien auf die Entwicklung des Nachwuchses werden aufgrund des begrenzen Umfangs dieser Arbeit hier nicht behandelt, ebenso wie mathematische Methoden (QSAR) und Tierversuchsverfahren mit einer reduzierten Anzahl an Tieren.

Reproduktionstoxizität im Allgemeinen („Effects on Reproduction“ in DB-ALM) umfasst alle Effekte von Chemikalien, die die Fortpflanzungsfähigkeit und die Entwicklung gesunder Nachkommen beeinträchtigen (WHO, 2001).

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Die Fortpflanzung von Säugetieren ist ein sehr komplexer Prozess. Der Fortpflanzungs-Zyklus besteht aus verschiedenen Entwicklungsphasen:

Gametenbildung, Befruchtung, Transport und Einnistung einer befruchteten Eizelle in die Gebärmutterschleimhaut, Embryogenese, prä- und postnatale Entwicklung bis zur Geschlechtsreife (Adler et al., 2010; Spielmann, 2009). In all diese Stadien können Chemikalien eingreifen und diese Prozesse stören, so dass verringerte Fruchtbarkeit der Erwachsenen und/oder die Beeinträchtigung der Entwicklung der Nachkommen die Folge sind (WHO, 2001).

Daten über die Auswirkungen auf die Fortpflanzung werden u.a. nach europäischem Gesetz für Industriechemikalien, Pflanzenschutzprodukte, Biozide und Pharmazeutika benötigt (REACH: EC, 2006; Plant Protection Products Directive:

EEC, 1991; Biocidal Products Directive: EC, 1998; Medicinal Products Directive: EC, 2004). Auch Inhaltsstoffe von Kosmetika müssen z.T. getestet werden (SCCS, 2009).

Alternative Strategien zur Ermittlung der Reproduktionstoxizität von Chemikalien sind insbesondere im Zusammenhang mit der REACH-Gesetzgebung interessant, wodurch u.a. toxikologische Informationen für Tausende von Chemikalien verlangt werden, um auf den europäischen Markt gelangen zu können (Balls, 2008; Combes, 2007; EC, 2006; Grindon et al., 2008a). Zugleich macht es die Komplexität des Fortpflanzungsprozesses besonders schwierig, Tierversuchs-freie Testmethoden zu entwickeln, die den ganzen Reproduktionszyklus (s.o.) abdecken können (Adler et al., 2010; Spielmann, 2009).

Derzeit werden Industriechemikalien, Agrochemikalien und Pharmazeutika vor allem mit in-vivo-Studien nach OECD-, EU- und ICH-Richtlinien auf mögliche Reproduktionstoxizität getestet.

Inzwischen ist auch ein breites Spektrum an in-vitro-Methoden in der Reproduktionstoxikologie bekannt. Die verwendeten Testsysteme umfassen in-vitro- bzw. ex-vivo-Kulturen von Primärzellen, etablierten Zelllinien, Gewebe-Explantaten und ganzer Organe. Es werden verschiedenste Endpunkte, die die Fähigkeit einer Substanz zur Beeinträchtigung der Fortpflanzung beschreiben, untersucht.

Typischerweise wird das Testgewebe nach der Exposition mit einer Chemikalie auf funktionelle Veränderungen untersucht, z.B. in den Bereichen Lebensfähigkeit, Reifung und Proliferation von Zellen, embryonale Morphologie und Entwicklung, Hormonsekretion, Anzeichen von Apoptose oder DNA-Schäden, Entwicklungsstadium der Keimzellen, Zytotoxizität, Genexpression, Anzeichen für oxidative Schäden, Protein-Produktion etc.. Die in DB-ALM verfügbaren

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Methodenbeschreibungen (method summaries) enthalten die Prinzipien und die Durchführung verschiedener Tests, Messung der Endpunkte und Datenauswertung.

Im Folgenden werden jeweils die Grundzüge einer Auswahl an in DB-ALM beschriebenen in-vitro-Methoden zur Bestimmung des Einflusses von Chemikalien auf die männliche und weibliche Fertilität beschrieben.

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3 In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf die männliche Fortpflanzungsfähigkeit

Der Einfluss von Chemikalien auf die männliche Fortpflanzungsfähigkeit kann in vitro durch die Auswirkung von Testsubstanzen auf die Spermienqualität und auf die funktionellen Einheiten der männlichen Reproduktionsorgane untersucht werden.

3.1.1 Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)

Im SCSA wird die mögliche Schädigung des Zellkerns von Spermien nach der Exposition mit einer Testsubstanz sichtbar gemacht. Es gibt verschiedene Testprotokolle. Die folgende Beschreibung ist einer Auswahl an Publikationen entlehnt (Benzoni et al., 2008; Evenson und Melamed, 1983; Evenson und Wixon, 2005; Minervini et al., 2010; Rignell-Hydbom et al., 2005; Uguz et al., 2009; Zubkova und Robaire, 2006).

Für den SCSA werden frische oder tiefgefrorene Spermaproben einer Donorspezies nach Wahl (z.B. Menschen, Ratten, Mäuse, Schweine, Rinder) 1-48 Stunden lang mit einer Testsubstanzlösung exponiert. Danach werden kleine Proben genommen und mit einer Detergenzien-haltigen Lösung versehen, um die Viskosität zu reduzieren.

Nach 30 Sekunden wird eine Acridinorange-haltige Pufferlösung hinzugegeben und binnen weniger Minuten erfolgt die Analyse in einem Durchflusszytometer mit Licht der Wellenlänge 488 nm zur Anregung von Fluoreszenz. Rote Fluoreszenz wird durch die Anlagerung von Acridinorange an Einzelstrang-DNA hervorgerufen, und grüne Fluoreszenz durch Interkalation des Farbstoffes in Doppelstrang-DNA. Die Lichtintensitäten der Fluoreszenzwellenlängen (rot und grün) werden gemessen und in den sogenannten DFI (DNA Fragmentation Index) überführt. Mit diesem Zahlenwert kann der Anteil an geschädigten Spermien (also diesen mit höherer Fluoreszenzintensität im roten Bereich im Vergleich zu einer nicht exponierten Kontrollgruppe) festgestellt werden. Analoge Messungen können auch mit dem TUNEL-Assay durchgeführt werden.

Dieser Test hat den Vorteil, dass Spermaproben verschiedener Donoren ohne deren Schädigung erhältlich sind (Hendricks et al., 2010). Zudem haben sich die Testergebnisse als sehr reproduzierbar herausgestellt (Evenson et al., 2007). Jedoch können Testergebnisse von Spermienproben verschiedener Donorspezies nicht direkt miteinander verglichen werden, zudem spielt auch das Reifungsstadium der

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Spermien eine Rolle (Benzoni et al., 2008; Tsakmakidis et al., 2008; Villani et al., 2010a; Zubkova und Robaire, 2006).

Der SCSA befindet sich noch in der Entwicklungsphase. Es sind noch keine Korrelationsbetrachtungen zwischen SCSA-Ergebnissen und in-vivo-Daten verfügbar.

3.1.2 ReProComet

Im sogenannten ReProComet-Test werden nach Exposition von Spermien mit einer Testsubstanz DNA-Einzelstrangbrüche mit einer Gelelektrophorese-Methode analysiert.

Das Testprotokoll wird folgendermaßen beschrieben (Cordelli et al., 2007; Villani et al., 2010b). Proben von Rindersperma werden mit PBS gewaschen und dann darin suspendiert. Es folgt die 2-stündige Exposition mit einer Testsubstanz. Die Negativkontrolle ist PBS, die Positivkontrolle Methylmethansulfonat. Danach werden auf Objektträger überführte und in Agarose eingebettete Spermatozoen lysiert und über Nacht mit HeLa-Zellextrakt bei 37 °C inkubiert, um DNA-Reparatur zu ermöglichen, die in Spermien ansonsten nicht stattfinden kann, da diese keine DNA- Reparaturenzyme besitzen. Wenn Moleküle der Testsubstanz an die DNA gebunden haben, kann es durch diese Reparaturmechanismen zu Strangbrüchen kommen. Die Objektträger werden für 10 min bei 4 °C in einen horizontalen Gelelektrophorese- Tank mit frischem Elektrophorese-Puffer (pH 12.1) gestellt, um die Entwindung der DNA zu ermöglichen. Dann wird die Elektrophorese 5 min lang bei 4 °C, 25 V und 300 mA durchgeführt. Danach wird fixiert und mit Ethidiumbromid angefärbt.

Durch dieses Verfahren werden DNA-Bruchstücke, die sich im elektrischen Feld aus dem Zellkern bewegen, sichtbar gemacht. Je weiter der Weg ist, den eine Bande auf dem Objektträger zurückgelegt hat, desto kürzer sind die entsprechenden DNA- Bruchstücke. Die Weglänge und der Anteil der zugehörigen Bruchstücke werden durch spezielle Computerprogramme visuell erfasst und quantifiziert.

Der wichtigste Endpunkt ist die EC50, also die Substanzkonzentration die den halb maximalen Effekt bezüglich der quantifizierten Größen verursacht. Die EC50 wird der aufgestellten Dosis-Wirkungs-Kurve entnommen.

Auch dieser Test verwendet gut zugängliche Spermaproben (Cordelli et al., 2007).

Bisher wurde eine gewisse Variabilität der Testergebnisse beobachtet, die womöglich

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durch die Verwendung unterschiedlicher Zellextrakte mit Reparaturenzymen hervorgerufen werden (Villani et al., 2010b).

Dieser Test wird noch weiter erforscht. Es sind noch keine Korrelationsbetrachtungen zwischen Ergebnissen aus ReProComet-Tests und in-vivo-Daten verfügbar.

3.1.3 Kulturen von Leydig-Zellen

Leydig-Zellkulturen können nach Einwirkung einer Testsubstanz auf funktionelle Parameter wie z.B. Hormonproduktion untersucht werden.

Dazu werden entweder primäre Leydig-Zellen aus den Testes von z.B. Menschen, Schweinen und Nagern entnommen und kultiviert oder es werden bestehende Zelllinien (MA-10, mLTC-1, TM3, BLT1) verwendet.

Es wurden verschiedene Testprozeduren berichtet. Die folgende Beschreibung ist ausgewählten Publikationen entnommen (Cheng et al., 2005; Murugesan et al., 2008; Sivakumar et al., 2006).

Leydig-Zellen werden enzymatisch aus Hodengewebe präpariert, zentrifugiert und gereinigt. Durch übliche Verfahren kommt man auf einen Anteil an Leydig-Zellen von ca. 90%. Die Zellen werden bei 90% Luftfeuchtigkeit und Luft mit 5% CO2bei 37 °C in Zellkultur-Medium kultiviert. Nach ein paar Stunden oder Tagen (mit täglichem Mediumaustausch) erfolgt die Exposition mit einer Testsubstanz für eine Stunde bis zu mehreren Tagen. Oft werden gewisse Stimulantien (z.B. hCG) zugegeben, um die Testosteronproduktion in vitro aufrechtzuerhalten. Danach werden mehrere Endpunkte untersucht, die durch Chemikalienexposition beeinflusst werden können.

Die Hormonproduktion wird mit RIA untersucht, die Enzymaktivität durch Zugabe von Substrat und folgender Analyse des Reaktionsprodukts z.B. mit HPLC und Gen- und Proteinexpression kann mit RT-PCR und PAGE/Western blotting untersucht werden (Rengarajan und Balasubramanian, 2007; Shi et al., 2010). Zytotoxizität kann z.B.

durch Anfärben mit MTT oder MTS untersucht werden.

Für diese Endpunkte werden EC50- oder IC50-Werte bestimmt.

Über dieses Testsystem wird in der Literatur diskutiert. Es erscheint geeignet, um z.B. Störungen der Steroidogenese zu untersuchen (Shi et al., 2010). Aber es ist offenbar noch unklar, in welchen Fällen Kulturen angereicherter Leydig-Zellen zur Substanztestung geeigneter sind als Ko-Kulturen, worin interzelluläre Kommunikation stattfinden kann (Chapin und Phelps, 1990). Zudem könnte das Alter des Donors die Testergebnisse beeinflussen (Svechnikov et al., 2008).

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Leydig-Zell-Tests befinden sich noch in der Entwicklung. Es gibt noch keine Korrelation zwischen denin-vitro-Testergebnissen und in-vivo-Daten.

3.1.4 Kulturen von Samenleitern

Samenleiter-Kulturen können nach Exposition mit einer Testsubstanz Veränderungen der Funktion und Morphologie zeigen.

Zu diesem Zweck wurden bisher Kulturen von Samenleitern von Ratten und Hamstern erstellt. Dazu werden Proben isolierter Samenleiter in Zellkulturplatten mit Zellkulturmedium gegeben und mit feuchter Luft (5% CO2) bei 32 °C (etwa Skrotaltemperatur) inkubiert (Allenby et al., 1991; Danner et al., 2009; Ku und Chapin, 1994). Diese Samenleiter-Kulturen können 1-16 Tage mit Testsubstanz kultiviert werden (Allenby et al., 1991; Geoffroy-Siraudin et al., 2010). Danach werden Samenleiter-Segmente histologisch untersucht. Die Funktionsfähigkeit der Zellen (Sekretion von Inhibin) kann durch RIA von Proben des Zellkulturmediums gemessen werden (Allenby et al., 1991).

Dieses Testsystem hat den Vorteil, als Explantat einer funktionellen Einheit der Testes die in-vivo-Situation gut widerzuspiegeln (Geoffroy-Siraudin et al., 2010).

Dennoch können nicht alle in vivo bestehenden Einflüsse auf die Spermatogenese in vitrorekonstruiert werden (Allenby et al., 1991; Ku und Chapin, 1994).

Es wurden gute Übereinstimmungen zwischen in vitro und in vivo-Testergebnissen berichtet, daher wird diesem Testsystem ein gewisses Potential zugesprochen (Allenby et al., 1991). Es befindet sich derzeit noch in der Entwicklungsphase.

3.1.5 Kulturen von Sertoli-Zellen

Analog zu Leydig-Zellen können auch Sertoli-Zellen unter Einfluss einer Chemikalie funktionelle Veränderungen zeigen.

Um diese zu messen, werden primäre Sertoli-Zellen von Nagern kultiviert oder bestehende Sertoli-Zelllinien verwendet.

Das Testverfahren wird anhand einer Auswahl an Publikationen beschrieben (Aly et al., 2010; Bekheet und Stahlmann, 2009; Feng et al., 2010; Li et al., 2009).

Zur Isolierung von Sertoli-Zellen werden Rattenhoden mit Collagenase digeriert und zentrifugiert. Der Rückstand wird mit PBS gewaschen, um PBS und Leydig-Zellen zu entfernen. Es wird nochmals enzymatisch behandelt, gewaschen und zentrifugiert, um Sertoli-Zellen von Keimzellen zu separieren. Die erhaltenen Zellen werden in

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Schälchen mit Matrigel gegeben und in Zellkulturmedium (z.B. DMEM) mit 10% FBS bei 34 °C (feuchte Luft, 5% CO2) kultiviert. Dadurch entstehen in vielen Fällen Zellkulturen mit über 90% Sertoli-Zellen. Verbleibende Keimzellen werden mit hypotoner Lösung lysiert. Nach 3 Tagen in Zellkultur erfolgt die Behandlung mit einer Testsubstanz für ein paar Stunden oder Tage.

Danach können verschiedene Endpunkte gemessen werden: Bestimmung der Cytotoxizität, Untersuchung der Proteinexpression mit RT-PCR oder PAGE/Western blotting, Messung der Aktivität von Enzymen die oxidativen Stress anzeigen, Apoptose-Bestimmungen etc. (Fiorini et al., 2008; Gong und Han, 2006; Gong et al., 2009; Li et al., 2009; Yang et al., 2005). Zudem ist der Effekt von Testsubstanzen auf Zell-Zell-Kontaktstellen (tight junctions) interessant, die die Blut-Testes-Schranke repräsentieren (Adler et al., 2010).

Dieses Testsystem hat sich als nützlich erwiesen, Chemikalien in erster Näherung als positiv oder negativ bezüglich der Toxizität auf Hodengewebe zu bewerten. Dafür wurden die Endpunkte Zytotoxizität und die Sekretion von Inhibin B herangezogen (Adler et al., 2010). Es gibt aber noch keine Korrelation zu in-vivo-Daten, daher ist eine weitergehende Validierung dieses Textsystems notwendig.

3.1.6 Organ- und Gewebekulturen von Testes

Unerwünschte Wirkungen von Chemikalien auf die Morphologie und Funktion der Testes, z.B. Spermato- und Steroidogenese, können mithilfe von Organ-und Gewebekulturen von Hoden verschiedener Spezies untersucht werden.

Zellkulturen ganzer Testes oder von Gewebe-Explantaten wurden bisher z.B. von neugeborenen Mäusen oder Ratten erstellt. Dies wird auf Filtermembranen, die in Zellkulturschalen in Medium schwimmen, durchgeführt. Die Kulturen werden bei 37

°C in feuchter Luft mit 5% CO2 gehalten, und das Medium wird alle 24 Stunden ausgetauscht. Die Testsubstanz wird nach 48 Stunden zugegeben. Die Exposition kann eine Stunde bis mehrere Tage lang stattfinden (Gohbara et al., 2010; Hallmark et al., 2007; Livera et al., 2006).

Danach werden verschiedene Endpunkte gemessen. Die Testosteron-Sekretion der Testes/-Explantate ins Medium kann direkt mit RIA gemessen werden. TUNEL wird mit Sektionen durchgeführt. Homogenisiertes und extrahiertes Gewebe kann zur Bestimmung der Hormonproduktion innerhalb des Gewebes und zur Analyse der Genexpression mit RT-PCR (hier: reverse-transcriptase polymerase chain reaction) herangezogen werden (Li et al., 2008; Livera et al., 2006).

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Dieses Modell hat den großen Vorteil, die Wirkung von Chemikalien auf die gesamte funktionelle Einheit der Testes untersuchen zu können, befindet sich allerdings noch in einem sehr frühen Entwicklungsstadium.

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4 In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf die weibliche Fortpflanzungsfähigkeit

Der Einfluss von Chemikalien auf die weibliche Fortpflanzungsfähigkeit kann in vitro durch die Auswirkung von Testsubstanzen auf den Zustand der Eizellen und auf andere funktionelle Einheiten der weiblichen Reproduktionsorgane untersucht werden.

4.1.1 Follicle Culture Bioassay(FBA)

Im FBA wird der Einfluss von Testsubstanzen auf die in-vitro-Reifung von Eizellen untersucht.

Das Testverfahren wird wie folgt beschrieben (Cortvrindt und Smitz, 2002; Sun et al., 2004; Sun et al., 2008; Van Merris et al., 2007; Van Wemmel et al., 2005).

Labormäusen werden im Durchschnittsalter von 12-14 Tagen Ovarien entnommen.

Diese werden seziert, um intakte Follikel einer bestimmten Reifungsstufe (prä-antral) und einer Hülle aus 2-3 Schichten Granulosa- und Thecazellen zu isolieren. Diese Follikel werden dann einzeln 12 Tage lang in Zellkulturmedium (z.B. alpha-MEM mit verschiedenen Zusätzen) zu antralen Follikeln reifen lassen (Inkubation unter Luft mit 5% CO2 bei 37 °C und 100% Luftfeuchtigkeit). Eine Kontrollgruppe bleibt unexponiert, während das Medium der anderen Follikel die Testsubstanz enthält.

Das Medium wird mehrmals ersetzt und zur Messung der Hormonproduktion (Estradiol und Progesteron) mit RIA aufgehoben. Am 12. Tag werden r-EGF und r- hCG in die Medien gegeben, um den Eisprung auszulösen. Am 13. Tag werden durch Fixierung und Anfärbung mikroskopisch der Reifungszustand der Eizellen und die Beschaffenheit ihrer Hüllen (Cumulus) und Chromosomen untersucht.

Der Prozentsatz der überlebenden Follikel und der Eizellen in einem bestimmten Reifungs- und Teilungsstadium und mit bestimmten Anomalien des Chromosomensatzes (z.B. Hyperploidie) relativ zu allen Follikeln bzw. Eizellen bestimmt.

Es wird berichtet dass der FBA ein wertvoller in-vitro-Test auf chemikalienbedingte Störungen der Ovarienfunktionen werden könnte, zudem sind mechanistische Informationen darin besser zugänglich als in vivo (Cortvrindt und Smitz, 2002; Lenie und Smitz, 2009; Van Merris et al., 2007; Van Wemmel et al., 2005). Bisherige Vergleiche vom FBA-Resultaten mit in-vivo-Daten sind vielversprechend (Schenk et

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al., 2010). Dieser Test könnte Teil einer in-vitro-Testbatterie zur Evaluierung von Substanzeffekten auf Ovarien werden (Schenk et al., 2010).

4.1.2 Granulosa- und Theca-Zellkultursysteme

Granulosa- und Thecazellen können in Kultur mit Testsubstanzen exponiert werden, um Effekte auf Somazellen der Ovarien zu studieren.

Dazu können primäre Zellen verschiedener Donorspezies (Menschen, Rinder, Schweine, Ratten, Mäuse) oder bestehende Granulosa-Zelllinien (KGN) herangezogen werden. Die Zellen werden aus Follikeln eines bestimmten Reifungszustandes isoliert und nach dem Waschen und Zentrifugieren getrennt oder gemeinsam in Co-Kultur (im Verhältnis Granulosa:Theca 4:1, wie in vivo) auf z.B.

Mikrotiterplatten ausgesät (Gregoraszczuk et al., 2008a; Gregoraszczuk et al., 2008b; Gregoraszczuk et al., 2009; Kolesarova et al., 2010; Tiemann et al., 2007).

Als Zellkulturmedien wurden bisher M199 oder DMEM/Ham’s F12 mit 5-12% FBS oder FCS verwendet (Gregoraszczuk et al., 2008a; Mlynarczuk et al., 2009; Tiemann et al., 2009). Die Kulturen werden in feuchter Luft mit 5% CO2 bei 37,0-38,5 °C gehalten (Caloni et al., 2009; Kolesarova et al., 2010; Wrobel et al., 2009; Zachow und Uzumcu, 2006). Testsubstanzen werden dem Medium hinzugegeben und bis zu 48 h einwirken lassen (Caloni et al., 2009; Kolesarova et al., 2010; Mlynarczuk et al., 2009; Stelzer und Hutz, 2009).

Anschließend kann das Medium mit RIA oder EIA auf Hormone (Steroide wie Progesteron und Estradiol) und Wachstumsfaktoren untersucht werden (Gregoraszczuk et al., 2009; Kolesarova et al., 2010; Zachow und Uzumcu, 2006).

Die überlebenden Zellen können z.B. mit dem Farbstoff MTT sichtbar gemacht werden, Proteinexpression wird z.B. mit Western blotting untersucht und Genexpression kann nach der Isolierung von mRNA mit RT-PCR evaluiert werden (Gregoraszczuk et al., 2009; Harvey et al., 2009; Kolesarova et al., 2010; Tiemann et al., 2007; Tiemann et al., 2009; Young et al., 2008; Zachow und Uzumcu, 2006). Die untersuchten Effekte werden im Vergleich zu unexponierten Kontroll-Kulturen betrachtet. Noch gibt es kein einheitliches Testprotokoll und keine Korrelationsbetrachtungen zu in-vivo-Daten, zudem werden viele Detailaspekte dieses Testsystems in der Literatur noch diskutiert.

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4.1.3 Der Ishikawa- Test

Als Ishikawa-Zellen wird eine Zelllinie bezeichnet, die aus einem Adenokarzinom der Gebärmutterschleimhaut gewonnen wurde. Diese Zellen exprimieren auch in vitro Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren (Nishida et al., 1985). Diese spielen eine wichtige Rolle bei der Einnistung eines Embryos in die Gebärmutterschleimhaut.

Chemikalien die die Expression von Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren in der Gebärmutterschleimhaut stören, können dazu führen dass sich kein Embryo darin einnisten und somit keine Fortpflanzung stattfinden kann. Mit dem hier beschriebenen Ishikawa-Test kann daher festgestellt werden, ob Chemikalien das Potential haben, diesen Prozess zu beeinträchtigen (Schaefer et al., 2010).

Ishikawa-Zellen sind im Handel erhältlich. Sie werden 3 Tage lang in MEM, weiteren Additiven und 5% FBS in Mikrotiterplatten bei 37 °C und an Luft mit 5% CO2

kultiviert. Danach werden sie für 24 h in einem Medium mit der Testsubstanz gehalten (Schaefer et al., 2010). Anschließend wird die Expression des Progesteron- Rezeptors mit Western blotting analysiert. Die zugehörige mRNA kann mit RT-PCR quantitativ analysiert werden (Schaefer et al., 2010).

mRNA-Levels und Testsubstanz-Konzentrationen werden gegeneinander aufgetragen, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen festzustellen. Tritt eine solche auf, also steigt das mRNA-Level bei einer gewissen Substanzmenge deutlich an, so wird die entsprechende Chemikalie als östrogen wirksam bewertet. Je nachdem ob der mRNA-Anstieg bei niedrigen oder höheren Konzentrationen auftritt, spricht man dann von einer stark oder schwach östrogen wirksamen Substanz (Schaefer et al., 2010).

Dieser Test hat in erstenin-vivo-Vergleichen nicht schlecht abgeschnitten, muss aber noch weiter ausgearbeitet werden. Zudem ist dieser Test höchst spezifisch auf den zugrundeliegenden biochemischen Prozess (Schaefer et al., 2010; Schenk et al., 2010).

4.1.4 In-vitro-Reifung von Eizellen (IVM-assay)

Der Einfluss von Chemikalien auf den Reifungsprozess von Eizellen kann in vitroan isolierten und kultivierten Oozyten untersucht werden.

Die Testprozedur wird nach Lazzari et al. (2008) und Luciano et al. (2010) beschrieben. Oozyten mit oder ohne Hülle (Cumulus) werden Ovarien von Rindern entnommen, die in Schlachthöfen erhältlich sind. Sie werden in ein spezielles Reifungsmedium gegeben: TCM 199 mit epidermalem Wachstumsfaktor, FSH/LH,

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Glutamin und Natriumpyruvat. Die Reifung von je 15-20 Oozyten in Medium mit oder ohne Testsubstanz wird in vitro 24 Stunden lang bei 38,5 °C an mit Wasser gesättigter Luft mit 5% CO2 vollzogen. Danach werden die Eizellen gewaschen, auf Objektträgern fixiert, angefärbt und am Mikroskop untersucht (Lazzari et al., 2008;

Luciano et al., 2010).

Anschließend wird die Morphologie der Eizellen bei 200-400facher Vergrößerung ausgewertet. Der beobachtete Endpunkt ist der Abschluss der Meiose bis zur Metaphase II. An diesem Punkt wird das Polkörperchen ausgestoßen. Alle Oozyten, die diesen Punkt nicht erreichen, werden als nicht gereift klassifiziert.

Der wichtigste Endpunkt ist der Anteil an gereiften Oozyten im Verhältnis zu allen Oozyten in der Zellkulturschale und wird als Reifungsrate bezeichnet. Aus der Dosis- Wirkungs-Kurve kann ein EC50-Wert abgeleitet werden (González et al., 2010;

Lazzari et al., 2008; Luciano et al., 2010; Schenk et al., 2010).

Erste Vergleiche der Testergebnisse mit in-vivo-Daten führten zu 60% richtigen Vorhersagen (Schenk et al., 2010). Daher wird für diesen Test ein Validierungsverfahren angestrebt, so dass er eines Tages als Teil einer Testbatterie zur Vorhersage von Effekten auf die weibliche Fertilität eingesetzt werden könnte (Lazzari et al., 2008; Luciano et al., 2010).

4.1.5 Kultur von Ovarien

Mit der Kultur von ganzen Ovarien oder Explantaten können Substanzeffekte auf die verschiedenen funktionellen Prozesse der Eierstöcke in vitrountersucht werden.

In der Literatur wird ein solcher Test am häufigsten mit der Kultur ganzer Ovarien, die jungen Mäusen oder Ratten entnommen wurden (neugeboren oder bi 4 Tage alt), beschrieben (Desmeules und Devine, 2006; Devine et al., 2002b; Igawa et al., 2009;

Talbot, 2008; Tuttle et al., 2009).

Die isolierten Ovarien werden z.B. in DMEM/Ham’s F12 und Antibiotika wie Streptomycin und anderen Additiven, u.a. BSA und Nährstoffe, kultiviert. Am gleichen Tag wird die Testsubstanz hinzugegeben und es wird für 6 Stunden bis zu mehreren Tagen exponiert. Das Gewebe wird währenddessen bei 37 °C an Luft mit 5% CO2

inkubiert. Das Medium wird jeden 2. Tag ersetzt.

Danach werden Sektionen der Ovarien histologisch untersucht, um die Zahl der überlebenden Follikel festzustellen. Apoptotische Zellen werden mit TUNEL und Immunohistochemie sichtbar gemacht. Homogenate der Ovarien können auf

(19)

bestimmte Enzyme und mRNA mit Western blotting bzw. RT-PCR analysiert werden, und der Hormongehalt des Mediums wird mit RIA analysiert. All die beobachteten Größen werden im Vergleich zu unexponierten Kontroll-Ovarien ausgewertet (Desmeules und Devine, 2006; Devine et al., 2002b; Igawa et al., 2009; Keating et al., 2008; Talbot, 2008; Tuttle et al., 2009).

Der Vorteil dieses Testsystems ist die gute Aufrechterhaltung der in vivo Verhältnisse;

es ist jedoch noch weitere Forschungsarbeit erforderlich (Devineet al., 2002a).

Der Test befindet sich noch in einem frühen Entwicklungsstadium. Es sind noch keine Vergleiche der Testergebnisse mitin-vivo-Daten bekannt.

(20)

5 Eine übergreifende Methode: Der In-vitro-Fertilisationstests (IVF)

In in-vitro-Fertilisationtests werden entweder Eizellen oder Spermien oder beide mit einer Substanz exponiert, um anschließend die Auswirkungen auf die Eizellen und/oder die Spermienqualität und/oder die Eizelle-Spermien-Interaktion und die Fähigkeit zur Befruchtung zu beurteilen.

Es gibt verschiedene Testprotokolle, wovon das mit dem Namen „Toxicity Test on IVF of Bovine Oocytes“ am weitesten entwickelt wurde (Bremer et al., 2005a; Bremer et al., 2005b; Hareng et al., 2005; Lazzari et al., 2008; Schenk et al., 2010). Dieses Protokoll wird im Folgenden nach Lazzariet al. (2008) kurz beschrieben:

Als Testsystem dienen Eizellen und Spermien von Rindern. Erstere bekommt man auf Schlachthöfen; tiefgefrorenes Rindersperma für die künstliche Befruchtung von Rindern ist im Handel erhältlich. Die Eizellen werden in Schälchen kultiviert und bis zu ihrer Reifung in Zellkultur gehalten. Dann wird aufgetauter Samen und eine Lösung der Testsubstanz (bzw. keine zur Negativkontrolle; Ionomycin zur Positivkontrolle) hinzugegeben und die Schälchen (je ca. 20 Eizellen und ca. 1000 Spermien) werden bei 38.5 °C in befeuchteter Luft mit 5% CO2 für 24 Stunden inkubiert. Danach wird mit Chromatin angefärbt und am Mikroskop ausgewertet. Eine erfolgreiche Befruchtung erkennt man an einer Teilung der Eizelle, der das Eindringen eines Spermiums und die Bildung eines männlichen und eines weiblichen Vorkerns vorausgeht. Unbefruchtete Eizellen sind daran zu erkennen, dass sie sich in der Regel noch in der Metaphase II befinden, keinen männlichen Vorkern aufweisen und das zweite Polkörperchen noch nicht ausgestoßen haben.

Der wichtigste Endpunkt ist die EC50, also die Substanzkonzentration die zu 50% die Befruchtung von Eizellen verhindert.

In einem ersten Vergleich mit in-vivo-Daten konnten mit diesem Test 50% bzw. 70%

korrekte Vorhersagen bezüglich des Potentials der untersuchten Substanzen, die männliche bzw. weibliche Fertilität zu beeinträchtigen, getroffen werden (Schenk et al., 2010).

(21)

6 Diskussion

Bislang hat noch keine Alternativmethode rechtliche Anerkennung erlangt, daher ist damit noch kein vollständiger Ersatz von Tierversuchen möglich. Zudem wird auf absehbare Zeit keine einzelne Alternativmethode den ganzen Reproduktionszyklus abdecken können, sondern es werden vielmehr Methodenkombinationen für Testbatterien erforscht (Adler et al., 2010). Die verfügbaren Alternativmethoden werden bislang vor allem zum Screening, also zur Auslese von Chemikalien, verwendet und sollen künftig verstärkt Einsatz in Testbatterien und als Teil von integrierten Teststrategien (IST) finden, um die Zahl an Tierexperimenten so weit wie möglich zu reduzieren (Grindon et al., 2008b; Schenk et al., 2010). Die Entwicklung von in-vitro-Teststrategien für den gesamten Reproduktionszyklus von Säugetieren war auch das Ziel des EU-geförderten ReProTect-Projektes (2004-2009), in dessen Rahmen verschiedene in-vitro-Methoden eingehend auf ihre Anwendbarkeit untersucht wurden, z.B. die hier vorgestellten Methoden SCSA, ReProComet, Kulturen von Leydig-Zellen, Testes-Kulturen, FBA, Granulosa-Zellkulturen, der Ishikawa-Test, IVM und IVF (Bremer et al., 2005a; Bremer et al., 2005b; Hareng et al., 2005; Schenk et al., 2010). Leider gibt es bislang kaum Publikationen zum Ergebnis dieses Projektes; die umfassendste Publikation ist die sogenannte

„Feasibility Study“, in der ein Teil dieser Tests im Zusammenwirken als Testbatterie zur Vorhersage von in-vivo-Effekten untersucht wurde (FBA, Ishikawa, IVM, IVF) (Schenk et al., 2010). Die Ergebnisse sind mittelmäßig bis vielversprechend, machen aber deutlich wie viel Entwicklungsarbeit noch notwendig ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Alternativmethoden zum Tierversuch auf einem guten Weg sind; es gibt jedoch noch reichlich Forschungsbedarf.

(22)

7 Zusammenfassung

Ein breites Spektrum an publizierten in-vitro-Methoden als Ergänzung oder Alternative zu Tierversuchen wird von dem Europäischen Zentrum zur Validierung alternativer Methoden (ECVAM) in der regelmäßig aktualisierten Datenbank DB-ALM (Database Service on Alternative Methods) der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt.

In dieser Arbeit wurde der 2010 bis Anfang 2011 aktualisierte Inhalt des Datenbanksektors „Reproduktionstoxikologie“ in den Bereichen männliche und weibliche Fortpflanzungsfähigkeit zusammenfassend präsentiert. Eine Auswahl des verfügbaren Inventars anin-vitro-Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien auf den männlichen und weiblichen Fortpflanzungsprozess bis einschließlich zur Einnistung eines Embryos in die Gebärmutterschleimhaut wurde vorgestellt.

Die verwendeten Testsysteme umfassen in-vitro- bzw. ex-vivo-Kulturen von Primärzellen, etablierten Zelllinien, Gewebe-Explantaten und ganzer Organe. Es werden verschiedenste Endpunkte, die die Fähigkeit einer Substanz zur Beeinträchtigung der Fortpflanzung beschreiben, untersucht. Typischerweise wird das Testgewebe nach der Exposition mit einer Chemikalie auf funktionelle Veränderungen untersucht, z.B. in den Bereichen Lebensfähigkeit, Reifung und Proliferation von Zellen, Hormonsekretion, Anzeichen von Apoptose oder DNA- Schäden, Entwicklungsstadium der Keimzellen, Zytotoxizität, Genexpression, Anzeichen für oxidative Schäden, Protein-Produktion etc..

Bislang hat noch keine Alternativmethode rechtliche Anerkennung erlangt, daher ist damit noch kein vollständiger Ersatz von Tierversuchen möglich. Zudem wird auf absehbare Zeit keine einzelne Alternativmethode den ganzen Reproduktionszyklus abdecken können, sondern es werden vielmehr Methodenkombinationen für Testbatterien erforscht. Die verfügbaren Alternativmethoden werden bislang vor allem zum Screening, also zur Auslese von Chemikalien, verwendet und sollen künftig verstärkt Einsatz in Testbatterien und als Teil von integrierten Teststrategien (IST) finden, um die Zahl an Tierexperimenten so weit wie möglich zu reduzieren.

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8 Literaturverzeichnis

DB-ALM:http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/(auf dem Stand vom 01.07.2011)

Adler, S.; Broschard, T.; Bremer, S.; Cronin, M.; Daston, G.; Grignard, E.; Piersma, A.; Repetto, G.; Schwarz, M. (2010)

Draft Report on Alternative (Non-Animal) Methods for Cosmetics Testing: current status and future prospects – 2010: Chapter 5 Reproductive Toxicity. Compiled by Workgroup 5, 14 July 2010

Allenby, G.; Foster, P.M.D.; Sharpe, R.M. (1991)

Evaluation of changes in the secretion of immunoactive inhibin by adult rat seminiferous tubules in vitro as an indicator of early toxicant action on spermatogenesis

Fundamental and Applied Toxicology, 16, 710-724

Aly, H.A.; Lightfoot, D.A.; El-Shemy, H.A. (2010)

Bacterial lipopolysaccharide-induced oxidative stress in adult rat Sertoli cells in vitro Toxicology In Vitro, 24, 1266-1272

Balls, M. (2008)

The way forward for reproductive/developmental toxicity testing ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 36, 713-714

Bekheet, S.H.M.; Stahlmann, R. (2009)

Disruption of gap junctional intercellular communication by antibiotic gentamicin is associated with aberrant localization of occludin, N-cadherin, connexin 43, and vimentin in SerW3 Sertoli cells in vitro

Environmental Toxicology and Pharmacology, 28, 155-160

Benzoni, E.; Minervini, F.; Giannoccaro, A.; Fornelli, F.; Vigo, D.; Visconti, A. (2008) Influence of in vitro exposure to mycotoxin zearalenone and its derivatives on swine sperm quality

Reproductive Toxicology, 25, 461-467

(24)

Bremer, S.; Balduzzi, D.; Cortvrindt, R.; Daston, G.; Eletti, B.; Galli, A.; Huhtaniemi, I.;

Laws, S.; Lazzari, G.; Liminga, U.; Smitz, J.; Spano, M.; Themmen, A.; Tilloy, A.;

Waalkens-Behrends, I. (2005a)

The effects of chemicals on mammalian fertility. The report and recommendations of ECVAM Workshop 53 - the first strategic workshop of the EU ReProTect Project ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 33, 391-416

Bremer, S.; Cortvrindt, R.; Daston, G.; Eletti, B.; Mantovani, A.; Maranghi, F.;

Pelkonen, O.; Ruhdel, I.; Spielmann, H. (2005b) Reproductive and developmental toxicity

ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 33 Suppl 1, 183-209

Caloni, F.; Ranzenigo, G.; Cremonesi, F.; Spicer, L.J. (2009)

Effects of a trichothecene, T-2 toxin, on proliferation and steroid production by porcine granulosa cells

Toxicon, 54, 337-344

Chapin, R.E.; Phelps, J. (1990)

Recent advances in testicular cell culture: Implications for toxicology Toxicology In Vitro, 4, 543-559

Cheng, J.; Fu, J.; Zhou, Z. (2005)

The mechanism of manganese-induced inhibition of steroidogenesis in rat primary Leydig cells

Toxicology, 211, 1-11

Combes, R. (2007)

Reproductive toxicity testing under the REACH system--time for a paradigm shift ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 35, 1-4

Cordelli, E.; Fresegna, A.M.; D'Alessio, A.; Eleuteri, P.; Spano, M.; Pacchierotti, F.;

Villani, P. (2007)

ReProComet: a new in vitro method to assess DNA damage in mammalian sperm Toxicological Sciences, 99, 545-552

Cortvrindt, R.G.; Smitz, J.E. (2002)

Follicle culture in reproductive toxicology: a tool for in-vitro testing of ovarian function?

(25)

Human Reproduction Update, 8, 243-254

Danner, S.; Kirchhoff, C.; Ivell, R. (2009)

Seminiferous tubule transfection in vitro to define post-meiotic gene regulation Reproductive Biology and Endocrinology, 7, 67

Desmeules, P.; Devine, P.J. (2006)

Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries

Toxicological Sciences, 90, 500-509

Devine, P.J.; Rajapaksa, K.S.; Hoyer, P.B. (2002a) In vitro ovarian tissue and organ culture: a review Frontiers in Bioscience, 7, d1979-1989

Devine, P.J.; Sipes, I.G.; Skinner, M.K.; Hoyer, P.B. (2002b)

Characterization of a rat in vitro ovarian culture system to study the ovarian toxicant 4-vinylcyclohexene diepoxide

Toxicology and Applied Pharmacology, 184, 107-115

EC, European Commission (2006)

Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC

OJ L 396, 30.12.2006

Evenson, D.P.; Kasperson, K.; Wixon, R.L. (2007)

Analysis of sperm DNA fragmentation using flow cytometry and other techniques Society of Reproduction and Fertility Supplement, 65, 93-113

Evenson, D.P.; Melamed, M.R. (1983)

Rapid analysis of normal and abnormal cell types in human semen and testis biopsies by flow cytometry

Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 31, 248-253

(26)

Evenson, D.P.; Wixon, R. (2005)

Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)

Feng, Y.; Fang, X.; Shi, Z.; Xu, M.; Dai, J. (2010)

Effects of PFNA exposure on expression of junction-associated molecules and secretory function in rat Sertoli cells

Fiorini, C.; Gilleron, J.; Carette, D.; Valette, A.; Tilloy, A.; Chevalier, S.; Segretain, D.;

Pointis, G. (2008)

Accelerated internalization of junctional membrane proteins (connexin 43, N-cadherin and ZO-1) within endocytic vacuoles: an early event of DDT carcinogenicity

Biochimica et Biophysica Acta, 1778, 56-67

Geoffroy-Siraudin, C.; Perrard, M.-H.; Chaspoul, F.; Lanteaume, A.; Gallice, P.;

Durand, P.; Guichaoua, M.-R. (2010)

Validation of a rat seminiferous tubule culture model as a suitable system for studying toxicant impact on meiosis effect of hexavalent chromium

Gohbara, A.; Katagiri, K.; Sato, T.; Kubota, Y.; Kagechika, H.; Araki, Y.; Ogawa, T.

(2010)

In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system Biology of Reproduction, 83, 261-267

Gong, Y.; Han, X.D. (2006)

Nonylphenol-induced oxidative stress and cytotoxicity in testicular Sertoli cells Reproductive Toxicology, 22, 623-630

Gong, Y.; Wu, J.; Huang, Y.; Shen, S.; Han, X. (2009)

Nonylphenol induces apoptosis in rat testicular Sertoli cells via endoplasmic reticulum stress

Toxicology Letters, 186, 84-95

González, R.; Ruiz-León, Y.; Gomendio, M.; Roldan, E.R. (2010)

(27)

The effect of glucocorticoids on mouse oocyte in vitro maturation and subsequent fertilization and embryo development

Toxicology In Vitro, 24, 108-115

Gregoraszczuk, E.L.; Milczarek, K.; Wójtowicz, A.K.; Berg, V.; Skaare, J.U.; Ropstad, E. (2008a)

Steroid secretion following exposure of ovarian follicular cells to three different natural mixtures of persistent organic pollutants (POPs)

Gregoraszczuk, E.L.; Ptak, A.; Karniewska, M.; Ropstad, E. (2008b)

Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co- culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis

Gregoraszczuk, E.L.; Ptak, A.; Skaare, J.U.; Mularz, K.; Chmielowiec, A.; Wojtowicz, A.; Ropstad, E. (2009)

Mechanisms of action of two different natural mixtures of persistent organic pollutants (POPs) in ovarian follicles

Xenobiotica, 39, 80-89

Grindon, C.; Combes, R.; Cronin, M.T.; Roberts, D.W.; Garrod, J.F. (2008a)

Integrated decision-tree testing strategies for developmental and reproductive toxicity with respect to the requirements of the EU REACH legislation

ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 36, 65-80

Grindon, C.; Combes, R.; Cronin, M.T.; Roberts, D.W.; Garrod, J.F. (2008b)

Integrated decision-tree testing strategies for developmental and reproductive toxicity with respect to the requirements of the EU REACH legislation

ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 36 Suppl 1, 123-138

Hallmark, N.; Walker, M.; McKinnell, C.; Mahood, I.K.; Scott, H.; Bayne, R.; Coutts, S.; Anderson, R.A.; Greig, I.; Morris, K.; Sharpe, R.M. (2007)

Effects of monobutyl- and di (n-butyl)-phthalate in vitro on steroidogenesis and Leydig cell aggregation in fetal testis explants from the rat: comparison with effects in vivo in the fetal rat and neonatal marmoset and in vitro in the human

Environmental Health Perspectives, 115, 390-396

(28)

Hareng, L.; Pellizzer, C.; Bremer, S.; Schwarz, M.; Hartung, T. (2005)

The integrated project ReProTect: a novel approach in reproductive toxicity hazard assessment

Harvey, C.N.; Esmail, M.; Wang, Q.; Brooks, A.I.; Zachow, R.; Uzumcu, M. (2009) Effect of the methoxychlor metabolite HPTE on the rat ovarian granulosa cell transcriptome in vitro

Hendricks, K.E.; Penfold, L.M.; Evenson, D.P.; Kaproth, M.T.; Hansen, P.J. (2010) Effects of airport screening X-irradiation on bovine sperm chromatin integrity and embryo development

Theriogenology, 73, 267-272

Igawa, Y.; Keating, A.F.; Rajapaksa, K.S.; Sipes, I.G.; Hoyer, P.B. (2009)

Evaluation of ovotoxicity induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene and its 3,4-diol metabolite utilizing a rat in vitro ovarian culture system

Keating, A.F.; Sipes, I.G.; Hoyer, P.B. (2008)

Expression of ovarian microsomal epoxide hydrolase and glutathione S-transferase during onset of VCD-induced ovotoxicity in B6C3F(1) mice

Kolesarova, A.; Roychoudhury, S.; Slivkova, J.; Sirotkin, A.; Capcarova, M.;

Massanyi, P. (2010)

In vitro study on the effects of lead and mercury on porcine ovarian granulosa cells Journal of Environmental Science and Health, Part A, 45, 320-331

Ku, W.W.; Chapin, R.E. (1994)

Spermatocyte toxicity of 2-methoxyethanol in vivo and in vitro: Requirement for an intact seminiferous tubule structure for germ cell degeneration

Lazzari, G.; Tessaro, I.; Crotti, G.; Galli, C.; Hoffmann, S.; Bremer, S.; Pellizzer, C.

(2008)

(29)

Development of an in vitro test battery for assessing chemical effects on bovine germ cells under the ReProTect umbrella

Lenie, S.; Smitz, J. (2009)

Steroidogenesis-disrupting compounds can be effectively studied for major fertility- related endpoints using in vitro cultured mouse follicles

Li, D.; Liu, Q.; Gong, Y.; Huang, Y.; Han, X. (2009)

Cytotoxicity and oxidative stress study in cultured rat Sertoli cells with methyl tert- butyl ether (MTBE) exposure

Li, Y.; Oral, O.; Abe, K.; Eto, K.; Abe, S. (2008)

The roles of pericystic cells and Sertoli cells in spermatogonial proliferation stimulated by some growth factors in organ culture of newt (Cynops pyrrhogaster) testis

General and Comparative Endocrinology, 159, 80-87

Livera, G.; Delbes, G.; Pairault, C.; Rouiller-Fabre, V.; Habert, R. (2006)

Organotypic culture, a powerful model for studying rat and mouse fetal testis development

Cell and Tissue Research, 324, 507-521

Luciano, A.M.; Franciosi, F.; Lodde, V.; Corbani, D.; Lazzari, G.; Crotti, G.; Galli, C.;

Pellizzer, C.; Bremer, S.; Weimer, M.; Modina, S.C. (2010)

Transferability and inter-laboratory variability assessment of the in vitro bovine oocyte maturation (IVM) test within ReProTect

Minervini, F.; Lacalandra, G.M.; Filannino, A.; Garbetta, A.; Nicassio, M.; Dell'aquila, M.E.; Visconti, A. (2010)

Toxic effects induced by mycotoxin fumonisin B(1) on equine spermatozoa:

assessment of viability, sperm chromatin structure stability, ROS production and motility

Mlynarczuk, J.; Wrobel, M.H.; Kotwica, J. (2009)

(30)

The influence of polychlorinated biphenyls (PCBs), dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its metabolite-dichlorodiphenyldichloroethylene (DDE) on mRNA expression for NP-I/OT and PGA, involved in oxytocin synthesis in bovine granulosa and luteal cells

Moore, N.; Bremer, S.; Carmichael, N.; Daston, G.; Dent, M.; Gaoua-Chapelle, W.;

Hallmark, N.; Hartung, T.; Holzum, B.; Hübel, U.; Meisters, M.-L.; Schneider, S.; van Ravenzwaay, B.; Hennes, C. (2009)

A modular approach to the extended one-generation reproduction toxicity study. The outcome of an ECETOC Task Force and International ECETOC/ECVAM Workshop ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 37, 219-225

Murugesan, P.; Muthusamy, T.; Balasubramanian, K.; Arunakaran, J. (2008)

Polychlorinated biphenyl (Aroclor 1254) inhibits testosterone biosynthesis and antioxidant enzymes in cultured rat Leydig cells

Nishida, M.; Kasahara, K.; Kaneko, M.; Iwasaki, H.; Hayashi, K. (1985)

[Establishment of a new human endometrial adenocarcinoma cell line, Ishikawa cells, containing estrogen and progesterone receptors]

Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. Acta Obstetrica et Gynaecologica Japonica, 37, 1103-1111

Rengarajan, S.; Balasubramanian, K. (2007)

Corticosterone has direct inhibitory effect on the expression of peptide hormone receptors, 11-HSD and glucose oxidation in cultured adult rat Leydig cells

Molecular and Cellular Endocrinology, 279, 52-62

Rignell-Hydbom, A.; Rylander, L.; Giwercman, A.; Jönsson, B.A.; Lindh, C.; Eleuteri, P.; Rescia, M.; Leter, G.; Cordelli, E.; Spano, M.; Hagmar, L. (2005)

Exposure to PCBs andp,p'-DDE and human sperm chromatin integrity Environmental Health Perspectives, 113, 175-179

SCCS, Scientific Committee on Consumer Safety (2009)

Memorandum on "Alternative Test Methods in Human Health Safety Assessment of Cosmetic Ingredients in the European Union". SCCS/1294/10

http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety/docs/sccs_s_001.p df

(31)

European Commission, Directorate-General for Health & Consumers

Schaefer, W.R.; Fischer, L.; Deppert, W.R.; Hanjalic-Beck, A.; Seebacher, L.;

Weimer, M.; Zahradnik, H.P. (2010)

In vitro-Ishikawa cell test for assessing tissue-specific chemical effects on human endometrium

Schenk, B.; Weimer, M.; Bremer, S.; van der Burg, B.; Cortvrindt, R.; Freyberger, A.;

Lazzari, G.; Pellizzer, C.; Piersma, A.; Schafer, W.R.; Seiler, A.; Witters, H.; Schwarz, M. (2010)

The ReProTect Feasibility Study, a novel comprehensive in vitro approach to detect reproductive toxicants

Scialli, A.R. (2008)

The challenge of reproductive and developmental toxicology under REACH Regulatory Toxicology and Pharmacology, 51, 244-250

Shi, Z.; Feng, Y.; Wang, J.; Zhang, H.; Ding, L.; Dai, J. (2010)

Perfluorododecanoic acid-induced steroidogenic inhibition is associated with steroidogenic acute regulatory protein and reactive oxygen species in cAMP- stimulated Leydig cells

Sivakumar, R.; Sivaraman, P.B.; Mohan-Babu, N.; Jainul-Abideen, I.M.; Kalliyappan, P.; Balasubramanian, K. (2006)

Radiation exposure impairs luteinizing hormone signal transduction and steroidogenesis in cultured human leydig cells

Spielmann, H. (2009)

The way forward in reproductive/developmental toxicity testing ATLA, Alternatives to Laboratory Animals, 37, 641-656

Stelzer, R.; Hutz, R.J. (2009)

Gold nanoparticles enter rat ovarian granulosa cells and subcellular organelles, and alter in-vitro estrogen accumulation

(32)

Journal of Reproduction and Development, 55, 685-690

Sun, F.; Betzendahl, I.; Shen, Y.; Cortvrindt, R.; Smitz, J.; Eichenlaub-Ritter, U.

(2004)

Prenatal follicle culture as a novel in vitro assay in reproductive toxicology testing in mammalian oocytes

Mutagenesis, 19, 13-25

Sun, F.; Betzendahl, I.; Van Wemmel, K.; Cortvrindt, R.; Smitz, J.; Pacchierotti, F.;

Eichenlaub-Ritter, U. (2008)

Trichlorfon-induced polyploidy and nondisjunction in mouse oocytes from preantral follicle culture

Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 651, 114- 124

Svechnikov, K.; Svechnikova, I.; Söder, O. (2008)

Inhibitory effects of mono-ethylhexyl phthalate on steroidogenesis in immature and adult rat Leydig cells in vitro

Talbot, P. (2008)

In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents Birth Defects Research. Part C: Embryo Today, Reviews, 84, 61-72

Tiemann, U.; Schneider, F.; Vanselow, J.; Tomek, W. (2007)

In vitro exposure of porcine granulosa cells to the phytoestrogens genistein and daidzein: effects on the biosynthesis of reproductive steroid hormones

Tiemann, U.; Tomek, W.; Schneider, F.; Müller, M.; Pöhland, R.; Vanselow, J. (2009) The mycotoxins alternariol and alternariol methyl ether negatively affect progesterone synthesis in porcine granulosa cells in vitro

Tsakmakidis, I.A.; Lymberopoulos, A.G.; Khalifa, T.A.; Boscos, C.M.; Saratsi, A.;

Alexopoulos, C. (2008)

Evaluation of zearalenone and alpha-zearalenol toxicity on boar sperm DNA integrity Journal of Applied Toxicology, 28, 681-688

(33)

Tuttle, A.M.; Stämpfli, M.; Foster, W.G. (2009)

Cigarette smoke causes follicle loss in mice ovaries at concentrations representative of human exposure

Human Reproduction, 24, 1452-1459

Uguz, C.; Varisli, O.; Agca, C.; Agca, Y. (2009)

Effects of nonylphenol on motility and subcellular elements of epididymal rat sperm Reproductive Toxicology, 28, 542-549

Van Merris, V.; Van Wemmel, K.; Cortvrindt, R. (2007)

In vitro effects of dexamethasone on mouse ovarian function and pre-implantation embryo development

Van Wemmel, K.; Gobbers, E.; Eichenlaub-Ritter, U.; Smitz, J.; Cortvrindt, R. (2005) Ovarian follicle bioassay reveals adverse effects of diazepam exposure upon follicle development and oocyte quality

Villani, P.; Eleuteri, P.; Grollino, M.G.; Rescia, M.; Altavista, P.; Spano, M.;

Pacchierotti, F.; Cordelli, E. (2010a)

Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species

Reproduction, 140, 445-452

Villani, P.; Spanò, M.; Pacchierotti, F.; Weimer, M.; Cordelli, E. (2010b)

Evaluation of a modified comet assay to detect DNA damage in mammalian sperm exposed in vitro to different mutagenic compounds

WHO, World Health Organization (2001)

Environmental Health Criteria 225, Principles for Evaluating Health Risks to Reproduction Associated with Exposure to Chemicals

IPCS International Programme on Chemical Safety; World Health Organization Geneva

Wrobel, M.; Mlynarczuk, J.; Kotwica, J. (2009)

(34)

The adverse effect of dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its metabolite (DDE) on the secretion of prostaglandins and oxytocin in bovine cultured ovarian and endometrial cells

Yang, S.; Han, X.; Wei, C.; Chen, J.; Yin, D. (2005)

The toxic effects of pentachlorophenol on rat Sertoli cells in vitro Environmental Toxicology and Pharmacology, 20, 182-187

Young, F.M.; Micklem, J.; Humpage, A.R. (2008)

Effects of blue-green algal toxin cylindrospermopsin (CYN) on human granulosa cells in vitro

Zachow, R.; Uzumcu, M. (2006)

The methoxychlor metabolite, 2,2-bis-(p-hydroxyphenyl)-1,1,1-trichloroethane, inhibits steroidogenesis in rat ovarian granulosa cells in vitro

Zubkova, E.V.; Robaire, B. (2006)

Effects of ageing on spermatozoal chromatin and its sensitivity to in vivo and in vitro oxidative challenge in the Brown Norway rat

Human Reproduction, 21, 2901-2910