Skriptum zu den Mikrobiologisch-
Systematischen Übungen
Beginn der Übungen: 8.30 Uhr im Praktikumsraum 6.Stock
1. ALLGEMEINER TEIL
1.1 SICHERHEITSBESTIMMUNGEN IM LABOR
Mit mikrobiologischer Laborarbeit ist zwangsläufig das Risiko der Laborinfektion und von physikalischen bzw. chemischen Unfällen gegeben. Die häufigsten Ursachen von Laborinfektionen sind Einatmung infektiöser Aerosole, orale Aufnahme von Erregern, Kontakt mit Keimen direkt über die Haut, Bindehaut oder Schleimhäute sowie Verletzungen. Mikroorganismen werden laut Schema der Weltgesundheitsorganisation in 4 Risikogruppen eingeteilt (I-IV). In der Risikogruppe I sind für gesunde Menschen apathogene Keime zusammengefaßt. Isoliertes, unbekanntes Material kann in der Regel keiner Risikogruppe zugerechnet werden und muß als potentiell pathogen betrachtet werden.
Auch Pilze sind mit sauberster mikrobiologischer Technik zu behandeln, da sie vielfach Unmengen an Sporen produzieren.
Beispiele von Erregern von Mycosen beim Menschen:
Erreger oberflächlicher Mycosen: Alternaria, Scopulariopsis, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Hefen
Erreger tiefer Mycosen der Haut und subcutaner Mycosen: Alternaria, Mucor, Bipolaris, Basidiobolus...
Erreger von systemischen Mycosen und Organmycosen: Bipolaris, Cladosporium, Curvularia, Phialophora, Aspergillus, Penicillium, Geotrichum, Mucor, Absidia u.a.
Zygomyceten.
1.2 KLEINES GLOSSAR ZU DEN KURSMIKROSKOPEN
Akkomodationstrieb: Grob- und Feintrieb zur Einstellung eines scharfen Bildes durch Veränderung der Höhe des Objekttisches. Die Position des Objekttisches ist für das 10er, 40er und 100er Objektiv ähnlich, sodaß nur mehr mit dem Feintrieb scharfgestellt werden muß.
Mit der Aperturblende wird der Kontrast und die Tiefenschärfe des Bildes eingestellt.
Die Auflösung ist der kleinste Abstand zweier getrennter Punkte, die bei der jeweiligen Vergrößerung auch im Mikroskop noch als solche zu sehen sind.
Binokulartubus zum zweiäugigen Betrachten des mikroskopischen Bildes. Der Augenabstand kann durch einfaches Verschieben eingestellt werden.
Dunkelfeld: Bei Präparaten, die nicht angefärbt werden können oder bei sehr kleinen Objekten ist es oft günstig, wenn diese seitlich angestrahlt werden. Der Hintergrund bleibt dunkel und die Objektkanten leuchten auf dunklem Hintergrund.
Hellfeld: Das vom Kondensor kommende Licht durchstrahlt das Präparat, man erkennt das Objekt auf hellem Hintergrund.
Kondensor: Hier wird das Licht gesammelt, um das Objekt gleichmäßig auszuleuchten.
Kreuztische werden mittels zweier Schrauben am Objekttisch befestigt und ermöglichen präzise Bewegungen des Präparates.
Meßokulare sind Okulare mit einer Skalierung welche nach einer Eichung in µm umgerechnet werden kann. Bei den Kursmikroskopen entspricht ein Teilstrich bei 1000 facher Vergrößerung (Ölimmersion) 1,4 µm.
Die Numerische Apertur wird aus der Öffnung des Objektivs und aus dem Brechungsindex des Mediums, welches sich zwischen dem Objekt und der Frontlinse befindet, berechnet. Sie ist ein Maß für das Auflösungsvermögen des Objektivs. Je höher die Numerische Apertur, umso höher ist die Auflösung des Objektivs.
Objektive: Die Vergrößerung und die numerische Apertur stehen am Objektiv. Weiters sind noch folgende Daten auf den Objektiven vorhanden: 160/- oder 160/0,17. Die Zahl 160 steht für die mechanische Tubuslänge (mm), für welche das Objektiv gerechnet wurde. Das Zeichen /- sagt aus, daß mit diesem Tubus sowohl Präparate mit, als auch solche ohne Deckglas verwendet werden
Okular: Die Vergrößerung ist angeschrieben. Hinter dem Vergrößerungswert des Okulars steht noch die Zahl 18. Sie gibt den Durchmesser der Sehfeldblende in mm an und heißt Sehfeldzahl. Mit ihr wird der Durchmesser des im Mikroskop überschaubaren Objektfeldes errechnet (Durchmesser des überschaubaren Objektfeldes in mm=Sehfeldzahl durch Vergrößerung des Objektivs)
Phasenkontrast: Bei diesem Verfahren wird durch Einschieben einer Ringblende in den Hellfeldkondensor eine ringförmige Beleuchtung erzeugt. Dieser Lichtring deckt sich bei richtiger Kondensoreinstellung exakt mit einem im Objektiv befindlichen Phasenring. Durch Interferenzen von Lichtstrahlen, die vom Objekt kommen und denen, die durch den Phasenring beeinflußt werden, entstehen hellfeldähnliche Abbildungen, wobei die dunkleren Objektstrukturen auf hellem Grund sichtbar werden. Für Phasenkontrastuntersuchungen können nur Objektive mit zusätzlicher Aufschrift
"Phaco" verwendet werden.
Reinigung mit 50% Ethanol nach jedem Gebrauch. Um die Leistung des Mikroskopes optimal ausnutzen zu können, ist es nicht nur wichtig, daß es adjustiert ist, sondern auch, daß es sauber gehalten wird. Besonders die Ölimmersionsobjektive sollten gründlich gereinigt werden.
Vergrößerung berechnet man aus der Vergrößerung des Okulars multipiziert mit der Vergrößerung der Objektive.
Objektiv/ Okular/ Gesamt- Objektfeld- Auflösung Arbeits-
Num. Apertur Sehfeldzahl vergrößerung durchmesser (mm) (µm) abstand (mm)
3,2/0,07 10x/18 32:1 5,62 3,93 39,4
10/0,25 10x/18 100:1 1,8 1,1 5,6
40/0,6 10x/18 400:1 0,45 0,43 0,42
100/1,25 10x/18 1000:1 0,18 0,25 0,09
Nun viel Spaß mit den Bildern der großen kleinen Welt!
2. BAKTERIEN
2.1 METHODEN ZUR HERSTELLUNG MIKROSKOPISCHER PRÄPARATE
2.1.1 VITALPRÄPARAT
Zur Herstellung eines Vitalpräparates wird ein Tropfen physiologische Kochsalzlösung (oder auch nur Wasser) auf einen Objektträger aufgebracht und darin eine Nadelspitze der Organismen verrührt.
Das Präparat kann sofort unter Verwendung eines Deckglases im Mikroskop betrachtet werden.
Form, Farbe und Größe der Organismen können in einem guten Mikroskop (auch Phasenkontrast verwenden) auch ohne Färbung beurteilt werden. Bakteriensporen können aufgrund ihrer starken Lichtbrechung erkannt werden.
Vitalpräparate haben den Vorteil, daß Organismen noch lebend beobachtet werden können. Dabei werden Artefakte, die durch die Fixierung entstehen können, vermieden und eine deutliche Motilität von Bakterien kann direkt festgestellt werden. Man muß allerdings darauf achten, Motilität nicht mit Brown'scher Molekularbewegung oder Konvektionsströmen zu verwechseln, welche aufgrund der Erwärmung auftreten können. Der Nachteil des Vitalpräparates ist, daß die Präparate kontrastärmer sind und die Bakterien im Vitalpräparat oft schon nach einigen Minuten ihre Motilität verlieren.
2.1.2 AUSSTRICH VON BAKTERIEN
Grundlage für gelungene Bakterienausstriche sind fettfreie Objektträger. Die Reinigung kann erfolgen mit
-heißer Chromschwefelsäure oder -Aceton/Seife/heißem Wasser/Aceton
Sehr nützlich ist auch ein kurzes Abflammen des Objektträgers.
Die Bakterien werden am Rande des Objektträgers in einem Tropfen Wasser oder Färbemittel (Methylenblau, Karbolfuchsin) verrührt. Das Deckglas soll möglichst gleichmäßig über den Objektträger geschoben werden. Erst nach dem Lufttrocknen hitzefixieren, indem man 3 mal kurz durch die Flamme fährt.
Da die Hitzefixierung die Bakterienstruktur verändern kann, wird bei empfindlichen Untersuchungsobjekten die Alkoholfixation angewendet: dabei wird das Präparat 3-5 Min. mit
2.1.3. FÄRBEVERFAHREN
Zur Bakterienfärbung werden wäßrig alkoholische Lösungen verwendet, die in der Hauptsache aus basischen Anilinfarbstoffen hergestellt werden. Methylenblau, Fuchsin, Gentianaviolett, Kristallviolett, Methylviolett. Saure Anilinfarbstoffe wie Eosin werden öfters zur Kontrastfärbung (z.B. von Geweben) benutzt. Außer Methylenblau vertragen alle hergestellten Farbstoffe selbst stärkeres Erhitzen.
Herstellen der Stammlösungen in der Praxis: Bei Farben wie Gentianaviolett, Fuchsin, Safranin, Bismarck-Braun 10-15g, bei Methylenblau 6-8g zu 100 ml Ethanol zusetzen. Gemische am Herstellungstag mehrmals kräftig schütteln, 3 Tage stehen lassen. Es soll ein Sediment von ungelöstem Farbstoff übrig bleiben. Die überstehende gesättigte Lösung wird filtriert und möglichst in lichtundurchlässige Flaschen abgefüllt.
Einfache Färbungen von Bakterien
Für morphologische Untersuchungen eignen sich am besten einfache Färbungen mit Methylenblau oder Karbolfuchsin. Beide Farbstoffe färben lufttrockene und fixierte Präparate. Die einfachen Färbelösungen werden bei Gebrauch aus 10 ml Stammlösung und 90 ml Aqua dest. (Gemisch filtrieren) hergestellt.
GRAM-Färbung
Die Gram Färbung wurde 1883 von Christian Gram entdeckt und ist eine wichtige und unumgängliche Methode bezüglich der Differenzierung und Identifizierung isolierter Bakterienstämme.
Diese Differentialfärbung ermöglicht eine Aufteilung der Bakterien in die Gruppen der
"grampositiven" und "gramnegativen" Bakterien. Die Farbreaktion ist mit dem Aufbau der Zellwand und weiteren Eigenschaften eng korreliert; daher kommt ihr eine wesentliche taxonomische Bedeutung zu.
Bei Färbung mit Kristallviolett und Beizung mit Lugol'scher Lösung entsteht in der Zelle ein Farb-Jod Komplex. Bakterien mit dicker Mureinschicht in der Zellwand halten die eingebeizte Kristallviolettlösung fest, sie erscheinen grauviolett (grampositiv). Keime mit dünner Peptidoglukanschicht verlieren unter dem Einfluß des Entfärbers den blauen Farbstoff und erscheinen deshalb nach Gegenfärbung mit Safranin rot (gramnegativ).
Durchführung:
1. Ausstrich einer Bakteriensuspension auf einem fettfreien Objektträger 2. Lufttrocknen
3. Hitzefixieren
4. Mit Kristallviolett überschichtet, nach 1 min mit A.d. spülen 5. Mit stabilisierter Jodlösung 1 min überschichten, mit A.d. spülen
6. Den entstandenen Farbstoff-Jod Komplex vorsichtig mit Entfärber (Aceton/Ethanol) entfärben und mit A.d. spülen.
7. Anschließend mit Safranin 1 min gegenfärben, mit A.d. spülen und lufttrocknen.
Gram negative Organismen sind rot, gram positive blau. Mischpräparate (Jauche) zeigen den Unterschied oft eindrücklicher. Präparate sollten von Kulturen stammen die nicht älter als 24 h sind (log.-Phase). Einige Bakterienarten sind gramvariabel und zeigen nur im ersten Wachstumsstadium eine positive Reaktion. Ideal sind Flüssigkulturen.
KOH-Test
Nach der Untersuchung von Gegersen liefert die Auflösung von Zellwand und zytoplasmatischer Membran von Bakterien durch 3%-iger KOH einen zuverlässigen Hinweis auf das Vorliegen gramnegativer Organismen. Diese bilden dabei mit dem Reagens eine zähflüssige, fadenbildende Masse.
Durchführung:
Reichlich Bakterienmasse von nicht selektiven Festnährböden wird mit einem Tropfen 3%iger KOH auf einem Objektträger verrieben. Nach 15 Sek. kann im Falle von gramnegativen Bakterien die Bildung eines Fadens beobachtet werden, wenn man die Impföse um einige Zentimeter vom Tropfen abhebt.
Beachte:
Es muß hinreichend Bakterienmasse von max 24h alten Kulturen verwendet werden.
Bei Moraxella- und Acinetobacter-Stämmen sowie gramnegativen sporenlosen Anaerobiern kommen falsch negative Reaktionen vor. Campylobacter-Arten reagieren falsch-positiv.
Zur Kontrolle sollte je ein gram-positiver und ein gram-negativer Stamm mitgeprüft werden.
Färbung von Bakteriensporen:
Bakteriensporen sind mit etwas Übung im ungefärbten Präparat, insbesondere im hängenden Tropfen an ihrer starken Lichtbrechung zu erkennen (besonders deutlich im Phasenkontrast). Bei einfacher Färbung bleiben sie ungefärbt mit schmalem, farbigem Saum. Sporen lassen sich durch verstärkte Färbung und Gegenfärbung isoliert darstellen.
Sporenfärbung nach Rakette
Hitzefixierte Präparate werden mit heißer 5% iger wäßriger Malachitgrünlösung einige Minuten überschichtet, mit A.d. vorsichtig gewaschen und mit 3%iger wäßriger Safraninlösung 2 min. gegengefärbt. Nach erneutem Spülen mit A.d. und Lufttrocknen erscheinen die Sporen grün, Plasma und Zellwand der Sporenmutterzelle rosa bis rosarot.
Die Endosporen und ihre Lage sind ein wichtiges taxonomisches Merkmal. Beim Vorkommen von Endosporen sind folgende Details zu beachten:
- Form: elliptisch (1, 2, 3) oder rund (4)
- Topologie (terminale (1, 4), zentrale (2) oder laterale (3) Lage - Anschwellungen der Sporenmutterzelle; "Tennisschlägerform" (4)
Darstellung von Bakterienkapseln und Schleimen
Viele Bakterien bilden besonders wenn sie auf zuckerhaltigen Nährböden kultiviert werden, Schleimhüllen und Schleimkapseln um die Zellen aus. Kapselsubstanzen (Polysaccharide und Polypeptide) haben eine geringere Affinität zu Farben als das somatische Material und bleiben daher bei üblichen Färbungen ungefärbt. Bei geeigneter Technik sind sie als weitgehend ungefärbte Höfe um die angefärbten Bakterien zu erkennen.
Negativfärbung im Tuscheausstich
Auf einem Objektträger wird eine Öse voll Bakterien in einem Tropfen Tusche verrieben und mit einem Deckglas ausgestrichen. Anschließend wird mit Methylenblau oder Safranin überschichtet und nach dem Lufttrocknen ohne Deckglas mikroskopiert.
Abb. 2.3: Tuscheausstrich
Darstellung von Bakteriengeißeln
Geißeln von Bakterien sind so dünn, daß sie bei der Hellfeldmikroskopie erst nach entsprechender Dickenvergrößerung sichtbar gemacht werden können. Dazu wird ein geeignetes frisches Beizmittel an sie präzipitiert und anschließend gefärbt. Voraussetzung für eine einwandfreie Geißelfärbung sind vollkommen fettfreie Objektträger. Die Art der Begeißelung ist ein taxonomisch wichtiges Merkmal;
Da Geißelfärbungen aufwendig sind und einige Übung erfordern, wobei giftige Reagenzien verwendet werden müssen, werden sie im Praktikum nicht mehr durchgeführt. Eine Elektronenmikroskopische Aufnahme kann die Geißeln deutlich sichtbar machen.
Fluoreszenzfärbung mit Acridinorange
Acridinorange bindet an Nukleinsäuren. Diese Färbung eignet sich vor allem zur Färbung von Zellkernen. In vielen Fällen ist eine Unterscheiung von lebenden und toten Organismen möglich.
Dabei fluoreszieren lebendige Strukturen grün, absterbende oder tote verfärben sich orangerot ( Achtung, es gibt Ausnahmen!). Bei "Vitalpräparaten" motiler Bakterien kann die Verfärbung gemeinsam mit dem Aufhören der Motilität beobachtet werden.
2.2 METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN
2.2.1 ALLGEMEINE ANMERKUNGEN
Für eine seriöse Arbeit in allen Teilgebieten der Mikrobiologie ist es wichtig, die Organismen, mit denen man arbeitet, zu kennen. Dazu ist es notwendig, Mikroorganismen unterscheiden und identifizieren zu können. Durch die Feststellung von bestimmten Merkmalen können zunächst unbekannte Keime auf der Grundlage von Gleichartigkeit oder Ähnlichkeit bestimmten, bereits definierten Kategorien (Taxa) zugeordnet werden. Die Charakterisierung erfolgt aufgrund von
-morphologischen Merkmalen (Größe, Form, Anordnung der Zellen, Besonderheiten der Innen-und Außenstruktur)
-kulturell-biochemischen Merkmalen (Lebens- uns Wachstumsbedingungen, Stoffwechselprozesse und biochemische Leistungen)
-der chemischen Zusammensetzung der Zellbestandteile, und deren Immunologischer Wirkung
-Genetischen Merkmalen (G/C Gehalt, DNA-Verwandschaften, Genomgröße).
VORGEHENSWEISE ZUR IDENTIFIKATION VON BAKTERIEN
1. Isolierung und Kultivierung aus Quellen bekannter Herkunft und Bedingungen.
2. Das Vorliegen einer Reinkultur ist die wichtigste Voraussetzung für die Identifizierung von Mikroorganismen und vor und im Zweifelsfalle auch nach der Untersuchung zu überprüfen.
3. Beurteilung der Kulturmerkmale (Koloniegröße- Farbe- Pigmente)
4. Die mikroskopische Beurteilung erlaubt aufgrund folgender Kriterien eine erste Einteilung des Isolates in die Großgruppen: Form, Farbe, Größe, Motilität, Endosporenbildung Spirillen haben z.B.
2.2.2. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG
Die Isolierung von Mikroorganismen erfolgt je nach Fragestellung auf für die zu untersuchende Organismengruppe geeigneten Vollnährmedien bzw. Selektivnährboden. Diese können je nach Anforderungen selber hergestellt werden, oder sind (vor allem im klinischen Bereich) bereits fertig erhältlich (z.B.Urotube).
Urotube Roche
Das im Handel erhältliche System besteht aus einer Tauchplatte, auf der 3 verschiedene Agarsorten aufgebracht sind. Es dient zur Isolierung von Bakterien aus dem Urin und zur Keimzahlbestimmung.
Das System kann bei kritischer Anwendung auch für andere Zwecke entfremdet werden.
Nach dem Beimpfen durch Eintauchen in die zu untersuchende Lösung wird bei 37°C für 24 h bebrütet. Lösungen, von denen eine sehr hohe Keimzahl erwartet wird, sollten verdünnt werden.
Agar 1) CLED: Cystin-Lactose-Elektrolyt deficient- Agar (grünes Medium)
Ermöglicht die Bestimmung der im Urin vorhandenen Gesamtkeimzahl. Der niedrige Gehalt an Elektrolyten erlaubt keine Beweglichkeit bzw. Schwärmen von Proteus.
Entsteht ein grün-blauer Hof so handelt es sich um Lactose-negative Organismen(
viele pathogene Keime): Bei einem gelben Hof handelt es sich um Lactose-positive Bakterien.
Das Aussehen der Kulturen kann als Orientierungshilfe dienen.
E.coli: Gelbe Kolonie, undurchsichtig, mit etw. dunklerem Zentrum Klebsiella: Gelbe oder bläuliche Kononien mit stark schleimigem Aussehen . Pseudomonas: Grüne Kolonie mit typisch matter Oberfläche und unregelmäßigen Konturen.
Salmonella: Blaue Kolonien Streptococcus faecalis: kleine gelbe Kolonien von ca 0,5 mm Durchmesser Staphylococcus aureus: dunkelgelbe Kolonie mit einheitlicher Färbung
Agar 2) Mac Conkey Agar (Gallensalze und Kristallviolett hemmen das Wachstum von gram+ Organismen): Das Medium dient zur Isolierung und Identifizierung von Enterobacteriaceae und zur Keimzahlbestimmung. Wachstum von zu 90 % nur Gram-negativen Bakterien. Dabei bilden Lactose-positive einen roten Hof.
Agar 3) Pseudomonaden Spezial Agar.
Cetrimed Agar: Pseudomonaden Selektivagar
Auswertung:
Bei unverdünnten Lösungen entspricht eine Kolonie 100 Bakterien/ml. Bei einer Keimzahl von unter 104 Bakterien/ml liegt eine Kontamination vor, ihr wird jedoch meist keine pathologische Bedeutung zugemessen. Eine Keimzahl von über 105 deutet auf eine Infektion hin.
Trinkwasserqualität: Die Gesamtkeimzahl sollte unter 100 Zellen pro ml liegen, wobei in 200 ml höchstens 1 Keim E. coli enthalten sein darf.
Abb. 2.4: Abschätzen der Gesamtkeimzahl am CLED-Agar (Urotube Roche) Anlegen von Reinkulturen
1. Gezieltes Isolieren von Organismen.
2. Verdünnungsaustrich: eine kleine Menge Bakterien wird mit einer Impföse in drei kurzen, parallelen Strichen auf die Agarfläche aufgebracht. Daraufhin wird die Öse abgeflammt. Nachdem sie ausgekühlt ist, streicht man quer über das Ende der vorhergehenden Ausstriche und noch einige Zentimeter darüber hinaus. Dadurch werden die Keime weiter verfrachtet und verdünnt. Nach erneutem Abflammen und Auskühlen der Öse wird der Vorgang noch 1-2 mal wiederholt.
(Einzellkulturen können auch mittels Verdünnungsreihen u.ä. Methoden hergestellt werden.) 3. Nach dem Bebrüten sollen die Einzellkulturen auf Vollmedien ausgestrichen werden.
4. Es ist empfehlenswert, diese "Reinkulturen" mikroskopisch zu kontrollieren sowie die Kulturmerkmale zu beachten und zu vergleichen.
2.2.3 METHODEN ZUR ZUORDNUNG DER ORGANISMEN ZU GROSSGRUPPEN
Voraussetzung für die Identifikation von Bakterien mit Hilfe von "Bunten Reihen" sind Informationen über deren Form (Mikroskop), Größe (Mikroskop), Motilität (Mikroskop, Mobilitätsagar), Gramverhalten (Gram-Färbung, Wachstum auf MacConkey-Agar). aerobe/anaerobe Wachstumsbedingungen (Herkunft, Art der Isolierung), Endosporenbildung, Oxidasetest und Katalasetest.
Oxidase Test
Ein farbloses reduziertes Reagens wird durch Bakterien, welche in ihrer Atmungskette Cytochrom C enthalten, oxidiert und verfärbt sich dadurch innerhalb kurzer Zeit blau oder schwarz.
Katalasetest
Die Katalase vermag Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff unter Gasbildung zu spalten.
Staphylokokken sind Katalase+, Streptokokken Katalase-negativ. Die Durchführung des Test erfolgt durch Zugabe von H2O2 zu einem beimpften Zuckersubstrat und Beobachtung der Gasbildung innerhalb von 5 min.
OF Medium
Teströhrchen für den oxidativen und fermentativen Glucose-Metabolismus.
Die im Handel erhältlichen Röhrchen mit einem Nährmedium, dessen einzige Kohlenstoffquelle aus Glucose besteht, ist vor der Beimpfung in kochendem Wasserbad zu verflüssigen. Anschließend wird es rasch in senkrechter Position abgekühlt und bis zum Gebrauch bei Zimmertemperatur aufbewahrt.
Es werden in der Regel 2 Röhrchen beimpft, wobei eines (für den fermentativen Abbau von Glucose) mit Paraffinöl überschichtet wird. Die hohe Glucose Konzentration der Röhrchen ermöglicht einen Nachweis der durch deren Abbau entstandenen Säuren. Der Farbumschlag von grün nach gelb wird bei Säurebildung durch Bromthymolblau angezeigt. Das Ergebnis kann nach 24 oder 48 Stunden abgelesen werden. Eine gelbe Verfärbung zeigt eine positive Reaktion an.
Fermentative Organismen können Glucose sowohl oxidativ als auch fermentativ abbauen.
Es besteht auch die Möglichkeit, bei einem der zwei parallelen API-Teststreifen das Röhrchen mit Glucose mit Paraffinöl zu überschichten und somit den Organismus unter anaeroben Bedingungen zu einem Glucoseabbau zu bringen.
Motilität
Die Motilität kann in einem Vitalpräparat oder im Motilitätsagar festgestellt werden. Unbewegliche Keime wachsen im Beweglichkkeitsagar nur im Stichkanal, während bewegliche sich im Medium verteilen und dadurch wolkige Auswüchse und dann eine mehr oder weniger homogene Trübung des Medium verursachen. Dabei ist die Art der Begeißelung unwichtig. Diese kann jedoch mit eigenen Geißelfärbetechniken sichtbar gemacht werden (Geißelfärbung nach Blenden und Goldberg).
Bei Vitalpräparaten ist darauf zu achten, daß die Motilität nicht mit Brown'scher Molekularbewegung bzw. Konvektionsströmen verwechselt wird (Phasenkontrastverfahren).
Hämolyse
Vor allem in klinischen Laboratorien werden die isolierten Stämme auf Blutagar (Buillon mit 5%
Schafblut) gezüchtet, da viele pathogene Organismen extrazelluläre Enzyme produzieren welche die Erythrozyten auf unterschiedliche Weise lysieren:
?-Hämolyse: grünliche Verfärbung
ß-Hämolyse: vollständige Auflösung der Erythrozyten; heller Hof um die Kolonien keine Hämolyse: (= ?-Hämolyse)
Zur Beurteilung müssen die Platten gegen das Licht gehalten werden. Die Bakterien sollen nur oberflächlich wachsen (mit sterilem Wattestäbchen beimpfen). Falls man mit der Impfschlinge in den Agar eintaucht (anaerobe Bedingungen), kann es zu falsch positiven ß-hämolytischen Verfärbungen kommen.
2.2.4 AUSTESTUNG DER STOFFWECHSELEIGENSCHAFTEN MITTELS EINER BUNTEN REIHE
API von BioMeriéux:
API Systeme bestehen aus Mikroröhrchen, die dehydrierte Substrate enthalten. Durch Zugabe der zu untersuchenden Bakteriensuspension werden die verschiedenen Substrate gelöst. Nach einer Inkubation von 18-24 bzw 48 h (je nach Testsystem) bei genau definierter Temperatur wird das Reaktionsmuster abgelesen und durch Zuordnung von Zahlenwerten ein Profil erstellt. Das System ermöglicht die Durchführung von festgelegten biochemischen Untersuchungen, die anhand von Farbumschlägen entweder spontan oder nach Zugabe von Reagenzien abgelesen werden können und dann zur Auswertung in Tripletts zusammengefaßt werden. Bei positivem Ausfall einer Reaktion wird dem ersten Test einer Dreiergruppe eine 1, dem zweiten Test eine 2 und dem dritten Test eine 4 zugeordnet. Bei negativen Ergebnissen wird eine Null notiert. Die 3 Ergebniszahlen der Tripletts werden addiert ergeben hintereinandergereiht die Profilnummer, welche entweder in Tabellen abgelesen werden kann oder mit Computerprogrammen ausgewertet wird.
API 20E
für Enterobakterien und andere Gramnegative Stäbchen mittels 23 standardisierter Reaktionen.
(Enterobacteriaceae sind Oxidase-negativ Gram-negativ Glucose-positiv)
Die spontan erfolgten Reaktionen werden mit Hilfe der Ablesetabelle auf dem Ergebnisblatt eingetragen. Dann werden die Reagenzien in den folgenden Röhrchen zugeben, wobei die Reihenfolge zu beachten ist.
VP Test: Je 1 Tropfen VP1+VP2 wird zugegeben, bei positiver Reaktion färbt sich das Röhrchen innerhalb 10 min rosa oder rot.
TDA Test: Eine dunkelbraune Reaktion auf TDA ist positiv
IND Test: 1 Tropfen James ergiebt bei positiver Reaktion eine unmittelbare rosarote Färbung. Ind bildet in diesem Fall einen roten Ring. Statt James-Reagens kann auch Tryp-Reagens verwendet werden.
NO2 Test: Die Glucoseröhrchen der API-Streifen enthalten Nitrat. Es wird je 1 Tropfen Nit1+Nit2 in das Glucoseröhrchen gegeben, wodurch bei roterFärbung Nitrit nachgewiesen werden kann. Bei negativer Reaktion (gelbe Färbung) kann das Nitrat entweder noch in seiner ursprünglichen Form vorliegen, oder bereits zu Stickstoff weiterreduziert worden sein. Zink hat die Eigenschaft, Nitrat zu Nitrit zu reduzieren.
Bleibt das Röhrchen 5 min nach Zugabe von 2-3 mg Zinkpulver gelb, so ist die Reaktion N2 positiv: das gesamte Nitrat wurde über Nitrit zu N2 reduziert. Wird es innerhal 5 min. rosarot, so ist N2 negativ, da die im Becherchen vorhandenen Nitrate erst durch Zink zu Nitrit reduziert wurden und nun mit dem Reagens einen Farbumschlag bilden.
Nitrat Nitrit Stickstoff
NO3 NO2 N2
Zn Reagens
roter Farbumschlag
Weitere Beispiele im Handel erhältlicher API-Testsysteme
API 20 E: Für Enterobacteriaceae und einige oxidasepositive fermentierende Bakterien (Stäbchen, g -, Oxidase -).
API 20 NE: Für nichtfermentierende Bakterien u.a. Gramnegative Bakterien (Stäbchen, g-, Oxidase +).
API 20 Strep: Für Streptokokken (Kokken, g +, Katalase -) API Staph: Für Staphylokokken (Kokken, g +, Katalase +)
API Listeria: Für Listeria Stämme (kurze, polymorphe Stäbchen, g +, bei 25°C motil, nicht motil bei 37°C, Katalase +, Oxidase -)
Grundschema einer Urinuntersuchung
Urin
(Probe bekannter Herkunft)
UROTUBE
McConkey-Agar Gramfärbung
Vitalpräparat
(Hefen können aufgrund ihrer Größe ausgeschlossen werden)
Stäbchen Kokken (meist gram neg.) (meist gram pos.)
Oxidase neg. Oxidase pos. Katalase neg. Katalsae pos.
Biolog:
Prinzip:
Der Kern des Systems sind die "Biolog MicroPlatesT M". Diese bestehen aus 96 Röhrchen (95 Teströhrchen, 1 Referenz), welche mit verschieden getrockneten Testsubstanzen (z. B. verschiedene Kohlenstoffquellen) beladen sind. Diese werden durch Beimpfen mit einer Zellsuspension rehydriert.
Der Abbau der Kohlenstoffquelle durch die jeweiligen Mikroorganismen äußert sich in einer Redoxreaktion, sichtbar durch einen roten Farbumschlag, bzw. in der Trübung des Medium. Das so entstandene Abbaumuster wird mittels spezieller Software interpretiert. Bei 95 Tests sind prinzipiell 4 x 1028 verschiedene Muster möglich.
Die Resultate können entweder manuell oder mittels "microplate reader", der an den Computer gekoppelt ist, eingegeben werden. Die "MicroLogT M Software" sucht im jeweiligen Datenfile nach möglichst ähnlichen Mustern um den Stamm zu identifizieren. Es ist auch möglich selbst neue Datenfiles anzulegen oder vorhandene Files mit neuen Daten zu ergänzen.
Wie bei den API-Tests ist es auch hier nötig die zu identifizierenden Stämme vorher in Großgruppen zu unterteilen (Gramverhalten !!) und das richtige System zu verwenden. Um gute Resultate zu erhalten ist es nötig die verschiedenen Stämme auf standardisierten Nährböden zu kultivieren und die für die jeweilige Gruppe geeigneten MicroPlatesT M zu verwenden.
Standardmedien:
BUGM w/ 5% Schafblut für die meisten g- und g+ Bakterien BUGM w/ 1% Glukose für Bacillus Arten, Nocardioforme BLA Agar für Milchsäurebakterien
BUY Agar für Hefen
Tryptic Soy Agar Pflanzenpathogene, Coryneforme (Curtobacterium sp., Clavibacter sp.)
Blutagar (TSA w/ 5%
Schafblut
für die meisten g- Bakterien
Schokolade Agar für pathogene g- Bakterien (Neisseria sp., Haemophilus sp., Moraxella sp.)
R2A Agar oligotrophe Bakterien aus Wasser, Boden; z.B. . Rhizobium sp., Methylobacterium sp)
MicroPlatesTM:
GN Gram-negative aerobe Bakterien
GP Gram-positive aerobe Bakterien, Bacillus Arten, Milchsäurebakterien, Nocardioforme, Coryneforme
YT Hefen
ES E. coli und Salmonella-Stämme
Durchführung:
1. Reinkultur!!!!
2. Gramverhalten testen.
3. Bebrüten auf geeignetem Medium (siehe Tabelle) für 4-18 Stunden.
4. Inokulum vorbereiten: Photometer (Spectronic) kalibrieren, Zellsuspension in 0,85% steriler Kochsalzlösung herstellen (Tabelle unten): Wattestäbchen mit steriler Kochsalzlösung befeuchten, Zellen mit Wattestäbchen von der Kultur abnehmen (Achtung: keine Bestandteile des Nährbodens mitaufnehmen!!!!), in die vorbereitete Kochsalzlösung übertragen und gut durchmischen.
Biolog Inokolumdichte gemessen bei 600 nm:
T A
GN 77,4% - 70,0% 0,109 - 0,155
GP-COC 43,5% - 41,4% 0,361 - 0,383
GP-ROD 50% 0,301
YT 66,0% 0,180
5. MicroPlate beschriften.
6. Suspension in die vorbereitete sterileWanne leeren.
7. Mit Multikanalpipette alle Röhrchen der MicroPlate mit exakt 150 µl Suspension beimpfen.
Achte darauf, daß kein Substrat von einem Röhrchen in das nächste verschleppt wird (Pipettenspitzen nicht in die Röhrchen tauchen!!! und nicht "patzen").
8. Für 4 - 6 Stunden bei 35°C (klinische Isolate) bzw. 30°C ("Wildfänge") in einer "feuchten Kammer" (verhindert Austrocknung der Näpfchen) bebrüten.
9. Auswerten. Falls noch keine befriedigende Resultate erzielt werden, die Platten über Nacht (16 - 24h) weiter bebrüten.
Die angegebenen Transmissions- bzw. Absorptionswerte gelten nur für das im Praktikum verwendete Photometer. Bei einem anderen Photometertyp können die Werte verschieden sein und müssen vorher mit den Standardsuspesionen überprüft werden.
Die Kochsalzlösung und die MicroPlates sollten etwas vorgewärmt werden, da verschiedene Stämme auf Kälteschock sensibel reagieren. Ab Schritt 5 muß schnell gearbeitet werden (nicht
2.3 MERKMALE AUSGEWÄHLTER GRUPPEN
Enterobacteriaceae:
Gramnegative, sporenlose, aerob und fakultativ anaerob wachsende Stäbchen von 1-6 µm Länge und 0,3-1,0 µm Dicke. Bei Motilität zumeist peritriche Begeißelung. Oxidase-negativ, Reduktion von Nitrat zu Nitrit, Fermentativer Abbau von Glucose.
Pseudomonadaceae:
Diese Grupe umfaßt die Gattung Pseudomonas und andere anspruchslose nicht fermentierende, obligat aerobe, gramnegative Stäbchen.
Micrococcaceae:
Die Familie besteht aus grampositiven Kokken mit meist positiver Katalasereaktion, die fakultativ anaerob wachsen, unbeweglich sind und keine Sporen bilden.
Bacillaceae:
Endosporenbildende Mikroben. Die Endosporen enthalten bis zu 15 % Dipicolinsäure, eine Wand aus Peptidoglykan und eine keratinartige Hülle, die sie gegen Hitze und zellschädigende Chemikalien weitgehend unempfindlich macht. Die Gattungen sind in jungen Kulturen zumeist grampositiv bis gramvariabel.
Actinomycetales:
Die sogenannten Strahlenpilze gehören trotz ihres historisch bedingten Namens zu den Prokaryonten und somit zum Bakterienreich. Sie können aber zu fädig verzweigten Geflechten auswachsen, und viele Arten vermehren sich mit Hilfe von Konidien, Fragmentations- und Sporangiosporen.
3. REICHE DER EUCARYOTA
Animalia Chromista Fungi Plantae Protozoa
Ernährung Heterotroph (phagotroph oder osmotroph)
Autotroph (photosyn- thetisch oder absorptiv)
Heterotroph (absorptiv / osmotroph
Autotroph (photosynthe -tisch)
Heterotroph
(phagotroph) oder autotroph
(photosynthetisch) Zellwände Keine Oft Zellulose;
Chitin und ß- Glucane fehlen
Chitin und ß- Glucane
Zellulose und andere Polysaccharid e
fehlend oder sehr vielförmig wenn vorhanden
Cristae der Mitochondrien
Faltenförmig (seltener tubulär)
tubulär faltenförmig faltenförmig tubulär Mastigonema
der Flagellen
Fehlen tubulär fehlen fehlen nicht tubulär
Tab. 3.1: Ausgewählte Charaktere der wichtigsten Reiche der Eukaryota (nach HAWKSWORTH ET AL., 1995).
In den Reichen Protozoa und Chromista gibt es Organismen, die morphologisch in gewisser Weise den echten Pilzen ähneln (Myxomyceten, Oomyceten) und daher im Praktikum behandelt werden.
4. MYXOMYCOTA (PROTOZOA):
4.1 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN
Die Abteilung besteht gegenwertig aus zwei Klassen den Protosteliomycetes und den Myxomycetes.
Tab. 4.1: Einteilung der Myxomycota in Klassen:
Unterklassen Myxoflagellaten vegetativer Thallus Sporokarp Protosteliomycetes +/- vielkerniges
Plasmodium
klein, gestielt mit wenig Sporen (1-4)
Myxomycetes + vielkerniges
Plasmodium
Sporangien mit endogener Sporenentwicklung
4.2 MYXOMYCETES
Plasmodien sind zellwandlose, vielkernige, amöboid bewegliche Plasmamassen, welche sich kriechend fortbewegen und sich phagotroph von Bakterien oder organischen Nährstoffen ernähren.
Reicht das Nahrungsangebot nicht mehr aus, wandern die Plasmodien, welche sich normalerweise im Substrat (Boden, Holz, Streu) befinden, ans Licht und beginnen Fruchtkörper zu bilden. Die freigesetzten haploiden Myxosporen keimen zu Myxamöben oder Myxoflagellaten, kopulieren und bilden neue, diploide Plasmodien die sich unter mitotischen Kernteilungen vergrößern. Unter ungünstigen Bedingungen können sich die Plasmodien in eine harte Überdauerungsform umwandeln.
Dieses Sklerotium bildet bei günstigeren Bedingungen wieder ein Plasmodium.
Die Klasse der Myxomycetes besteht aus 5 Ordnungen, die wie folgt unterschieden werden:
Tab.4.1: Einteilung der Myxomycetes in Ordnungen.
Sporenpulver Capillitium Columella Sporokarp
Echinosteliales hell fehlt vorhanden gestielte, meist winzige Sporangien
Liceales hell fehlt fehlt Sporangien, Aethalien,
Pseudoaethalien, Plasmodiocarpe Trichiales hell aus röhrigen Fäden
(Elateren)
fehlt Sporangien, Plasmodiocarpe Stemonitales dunkel netzig vorhanden Sporangien, Aethalien Physarales dunkel aus dünnen nicht
röhrigen Fäden (mit Kalkeinlagerungen)
fehlt oder vorhanden
Sporangien, Aethalien, Pseudoaethalien,
Plasmodiocarpe;
4.3 PROTOSTELIOMYCETES
Die vielkernigen Plasmodien teilen sich in einkernige Portionen, aus denen je 1 gestieltes Sporangium wächst, das 1-4 Sporen bildet. Bei Ceratiomyxa wird nur 1 einzige Spore produziert. Mehrere einzelne Sporangien bilden zusammen einen Sammelfruchtkörper (Abb. 4. 2).
4.4 SAMMELN UND BESTIMMEN:
Die Fruchtkörper der Myxomyceten und seltener auch frische Plasmodien können bei näherem Hinschauen im Wald relativ leicht gefunden werden. Sie kommen gern an morschem Holz vor, und sollten mit einem Messer mit etwas Substrat entnommen, und in kleinen Dosen transportiert werden.
Die makroskopischen Merkmale der meist recht kleinen Fruchtkörper sollten unter einer Lupe betrachtet werden. Die Farbe des Sporenpulvers läßt sich so aufgrund der abgelagerten Sporen feststellen. (Im Mikroskop erscheinen die Sporen andersfarbig.) Anschließend werden die mikroskopischen Merkmale ermittelt und mit Hilfe geeigneter Schlüssel bestimmt.
4.5 KLEINES GLOSSAR ZU DEN MYXOMYCETEN:
Aethalien: miteinander verschmolzene Einzelfruchtkörper. Die Peridie zwischen den ursprünglichen Einzelfruchtkörpern ist bis auf wenige Reste (Pseudocapillitium) aufgelöst.
Capillitium: Röhrige, fädige oder netzige Strukturen, im Inneren des Fruchtkörpers.
Columella: Fortsetzung des Stiels im Köpfchen.
Elateren: Sonderform des Capillitium bei den Trichiales: röhrige, hohle Fäden.
Hypothallus: zarte bis derbe Haut (Rest des Plasmodium), die die einzelnen Fruchtkörper mit dem Substrat verbindet.
Kalkeinlagerungen: Bei den Physarales wird Kalk in den Netzknoten des Capillitium oder in bzw.
auf der Peridie gebildet. Dieser ist entweder granulär ("kleine Kugeln") oder kristallin (unregelmäßig nadelförmig oder Drusen)
Peridie: Sporangienwand
Plasmodiokarp: Die Fruchtkörper konzentrieren sich entlang der Plasmodiumäste und ähneln einem erstarrten Plasmodium.
Plasmodium: Mehrkernige, amöboid bewegliche Riesenzelle.
Pseudoaetalium: Dicht beisammenstehende Einzelfruchtkörper täuschen ein Aetalium vor Pseudocapillitium: Reste der ursprünglichen Sporangienwand bei Aethalien.
Sklerotium: Überdauerungsform des Plasmodium.
Sporangium (Sporophor): Formenreiche Einzelfruchtkörper, mit oder ohne Stiel, ev. auf einer gemeinsamen Unterlage die dann Hypothallus genannt wird.
Sporen: Myxomycetensporen können hyalin oder gefärbt sein, weisen eine Ornamentation auf oder nicht und unterscheiden sich in Form und Größe.
1 Fruchtkörper mit reifen Sporen (R!)
2 keimende Sporen
3 Myxamöbe-Myxoflagellat 4 Koloniebildung durch
Teilung 5 Microzyste
(Ruhestadium) 6 Plasmogamie
7 Zygote
8-9 Plasmodium
10 Sklerotium (Makrozysten) 11-12 Fruchtkörperbildung
Abb. 4.1: Lebenszyklus der Myxomycetes (NEUBERT ET AL. 1993)
Abb. 4.2: Beispiel eines Protosteliomycetes-Fruchtkörpers: Ceratiomyxa fruticulosa. Zu einem Sammelfruchtkörper vereinigte Sporangien.
Abb. 4.3: Fruchtkörpertypen der Myxomycetes: 1 Plasmodiokarp und Capillitium von Hemitrichia serpula. 2 Geschlossenes und offenes Sporangium von Physarum nucleatum. 3 Sporangium und Spore von Stemonitis fusca. 4 Junges und altes Sporangium von Diachea leucopodia. 5 Sporangium, Capillitiumfaden (Elatere) und Spore von Trichia varia. 6 Aethalium von Lycogala epidendrum. 7 Sporangienbüschel von Physarum nicaraguense.
8 Pseudoaethalium von Tubifera ferrugenosa
5 OOMYCOTA (CHROMISTA)
5.1 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN
Die Oomycota werden derzeit in 9 Ordungen (ca. 700 Arten) gegliedert, von denen 3 im Praktikum behandelt werden.
Der Thallus der Oomyceten ist siphonal (coenocytisch), es werden nur die Sexualorgane durch Septen vom übrigen Mycel abgetrennt.
Ihre Zellwand enthält Zellulose (kein Chitin), was auf eine enge Verwandtschaft mit Braunalgen (Phaeophyceae) bzw. Xanthophyceae hinweist (vgl. Vaucheria : Zellwand mit Zellulose, der Oogamie sehr ähnliche sexuelle Fortpflanzung).
Innerhalb der Oomycota finden wir verschieden Entwicklungslinien:
- Aufstieg vom Leben im Wasser zum Landleben.
- schrittweiser Ersatz der Zoosporen durch Konidien, bzw. Übergang von Hydrochorie zu Anemochorie.
- Steigerung der biologischen Ansprüche von Saprobie über Abhängigkeit von bestimmten Substraten bis hin zur obligat biotrophen Lebensweise.
- Verfeinerung der parasitischen Eigenschaften (Spezialisierung auf best. Wirte oder Wirtsorgane, Reizung der parasitierten Wirte anstelle des Abtötens).
5.2 FORTPFLANZUNG
Sexuelle Fortpflanzung:
Die Oomyceten weisen einen sehr einheitlichen Mechanismus der sexuellen Fortpflanzung auf, die OOGAMIE .
Sie beginnt mit der Anlage der Oogonien. Ausgehend von terminalen, kugeligen, plasmareichen Anschwellungen entwickeln sich Oogonien. Diese grenzen sich von den coenocytischen Hyphen durch ein Septum ab. Im Inneren des Oogon degenerieren die meisten Kerne, die übriggebliebenen teilen sich meiotisch. Das Plasma zerklüftet sich und die Portionen runden sich zu einkernigen Oosphären ab. Die Antheridien entwickeln sich auf ähnliche Weise, sind aber schlank und schlauchartig. Die Kerne teilen sich ebenfalls meiotisch.
Die Steuerung der Entwicklung der Sexualorgane erfolgt unter anderem durch Antheridiol und Oogoniol. Im Rahmen dieser Koordination finden die Antheridien je ein Oogon und die Enden der vom Antheridium ausgesandten Befruchtungsschläuche je eine Eizelle. Die Karyogamie erfolgt sofort.
Die Oosphären umgeben sich mit einer doppelten Wand und werden somit zu Oosporen. Diese keimen in der Regel erst nach mehrmonatiger Ruhepause mit Sporangien oder Hyphen aus.
Asexuelle Fortpflanzung:
Die asexuelle Fortpflanzung erfolgt in Form von Zoosporen, die in endständigen, durch Septen abgegrenzten, Zoosporangien gebildet werden. Nach der Abgrenzung zerklüftet sich das Plasma zu abgerundeten Portionen, die sich zu diploiden Zoosporen entwickeln. Bei ursprünglichen Formen treten zwei verschiedene Schwärmstadien auf (Diplanie). Die primären Zoosporen (jene, die das Zoosporangium verlassen) sind akrokont und biflagellat begeißelt (eine Flimmer- [Zuggeißel] und eine Peitschengeißel [zur Stabilisierung] am vorderen Ende inseriert). Diese encystieren sich und
5.3 SAPROLEGNIALES
Diese Ordnung umfaßt wasserlebende (oder in feuchten Böden vorkommende), saprotrophe oder parasitische Oomyceten. Sie bilden ein gut ausgebildetes, schnell wachsendes Mycel. Im Substrat wachsende Hyphen sind dünn und reich verzweigt, im Wasser wachsende Hyphen, dick, plasmareich und wenig verzweigt. Die sexuelle Entwicklung entspricht der weiter vorne beschriebenen Form. Innerhalb der asexuellen Fortpflanzung gibt es eine Tendenz zu unbeweglichen Zoosporen. Saprolegnia sp. bildet beide Schwärmstadien (Diplanie) aus. Bei Diktyuchus sp. wird das erste Schwärmstadium unterdrückt, die sekundären Zoosporen keimen direkt aus dem Zoosporangium aus. Innerhalb der Gattung Aplanes kommt es zur Unterdrückung beider Schwärmstadien. Hier keimen die Zoosporen in situ, d.h. in den Sporangien.
Abb. 5.1: Saprolegnia litoralis. A-D Entwicklung von Oogon und Antheridium. C Im Oogon bilden sich Plasmaportionen. D Die Umrisse von zwei Oosphären sind sichtbar. E Oogon mit zwei Oosporen. F Interkalar gebildetes Oogon (Antheridium fehlt). G Kette von Gemmen. H Gemmen von Saprolegnia sp.
Abb. 5.3: Zoosporangium von Dictyuchus monosporus (spez. Form - Netzsporangium, siehe Glossar). a Entleertes Sporangium, am unteren Ende bildet sich ein neues Netzsporangium. b-e Keimungsvorgang, es bilden sich nur Sporen des zweiten Schwärmstadium.
Abb. 5.4: Zoosporangium von Aplanes androgynus. Sporangium mit keimenden Sporangiosporen.
Abb. 5.5: Zoosporangium von Achlya prolifera. Im Inneren noch Zoosporen des ersten Schwärmstadiums (a), darüber, die schon wieder mit einer Wand umgebenen Zoosporen (b) und zwei Zoosporen des zweiten Schwärmstadiums (c).
5.4 LEPTOMITALES
Organismen der Gattung Leptomitus sind häufig in Abwasser zu finden (Saprophyten in Süßwasser).
Als typisches Kennzeichen für die Gattung Leptomitus gelten die regelmäßigen Einschnürungen an den Hyphen (sie sind segmentiert, aber nicht septiert!!!). Die sexuelle Reproduktion zeigt hier eine Abweichung, es wird nur eine von Periplasma umgebene Oospore pro Oogon gebildet. Antheridien sind in der Regel vorhanden. Die Oosporen besitzen ein zentrales Tröpfchen von Reservestoffen. Die Zoosporangien sind zylindrisch, eiförmig oder birnenförmig, wie bei Saprolegnia sp. treten auch hier zwei Schwärmstadien auf (Diplanie).
Abb. 5.6: A-C Apodachlya pyrifera. A Somatische Hyphe, welche die typischen Einschnürungen zeigt. B Sich entwickelndes Zoosporangium. C Oospore. D Rhipidium americanum. Sich entwickelnde von Periplasma umgebene Oospore.
5.5 PERONOSPORALES
Der Thallus der Peronosporales ist mycelial aber coenocytisch. Sie sind (bis auf wenige Ausnahmen) keine Saprophyten mehr, sie sind zur biotrophen Lebensweise übergegeangen. Sie parasitieren höhere Landpflanzen, sind aber auf hohe Luftfeuchtigkeit angewiesen. Die interzellulär wachsenden Hyphen senden Haustorien in die lebenden Zellen. Aus den Spaltöffnungen wachsen verzweigte Sporangienträger, die die Zoosporangien tragen. Oft werden ganze Sporangien durch den Wind auf Blätter anderer Pflanzen übertragen. Sie entlassen dort nierenförmige Schwärmer.
Die fortschreitende Anpassung an das Landleben führt zur Bildung von "Konidien": Die Sporangien selbst dienen als Verbreitungseinheit und keimen mit Hyphen.
In der Familie der Peronosporaceaen fehlen bei der sexuellen Fortpflanzung funktionsfähige männliche Gametangien (Antheridien), die Kerne des Oogons verschmelzen paarweise (Autogamie).
Abb. 5.7: Phytophtora infestans (Pythiaceae). a Aus der Spaltöffnug eines Kartoffelblattes ragender Sporangienträger mit Sporangien. b Sporangien mit ausschlüpfenden Zoosporen. c Oogon (1), dessen Stiel das darunterliegende Antheridium (2) durchwachsen hat. d keimende Oospore mit sich entwickelndem Sporangium.
Abb. 5.8: Albugo candida: a Sporangien Kette; b Freisetzung der Zoosporen aus den Sporangien a b
5.6 KLEINES GLOSSAR ZU DEN OOMYCETEN
akrokont: Eine oder mehrere Geißeln sind am "vorderen" Ende inseriert (Zuggeißeln) Anemochorie: Die Vermehrungseinheiten werden durch Luftbewegungen verbreitet.
Antheridium: Männliches Gametangium biflagellat: Die Zelle besitzt zwei Geißeln.
coenocytisch: (-er Thallus) Eine vielkernige "Masse von Plasma", nicht zellulär im Sinne von septiert.
Diplanie: Es treten zwei verschiedene Schwärmstadien (Zoosporen) mit einem Ruhestadium dazwischen auf.
heterokont: (-e Begeißelung) Die Zelle besitzt Geißeln, die sich in Länge oder Bau unterscheiden.
Hydrochorie: Die Vermehrungseinheiten werden mit Hilfe von Wasser verbreitet (Tautröpfchen, Regentropfen, fließendes Wasser).
Netzsporangium: Spezielle Form des Zoosporangiums bei Dictyuchus sp.. Die Zoosporen verlassen das Zoosporangium nicht als primäre sondern erst als sekundäre Zoosporen. Das Stadium der primären Zoosporen ist unterdrückt. Vor allem an entleerten Zoosporangien kann man die Netzstrucktur der einzelnen Kompartimente, aus denen die sekundären Zoosporen schlüpfen erkennen.
Oogamie: spezielle Form der Gametangiogamie: Im Oogon werden Oosporen gebildet. Diese werden durch Befruchtungsschläuche der Antheridien befruchted.
Oogon: weibliches Gametangium. Im innerem werden Oosporen gebildet.
opisthokont: Eine oder mehrere Geißeln sind am "hinteren" Ende inseriert (Schubgeißeln) pleurokont: Eine oder mehrere Geißeln sind seitlich inseriert.
siphonal: (-er Thallus) Der Thallus ist nicht septiert.
Zoosporangium: Struktur in deren innerem Zoosporen gebildet werden.
Zoosporen: Begeißelte und damit bewegliche Mitosporen.
6 CHYTRIDIOMYCOTA (FUNGI)
6.2. ALLGEMEINE DARSTELLUNG
Der Thallus der Chytridiomyceten ist meist wenig entwickelt. Er ist oft einzellig (holokarp), kugelig oder blasenförmig. Häufig werden Rhizoide gebildet (kein Hyphenmycel!!!). Die Fortpflanzungstypen, die wir in dieser Klasse finden sind Iso-, Aniso- und Oogamie.
Abb. 6.1: Thallusstrukturen in der Ordnung der Chytridiales
Innerhalb der Chytridiomyceten sind verschiedene Entwicklungslinien zu beobachten:
* Die ursprüngliche Holokarpie (einzelliger Thallus; besteht nur aus dem Sporangium) wird durch Eukarpie (mehrzelliger Thallus, bestehend aus Hyphen und Sporangien) ersetzt.
* Es tritt eine Dikaryophase auf.
* Generationswechsel und Entwicklung eines diplontischen Lebenszyklus.
* Verschiedene Befruchtungsmodi, Iso-, Aniso- und Gametangiogamie (z. B. Oogamie).
6.3 BEISPIELE
6.3.1 LEBENSZYKLUS VON RHIZOPHIDIUM SP. (CHYTRIDIALES) Sexuelle Vermehrung:
Bei Rhizophidium sp. (Chytridiales) kopulieren zwei Planogameten, die sich von den Zoosporen morphologisch nicht unterscheiden lassen. Zuerst setzt sich der männliche Gamet am Substrat fest, zieht seine Geißel ein und verankert sich mit Rhizoiden im Substrat. Der weibliche Gamet setzt sich auf den männlichen Gameten und zieht ebenfalls die Geißel ein. An der Berührungsstelle wird die Zellwand aufgelöst, der Inhalt des männlichen Gameten ergießt sich in den weiblichen Gameten (Plasmogamie). Nach der Karyogamie entwickelt sich eine diploide Dauerspore. Die Dauerspore keimt nach der Reduktionsteilung mit einem Keimsporangium und entläßt haploide Zoosporen.
Asexuelle Vermehrung:
Ein opisthokont begeißelter Schwärmer setzt sich am Substrat fest, zieht seine Geißel ein und und verankert sich mit Rhizoiden (sind im Lichtmikroskop nicht sichtbar) im Substrat. Er schwillt zu einem blasigen Zoosporangium an. Der Zellinhalt zerklüftet sich in einzelne Plasmaportionen, die sich zu Zoosporen differenzieren. Die Schwärmer verlassen das Sporangium durch eine Öffnung.
Abb. 6.2: Rhizophydium halophilum. Zoosporangien mit Entleerungspapillen auf einem Pollenkorn von Pinus.
Abb. 6.3: a-n Rhizophydium ovatum (holokarp). a-e Infektion und Bildung eines Zoosporangiums.
f-n sexuelle Reproduktion, Bildung einer Dauerspore. (Beschreibung siehe oben, sex. und asex.
Entwicklung bei Chytridiomyceten). o-s Rhizophydium sp. Keimung der Dauerspore mit eine Zoosporangium.
6.3.2 LEBENSZYKLUS VON ALLOMYCES MACROGYNUS (BLASTOCLADIALES)
Im zunächst diploiden Dauersporangium kommt es zur Reduktionsteilung. Nach einigen Mitosen reifen haploide Zoosporen. Diese setzen sich am Substrat fest, umgeben sich mit zellwand und bilden den Gametophyten. An diesem werden paarweise weibliche und männliche Gametangien gebildet.
Das oben sitzende etwas kleinere männliche Gametangium ist durch Carotinoide orangerot gefärbt.
Die weiblichen Gameten sind deutlich größer als die männlichen (Anisogamie). Nach deren Entlassung aus den Gametangien verschmelzen sie paarweise zu diploiden Zygoten. Diese wachsen zu Sporophyten aus, an welchen Zoosporangien und orangbraun gefärbte Dauersporangien gebildet werden. Die in den Zoosporangien gebildeten diploiden Zoosporen können wieder zu Sporophyten auswachsen. Die Dauersporangien keimen erst nach einer längeren Ruhephase mit haploiden Zoosporen.
Abb. 6.4: Lebenszyklus Allomyces macrogynus.
6.4 KLEINES GLOSSAR ZU DEN CHYTRIDIOMYCETEN
Anisogamie: Zwei morphologisch differenzierbare bewegliche Gameten kopulieren.
Dikaryophase: In einer Wachstumsphase besitzen die Zellen zwei haploide Kerne. Sind die Kerne genetisch ident, spricht man von Homodikaryon, sonst von Heterodikaryon.
Gametangiogamie: Hier werden keine Gameten gebildet, Gametangien verschmelzen, wobei es zur Fusion des gesamten Plasmas beider Gametangien kommt. Bei Fusion gleichgestaltiger Gametangien spricht man von Isogametangiogamie, bei Fusion unterschiedlich gebauter Gametangien von Anisogametangiogamie.
Isogamie: Zwei morphologisch nicht differenzierbare bewegliche Gameten kopulieren.
7. ZYGOMYCOTA (FUNGI)
7.1 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN
Die Zygomyceten sind durch folgende Merkmale charakterisiert:
-Die Vegetationskörper besitzen als charakteristischen Bestandteil der Zellwand Chitin. Die Hyphen sind coenocytisch, beginnen sich allerdings bei gewissen Vertretern regelmäßig zu septieren.
-Bei der ungeschlechtlichen Fortpflanzung sind sämtliche motile Zellen unterdrückt. An ihre Stelle treten anemochore Sporangiosporen bzw. Konidien.
-Die geschlechtlichen Fortpflanzung wird durch Kopulation undifferenzierter coenocytischer Gametangien eingeleitet (Gametangiogamie).
-Zu den Zygomyceten werden 6 Ordnungen gestellt, wobei im Praktikum nur die leicht kultivierbare Gruppe der Mucorales behandelt wird.
7.2 VEGETATIVE VERMEHRUNG DER MUCORALES
Die ungeschlechtlichen Fruktifikationen der Mucorales weisen eine große Mannigfaltigkeit auf und bilden die wichtigste Grundlage für die Einteilung der Ordnung in Familien, Gattungen und Arten.
Das Mycel der Pilze besteht aus einem verzweigten, schnellwüchsigen Substratmycet, das aus vielkernigen und unseptierten Hyphen besteht (coenocytisch). Über solche Thalli erheben sich kurze Seitenäste einzelner Hyphen und schwellen an den Enden zu kugeligen Köpfchen an, die sich zu Sporangien entwickeln. Bei Reife löst sich die ganze Sporangienwand auf oder zerbricht, die Sporen werden frei und sind sofort keimfähig.
Abb. 7.1: Sporangienentwicklung bei Mucor (schematisch: a-c Entwicklung der Columella (1) und der Sporen. d. Sporangium nach Entleeren der Sporen mit Columella (1) und Reste der Peridie (2).
7.3 SEXUELLE FORTPFLANZUNG DER MUCORALES
7.3.1 FORTPFLANZUNGSSYSTEME ALLGEMEIN Heterothallie (Selbstinkompatibilität)
Heterothallische Arten sind solche, deren Thallus nur einem Kreuzungs- oder Paarungstyp zugeordnet werden kann. Demnach ist eine Konjugation nur zwischen Thalli verschiedener Kreuzungstypen möglich. Thalli des gleichen Paarungstypes können nicht miteinander verschmelzen, sie sind selbststeril. Es wird unterschieden zwischen Morphologischer Heterothallie und Physiologischer Heterothallie.
Morphologische Heterothallie: Echter Diözismus; auf einem Mycel, welches aus einer einzigen Spore entstanden ist, wird nur eine Art von "Sexualorganen" (entweder kernspendende Organe oder kernempfangende Organe) ausgebildet. Dieses Mycel dient nur als Kernspender oder als Kernempfänger.
Physiologische Heterothallie: Selbstinkompatible Monözie; auf einem Mycel, welches aus einer einzigen Spore entstanden ist, werden kernspendende Organe und kernempfangende Organe ausgebildet (Monözie). Durch Selbstinkompatibiltät wird aber eine Selbstbefruchtung ausgeschlossen. Da keine morphologischen Unterschiede zwischen den Mycelien entgegengesetzter Sexualtendenz feststellbar sind, werden sie mit + und - bezeichnet.
Homothallie (Selbstkompatibiltiät oder Eigenverträglichkeit)
Das Mycel, das aus einer einzigen Spore entstanden ist, ist monözisch und selbstfertil (autogam).
Die hier erklärten Mechanismen sind nicht nur auf die Zygomyceten beschränkt, sie gelten auch für alle folgenden Pilzgruppen.
7.3.2 SEXUELLE FORTPFLANZUNG DER MUCORALES
Die Verschmelzung von Gametangien (Gametangiogamie) erfolgt infolge eines chemotropischen Reizes (Trisporsäure) zwischen zwei verschiedenen heterothallischen Mycelien oder innerhalb eines homothallischen Mycels. Die Kopultionsäste teilen durch eine Querwand das Gametangium vom basalen Teil ab, der als Suspensor bezeichnet wird. Sind die Gametangien genügend herangewachsen, so wird die zwischen ihnen befindliche Zellwand aufgelöst, und die Zellinhalte verschmelzen. Die so entstandene Zygote oder Zygospore bildet eine neue Wand. Die Suspensorzellen tragen bei manchen Gattungen Fortsätze, welche die Zygote umschließen.
7.4 AUSGEWÄHLTE BEISPIELE
Rhizopus
Die Sporangien werden meist büschelig an Ausläufern gebildet. Die Sporangienträger sind unverzweigt, die Sporangien haben eine Apophyse. Rhizoide werden ausgebildet.
Abb. 7.3: Rhizopus stolonifer: 1 Stolonen (Laufhyphen, 2 Rhizoide, 3 Substrat, 4 Sporangiophore, 5 junge Sporangien, 6 reife Sporangien
Absidia
Die Sporangien sind birnenförmig und haben eine deutliche Apophyse. Typisch sind die dichotomen Verzweigungen der Sporangienträger.
Mucor
Die Sporangienträger sind mehr oder weniger verzweigt, die Sporangien sind von unterschiedlicher Größe mit gut ausgebildeter Columella aber stets ohne Apophyse.
Abb 7.5: Mucor racemosus: a Sporangiophor mit Sporangium und Columella. b Columellae. c Chlamydosporen. d Sporangiosporen
Phycomyces
Die stets unverzweigten Sporangienträger werden über 80 mm hoch und haben einen metallischen Glanz. Die Sporangienträger zeigen einen ausgeprägten Phototropismus.
Syncephalastrum
An den Köpfchen der aufrechten Sporangienträger werden Merosporangien gebildet.
Abb. 7.7: Syncephalastrum racemosum. a Sporangiophore mit Vesikel an denen Merosporangien gebildet werden. b Moerosporangien mit Merosporen
7.5 GLOSSAR ZU DEN ZYGOMYCETEN
Apophyse: Der Sporangienträger erweitert sich unter dem Sporangium.
Columella: Sterile zentrale Achse innerhalb eines reifen vegetativen oder sexuell entstandenen Sporongium.
Abb. 7.8: Verschiedene Formen der Columella: a kugelig, b oval, c birnenförmig, d halbkugelig, e halbkugelig mit Fortsatz und Apophyse, f halbkugelig mit Apophyse
Gemmen: Zellen wechselnder Größe mit nicht oder wenig verdickten Wänden (vgl Chlamydosporen) am coenocytischen Substratmycel. Riesenzellen sind große Gemmen,
Abb. 7.9: Verschiedene Formen von Gemmen: a Kugel- und Sproßgemmen, b Kugelgemmen am Substratmycel, c, d Riesenzellen
Merosporangien: zylindrische Sporangiolen, die Sporangiosporen sind einreihig angeordnet.
Rhizoiden: Bei vegetativen Thalli, die in Substrathyphen (Nährstoffaufnahme) und Lufthyphen (Reproduktion) differenziert sind, verankern diese differenzierten Hyphen den Thallus häufig im Substrat.
Sporangiolen: kleine, columellalose Sporangien mit 1-wenigen Sporen.
Stolonen: Hyphen, die als Ausläufer von Rhizoid zu Rhizoid rasches Wachstum ermöglichen.
Zygosporen: Zygosporen sind morphologisch charakteristisch für bestimmte Gattungen der Zygomyceten. Auch die typischen Anhängsel der Suspensorzellen sind wichtige Merkmale für die Bestimmung von Zygomyceten.
8 HEFEN UND HEFEARTIGE ORGANISMEN
8.1 DEFINITION
Der Begriff "echte Hefen" wird den Saccharomycetaceae (Endomycetales, Ascomycota) gleichgesetzt. "Hefeartig" wird im Sinn von "sich vorwiegend durch Zellsprossung vermehrend"
verwendet und bezieht sich nicht auf "echte" Verwandtschaft.
8.2 ZELLGRÖßE UND ZELLFORM
Um zu entscheiden, mit welcher Art Organismus, ob Bakterium oder Hefe, man es zu tun hat, ist die Zellgröße oft ein hilfreicher Hinweis (Abb. 8.1). So wird es sich bei einem knospenden Organismus mit 10µm Durchmesser mit großer Wahrscheinlichkeit um eine Hefe (eukaryoter Organismus) und nicht um ein knospendes Bakterium (prokaryoter Organismus) handeln.
Bei Hefen kommen unterschiedliche Zellformen vor (Abb. 8.2). Ein und die selbe Art kann je nach Alter, Kulturbedingung usw. eine andere Zellform ausbilden (Tab. 8.1).
Abb. 8.1: Skala der mikroskopischen Dimensionen nach Bessis
Abb. 8.2: Zellformen der Hefen: a - sphärisch, b - ellipsoid, c - zitronenförmig (limoniform), d - spitzbogenförmig (ogival), e - flaschenförmig, f - elongiert, g - filamentös
Tab. 8.1: Entwicklung der Form in Hefezellen
Zellform Formvariabilität Effekt externer Bedingungen spärisch Sphärische Zellen ändern sich
ungern. Wenn, wird der Durchmeser veringert. Z. B.
bei schneller Zellteilung.
Hefen werden bei längerem Wachstum im selben Medium, bei Mineralstoff- überschuß oder bei Kohlenstoff-knappheit.
sphärisch.
kurz elliptisch Ellipsoide Zellen ändern sich ungern, wenn, werden sie elongiert oder sphärisch
Elliptische Zellen werden bei Änderung der Kulturbedingungen, bei Degenerie-rung oder eingeschränkter Zellteilung gebildet.
elongiert Die Zellform wird leicht verändert.
Nährstoffmangel oder Sauerstoffüber- schuß verursachen eine Verlängerung der Zellen
filamentös Filamentöse Zellen bilden ein Pseudomycel oder ein echtes Mycel
Durch verzögerte Zellteilung, Nährstoffmangel, Sauerstoffüber-schuß oder aus genetischen Gründen kann es zu filamentösem Wachstum kommen
8.3 PSEUDOMYCELBILDUNG
Ein Pseudomycel entsteht wenn sich Mutter- und Tochterzellen länglicher polar knospender Zellen nicht trennen. Auslöser für ein solches Wachstum kann Stickstoffarmut im Medium sein. Es treten auch hier verschiedene Typen auf (Abb. 8.3)
8.4 SEXUELLE VERMEHRUNG DER ECHTEN HEFEN (ENDOMYCETALES)
Zwei haploide Einzelzellen verschmelzen zu einer diploiden Zygote. Diese Zygote kann sich bei verschiedenen Arten weiter vegetativ vermehren, oder durch endogene Bildung von vier haploiden Ascosporen zum Ascus werden. Als Sonderform kann auch eine Mutterzelle mit der Tochterzelle verschmelzen (Pädogamie). Bei manchen Arten verschmelzen die Ascosporen bereits im Ascus. Je nach Vorherrschen der diploiden oder haploiden Phase unterscheidet man drei Stufen:
haplobiontische Stufe: Außer der Zygote kommen keine diploiden Formen vor
haplo-diplobiontische Stufe: sowohl haploide als auch diploide Zellen können sich vegetativ vermehren
diplobiontische Stufe: Die Ascosporen verschmelzen bereits im Ascus. Es vermehren sich nur diploide Zellen ungeschlechtlich.
Abb. 8.4: Entwicklungszyklen von Hefen
8.5 VEGETATIVE VERMEHRUNG
Wie auch bei den mitosporenbildenden Pilzen gibt es bei Hefen verschiedene Typen asexuell entstandener Sporen (= Konidien) (Abb.8.5): Blastokonidien sind durch Sprossung entstandene Tochterzellen. Ganze Hyphenelemente können zu einzelnen zylindrischen Sporen zerfallen (Arthrokonidien). Chlamydosporen sind große, dickwandige Dauerformen von unterschiedlicher Gestalt (rund, oval bis irregulär geformt), die entweder interkalar (innerhalb einer Hyphe) oder terminal (an der Hyphenspitze) gebildet werden. Auslöser für die Chlamydosporenbildung ist
Abb. 8.5: Verschiedene vegetative Vermehrungseinheiten: a - Blastokonidien, b - Ballistokonidien, c - Arthrokonidien, d - Chlamydosporen
8.6 ZELLTEILUNG DER ECHTEN HEFEN
8.6.1 MORPHOLOGIE
Zellteilung nach dem Bechertypus
In einer Ausbuchtung der Mutterzelle (Sproß) scheidet die Tochterzelle eine eigene Wand aus und hinterläßt beim Ablösen den basalen becherförmigen Teil der von der Mutterzelle stammenden Wand. An der gleichen Stelle, im Zentrum des Becherchens, können weitere Sprossungen erfolgen und entsprechend ihrer Zahl schichten sich mehrere Becherchen ineinander, so daß jeweils das innerste das jüngste ist. Bsp. Endomyces magnusii
Zellvermehrung nach dem Spalttypus
In der Mitte der zylindrischen Zellen werden Septen angelegt. Die beiden gleich großen und gleich geformten Tochterzellen trennen sich und hinterlassen an den Trennungsflächen Narben; Außerdem bleiben an den Trennungsstellen Reste der alten Wand als Ringe erhalten und können auch nach Verlängerung und Teilung der Tochterzellen noch festgestellt werden. Einheiten, welche mehrmals an Teilungen beteiligt waren, tragen ein System von konzentrischen Ringen verschiedenen Alters. Bsp.:
Schizosaccharomyces pombe
Zellsprossung nach dem Narbentypus
An der Mutterzelle stülpt sich die Zellwand an einer Stelle aus, und die heranwachsende Tochterzelle trennt sich später durch eine Wand ab. An beiden Zellen bleiben ringförmige Narben zurück. Jede weitere Sprossung erfolgt an einer anderen Stelle der Wand. Das relative Alter der Sproßzelle läßt
Abb. 8.6 a-e Bildung von Thallokonidien nach dem Bechertypus bei Endomyces magnusii. a Die junge Konidie (1) ist von drei verschiedenaltrigen Bechern (2, 3, 4) umschlossen. b Schematischer Schnitt durch junge Konidie (1), welche von zwei becherartigen Zellresten umgeben ist (2, 3). c Querwandbildung; d, e sich trennende Zellen. f-1 Zellteilung bei Schizosaccharomyces octosporus. f Zweizellige Einheit vor der Trennung der Tochterzellen; g wachsende Hefezelle mit zwei von früheren Teilungen herrührenden Wandrestringen (1, 2); h schematischer Schnitt durch eine heranwachsende Zelle mit zwei Wandrestringen (1, 2); i beginnende Querwandbildung im Zentrum der Zelle; k gebildete Querwand; 1 sich trennende Tochterzellen. m-n Sprossung nach dem Narbentypus bei Saccharomyces cerevisae. m Mutterzelle (1) mit der Bildungsnarbe (2) und zwei Sproßnarben (3) bildet eine neue Sproßzelle. n Schematischer Schnitt durch eine Hefezelle mit der Bildungsnarbe (1) und drei verschieden alten Sproßnarben (2, 3). o-p Sprossung nach dem Annellidentypus bei Saccharomycodes ludwigii. o Sprossende Zelle (1), die von einigen
8.6.2 TOPOLOGIE
Man unterscheidet nicht nur die Art und Weise wie die Tochterzellen gebildet werden, sondern man soll auch darauf achten, wo diese gebildet werden:
polare Sprossung:die Knospe wird an der Spitze der Zelle gebildet.
bipolare Sprossung: die Knospen werden abwechselnd am einen oder anderen Pol gebildet.
laterale Sprossung: die Bildung der Knospe erfolgt seitlich.
8.7 KLASSIFIZIERUNG
Sowohl bei den Ascomyceten als auch bei den Basidiomyceten kommen hefeartig wachsende Stodien vor. Die Perfektformen sind leicht zu unterscheiden. Schwieriger wird die Entscheidung zu welcher Gruppe der Organismus gezählt wird, wenn keine sexuelle Vermehrung beobachtet werden kann. Da sich Ascomyceten und Basidiomyceten auch im Bau der Zellwand unterscheiden, versucht man über Zellwandfärbung die beiden Gruppen zu trennen.
8.8 METHODEN
8.8.1 FLUORESCENZ FÄRBUNG MIT CALCOFLUOR WHITE MR2
Die Zellwand von vielen Ascomycetenhefen besteht aus Glucan und Mannan. Nur in den Narben wird Chitin eingelagert. Der Farbstoff bindet an verschiedene Glucosepolymere und somit auch an Chitin.
Im Fluorescenzmikroskop werden die Narben bei z.B. Saccharomyces cerevisiae als blau leuchtende Ringe sichtbar.
Die Zellen werden mit 3% Formaldehyd in physiologischer Kochsalzlösung fixiert und dann in 0,1%
(w/v) Calcofluor White MR2 für 5 min bei Raumtemperatur suspendiert, dann zentrifugiert und zweimal mit destiliertem Wasser gewaschen. Die Anregung im Fluorescenzmikroskop erfolgt bei 340-380 nm.
8.8.2 FARBREAKTION ZUR DIFFERENZIERUNG VON ASCOMYCETEN- UND HEMIBASIDIOMYCETEN-HEFEN
Die Zuordnung von imperfekten Hefen ist nach traditionellen Methoden zeitaufwendig und meist an eine anspruchsvolle apparative Laborausstattung gebunden (z.B.
Transmissionselektronenmikroskope = TEM).
Farbstoff:
Von verschiedenen stabilisierten, aromatischen DIAZONIUM-Verbindungen hat sich am besten DIAZO BLUE B = DBB (Syn.: o-Dianisidine tetrazotiert; Fast Blue Salt) bewährt.
DBB wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Tris HCL Puffer (pH 7,0) gelöst und auf 4°
C abgekühlt. Die Lösung muß kurz vor Gebrauch hergestellt werden!
Testen der Kulturen:
Die Kulturen werden auf MY-Agar oder SABOURAUD-Agar mind. 3 Wochen bei 25 Grad C bebrütet (jüngere, bzw. wesentlich ältere Kulturen zeigen keine positive Reaktion mehr!) Das Reagenz wird bei Zimmertemperatur (ca. 20° C) aufgetropft. Bei positiver Reaktion entwickelt sich innerhalb von 1-2 min. eine dunkelrote Farbe. Eine gelbliche Verfärbung der Kolonien ist als negativ zu bewerten.
WICKERHAMS MY-AGAR:
Malzextrakt 3 g Hefeextrakt 3 g Pepton (Casein od. Soja) 5 g Glucose 10 g Agar 20 g auf 1000 ml H2O.
SABOURAUD-GLUCOSE 1 % MALTOSE 1 % AGAR (Fa.MERCK) Beispiele verschiedener Hefetypen:
A. Ascomycetenhefen (negativ) Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe
B. Anascogene Hefen mit ZW vom Ascomyceten-Typ (negativ) Candida entomophila
Trichosporon terrestre
C. Hemibasidiomyceten-Hefen (positiv) Filobasidium capsuligenum Aessosporon dendrophilum Leucosporidium scottii
D. Imperfekte Hefen mit ZW vom Hemibasidiomyceten-Typ (positiv) Candida curvata
Cryptococcus albidus Rhodutorula rubra
