Gesamtprotein von Milch und Milchprodukten
Polarographisches Verfahren
10466
ICS 67.100.01 Ersatz für
DIN 10466:1994-02
Determination of whey protein content in total protein of milk and milk products — Polarographic method
Détermination de la teneur en protéines du serum dans les protéines totales du lait et des produits laitiers —
Méthode polarographique
Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsaus- schuss „Chemische und physikalische Milchuntersuchung“, erarbeitet.
Änderungen
Gegenüber DIN 10466:1994-02 wurden folgende Änderungen vorgenommen:
a) Die Anforderungen an die zu verwendenden Chemikalien wurden zum Teil neu gefasst.
b) Die normativen Verweisungen wurden aktualisiert.
c) Die Norm wurde gestalterisch den gültigen Regeln für den Aufbau und die Abfassung von DIN-Normen angeglichen.
Frühere Ausgaben DIN 10466: 1994-02
Fortsetzung Seite 2 bis 10
Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt ein Verfahren zur polarographischen Bestimmung des Molkenproteinanteils im Gesamt- protein von Milch und Milchprodukten fest.
WARNUNG — Bei dem Verfahren ist das toxische Methylquecksilberchlorid als Reagenz erforder- lich. Deshalb sollte diese Norm nur dann eingesetzt werden, wenn, wie z. B. bei gereiftem Käse, das elektrophoretische Verfahren nach DIN 10472 nicht anwendbar ist oder es aus anderen Gründen nicht durchgeführt werden kann.
ANMERKUNG Die mit diesem Verfahren ermittelten Werte für den Molkenproteinanteil im Gesamtprotein sind mit den mit DIN 10472 ermittelten Ergebnissen vergleichbar.
2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen.
Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Ver- weisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschließlich Änderungen).
DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte — Leitfaden zur Probenahme (ISO 707:1997); Deutsche Fas- sung EN ISO 707:1997.
E DIN EN ISO 8968-1, Milch — Bestimmung des Stickstoffgehaltes — Teil 1: Kjeldahl-Verfahren (ISO/DIS 8968-1:1998); Deutsche Fassung prEN ISO 8968-1:1998.
3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe:
3.1
Molkenproteinanteil im Gesamtprotein
der mit dem in dieser Norm festgelegten Verfahren bestimmte Massenanteil an Substanzen ANMERKUNG Der Molkenproteinanteil im Gesamtprotein wird in Prozent angegeben.
3.2
Cystinwert
das Verhältnis der Masse an Cystin zu der Masse an Stickstoff
ANMERKUNG Der Cystinwert wird in Mikrogramm Cystin je Milligramm Stickstoff (µg/mg) angegeben.
4 Kurzbeschreibung
Von der Probe wird der so genannte Cystinwert bestimmt. Dieser Wert ist ein Maß für den Cystein- und den Cystingehalt der Proteine einer Probe. Die Molkenproteine, die in Milch etwa 20 %1) des Gesamtproteins darstellen, enthalten viel Cystin und Cystein (Cystinwert etwa 235 µg/mg N). Der Caseinanteil im Gesamt- protein von Milch beträgt etwa 80 %1). Die Caseine enthalten nur wenig Cystin und Cystein (Cystinwert et- wa 19 µg/mg N).
1) Massenanteil.
Der Cystinwert eines Milchproduktes ist daher um so größer, je höher der Molkenproteinanteil am Gesamt- protein ist. Zur Bestimmung des Cystinwertes wird die Probe mit sulfithaltiger Harnstoff-Pufferlösung ver- setzt. Dadurch wird Cystin zu Cystein reduziert.
3
3 R SH R S SO
HSO R S S
R− − − + → − + − − (1)
Anschließend wird das Cystein mit Methylquecksilberchlorid umgesetzt.
HCl CH SHg R HgCl CH SH
R− + 3 → − − 3+ (2)
Das für diese Umsetzung nicht verbrauchte Methylquecksilberchlorid wird polarographisch bestimmt.
Der Polarograph wird mit einer Cystinlösung kalibriert und der Cystinwert als µg Cystin je mg Stickstoff be- rechnet.
Der Molkenproteinanteil im Gesamtprotein wird aus dem Cystinwert einer Probe und den Referenzwerten für molkenproteinfreies Casein und für caseinfreie Molkenproteine berechnet.
5 Chemikalien
5.1 Allgemeines
Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss destilliert oder min- destens von entsprechender Reinheit sein.
5.2 Sulfithaltige Harnstoff-Pufferlösung pH = 9,3
9 g Ammoniumchlorid, NH4Cl40 g Kaliumchlorid, KCl
25 g Natriumsulfit (wasserfrei), Na2SO3
500 g Harnstoff, CH4N2O 1 g Triton X-1002)
werden zusammen in Wasser gelöst, mit Ammoniaklösung w(NH3) = 25 %3) auf einen pH-Wert von 9,3 ein- gestellt und mit Wasser zu 1 l aufgefüllt. Die Pufferlösung ist verschlossen aufbewahrt, bei Raumtempera- tur vier bis acht Wochen verwendbar.
5.3 Methylquecksilberchlorid-Lösungen
WARNUNG — Methylquecksilberchlorid (CH3HgCl) ist hochgiftig und ist wie alle Quecksilberverbin- dungen zu entsorgen (MAK-Wert: 0,01 mg/m3). Folgende Punkte sind bei der Handhabung zu beach- ten: Nicht direkt einatmen! Beim Einwägen Wägegläschen mit Deckel verwenden! Veränderungen der Substanzmenge nur unter dem Abzug vornehmen! Hautkontakt vermeiden! Beim Herstellen der Lösungen Einmalhandschuhe tragen! Zum Pipettieren stets Sicherheitspipetten (z. B. Kolben- pipette) benutzen.
2) Triton X-100 ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrich- tung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN.
Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen führen.
3) w ist der Massenanteil.
5.3.1 Stammlösung
(625 ± 10) mg Methylquecksilberchlorid (CH3HgCl) werden auf einer oberschaligen Waage im Abzug (!) in ein Wägegläschen mit Deckel eingewogen, mit etwas N,N-Dimethylformamid gelöst und quantitativ mit N,N-Dimethylformamid in einen 25-ml-Messkolben übergeführt. Es wird mit N,N-Dimethylformamid bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei Raumtemperatur haltbar.
5.3.2 Messlösung
2 ml der Stammlösung werden in einen 100-ml-Messkolben mit 23 ml N,N-Dimethylformamid (Messzylinder oder Dosimat) verdünnt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
Für jede CH3HgCl-Stammlösung (5.3.1) muss mit der Messlösung eine Kalibriergerade erstellt werden.
5.4 Cystin-Standardlösung
Etwa 110 mg Cystin werden in ein 50-ml-Becherglas auf 0,1 mg eingewogen und in 20 ml Salzsäure, c (HCl) = 1 mol/l, gelöst. Die Lösung wird mit Wasser in einen 1 000-ml-Messkolben quantitativ überge- spült. Anschließend wird der Messkolben mit destilliertem Wasser aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung ist stets frisch herzustellen.
5.5 Salzsäure-Lösungen
5.5.1 c (HCl) = 1 mol/l4) 5.5.2 c (HCl) = 0,02 mol/l4)5.6 Stickstoff hoher Reinheit,
Volumenkonzentration σ = 99,999 %5.7 Petroleumbenzin,
Siedebereich von 40 °C bis 60 °C (siehe 8.1).6 Geräte und Hilfsmittel
6.1 Allgemeines
Es sind die Geräte und Hilfsmittel nach E DIN EN ISO 8968-1 sowie die in 6.2 bis 6.12 aufgeführten zu verwenden.
6.2 Waagen
6.2.1 Oberschalige Waagen, Skalenteilungswert 0,001 g
6.2.2 Analysenwaage, Skalenteilungswert 0,1 mg
6.3 Polarograph mit Polarographierstand,
geeignet zur differentiellen Pulspolarographie. Vorzugs- weise ausgestattet mit einer temperierbaren Messzelle. Das verwendete Quecksilber muss Analysen- qualität besitzen.4) c ist die Stoffmengenkonzentration.
Beispiel für eine Geräteeinstellung
UStart − 0,2 V
∆U − 1,5 V
tdrop 0,8 s
mm/tdrop 0,25
UDP 250 × 0,2 mV
6.4 Thermostat,
einstellbar auf (20 ± 1) °C6.5 1-m
llll-, 2-m
llll-, 3-m
llll-, 4-m
llll-, 5-m
llll- und 25-m
llll-Vollpipetten,
z. B. nach DIN 126916.6 5-m
llll-Messpipette,
z. B. nach DIN 126976.7 2-m
llll-Kolbenhubpipette,
z. B. nach DIN 12650-26.8 25-m
llll-Messzylinder oder Dosimat
6.9 Messkolben,
Nennvolumen 25 ml, 100 ml und 1 000 ml, z. B. nach DIN EN ISO 10426.10 Bechergläser,
Nennvolumen 100 ml, z. B. nach DIN 123316.11 Glasstäbe,
Länge etwa 12 cm, Durchmesser etwa 0,5 cmWahlweise bei stark fetthaltigen Proben zusätzlich die Geräte nach 6.12 und 6.13.
6.12 Soxhlet-Apparatur mit Extraktionshülsen
6.13 Gefriertrocknungsanlage oder Vakuumtrockenschrank,
einstellbar auf (50 ± 2) °C7 Probenahme
Nach DIN EN ISO 707
8 Durchführung
8.1 Vorbereitung stark fetthaltiger Proben
Stark fetthaltige Proben wie Sahne, Kondensmilch, Frischkäse und Käse mit mehr als 40 % Massenanteil an Fett in der Trockenmasse müssen weitgehend entfettet werden. Hierzu werden die Proben mit einem geeigneten Gerät nach 6.13 getrocknet und die Pulver anschließend in einer Soxhlet-Apparatur nach 6.12 etwa 2,5 h mit Petroleumbenzin (5.7) extrahiert.
8.2 Einwaage
Von jeder Probe werden vier bis fünf unterschiedliche Mengen, die innerhalb der in Tabelle 1 angegebenen Bereiche liegen, in 100-ml-Bechergläser (6.10) eingewogen.
Tabelle 1 — Richtwerte für Einwaagen einiger Milchprodukte
Produkt Einwaage
mg
Milch, Buttermilch, Molke 400 bis 1 600
Milchpulver, Buttermilchpulver, Caseine, Caseinate, Molkenpulver, Käse, Speise- eis nach Probenvorbereitung nach 8.1
40 bis 160
Speisequark (alle Fettgehaltsstufen) 200 bis 600
Molkenproteinpulver 7 bis 30
8.3 Bestimmung
8.3.1 Stickstoff- bzw. Proteinbestimmung
Bei Milch und Milchprodukten ohne besonderen Proteinabbau (Milchpulver, Molke, Molkenpulver, Butter- milch, Buttermilchpulver, Retentat, Permeat, Joghurt, Speiseeis) ist der Stickstoffgehalt der mit Zinksulfat und Natronlauge fällbaren Stickstoffverbindungen zu bestimmen. Bei Caseinen, Caseinaten, reinen Milcheiweißpulvern sowie bei Frischkäsen und gereiften Käsen ist der Gesamtstickstoffgehalt nach E DIN EN ISO 8968-1 zu bestimmen.
8.3.2 Leerwert
Es werden 5 ml Salzsäure-Lösung (5.5), c = 0,02 mol/l, 25 ml sulfithaltige Harnstoff-Pufferlösung (5.2) und 2 ml Messlösung nach 5.3.2 in ein Polarographiergefäß pipettiert und auf (20 ± 1) °C vortemperiert. Dann wird kurz (etwa 1 min) Stickstoff erst durch die Lösung und danach über diese hinweggeleitet. Nachdem die Lösung wieder zur Ruhe gekommen ist (nach etwa 1 min), wird das Polarogramm bei (20 ± 1) °C aufge- zeichnet. Bei herkömmlichen Polarographen wird die Peakhöhe beim Halbstufenpotential der Methylqueck- silberchlorid-Lösung (um − 570 mV) ermittelt. Als Peakhöhe H0 gilt der senkrechte Abstand in Millimeter von der Spitze des Peaks zur Tangente, die am tiefsten Punkt des rechten Kurvenastes angelegt wird. Bei VA-Prozessoren wird mit dem nA-Wert beim Halbstufenpotential gerechnet.
8.3.3 Probenwert
Die Pulvereinwaagen in den 100-ml-Bechergläsern werden mit 5 ml Salzsäure-Lösung, c = 0,02 mol/l, und 25 ml sulfithaltiger Harnstoff-Pufferlösung versetzt und mit einem Glasstab umgerührt bis sich die Probe weitgehend gelöst hat. Bei Milch, flüssigen Milchprodukten und Speisequark wird die Einwaage mit Salz- säure-Lösung, c = 0,02 mol/l, auf 5 g (Messpipette) ergänzt und mit 25 ml sulfithaltiger Harnstoff- Pufferlösung versetzt.
Dann werden 2,0 ml Methylquecksilberchlorid-Lösung nach 5.3.2 zugesetzt, und es wird erneut umgerührt.
Mit einer Folie abgeschlossen, können so 15 bis 20 Einwaagen für die Polarographie vorbereitet werden.
Der jeweils zur Polarographie anstehende Ansatz wird in einem Wasserbad auf 20 °C vortemperiert und dann in das (temperierbare) Polarographiergefäß übergeführt. Es wird kurz (etwa 1 min) Stickstoff durch die Lösung geleitet, anschließend 1 min, bei fetthaltigen Proben 4 min gewartet (der Stickstoff strömt dabei über den Ansatz hinweg) und dann das Polarogramm bei (20 ± 1) °C erstellt. Die Peakhöhe (H1 bis H5) bzw. der nA-Wert wird wie beim Leerwert beschrieben ermittelt.
8.3.4 Kalibrierung
Von der Cystin-Standardlösung werden x ml (x = 1 bis 5) im Polarographiergefäß oder 100-ml-Becherglas mit (5 minus x ml) Salzsäure-Lösung (c = 0,02 mol/l), 25 ml Pufferlösung nach 5.2 und 2,0 ml Methylqueck- silberchlorid-Lösung nach 5.3.2 versetzt und bei (20 ± 1) °C in einem (temperierbaren) Polarographiergefäß polarographiert. Die Peakhöhen H1C bis H5C sind wie in 8.3.2 beschrieben zu ermitteln. Die Peakerniedri- gungen y (in mm bzw. nA) werden gegen die je Ansatz enthaltene Masse Cystin x (in mg) aufgetragen. Aus den x- und den dazugehörigen y-Werten ist die Regressionsgerade zu berechnen. Die Steigung b der Ge- raden entspricht der Peakerniedrigung je mg Cystin.
Die Kalibrierung ist zu wiederholen, wenn eine neue CH3HgCl-Stammlösung zum Einsatz kommt oder wenn trotz gleicher Stammlösung für den Leerwert mit einer frisch bereiteten CH3HgCl-Messlösung eine stetige Abnahme beobachtet wird, denn dies deutet auf eine langsame Veränderung der Kapillareigen- schaften hin. Die Kapillare sollte dann erneuert werden.
Zur Aufstellung der Geradengleichung und damit zur Bestimmung der Steigung bc wären theoretisch zwei Messpunkte ausreichend. Um den Fehler möglichst gering zu halten, werden fünf Geradenpunkte ermittelt.
Liegt bei der Aufzeichnung der Geraden ein Wert deutlich daneben, wird dieser abweichende Wert elimi- niert. Der Korrelationskoeffizient r sollte größer als 0,999 7 sein.
9 Auswertung
9.1 Berechnung
9.1.1 Berechnung der Peakerniedrigung je Milligramm (mit ZnSO4 und Natronlauge fällbarem) Stickstoff der Probe
Für jede Einwaage wird die Masse an Stickstoff bzw. die Masse an mit ZnSO4 und NaOH fällbarem Stick- stoff berechnet (x-Werte) und die Peakerniedrigung des Leerwertes durch die Probe festgestellt (y-Werte:
H0 — H1, H0 — H2 usw.). Aus den so erhaltenen x-Werten und den dazugehörigen y-Werten ist die Glei- chung der Geraden y = bx + a zu ermitteln. Die Steigung b der Geraden entspricht der Peak-erniedrigung bezogen auf die Masse an (mit ZnSO4 und Natronlauge fällbarem) Stickstoff in Millimeter je Milligramm [mm/mg] (bzw. Nanoampere je Milligramm [nA/mg]).
9.1.2 Berechnung des Cystinwertes der Probe
Der Cystinwert der Probe, ζC,N, angegeben als Massenverhältnis in Mikrogramm Cystin je Milligramm Stick- stoff, wird nach Gleichung (3) berechnet:
C N
y y
C,N
= ⋅ 103
ζ (3)
Dabei ist
yN die Peakerniedrigung bezogen auf die Masse an Stickstoff, angegeben in Millimeter bzw. Nano- ampere je Milligramm Stickstoff;
yC die Peakerniedrigung bezogen auf die Masse an Cystin, angegeben in Millimeter bzw. Nano- ampere je Milligramm Cystin.
9.1.3 Berechnung des Molkenproteinanteils im Gesamtprotein der Probe
Der Molkenproteinanteil wMP im Gesamtprotein, angegeben als Massenanteil in Prozent, wird nach Gleichung (4) berechnet:
19 100 235
) 19 ( ,
− ⋅
= CN −
w ζ
MP (4)
Dabei ist
ζC,N der Cystinwert der Probe nach 9.1.2.
9.2 Präzision
9.2.1 AllgemeinesDie Präzisionsdaten wurden in einem nach DIN ISO 57255) durchgeführten Ringversuch an lyophilisiertem Speisequark mit einem Molkenproteinanteil von 6 % (a) bzw. 18 % (b) ermittelt.
9.2.2 Wiederholpräzision
Die Differenz zwischen zwei an identischem Untersuchungsmaterial durch einen einzigen Bearbeiter mit derselben Geräteausstattung innerhalb der kürzestmöglichen Zeitspanne gefundenen Ermittlungser- gebnissen darf bei üblicher und korrekter Anwendung des Verfahrens die Wiederholgrenze r im Mittel nicht häufiger als einmal in 20 Fällen überschreiten.
a) r = 0,8 % sr = 0,28 % b) r = 0,9 % sr = 0,32 %
ANMERKUNG sr ist die Wiederholstandardabweichung.
9.2.3 Vergleichpräzision
Durch zwei Labors mitgeteilte Ermittlungsergebnisse an identischem Untersuchungsmaterial dürfen sich bei üblicher und korrekter Anwendung des Verfahrens im Mittel nicht häufiger als einmal in 20 Fällen um mehr als die Vergleichgrenze R unterscheiden.
a) R = 1,3 % sR = 0,46 % b) R = 2,0 % sR = 0,71 %
ANMERKUNG sR ist die Vergleichstandardabweichung.
10 Hinweise zur Durchführung und Auswertung
Es entspricht dem Messprinzip dieser Norm, die Differenz aus der Höhe des Leerwertes und der Höhe des Probenwertes zu bilden. Rechnerisch ergibt sich für die Steigung der Geraden der gleiche Wert (mit negati- vem Vorzeichen), wenn die gemessenen Höhen (bzw. nA-Werte) direkt zum Stickstoffgehalt der Einwaage bzw. zum Cystingehalt der Cystin-Standardlösung in Beziehung gesetzt werden. In diesem Fall darf der Leerwert (0 mg Cystin bzw. 0 mg Probe) nicht in die Berechnung einbezogen werden.
Bei Proben, die sich nach der Herstellung nur unwesentlich verändern oder deren Zustand durch Gefrier- trocknung erhalten werden kann, wird üblicherweise der tatsächliche Proteinstickstoff-Gehalt durch Fällung mit Zinksulfat und Natronlauge bestimmt. Der Nichtproteinstickstoff wird also nicht in die Berechnung ein- bezogen. Bei Käse wird von diesem Prinzip abgegangen, da hier je nach Reifegrad der tatsächliche Pro- teinstickstoff-Gehalt mit der Zeit abnimmt. Zudem sind an der Reifung nahezu ausschließlich die Caseine beteiligt, nicht aber die Molkenproteine. Wenn im reifen Käse nur der Proteinstickstoff-Gehalt, nicht der Ge- samtstickstoffgehalt der Berechnung zugrunde gelegt wird, ist ein höherer Molkenproteinanteil zu erwarten als im unreifen Käse. In Proben mit besonders hohem Fettgehalt und verhältnismäßig niedrigem Protein- gehalt (z. B. Rahm) und in Buttermilch, d. h., in Proben mit einem relativ hohen Anteil an Fettkügelchen- membranprotein, werden im Vergleich zu Proben mit mäßigem Fettgehalt erhöhte Cystinwerte gefunden, in Proben mit extremer Wärmebelastung (z. B. Kondensmilch) niedrigere Cystinwerte. Das bedeutet, dass es in diesen besonderen Fällen sinnvoller ist, das Produkt durch den Cystinwert zu charakterisieren und nicht durch den Molkenproteinanteil.
5) DIN ISO 5725:1988-04 (jetzt zurückgezogen) wurde zur Ermittlung der Präzisionsdaten verwendet.
11 Untersuchungsbericht
Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Norm mindestens anzugeben:
a) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;
b) Art und Datum der Probenahme;
c) Eingangs- und Untersuchungsdatum;
d) Molkenproteinanteil im Gesamtprotein, angegeben als Massenanteil in Prozent;
e) Begründung, falls von dieser Norm abgewichen wurde.
Literaturhinweise
DIN 10472, Bestimmung des Molkenprotein- und Caseinanteils am Gesamtprotein von Milch und Milchpro- dukten — Elektrophoretisches Verfahren.
DIN 12331, Laborgeräte aus Glas — Becher.
DIN 12650-2, Mechanische, physikalische und elektrische Laborgeräte — Volumenmessgeräte mit Hub- kolben — Kolbenhubpipetten.
DIN 12691, Laborgeräte aus Glas — Vollpipetten mit einer Marke, schnellablaufend, Wartezeit 15 Sekun- den, Klasse ASS.
DIN 12697, Laborgeräte aus Glas — Messpipetten, schnellablaufend, Wartezeit 15 Sekunden, Klasse ASS.
DIN EN ISO 1042, Laborgeräte aus Glas — Messkolben (ISO 1042:1998); Deutsche Fassung EN ISO 1042:1999.
DIN ISO 5725, Präzision von Messverfahren — Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpräzision von fest- gelegten Messverfahren durch Ringversuche; Identisch mit ISO 5725, Ausgabe 1986.
Lechner, E. (1990): Bestimmung des Molkenproteinanteils im Gesamtprotein von Frischkäse und gereiftem Käse, dmz, Lebensmittelindustrie und Milchwirtschaft 111, 1112–1117.
