Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Einfluss eines Bindungspeptids
auf spermatologische Parameter in vitro und Befruchtungsergebnisse bei Jungsauen
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Meike Evert aus Lamspringe
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung : Apl. Prof. Dr. Dr. h.c. K.F. Weitze Apl. Prof. Dr. D. Waberski
1. Gutachter : Apl. Prof. Dr. K.F. Weitze 2. Gutachter : PD Dr. A. Einspanier
Tag der mündlichen Prüfung : 28.05.2002
Die Arbeit wurde durch Forschungsmittel der BioPoreTM Inc., State College, PE, USA und der Joachim- und Irene- Hahn- Stiftung gefördert.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 9
2 LITERATUR 12
2.1 SPERMIEN- EIZELLBINDUNG 12
2.1.1 DIE ZONA PELLUCIDA 12
2.1.2 AKROSOMENREAKTION DES SPERMIUMS 27
2.1.3 BINDUNGSMECHANISMUS 42
2.2 DER DUDFINDERTMSPERMIEN BINDUNGSASSAY (SBA) 49
2.2.1 ENTWICKLUNG 49
2.1.2 DURCHFÜHRUNG DES DUDFINDER TMSPERMIEN- BINDUNGSASSAYS 52 2.1.3 VERGLEICH MIT ANDEREN SPERMIENBINDUNGSASSAYS 53
2.3 PROSAPOSIN 56
2.3.1 CHARAKTERISIERUNG DES PEPTIDS 56
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 69
3.1 MATERIAL UND METHODE 69
3.1.1 VERSUCHSTIERE 69
3.1.2 GEWINNUNG DES SPERMAS 70
3.1.3 HERSTELLUNG DER BESAMUNGSPORTIONEN 72 3.1.4 BEURTEILUNG DES SPERMAS IN- VITRO 74
3.1.5 BRUNSTKONTROLLE 78
3.1.6 INSTRUMENTELLE BESAMUNG 79
3.1.7 BESTIMMUNG DES OVULATIONSZEITPUNKTES 79 3.1.8 GEWINNUNG UND DARSTELLUNG DER EMBRYONEN UND OOZYTEN 81 3.1.9 EMBRYONEN- UND OOZYTENUNTERSUCHUNG 82
3.1.10 STATISTISCHE AUSWERTUNG 84
3.2 ERGEBNISSE 86
3.2.1 SELEKTION DER EBER 86
3.2.2 IN-VITRO ERGEBNISSE 88
3.2.3 BEFRUCHTUNGSERGEBNISSE 105
4 DISKUSSION 116
4.1 SPERMIENUNTERSCHIEDE 116
4.2 BEFRUCHTUNGSERGEBNISSE 123
5 ZUSAMMENFASSUNG 127
6 SUMMARY 129
7 LITERATURVERZEICHNIS 131
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
AM Akrosomenmembran
AS Akzessorische Spermien
ATP Adenosintriphosphat
BHZP Bundeshybridzuchtprogramm
BTS Beltsville thawing Solution
°C Grad Celsius
Ca 2+ Calcium- Ion
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat
cm Zentimeter
CTC Chlortetracyclin
d.h. das heißt
DAG Diacylglycerol
DNA Desoxyribonucleinacid
Fuc Fucose
Gal Galaktose
Glc Glucose
GlcNAC N- Acetylglucosamin
GTP Guanidyltriphosphat
GTP Guanisintriphosphat
h Stunde
H+ Wasserstoffion
IP3 Inositoltriphosphat
IVF In-vitro Fertilisation
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
Man Mannose
MAS Morphologisch abweichende Spermien
mg Milligramm
MHz Megahertz
ml Milliliter
mZP Mäuse- Zona Pellucida
n Anzahl
Na+ Natrium- Ion
nm Nanometer
p. Ov. post Ovulationem
PBS Phosphate Buffered Solution
PG Prostaglandin
pg Picogramm
PI Propidiumiodid
PIP2 Phosphoinositoldiphosphat
PM Plasmamembran
pMol Piko-Mol
PT Plasmatropfen
PVM Perivitellinmembran
pZP Porcine- Zona Pellucida
SAS Statistical Analysis System
SD Standardabweichung
SGP- 1 Sulfatiertes Glykoprotein- 1
Tab. Tabelle
TG- Sperma Tiefgefriersperma
UPSEBP Universal Sperm Egg Binding Protein
ZP Zona pellucida
ZP-1, -2, -3, -A, -B, -C Zona pellucida- Protein -1, -2, -3, -A, -B, -C
µl Mikroliter
µMol Mikromol
1 Einleitung
Bevor es zur Spermien-Eizellbindung und damit zum entscheidenden Schritt der Befruchtung kommt, durchlaufen Säugetierspermien auf ihrem Weg vom Ort der Samendeponierung in Scheide oder Uterus zum Ort der Befruchtung im mittleren Eileiter eine Serie von Reifungsschritten, die nur dann zur Etablierung einer zahlenmäßig ausreichend großen befruchtungsfähigen Spermien- population im unteren Eileiteristhmus führen, wenn sie in einer ganz bestimmten Reihenfolge am jeweils richtigen Ort erfolgen.
Unter Berücksichtigung dieser komplexen Zusammenhänge kommt es häufig bereits vor der Insemination zur Beeinträchtigung der Befruchtungsfähigkeit der applizierten Spermienpopulation, ohne dass dieses anhand routinemäßig erhobener Spermienparameter, wie Vorwärtsbeweglichkeit oder Anteil morphologisch veränderter Spermien, im Einzelfall abzuschätzen ist.
Kenntnisse über spermienassoziierte Proteine und deren Bedeutung im Rahmen dieser Reifungsschritte lassen erkennen, dass wesentliche Veränderungen an den verschiedenen Domänen der Spermienmembran im Verlauf der Nebenhodenpassage ablaufen, die mit der Ejakulation und der damit verbundenen Vermischung mit dem Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen einen Zustand bewirken, in der die Samenzellen bereits nach kurzfristigem Aufenthalt im weiblichen Genitaltrakt die Befruchtungsfähigkeit erreichen können, falls die Ovulation der Eizelle kurz bevorsteht (AMANN et al., 1993; YANAGIMACHI, 1994; HAMMERSTEDT et al., 2001). Es wird davon ausgegangen, dass einige der in Hoden, Nebenhoden und durch akzessorisches Sekret an die Spermienmembran assoziierte Proteine von spezifischer fertilitätsentscheidender Bedeutung sind (KUILLAN et al., 1993; KLINEFELTER et al., 1997). Insbesondere wurden verschiedene spezifische glykosilierte Proteine mit der Spermien- Eizellbindung in Zusammenhang gebracht (WASSARMAN und LITSCHER, 1995), wobei einige Autoren (TOEPFER-PETERSEN et al., 1995) die Rolle
multipler und synergistischer Seitenketten besonders hervorheben. Viele dieser Moleküle haben sich während der Evolution bei den Säugetierspezies kaum verändert. Zu diesen Molekülen zählt auch das Protein Prosaposin, welches im Cytoplasma und dem Sekret der Sertolizellen reichlich vorkommt, mit dem Seminalplasma ausgeschleust wird und in Kontakt mit der Spermienoberfläche kommt. Prosaposin wird auch als sulfatiertes Glykoprotein-1 (SGP-1) bezeichnet (COLLARD et al., 1988; O’BRIEN und KISHIMOTO, 1991; KISHIMOTO, 1992).
Ein Fragment von Prosoposin mit zirkulärer Struktur, welches von HAMMERSTEDT et al. (2001) als „Universal Sperm Egg Binding Protein“
(UPSEBP) bezeichnet wurde, basiert auf der Struktur des Rattenprosaposins und besteht aus 60 Aminosäuren.
Es fördert über nicht-speziesspezifische Liganden die initiale Spermien- Eizellbindung (AMANN et al., 1999 a, b) und kam in den vorliegenden Untersuchungen als FertPlus®- Peptid zur Anwendung. Bisher vorliegende Ergebnisse der Inkubation von Spermien mit dem FertPlus®- Peptid haben gezeigt, dass es unter in- vitro Fertilisationsbedingungen (IVF) von Mäuseeizellen zu einer Steigerung des Anteils befruchteter Eizellen (MARGAGREE et al., 2000) und zur Verbesserung der Befruchtungsrate von in- vitro befruchteten Rindereizellen kommt (SEIDEL et al., 2001). Nach AMANN et al. (1999 b) und GILL et al. (1999) bewirkt dieses Peptid nach Inkubation von Menschen-, Mäuse-, Eber- oder Bullensperma bzw. Bullen- Tiefgefriersperma eine signifikante Steigerung von in-vitro- Befruchtungsergebnissen und führte im Rahmen von Besamungsversuchen mit Puten- und Hahnsperma zu einer signifikanten Steigerung der Befruchtungsrate und Anzahl geschlüpfter Küken.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob der Zusatz von FertPlus® in einer Konzentration von 0,2 und 1 µMol zu flüssigkonserviertem Schweinesperma einen Einfluß auf verschiedene spermatologische Parameter im Verlauf einer Lagerung von bis zu 5 Tagen hat und die experimentelle Insemination von spontan brünstigen Jungsauen
unter Anwendung intensiver Brunst- und Ovulationskontrolle die Befruchtungsrate auf der Basis von Tag 3 bis 5 Embryonen, sowie die Anzahl akzessorischer Spermien/ Zona pellucida beeinflußt.
2 Literatur
2.1 Spermien- Eizellbindung
2.1.1 Die Zona pellucida
2.1.1.1 Morphologie und Biosynthese der Zona pellucida
Die Zona pellucida (ZP) ist eine transparente extrazelluläre Matrix, die Oozyten und präimplantatorische Embryonen der Säugetiere umgibt (SINOWATZ et al., 2000).
Der Zellkern der Eizelle liegt, wie bei jeder anderen Zelle auch, eingebettet im Zytoplasma, welches von einer Vitellin- bzw. Plasmamembran umschlossen wird. Zwischen der die Eizelle umhüllenden Zona und der Plasmamembran befindet sich der perivitelline Raum (AUSTIN et al., 1982).
Die ZP besteht aus einer komplexen Glykoproteinmatrix, die beim Schwein eine Dicke von 13-16 µm und einen Durchmesser von 100-150 µm hat (PRASAD et al., 2001).
Abbildung 1: Die Oozyte und ihre assoziierten Zellen kurz nach der Ovulation. Cumulus und Corona radiata- Zellen werden bei einigen Spezies vor der Befruchtung abgestoßen (nach BEARDEN und FUQUAY, 1997).
Die ovulierte Eizelle ist von einer mehrlagigen Schicht von Granulosazellen umgeben, die direkt an der ZP angelagert sind und als Corona radiata bezeichnet werden (Abbildung 1); Eizelle und Corona radiata ergeben zusammen den Cumulus- Oozyten-Komplex (ALBERTS et al., 1990).
Die Follikelzellen des ZP- nahen Cumulus oophorus nehmen Kontakt mit der Eizelle auf, wodurch die parakrine Kommunikation zwischen beiden Zelltypen während des Wachstums der Eizelle gesichert wird (TOEPFER-PETERSEN et al., 2000).
Daneben kommen auch zytoplasmatische „gap junctions“ vor (DORST, 1991), in denen Microvilli der Oozyten und Fortsätze des benachbarten Follikelepithels liegen. Diese bis in die Eizelle eindringenden Zytoplasmaausläufer sollen der Bereitstellung von Nährstoffen für die Eizelle dienen (SCHNORR, 1996).
Die Entwicklung und der extrazelluläre Zusammenbau der ZP geschieht während der frühen Entwicklungsstufen der ovariellen Follikulogenese, der die Meiose der Oozyte folgt. Durch Vereinigung der Zellen bildet sich eine die gesamte Eizelle umgebende Hülle, die im Stadium des Sekundär- und Tertiärfollikels aus einer dichten inneren und lockeren äußeren Schicht aufgebaut ist. Die äußere Schicht der Zona besitzt eine fenestrierte schwammartige Oberfläche, mit charakteristischer „Schweizer Käse- Struktur“, welche wahrscheinlich das Ergebnis der Ausdehnung während des Follikelwachstums ist. Die poröse Matrix dieser Struktur erlaubt die Penetration von großen Molekülen, wie Immunglobulinen und Ferritin, aber ist unpermeabel für kleine Moleküle, wie Heparin. Demzufolge ist die Fähigkeit von Molekülen, die ZP zu passieren, nicht abhängig von der Größe, sondern von biochemischen und physikochemischen Eigenschaften. Die innere Oberfläche der ZP zeigt dagegen eine fein granulierte Struktur (SHIVERS und DUNBAR, 1977; DUNBAR et al., 1994). Diese Architektur der ZP verändert sich während der Reifung der Oozyte und während der Befruchtung (SUZUKI et al., 1994).
Die Größe, Dicke und Widerstandsfähigkeit der ZP variieren stark von Spezies zu Spezies (Tabelle1).
Tabelle 1: Die Dicke der Zona pellucida verschiedener Spezies (nach DUNBAR, 1983; WASSARMAN und LITSCHER, 2001).
TIERART DICKE DER ZP
Opossum 2 µm
Maus 6,5 µm
Schwein und Mensch 13 bis 16 µm
Rind 27 µm
Die ZP der meisten Säugetiere setzt sich aus den drei Glykoproteinen ZP1, ZP2 und ZP3 zusammen, die viele Homologien innerhalb der Säugetierspezies aufweisen: Die Zona von Menschen, Schweinen, Kaninchen, Ratten, Mäusen, Hamstern und Pferden besitzt jede der Komponenten der drei Familien, wohingegen die Zona der Katzen nur zwei Familien besitzt (DUNBAR et al., 1994).
Die meisten Daten über die Struktur und Funktion stammen von Untersuchungen an der Maus. Neuere Daten von Schweinen und anderen Säugetieren zeigen jedoch, dass das Mäusemodell nicht für alle Spezies gilt:
z.B. besitzt das ZP3 der Maus (mZP3) die primäre Spermienrezeptor- Aktivität, während sie beim Schwein auf dem pZP3a lokalisiert ist (PRASAD et al.,1994).
Bei Nagetieren, die eine relativ dünne ZP besitzen, werden diese Glykoproteine durch die Oozyte selbst synthetisiert, wohingegen bei unseren Haussäugetieren (z.B. Schwein und Rind), die eine dicke ZP besitzen, während der Follikelentwicklung neben der Oozyte auch die umliegenden Granulosazellen zur Bildung beitragen (SINOWATZ et al., 1999). Nach PRASAD et al. (1994) spielen die Glykoproteine der ZP auch in der Granulosazelldifferenzierung und Follikulogenese eine bedeutende Rolle.
Die Genexpression für Entwicklung und extrazelluläre Zusammensetzung dieser einzigartigen Matrix geschieht in den frühen Stufen der Follikulogenese. Bei der Maus werden die drei Glykoproteine von der Oozyte während ihrer sehr kurzen Wachstumsphase (in ca. 2- 3 Wochen) synthetisiert und sezerniert. Während dieser Periode vergrößert sich die Dicke der Oozyte von 12 µm auf ca. 80 µm (WASSARMAN und LITSCHER, 2001).
Die Zona kann durch chemische Analysen in mehrere Komponenten zerlegt werden (Tabelle 2) (DUNBAR et al., 1980).
Tabelle 2: Komponenten der Zona pellucida des Schweines nach chemischer Analyse (nach DUNBAR et al., 1980)
Komponente %
Protein 71
neutrale Hexosen 19
Sialinsäure 7
Sulfate 2,4
andere 0,6
Die ZP der meisten Säugetiere umfasst drei große Glykoproteine mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten und Heterogenitäten, die durch posttranslationale Modifikationen einschließlich Glykosielierung und Sulfatierung hervorgerufen werden (WASSARMAN, 1988). Dadurch kommt es zu Unterschieden der ZP-Struktur und -Funktion bei Nagetieren und domestizierten Tieren (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001).
Die Maus war die erste Säugetierspezies, bei der die einzelnen Glykoproteine der ZP mittels Gelelektrophorese isoliert werden konnten. Das Glykoprotein mit dem höchsten Molekulargewicht von ca. 200 kDa nannte man mZP1. Die darauf folgenden Glykoproteine mZP2 und mZP3 besitzen ein Molekulargewicht von 120 kDa bzw. 83 kDa (BLEIL und WASSARMAN, 1980).
Die Verwechslungen um die Identifikation der verschiedenen ZP- Glykoproteine stammen von der unterschiedlichen Nomenklatur, die zur Beschreibung der komplexen Natur der ZP-Proteine verwendet wird. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Isolierung großer Anzahlen von Säugetieroozyten und Zonae (DUNBAR et al., 1980) und die Festlegung der primären Aminosäuresequenz der ZP- Glykoproteine durch geklonte cDNA vieler Spezies, führte zur detailierten Charakterisierung der ZP-Glykoprotein- Familien (Tabelle 3) (DUNBAR et al., 1994). Mit der Identifizierung der kodierenden Gene für die einzelnen Glykoproteine gelang es HARRIS et al.
(1994) ein einheitliches speziesübergreifendes System zu etablieren: Sie führten die Begriffe der ZPA-, ZPB- und ZPC- Genfamilie ein, wobei sie sich an der Anzahl der Basenpaare orientierten, d.h. das ZPA ist das größte und das ZPC ist das kleinste Gen.
Tabelle 3: Charakteristika der ZP- Proteine bei verschiedenen Säugetierspezies
(nach PRASAD et al., 2000 und SINOWATZ et al.,2001) -: Keine Angaben in der Literatur vorhanden;
1: Hergeleitet von der cDNA- Sequenz 2: Vergleich auf dem Aminosäure- Level
Tierart ZP- Protein
Molekular gewicht
(kDa)
Amino- säure-
reste1
Anzahl der glyko- silierten
Seiten
Identität zum Menschen2
%
Genom- größe/
Anzahl der Exons Mensch ZP1
ZP2 ZP3/
low ZP3/
high
80- 92 58- 62 54- 62 58- 72
540 745 424 -
6 6 4 -
- - - -
11kb/12 14kb/19 18,3kb/8
-
Maus ZP1 ZP2 ZP3
200 120 83
623 713 424
6 7 6
39 60 67
6,5kb/12 12,1kb/18
8,6kb/8 Kaninchen ZP1
ZP2 ZP3
68-125 81- 100 100- 132
540 684 419
6 7 5
71 72 69
- - -
Schwein ZP1 ZP3α ZP2
ZP3ß ZP4
80-90 60-65 55 55 20- 25
716 716 536 421 -
7 7 5 4 -
64 64 68 73 -
20kb/18 - - - -
Rind ZP1 ZP3α ZP2
ZP3
78 64 21 21
- - - -
- - - -
- - - -
- - - -
2.1.1.2 Die Glykoproteine der Zona pellucida
Die ZP-Glykoproteine können in die drei großen Familien ZP1, ZP2 und ZP3 entsprechend den Ähnlichkeiten ihrer Aminosäuresequenz eingeteilt werden.
Die Charakteristika der ZP-Proteine von verschiedenen Spezies und ihrer Nomenklatur sind in Tabelle 3 aufgelistet. Die Polypeptidketten der drei Glykoproteine weisen zu 50-98% Homologien hinsichtlich der Nukleinsäuren auf (DUNBAR et al., 1994).
Obwohl das Molekulargewicht, welches von der cDNA-Aminosäuresequenz der individuellen nativen ZP- Proteine herrührt, Unterschiede aufweist, sind während der Evolution die Anzahl und Position der Cystein- Reste und der potentiell N-gebundenen glykosilierten Seiten innerhalb jeder Familie erhalten worden. Auch die Genom- Struktur einer jeden Familie weist ähnliche Intron-/ Exon- Organisationen auf (McLESKEY et al., 1998).
Die ZP1- Familie scheint hinsichtlich der Struktur und Funktion die wenigsten Homologien aufzuweisen. Das Mäuse- ZP1 (mZP1) ist hinsichtlich der Aminosäuren nur zu 39% identisch zum menschlichen ZP1, wohingegen das ZP1 von Kaninchen und Schweinen zu 70% identisch ist mit dem menschlichen ZP1. Desweiteren ist das mZP1 623 Aminosäuren lang und beinhaltet eine Sequenz in der N- terminalen Region, die im ZP1 anderer Spezies nicht vorhanden ist (PRASAD et al., 1997).
Die Glykoproteine der ZP formen lange Filamente, die netzartig miteinander verknüpft sind (HARRIS, 1994) und eine charakteristische Struktur bilden, die durch nicht- kovalente Bindungen eine sehr heterogene Mischung von Asparagin (N)- und Serin-/ Threonin (O)- gebundenen Oligosaccharid- Seitenketten darstellt (WASSARMAN et al., 1998).
Für die meisten Spezies steht fest, dass die Oligosaccharidketten der ZP und die komplementären Kohlenhydratbindungsproteine auf der Spermien- Oberfläche die initiale Bindung und Erkennung zwischen Spermien und ZP vermitteln (HOSHIBA und SINOWATZ, 1998).
An die Oligosaccharide sind Sulfate und Sialinsäure gebunden (NOGUCHI und NAKANO, 1992), was zusätzlich zur Heterogenität des Molekulargewichtes beiträgt und alle drei Glykoproteine relativ sauer macht (NAKANO und YONEZAWA, 2001).
Bei den Mäusen trägt das ZP- Protein 3 (mZP3) zusammen mit dem ZP- Protein 2 (mZP2 ) die Spermienrezeptor- Aktivität und das Akrosomenreaktion- induzierende Potential auf langen Heterodimer- Filamenten, die untereinander verbunden sind mit dem ZP- Protein 1 (mZP1) (WASSARMAN und MORTILLO, 1991).
Diese mehr oder weniger speziesspezifische Funktionen sind bei der Maus von Oligosacchariden der Glykoproteine abhängig, die in der Nähe von zwei Serin- Resten am Ende des Carboxylendes des 28 kDa- Peptides von mZP3 lokalisiert sind (ROSIERE und WASSARMAN, 1992; WASSARMAN und LITSCHER, 2001).
Dieser Abschnitt der Polypeptide hat sich während der Evolution unterschiedlich entwickelt und man nimmt an, dass diese Unterschiede auch in alternativen Oligosaccharidstrukturen für ZP3 der verschiedenen Säugetierspezies vorkommen (WASSARMAN und LITSCHER, 2001).
Auch die Vitellinmembran der Eizellen von Fischen, Vögeln und Amphibien besteht aus Glykoproteinen, welche den Polypeptiden von mZP1 bis mZP3 ähneln (WASSARMAN, 1999).
Im Mausmodell unterstützen folgende Ergebnisse die These, dass das mZP3 der primäre Spermienrezeptor ist:
Gezielte Zerstörung von mZP3- Genen durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen hat keinen Effekt auf die Phänotypen der männlichen Mäuse, aber die homozygoten Null- Weibchen erwiesen sich als unfruchtbar (LIU et al., 1996; RANKIN et al., 1996).
Die Ovarien von homozygoten Null- Weibchen (mZP3-/-) besitzen wachsende Oozyten, denen eine ZP komplett fehlt, wohingegen Oozyten von heterozygoten Null- Weibchen (mZP3+/-) eine ZP haben, deren Dicke (ca.
2,7 µm) nur die Hälfte des Wildtypes beträgt (WASSARMAN et al.,1997).
Nach Inkubation von einem der drei ZP- Glykoproteinen (purifiziert) und Spermien, bindet nur purifiziertes mZP3 an die Köpfe von akrosomintakten Spermien und verhindert dadurch die Bindung von Spermien an ovulierte Eier in vitro (BLEIL und WASSARMAN, 1980, 1986).
Desweiteren sind die Mäusespermien unfähig, an die ZP von bereits befruchteten Eizellen oder präimplantorischen Embryonen zu binden, bei denen die Zona- Reaktion bereits abgelaufen ist. Denn eine Konsequenz der Zona- Reaktion ist die Veränderung des mZP3, so dass frei- schwimmende Spermien die Glykoproteine nicht mehr erkennen und binden können (WASSARMAN und LITSCHER, 2001).
Beim Schwein jedoch können penetrationskompetente Spermien in die ZP von befruchteten Eizellen eindringen, während diese den unteren Eileiteristhmus durchwandert (WEITZE et al., 1988).
Die ZP- Glykoproteine ZPA, ZPB und ZPC beim Schwein werden auch pZP1, pZP3a und pZP3ß genannt (YONEZAWA und NAKANO, 2001) und können durch Elektrophorese in zwei Komponenten mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kDa und 90 kDa getrennt werden (HEDRICK und WARDRIP, 1986).
Die 55- kDa- Familie (ZPB oder ZP3a und ZPC oder ZP3ß), in der beim Schwein die Spermienrezeptor- Aktivität der Zona lokalisiert ist (ZP3a), bildet 70- 80% der gesamten Zona- Glykoproteine (YUREWICZ et al., 1991).
Die Information über die Oligosaccharidstruktur der ZP- Glykoproteine sind für das Schwein beinahe komplett und teilweise auch bei Maus und Rind verfügbar (TOEPFER-PETERSEN, 1999).
Obwohl die Strukturen der Oligosaccharidketten bei den drei Spezies grundlegend dieselben sind, unterscheiden sie sich in der Prozentzahl und Struktur der neutralen N- gebundenen Kohlenhydrat- Seitenketten (YUREWICZ et al., 1991). Intaktes ZP3a und ZP3ß kann nur voneinander separiert werden, wenn die saure N- Acetyllaktosamin- Region von ihren Kohlenhydratketten durch Endo- ß- Galaktosidase- Verdauung abgetrennt wird. Die durch ß- Galaktosidase separierte ZP3a und ihr N- terminales Fragment beinhalten die Spermien- Rezeptor- Aktivität (NAKANO und
YONEZAWA, 2001). Liegen pZP3a und pZP3ß jedoch zusammen vor, so wird die Spermienbindungskapazität vergrößert (YUREWICZ et al., 1991).
2.1.1.3 Die Kohlenhydratketten der Zona pellucida
Die N- gebundenen Oligosaccharide der 55 kDa- Familie (ZP3α und ZP3ß) der porcinen Glykoproteine bestehen aus neutralen (28%) und sauren (72%) Kohlenhydrat- Seitenketten.
Beim Schwein besitzen die neutralen N- gebundenen Kohlenhydratketten von pZP3a und pZP3ß die Spermien- Rezeptor- Aktivität, von denen die komplexen drei- und vierantennären Kohlenhydrat- Seitenketten eine stärkere Aktivität aufweisen als die zweiantennären. Die sauren Seitenketten dagegen scheinen keine Aktivität zu besitzen.
Die drei-/ vierantennären N- Glykane sind in der N- terminalen Region von reifen ZP3a lokalisiert (entspricht dem Glykopeptid A des pZP3α mit 111 Aminosäuren; Aminosäure- Reste 137- 247) (Abbildung 2), um die Bindung von Spermien an die ZP zu vermitteln, wohingegen die strukturell identischen drei-/ vierantennären N- Glykane von dem pZP3β- Molekül in der Gametenerkennung keine Rolle zu spielen scheinen. Das Glykopeptid A besitzt zwei N- gebundene Seitenketten bei Asparagin 203 und Asparagin 220. Wahrscheinlich binden die Eberspermien an die N- gebundenen Seitenketten auf Asparagin 220. Desweiteren trägt das pZP3ß zur Expression der Spermien- Rezeptor- Aktivität von neutralen N- gebundenen Seitenketten auf dem pZP3a bei (NOGUCHI et al., 1992; KUDO et al.,1998;
YONEZAWA et al.,1999 ).
Mittels spezifischer Zucker-Bindungsproteine (Lektine) ist es möglich, die unbekannten Zuckerstrukturen aufzuklären, da diese mit hoher Spezifität an bestimmte Zucker binden. Beim Schwein findet man a-D-Glucose, a-D- Mannose, ß-D-Galaktose sowie ß-(1-4)-D-N-Acetylglucosamin (2-3/6) N-
Acetyl- Sialinsäure. Neben Untersuchungen mit Lektinen war es in den letzten Jahren auch möglich, aufgrund besserer Analysemethoden Zuckerketten direkt zu analysieren. Die ZP-Glykoproteine pZP3a und pZP3ß haben je drei glykosidisch gebundene und drei (pZP3a) bzw. sechs (pZP3ß) O-glykosidisch gebundene Zuckerketten (NOGUCHI et al., 1992).
Ergänzende Studien manifestierten die speziesabhängigen Variationen in der Expression und Verteilung von Zucker-Seitenketten durch die ZP. Die Lektin- Bindungsmuster der verschiedenen Spezies sind hoch spezifisch (SHALGI et al., 1991). Einige Kohlenhydrat- Strukturen, wie Mannose und N- Acetyl- glukosamine, welche üblicherweise in der „Core“- Region von N- gebundenen Oligosacchariden vorkommen, wurden bei allen untersuchten Spezies gefunden (GEYER und GEYER, 1998).
Der einzige Unterschied zwischen diesen Oligosacchariden ist das C- terminale glykosilierte Ende innerhalb der ZP3ß- Moleküle, welches vielleicht zu einer reduzierten Zugänglichkeit zu diesen Glykanketten führt und von der Faltung des Moleküls abhängig ist. Diese Beobachtung hebt hervor, dass auch die Zusammensetzung von ZP- Glykoproteinen und der Aufbau der biologisch aktiven Oligosacchariden innerhalb der dreidimensionalen Struktur eine wichtige Eigenschaft für die physiologisch relevante Bindung zwischen beiden Gameten ist.
Desweiteren deuten die Untersuchungsergebnisse darauf hin, dass die Kohlenhydratketten, die im ZP3α an die Aminosäure Asparagin an der Stelle 220 gebunden sind, die vorherrschende Rolle in der Spermien- Ei- Bindung einnehmen (Abbildung 3) (NAKANO und YONEZAWA, 2001).
N
ZP1 36 268 668
N N S T N
pZP3a 23 137 203 220 333 466
N N T TT N
pZP3ß 23 124 146 271 348
Abbildung 2 (nach TOEPFER-PETERSEN et al., 2000): Schematische Darstellung von den bekannten N- glykosilierten Seiten in porcinen ZP- Glykoproteinen. Von den sechs potentiell N- glykosilierten Seiten des ZP1 ist nur das zweiantennäre N- Glykan an Asn 268 identifiziert worden (TOEPFER-PETERSEN, unveröffentlich). pZP3a und pZP3ß weisen drei glykosilierte Seiten auf (KUDO et al., 1998; YONEZAWA et al., 1999)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)Man(a1-6) Fuc(a1- 6) Man(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4)GlcNAc-PA- GlcNAc(ß1- 2)Man(a1- 3)
GlcNAc(ß1- 2)Man(a1- 6) Fuc(a1- 6) Man(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4)GlcNAc-PA- Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)Man(a1-3)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)Man(a1-6) Fuc(a1- 6) Man(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4)GlcNAc-PA- Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)Man(a1-3)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)- Man(a1-6) Fuc(a1- 6) Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1-4) Man(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4)GlcNAc-PA- Man(a1-3)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 6)
Man(a1-6)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2) Fuc(a1- 6) Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4) Man(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 4)GlcNAc-PA- Man(a1-3)
Gal(ß1- 4)GlcNAc(ß1- 2)
Abbildung 3 (nach NAKANO und YONEZAWA, 2001): Neutrale N- glykosidisch gebundene Kohlenhydratseitenketten an der Aminosäure Asparagin 220 im pZP3ß, die nach Meinung der Autoren wahrscheinlich die
vorherrschende Rolle in der Spermien- Eizellbindung einnehmen.
Gal: D- Galaktose Glc: D- Glucose Fuc: Fucose GlcNAc: N- Acetylglucosamin
2.1.1.4 Funktion der ZP
Der erste Kontakt zwischen Eizelle und Spermium findet an der ZP, dem Glykoproteinmantel statt, der die empfindlichen Oozyten und Embryonen schützt.
Obwohl normale Befruchtung und Entwicklung vor der Implantation in vitro auch in Abwesenheit der ZP möglich sind (NAITO et al., 1992), ist das Vorhandensein für die Entwicklung des Embryos vor der Implantation in vivo essentiell.
Die ZP bildet eine dichte Hülle um die Eizelle, die nach YANAGIMACHI (1994) und PRASAD et al. (2001) folgende Funktionen besitzt:
Organisation und Differenzierung der Granulosazellen und Follikelentwicklung;
Relative speziesspezifische Eizellerkennung und -Bindung über
Kohlenhydrat- Protein- Interaktionen durch kapazitierte Spermien;
Oligosaccharide, die in einer festen Anordnung innerhalb der molekularen Architektur der Eizellhülle vorhanden sind, werden von den komplementären Kohlenhydrat- Rezeptoren der Spermien der eigenen oder nah verwandten Art erkannt, damit die Gameten- Erkennung zur Befruchtung führt;
Primäre oder sekundäre Bindung von kapazitierten Spermien an der ZP;
Induktion der Akrosomenreaktion bei akrosomenintakten Spermatozoen;
Verhinderung der Polyspermie durch befruchtungsinduzierte Modifikationen der ZP;
Mechanischer Schutz des frühen Embryo;
Zusammenhalt der Blastomeren nach der Befruchtung, damit sie nicht an anderen Embryonen (Verlust der Individualität) oder am Eileiterepithel anhaften und zugrunde gehen;
Verhinderung einer vorzeitigen Implantation im Eileiter;
Diskutiert wird eine Immunitätsbarriere gegen körpereigene Lymphozyten oder Schutz gegen invasive Microorganismen, die aber nach Meinung der
Autoren eher unwahrscheinlich ist, da Makromoleküle, wie Immunglobuline und auch Viruspartikel, Hefen und Follikelzellen leicht durch die Zona eindringen können.
Für Spermatozoen, die bis in den Eileiter gelangt sind, ist die Zona die letzte physikalische Barriere, die sie passieren müssen, bevor sie die Oozyte befruchten können.
Gewöhnlich können mehrere Spermien die Zona passieren, aber nur ein Spermatozoon sollte mit der Eizelle fusionieren. Der Kontakt mit dem Spermatozoon veranlaßt die Zytoplasmamembran zum „schnellen Polyspermieblock“, einer Sofortmaßnahme. In der reifen Eizelle sammeln sich unter der Vitellinmembran die sogenannten kortikalen Granula, die daraufhin durch „Calciumwellen“ innerhalb von Sekunden exozytotisch freigesetzt werden (Cortexgranulareaktion). Durch die Ausschüttung der Enzyme der kortikalen Granula wird die Struktur der ZP derart verändert, daß keine weiteren Spermatozoen binden oder eindringen können („langsamer Polyspermieblock“). Dabei modifizieren Glykosidasen und Proteasen die Glykoproteine der ZP, einen Prozess, der auch als „Zona- Reaktion“
bezeichnet wird. Inwieweit alle drei Vorgänge zum Polyspermieblock beitragen, ist tierartlich unterschiedlich. Da beim Schwein die Zona- Reaktion nur unvollständig abläuft, ist eine geringe Spermienzahl im Eileiter zur Verhinderung der Polyspermie besonders von Bedeutung. Bei Kaninchen und Maus ist der „schnelle“, wohingegen bei Rind und Schaf der „langsame Polyspermieblock“ der wirksamste Mechanismus ist (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001)
2.1.2 Akrosomenreaktion des Spermiums 2.1.2.1 Allgemeines
Die den Hoden verlassende Spermien sind noch nicht befruchtungsfähig und erlangen diese Fähigkeit erst auf dem Weg zur Eizelle. Insbesondere im männlichen Genitale geschieht die Spermienreifung und -modifikation während der Nebenhodenpassage und der Ejakulation (BLAQUIER et al., 1989).
Eine Schlüsselrolle in der molekularen Kommunikation zwischen Spermien und ihrer Umwelt nimmt die Plasmamembran ein, in der alle essentiellen Molekülgruppen einer Biomembran vorhanden sind (ROVAN, 2001).
Die strukturellen Veränderungen der Spermienoberfläche sind durch Ablösung, Modifikation und Maskierung von Antigenen gekennzeichnet, welche durch Wechselwirkungen mit dem Nebenhoden und Seminalplasma entstehen (KIRCHHOFF, 1995).
2.1.2.2 Morphologie des Akrosoms
Der Kopf des Spermiums weist bei allen Haussäugetieren eine ovale bis stark birnenförmige Struktur auf und ist abgeplattet . Die Grundlage des Kopfes bildet der stark kondensierte Zellkern mit seinem haploiden Chromosomensatz. Die vorderen zwei Drittel werden vom Akrosom kappenförmig überzogen (RÜSSE und SINOWATZ, 1991), welches aus der vorne lokalisierten Akrosomenkappe und dem hinten lokalisierten Äquatorialsegment besteht. Abbildung 4 zeigt die relative Größe und topographische Beziehung zwischen diesen beiden Segmenten bei 7 verschiedenen Spezies. Obwohl Größe und Form des Akrosoms zwischen den Spezies sehr variiert, ist die Basisstruktur bei allen Säugetieren dieselbe.
Die Akrosomenkappe selbst ist ein mit hydrolytischen Enzymen gefülltes, membranumschlossenes Organell, das von der Plasmamembran bedeckt wird und vom Golgi- Apparat abstammt (YANAGIMACHI, 1998). Die dem Kern nahe Membran wird als innere Akrosomenmembran und die der Plasmamembran anliegende als äußere Akrosomenmembran bezeichnet (FAWCETT, 1975). Die äußere zeichnet sich durch regional unterschiedliche Glykoprotein- und Lipidzusammensetzung einzelner eng benachbarter Membranareale (Oberflächendomänen) aus, die zu unterschiedlichen Funktionen führen. So verschmilzt z.B. nur der vordere Anteil der Plasmamembran des Spermiums während der Akrosomenreaktion mit der darunter gelegenen äußeren akrosomalen Membran, wobei die hydrolytischen Enzyme des Akrosoms freigesetzt werden. Die Plasmamembran im Bereich des Äquartorialsegmentes vermittelt dagegen den Kontakt des Spermiums mit der Eizelle (SINOWATZ und RÜSSE, 1991).
Der Inhalt des Akrosoms erscheint elektronendicht und feinkörnig und besteht vor allem aus Proteinen mit enzymatischer Funktion, die bei der Interaktion von Spermium und Oozyte aktiviert werden (YANAGIMACHI, 1994).
Abbildung 4: Schematische Darstellung der relativen Größe und topographischen Beziehung zwischen den Akrosomen und dem Äquatorialsegment bei Spermien sieben verschiedener Spezies. Die Figur in der Mitte ist eine schematische Darstellung eines sagittalen Schnittes (- - - -) durch einen Spermienkopf (nach YANAGIMACHI, 1994).
2.1.2.3 Kapazitation
Ejakulierte Säugetierspermatozoen müssen erst eine als Kapazitation bezeichnete Aktivierungsphase durchlaufen, um befruchtungsfähig zu werden.
Unter Kapazitation versteht man alle physiologischen Veränderungen eines Spermatozoons, die es zur Akrosomenreaktion befähigen (BEDFORT, 1983).
Ihre wesentlichen Schritte erfolgen in vivo im caudalen Eileiteristhmus und sind durch Umbauprozesse der molekularen Strukturen der Plasmamembran charakterisiert.
Der heute nur teilweise bekannte Prozess der Kapazitation ist durch eine Reihe endogener Veränderungen charakterisieren, die den Stoffwechsel, die intrazelluläre Ionenkonzentration, die Membraneigenschaften (Fluidität und Membranpotential) und die Reorganisation der Spermatozoenoberfläche sowie die Phosphorilierung von Proteinen betreffen (OLIPHANT et al., 1985;
TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001).
Der erste Schritt der Kapazitation ist die Entfernung sogenannter Dekapazitationsfaktoren (Abbildung 5), wie z.B. oberflächengebundener Proteine, die während der Nebenhodenreifung oder Ejakulation am Akrosom angelagert werden (OLIPHANT et al, 1985). Enzyme, wie Phospholipasen, erhalten so Zugang zu den Membranlipiden, die dadurch umgebaut werden, wobei Cholesterin aus der Membran entfernt wird. Die dabei entstehenden Lysophosphatidylcholine fördern die Kapazitation und die Akrosomenreaktion. Durch diese Veränderungen wird die Plasmamembran destabilisiert, die Aggregation integraler Membranproteine begünstigt und die Fluidität der Plasmamembran erhöht. Es bilden sich proteinarme Mikrodomänen, über die vermutlich bei der späteren Akrosomenreaktion die vielfältigen Punktfusionen mit der darunterliegenden äußeren akrosomalen Membran ablaufen können. Das Spermatozoon wird durch diese Vorgänge in einen aktivierten Zustand versetzt und trifft nach der Passage des Cumulus oophorus auf die ZP. An der ZP erfolgt die erste Kontaktaufnahme und die
wichtige Erkennung der Gameten (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001).
Abbildung 5: Schematischer Darstellung der initialen Vorgänge des Kapazitationsprozesses (nach TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001). (a) Oberflächliche Proteine schützen die Spermienoberfläche (b) Oberflächenassoziierte Proteine werden entfernt; die Membran wird permeabel für Calciumionen;
Cholesterin kann mit Hilfe lipidbindender Proteine des weiblichen
Genitaltraktes aus der Spermienmembran entfernt werden.
(c) Die Spermienmembran besitzt nun eine erhöhte Fluidität, die die Reorganisation mobiler Membranproteine und die Bildung von proteinfreien Mikrodomänen fördert.
Man geht davon aus, dass nur akrosomenintakte Spermien den Cumulus oophorus passieren und an die ZP binden können. Die Umgestaltung des molekularen Aufbaus betrifft besonders die periakrosomale Plasmamembran und führt zu einer Reorganisation von Membranproteinen in dieser Region (YANAGIMACHI, 1994).
Eine weitere Folge der Kapazitation ist die Veränderung des Bewegungsmusters in eine charakteristische Zick- Zack- Bewegung des Spermienkopfes und eine peitschenartige Bewegung des Spermienschwanzes (Hyperaktivierung), die durch Stimulierung des Energiestoffwechsels und Veränderung der Elastizität der Geißel entsteht.
Diese wird durch erhöhten Influx von Calciumionen (Ca2+), durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), erhöhten pH- Wert und durch die Entfernung von blockierenden Substanzen während der Kapazitation hervorgerufen. Die erhöhte Mitochondrienaktivität und Verringerung der
„Steifheit“ der Geißel führt dann zur Hypermotilität (YANAGIMACHI, 1988).
Die Hyperaktivierung scheint in vivo essentiell für die Befruchtung zu sein, da sie die Chance der Spermien erhöht, die Oozyte mit den Cumuluszellen zu finden (CALOGERO et al.,1996; SUAREZ, 1996 ).
Der Ca 2+ - Einstrom bei Kontakt mit der ZP löst bei einem akrosomenintakten, kapazitierten Spermatozoon die Akrosomenreaktion aus.
Bei diesem exozytotischen Prozess kommt es durch vielfältige Punktfusionen der äußeren akrosomalen Membran mit der darunterliegenden Plasmamembran zur Freisetzung der im Akrosom enthaltenen Enzyme. Die Membran enthält nun eine wesentliche höhere Membranfluidität für ihre integralen Membranproteine, die jetzt die Möglichkeit zur Konfigurationsänderung haben und ihre Bindungsdomänen, wie Heparin- und Lektinmotive, zu den jeweiligen Liganden orientieren können. Alle Veränderungen sind essentielle Voraussetzungen für die nachfolgende Akrosomenreaktion und Penetration der ZP (OLIPHANT, 1985).
Die Dauer des Kapazitationsprozesses hängt von dem Intervall zwischen Insemination und Ovulation ab und kann einige Stunden dauern. Kapazitierte Spermien sind sehr instabil und kurzlebig, so dass der Transport zur Ampulle und die Befruchtungssequenz unmittelbar erfolgen müssen (YANAGIMACHI, 1994).
2.1.2.4 Funktionelle Bedeutung der Akrosomenreaktion
Bei frisch ovulierten Eizellen ist die ZP vom Cumulus oophorus umgeben, der aus Cumuluszellen und ihrer Matrix besteht, deren Hauptkomponente polymerisierte Hyaluronsäure ist. Nur akrosomenreagierte Spermien sind in der Lage die ZP zu passieren und mit der Oozyten- Plasmamembran zu fusionieren (YANAGIMACHI, 1981).
Die exozytotische Akrosomenreaktion führt zu multiplen Fusionen zwischen äußerer Akrosomenmembran und darüberliegender Plasmamembran, so dass akrosomaler Inhalt freigesetzt wird (Abbildung 6). Der Bereich, in dem die punktförmige Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosomenmembran stattfindet, stimmt im Wesentlichen zwischen den unterschiedlichen Spezies überein. Es kann jedoch der apikale Rand von der akrosomalen Kappenregion beim Kaninchen sein oder die Grenze zwischen akrosomaler Kappe und dem Äquatorialsegment bei Hamster und Widder.
Das Äquatorialsegment an sich ist jedoch während der Akrosomenreaktion in die Vesikulation der Membran nicht involviert, was an Calpactin II, Vimentin und Intermediärfilamenten liegen könnte, die für eine feste Verbindung zwischen der äußeren Akrosomenmembran und der darüberliegenden Plasmamembran in dieser Region sorgen (YANAGIMACHI, 1994).
Abbildung 6: Schematische Darstellung einiger morphologischer Veränderungen im: Verlauf der Akrosomenreaktion von Säugetierspermatozoon (nach WASSARMAN, 1999)
A : Das akrosomenintakte Spermatozoon;
B : Fusion der äußeren akrosomalen Membran und der Plasmamembran;
C, D : Die Membranvesikel, die aus Plasmamembran und äußerer
akrosomaler Membran bestehen, werden freigesetzt.
pm: Plasmamembran am: Akrosomenmembran
2.1.2.5 Die Geschwindigkeit der Akrosomenreaktion
Vollständig kapazitierte Spermatozoen initiieren und komplettieren die Akrosomenreaktion in kurzer Zeit. Unter physiologischem Ca2+ - Einfluss (ca.
2 nMol) treten z.B. Spermatozoen vom Meerschweinchen in vitro nach 30- 60 Sekunden in die Akrosomenreaktion ein und vervollständigen die Reaktion innerhalb der darauffolgenden 5 Minuten (YANAGIMACHI und UZUI, 1974).
Nach YANAGAMACHI (1994) können Hamster- Spermatozoen, nach ein- bis zweistündiger Vorinkubation in einem normalen Kapazitationsmedium und darauffolgender Inkubation in einem niedrig konzentrierten Lysolecithin- Medium (0,05 mg/ ml), die Akrosomenreaktion innerhalb von 2 Minuten vollständig durchführen.
Kapazitierte Spermatozoen einiger Affenarten sind in der Lage die Akrosomenreaktion innerhalb einer Minute zu vervollständigen. Werden kapazitierte menschliche Spermien Follikelflüssigkeit ausgesetzt, kommt es nach 5- 10 Sekunden zu ersten Fusionen zwischen äußerer akrosomaler Membran und Plasmamembran; die Reaktion läuft innerhalb der nächsten drei Minuten vollständig ab (YUDIN et al., 1988).
2.1.2.6 Mechanismus der Akrosomenreaktion
Läuft die Akrosomenreaktion von motilen Spermatozoen in vitro ohne Zusatz stimulativer Medien ab, wird gewöhnlich von einer „spontanen Akrosomenreaktion“ gesprochen, wohingegen die „falsche Akrosomenreaktion“, die mit dem Spermientod assoziiert ist, jederzeit im weiblichen Geschlechtstrakt erfolgen kann (SMITH et al., 1989).
Einige Spermatozoen scheinen das frühe Stadium der Akrosomenreaktion innerhalb des Cumulus oophorus zu beginnen, jedoch zeigen die meisten Studien, dass befruchtungsfähige Spermatozoen die „echte
Akrosomenreaktion“ in vivo nicht beginnen, ohne mit der ZP in Kontakt gekommen zu sein („Zona- vermittelte Akrosimenreaktion“) (CROZET und DUMONT, 1984).
Im Falle der Maus und wahrscheinlich bei vielen anderen Säugetieren wirkt das ZP3 als ein Ligand und seine Bindung mit dem Spermienrezeptor fördert die Kettenreaktion, die zur Akrosomenreaktion führt. Die ZP3- Peptidkette muß intakt sein, damit der Ligand seine Funktion entfalten kann, wohingegen die Oligosaccharidsequenz von ZP3 nicht die kritische Bedeutung für die Akrosomenreaktion- induzierende Aktivität zu haben scheint (BEEBE et al., 1992).
Die „Zona- vermittelte Akrosomenreaktion“ ist nicht streng speziesspezifisch, aber unterzieht sich am effizientesten auf der Zona derselben Spezies.
Hamsterspermatozoen sind z.B. nicht nur fähig, auf der menschlichen Zona in die Akrosomenreaktion einzutreten, sondern diese auch zu penetrieren und Widderspermatozoen können die Akrosomenreaktion auf Rinder- Zonae absolvieren, bevor sie diese dann auch penetrieren (SLAVIK et al., 1990).
Es sind gute Methoden etabliert wurden, die Spermatozoen der meisten Spezies in Abwesenheit der Zona in die Akrosomenreaktion eintreten zu lassen. Das Auftreten der „spontanen Akrosomenreaktion“ scheint von verschiedenen Faktoren abhängig zu sein:
von der Zusammensetzung des Mediums, der Spezies des Tieres,
dem epidymalen Reifungsgrad und
dem immunologischen Zustand der Spermien (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001).
Seit SALING et al. (1979), BLEIL und WASSARMAN (1980) davon berichteten, daß Mäuse ZP die Akrosomenreaktion von kapazitierten Mäuse- Spermatozoen induziert, ist die „Zona- induzierte Akrosomenreaktion“ bei vielen Tierarten, einschließlich Ratte, Hamsters, Kaninchen, Rind, Schwein, Schaf , Affe und Mensch untersucht wurden.
Die Bindung des Akrosoms an die ZP ist der Startschuß für die Akrosomenreaktion, die u.a. in der Exposition neuer Domänen von integralen Membranproteinen und der Freisetzung hydrolytischer Enzyme besteht.
Beide Ereignisse sind gleichermaßen für den Befruchtungserfolg essentiell.
Durch einen Protonenaustausch (Abbildung 7) kommt es zur Alkalisierung des Innenmilieus und Proteinkinase C aktiviert Phospholipase A2. Diese baut Membranphospholipiden zu Arachidonsäure ab, die wiederum durch die Enzyme Zyklooxigenase und Lipooxigenase in Prostaglandine und Leukotriene umgewandelt werden.
Ein Anstieg der zytosolischem Ca 2+- Konzentration, verbunden mit Erhöhung des pH- Wertes, lösen die Akrosomenreaktion als Voraussetzungen für die Fusion der äußeren Akrosomenmembran mit der Plasmamembran und für die Exozytose des akrosomalen Inhaltes aus (BREITBART und SPUNGIN, 1997).
Abbildung 7: Schematische Abbildung der Akrosomenreaktion bei Säugetieren mit einigen bekannten molekularen „Ereignissen“, die vom ZP3 des Spermatozoons ausgehen und zur Induktion und Vervollständigung der Akrosomenreaktion bei Säugetierspermien führen (nach WASSARMAN, 1999)
LAX et al. ( 1997) haben in immunzytochemischen Studien nachgewiesen, daß G- Protein- gekoppelte Rezeptoren involviert sind und konnten die subzelluläre Verteilung der Proteinkinase C- Untereinheiten α und β1 bei Rinderspermien darstellen.
Die Akrosomenreaktion und die Exozytose des akrosomalen Inhaltes können auch in vitro durch Ca2+- Ionophore wie A 23187 oder durch Progesteron ausgelöst werden. Vom Progesteron wird angenommen, dass es auch in vivo bei verschiedenen Tierarten an der Induktion der Akrosomenreaktion beteiligt ist. BLACKMORE (1998) stellte die Hypothese auf, dass von Cumuluszellen sezerniertes Progesteron an einem Progesteronrezeptor in der Plasmamembran der Spermien bindet.
Seit den siebziger Jahren wurde schon vermutet, dass auch Prostaglandine (PG) eine Rolle spielen. SCHAEFFER et al. (1998) konnte zeigen, dass PGE1 spezifisch an die Plasmamembran bindet und, ähnlich wie Progesteron, über Ca 2+ -Influx die Akrosomenreaktion auslösen kann.
Darüber hinaus ist der über PGE1 aktivierte Ca 2+ - Kanal durch Zn 2+ -Ionen blockierbar, so dass Zn 2+ im Seminalplasma eine vorzeitige Akrosomenreaktion verhindert.
2.1.2.7 Methoden zur Beurteilung des akrosomalen Status
(a) Elektronenmikroskopie
Obwohl die Elektronenmikroskopie für die Routinediagnostik zu aufwendig ist, ermöglicht nur die Transmissionselektronenmikroskopie detaillierte morphologische und funktionelle Studien des Akrosoms einschließlich der Akrosomenreaktion. Wenn alle oder der größte Teil der Spermien zum Zeitpunkt der Fixation leben, dürften die Ultrastruktur- Bilder dem realen akrosomalen Zustand der lebenden Spermien nahe kommen. Wenn dies nicht der Fall ist, ist Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse geboten.
Ist die äußere Akrosomenmembran und der Rest der Plasmamembran mit der darüberliegenden Membran intakt, so ist die festzustellende Akrosomenreaktion höchst wahrscheinlich eine „echte Akrosomenreaktion“.
Ist die Plasmamembran zerstört oder verloren gegangen ist, sind die beobachteten akrosomalen Veränderungen als „degenerative oder falsche Akrosomenreaktion“ anzusehen (YANAGIMACHI, 1994).
(b) Phasenkontrast- (Interferenz- Kontrast-) Mikroskopie
Spermatozoen bestimmter Spezies besitzen so große Akrosomen (z.B.
Meerschweinchen), daß eine lichtmikroskopische Beobachtung von Veränderungen bei lebenden Spermatozoen leicht möglich ist.
Wenn die Spermien sich allerdings sehr schnell bewegen, z.B. nach Hyperaktivierung, kann die Festlegung des Akrosomenstatus schwierig oder unmöglich sein. Diese Schwierigkeit kann durch Verlangsamung der Spermienbewegung mittels:
Kühlung des Mikroskoptisches,
Suspendieren der Spermien in einem viskösem Medium, Minimierung des Volumens der Spermiensuspension oder
Langsame Immobilisierung der Spermien durch kurze Bestrahlung mit UV- Licht überwunden werden (CUMMINS et al., 1986).
(c) Färbung
Spermatozoen vieler Spezies (z.B. Ratte, Bulle, Widder, Affe und Mensch) haben entweder sehr dünne oder sehr knappe Akrosomen und demzufolge ist es schwierig, die Akrosomenreaktion im lebendem Zustand zu verfolgen.
Aus diesem Grund sind verschiedene Färbungen entwickelt wurden, von denen zwei häufig eingesetzt werden. Eine Technik nutzt Hoechst® 33258 (einen fluoresziierenden DNA- bindenden Farbstoff mit limitierter Membranpermeabilität) und spezifische Lektine oder Anti- Akrosomen
Antikörper. Die Spermatozoen werden zuerst in einem Hoechst® 33258- Medium behandelt, welches den Nukleus von toten Spermien anfärbt, wohingegen der Farbstoff durch eine intakten Plasmamembran von lebenden Spermien nicht eindringen kann. Die Spermatozoen werden dann fixiert und von Lektinen gebunden, die eine Affinität zu Akrosomen besitzen oder mit Antikörpern markiert, die gegen akrosomalen Inhalt oder die akrosomale Membran gerichtet sind (CROZZ und MEIZEL, 1989).
Sind die Akrosomen nicht sehr schmal (z.B. Akrosomen von Bullen- spermatozoen), kann die wahre Akrosomenreaktion von der falschen ohne Hilfe von Lektinen oder Antikörpern unterschieden werden: Die Spermatozoen werden zuerst mit Hoechst® 33258 markiert, dann fixiert und unter einem Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskop ausgewertet: Von Spermatozoen, die keine akrosomale Kappe oder einen fluoresziierenden Kern besitzen, wird angenommen, dass eine „echte Akrosomenreaktion“
abgelaufen ist (DE LEEUW et al.,1991 ).
Alle Techniken jedoch, die Hoechst® 33258- Farbstoff benutzen, haben ein innewohnendes Problem, da die Plasmamembran von toten Spermien für diesen Farbstoff nicht in allen Fällen permeabel ist, so dass diese dann oft als lebende und damit als potentiell befruchtungsfähige Spermien klassifiziert werden. Um Fluorescein- Techniken zu nutzen, müssen Spermien zuvor abgetötet werden. So kann nicht mehr zurückverfolgt werden, ob das Spermatozoon zum Zeitpunkt der Fixation deutlich motil/ schwach motil oder unbeweglich war. Aus diesen Gründen ist es unerläßlich, die Lebensfähigkeit der Spermien vor der Färbung oder Fixierung zu ermitteln, um die Zuverlässigkeit der Technik zu vergrößern. (YANAGIMACHI, 1994).
Auch der Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid wird zur Evaluierung der Plasmamembranintegrität verwendet. Hier ist das zugrundeliegende Prinzip der Ausschluß von dem nicht- permeablen DNA- markierenden Farbstoff Propidiumiodid durch intakte Plasmamembranen. Damit sind die Spermien mit Membranschäden, die sich der konventionellen, lichtmikroskopischen
Diagnostik entziehen, indirekt mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes leuchtend rot darstellbar (WABERSKI et al., 1999).
Eine andere Technik, die ursprünglich für Mäusespermatozoen entwickelt wurde, benutzt das Antibiotikum Chlortetracyclin (CTC), welches die Spermienoberfläche in Abhängigkeit von der Kapazitation oder Akrosomenreaktion anfärbt (WARD und STOREY, 1984). Das Prinzip der Technik ist nicht vollständig geklärt. CTC bindet wahrscheinlich an eine Substanz mit Ca2+ -Affinität oder an ein anionisches Peptid der Sperma- Plasmamembran.
Nach Fraser et al. (1990) wird dieses Peptid vom Nebenhoden sezerniert und hat eine Spermien- dekapazitierende Aktivität. Während der Kapazität wechselt das CTC- Muster und nach der Akrosomenreaktion zeigen die Spermien keine CTC- Bindung mehr. Wiederum besteht hier das Problem, daß auch mit dieser Technik keine lebenden von moribunden/ toten Spermien unterschieden werden können.
2.1.3 Bindungsmechanismus
2.1.3.1 Die Bindung von Spermien an die Zona pellucida der Oozyten
Die Bindung zwischen Säugetierspermatozoen und ZP einer Oozyte ist der entscheidende Schritt der Befruchtung (WASSARMAN, 1995), da beim Fehlen der Zonabindung weder die Zonapenetration noch die Fusion mit der Plasmamembran der Oozyte möglich ist (YANAGIMACHI, 1981).
Diese Bindung resultiert aus spezifischen Interaktionen zwischen Bindungsstellen der Plasmamembran des Spermienkopfes und einem Spermien- Rezeptor in der ZP. Eine große Anzahl von Beobachtungen bei Mäusen führte zu diesem Ergebnis:
Die Bindung von Säugetier- Spermatozoen ist teilweise speziesspezifisch (d.h. Meerschweinchen- Spermien binden nicht an die Zona von Mäuse- Oozyten).
In lösung verbrachte, unbefruchtete Zonae von Mäuse- Oozyten zeigen in- vitro „Rezeptor- Aktivität“ für Spermatozoen (WASSERMAN und LITSCHER, 2001).
Bei der Maus ist der Mechanismus bisher am besten erforscht. Man unterscheidet eine primäre und eine sekundäre Bindung. Der erste Kontakt (die primäre Bindung oder das „Attachment“) findet zwischen ZP der Eizelle und äußerer akrosomaler Membran der kapazitierten Spermatozoen statt.
Über die Zona pellucida wird die Erkennung und initiale Bindung beider Gameten vermittelt. Das „Attachment“ wird als lose, nicht- spezifische Interaktion zwischen Spermatozoon und unbefruchteter Oozyte definiert, welche nicht fester ist, als die Beziehung zwischen Spermatozoon und der ZP einer befruchteten Eizelle, analog dem losen „Attachment“ vom Virus zur Wirtsoberfläche vor der spezifischen Bindung (BENAU und STOREY, 1987;
WASSARMAN, 1991).
Die sekundäre Bindung folgt der Akrosomenreaktion und ist als spezifische Interaktion zwischen innerer akrosomaler Membran und ZP definiert.
Wahrscheinlich sind die sekundäre Bindung und die frühe Stufe der Spermienpenetration durch die ZP ein und dasselbe Ereignis (WASSARMAN,1991).
Die Erkennung zwischen Spermatozoon und Eizelle wird über Kohlenhydrat- Seitenketten vermittelt (siehe Kapitel 2.1.1) (MC LESK et al., 1998;
TOEPFER-PETERSEN, 1999).
Neuere Untersuchungen gehen davon aus, dass sich auf der Seite des Spermatozoons ein Komplex aus mehreren Rezeptoren innerhalb der Spermienmembran bildet, der für die Erkennung und primäre Bindung verantwortlich ist (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001)
Auch beim Schwein folgt die Spermatozoen- Eizellen- Interaktion einer ähnlichen Sequenz von Ereignissen. Ein akrosomenintaktes Spermatozoon bindet an die ZP und löst durch den Kontakt die Akrosomenreaktion aus (BERGER et al., 1989). Die akrosomalen Enzyme, v.a. die Serin- Protease Akrosin, werden freigesetzt, und eine limitierte Proteolyse der
Glykoproteinschicht findet statt (TOEPFER-PETERSEN und CECHOVA, 1990), so daß das Spermium die ZP penetrieren kann.
Der Mechanismus ist beim Schwein noch nicht vollständig geklärt. In verschiedenen Studien wurde eine Spermienrezeptoraktivität für pZP3ß nachgewiesen. Die Blockierung von pZP3ß mit monoklonalen Antikörper hemmte die Bindung der Spermatozoen an ZP signifikant (SACCO et al., 1989; YUREWICZ et al., 1993).
Ein hoher Prozentsatz der Zuckerketten endet mit N- Acetylglukosaminresten. Eine Abspaltung dieser Reste führte zu einer Verminderung der Spermienbindung (MORI et al., 1991). Die Autoren gehen davon aus, dass der Mechanismus der Spermien- Eizellen- Interaktion beim Schwein wesentlich komplizierter ist, als bei der Maus.
2.1.3.2 Biochemie der Spermatozoen- Zona pellucida- Bindung
Die Membran von unkapazitierten Spermatozoen ist durch eine hohe Cholesterolkonzentration und Dekapazitationsfaktoren charakterisiert, die die Zona-pellucida Rezeptoren in der Membran verankern, von denen es wahrscheinlich mehrere Arten gibt (HUNTER et al., 1987).
Bei der Kapazitation bekommt die Plasmamembran durch Cholesterolefflux und Entfernen der Dekapazitationsfaktoren mehr Fluidität, was zur freien Beweglichkeit des Rezeptors in der Membranoberfläche führt. ZP3- Liganden verursachen nach der Bindung des Rezeptors eine Aggregation und Aktivierung von diesem und lösen die Reaktionskaskade aus (u.a. weitere Aktivierung von Rezeptoren), die zur Akrosomenreaktion führt.
Wahrscheinlich gibt es mehr als den einen Rezeptor mit Proteinkinaseaktivität (LEYTON et al., 1989).
Aktivierte ZP- Rezeptoren stimulieren ein G- Protein, welches die Phospholipase Cβ1 in der Plasmamembran aktiviert. Diese spaltet Phosphadidylinositol- Diphosphat (PIP 2) in Diazylglycerol (DAG) und
Inositoldiphosphat (IP3). IP3 vergrößert die intrazelluläre Ca 2+- Konzentration durch Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern und DAG aktiviert die Ca 2+- abhängige Proteinkinase C, welche Proteine phosphoriliert. Ein Teil von IP3 wird durch Methylierung zu IP4, welches die Öffnung von spannungsabhängigen Ca2+- Kanälen reguliert (FLORMAN et al., 1992), die einen massiven Influx von extrazellulärem Ca2+ bewirken.
Diese Ca2+- Verschiebungen auf der Plasmamembran fördern direkt die Membranfusion. Das aktivierte G- Protein stimuliert außerdem die Phospholipase A2, welche Phosphadidylcholin in Lysophadidylcholin und Arachidonsäure spaltet, von denen hohe Fusionsbereitschaft ausgeht. In ähnlicher Weise wird die Phospholipase D durch das G- Protein aktiviert, welche Phophadidylcholin in Cholin und phosphatierte Säuren spaltet.
Aktivierte G- Proteine aktivieren außerdem Adenylatzyklase, welche die cAMP- Produktion stimuliert. Teilweise fördert der cAMP- Anstieg die Proteinkinase A und die Phosphorilierung von Proteine, die für die Akrosomenreaktion essentiell sind und teilweise führt er am Na+- Kanal zum erhöhten Na+- Influx und H+- Efflux, der wiederum zum Anstieg des intrazellulären pH- Wertes führt. Kapazitierte Spermien binden fest an die Oberfläche der Zona, bevor sie diese penetrieren (FLEMMING und YANAGIMACHI, 1981; FLEMMING und YANAGIMACHI, 1984).
Für die Bindung an die ZP scheinen zwei Rezeptortypen essentiell zu sein:
Ein G- proteingekoppelter Rezeptor, der Phospholipase Cβ1 aktiviert und eine Tyrosinkinase, die Phospholipase Cγ aktiviert.
Bindet das entsprechende Signalmolekül an den G- proteingekoppelten Rezeptor, so kommt es zur GTP- Bindung an die α- Untereinheit des G- Proteins und zur Aktivierung der Adenylatzyklase, einem Enzymkomplex, der ATP in cAMP umwandelt. Die cAMP- Moleküle binden an regulatorische Untereinheiten der Proteinkinase A und aktivieren so deren katalytische Untereinheiten. Diese wiederum aktivieren einen spannungsabhängigen Ca2+- Kanal in der äußeren Akrosomenmembran, worauf Ca2+ aus dem Akrosom in das Zytoplasma strömt und es zu einem minimalen zytosolischen
Anstieg von Ca2+ kommt, der aber ausreicht, um seinerseits die Proteinkinase γ zu aktivieren. Diese wandelt Phosphatidyl- Inositol- Diphosphat (PIP2) durch Phosphorilierung und Hydrolyse zu Diazylglyzerin und Inositol- Triphosphat (IP3) um. Das Diazylglyzerin bewirkt Phosphorilierung und Translokation der Proteinkinase C in die Plasmamembran. Hier phosphoriliert das Enzym die Proteine eines membranständigen, spannungsabhängigen Ca2+- Kanals, wodurch sich dieser öffnet und extrazelluläres Ca2+ massiv einströmen kann. Das zytosolische Ca2+ bindet an Kalmodulin, welches einen Na+/ H+-Austauscher antreibt, der Na+ aus der Zelle pumpt.
Beim Eber wird das Kalmodulin durch ein eigenes Protein, das SP 17, am Verwendungsort festgehalten. Dieses liegt als Triplettprotein zunächst in der Proform von 22- 24 kDA vor (YANAGIMACHI, 1994).
Bei Glykoproteinen der Spermienmembran, die Affinitäten zu den Glykoproteinen der Zona zeigen, fällt auf, dass es zwar eine Vielzahl artspezifischer Proteine gibt, die jedoch weitgehend Homologien und Verteilungsmuster zu Proteinen anderer Arten zeigen. In vitro binden β1- Galaktosyltransferase der Maus, das SP56- Protein der Maus, das SP17- Protein des Kaninchens, das humane Mannosebindungsprotein, das SSP7 des Hengstes und die gut untersuchten Spermadhäsine des Ebers AQN-1, AQN-2, die AWN- Proteine, die PSP-1/ -2 an Zuckerreste der jeweiligen ZP (Tabelle 3) (TOEPFER-PETERSEN et al.,1997). Die Spermadhäsine des Ebers sind eine große Proteinfraktion in der Seminalflüssigkeit (TOEPFER- PETERSEN et al., 1995). Sie sind daher eine ganz besondere Gruppe von Glykoproteinen, die an die Plasmamembran assoziiert oder in diese verankert werden und auf Grund ihrer spezifischen Oligosaccharid- Seitenketten für die selektive Bindung an die ZP und damit auch für die Auslösung der Akrosomenreaktion und Exozytose verantwortlich sind (ROVAN, 2001).
Die Spermadhäsine des Eber, die von der Samenblasendrüse sezerniert werden, sind in diesem Zusammenhang am besten untersucht. Bei einer
Molekularmasse von 12- 16 kDa, sind es strukturell multifunktionelle Polypeptide mit einem weiten Spektrum von Bindungsmöglichkeiten. So binden sie an verschiedene Oligosaccharidreste, an sulfatierte Glukosaminoglykane, verschiedene Phospholipide und an Proteinaseinhibitoren. Diese variable Bindungsaffinität legt die Vermutung nahe, dass die Spermadhäsine des Ebers bei nahezu allen Stufen des Ablaufs der Befruchtung beteiligt sind (BENOFF,1997).
Tabelle 3: Einige Zona pellucida- Bindungsproteine (nach WASSARMAN, 1999)
Zona- pellucida- Bindungsproteine
Kommentar
ß- Galaktosyltransferase Bindet spezifisch an N- Acetylglukosamin- Reste von mZP3 der Maus
SPERMIENPROTEIN- 56 Bindet an mZP3 Oligosaccharide der Maus Spermienadhäsine Besitzen Kohlenhydrat- Bindungsaktivität beim
Schwein
Zona- Rezeptorkinase Bindet an mZP3 der Maus
Mannose- Bindungsprotein a- D- Mannosidase, die Mannose- Reste der Zona pellucida des Menschen bindet Spermien-
Bindungsprotein- 17
Spermien- spezifisches Autoantigen, das an die Zona der Kaninchen bindet
Fertilisations- Antigen Bindet an menschliche ZP3 Spermien- Agglutinations-
Antigen
Menschliches Oberflächenantigen
Während der Passage durch den Nebenhoden binden vor allem die AWN, das AQN-1 und das AQN-3 kovalent an die Phospholipide der Spermienmembran. Aggregierte Spermadhäsine können möglicherweise als akrosomenstabilisierende Faktoren fungieren. Zum Zeitpunkt der Ejakulation
stellen die aus der Samenblasendrüse stammenden Proteine vermutlich eine Art Schutzmantel für die Spermien dar, um eine vorzeitige Akrosomenreaktion zu verhindern. Diese Proteine sind an verschiedene Membranbindungsstellen lediglich assoziiert und können durch in vitro induzierte Kapazitation leicht von dieser entfernt werden. Möglicherweise binden sie auch über Heparinbindungsstellen an Rezeptoren des Oviduktepithels und sind so Aktivatoren der Kapazitation und der Hyperaktivierung. Es wird vermutet, dass eigentlich nur die AWN- und die AQN-3 Proteine die primären Rezeptoren für die Zonaproteine sind, die für die Zellerkennung sowie für die erste Bindung an die ZP in Betracht kommen (TOEPFER-PETERSEN et al.,1998). Die AWN- Konzentration am Spermatozoon sinkt durch Kapazitationsvorgänge auf ein Niveau, das mit dem Gehalt im Nebenhoden zu vergleichen ist. Durch immunhistologische Untersuchungen konnte AWN auf Spermatozoen, die aus der uterotubalen Verbindung inseminierter Sauen zurückgewonnen wurde, nachgewiesen werden. Die uterotubale Verbindung und der caudale Isthmus stellen bei Sauen ein Spermienreservoir dar, in dem die Kapazitation beendet wird.
Verbleibende Spermadhäsinmoleküle auf kapazitierten Spermatozoen befinden sich in einer günstigen Lokalisation, um nach DOSTALOVA et al.
(1994) eventuell als primäre ZP- bindende Proteine fungieren zu können.
Das isolierte Spermadhäsin AWN bindet mit hoher Affinität an die ZP- Glykoproteine, bevorzugt an O- glykosidisch gebundene Zuckerstrukturen, die folgende Sequenz aufweisen: Galaktose (ß1- 3)- N- Azetylgalaktosamin.
Mit wesentlich geringerer Affinität binden sie an Galaktose (ß1- 4)- N- Azetylglukosamin, welches hauptsächlich in N- glykosidisch gebundenen Zuckern vorkommt (DOSTALOVA et al., 1995).
Eine weitere Gruppe von Proteinen nimmt eine Art Zwischenstellung zu den erstgenannten ein. Sie werden zwar vom Genom der Spermatiden exprimiert, von diesen aber sofort sezerniert, extrazellulär ausgeschleust und entweder über die Guanidyl- Phosphatidyl- Inositol- (GPI)- Anker in der Plasmamembran verankert oder an deren Proteine assoziiert. Sie fungieren
als Chaperone, die externe Proteine einfangen und assoziieren, oder werden als Enzyme in den entsprechenden Abschnitten der ableitenden Samenwege selektiv freigesetzt. Viele dieser Proteine sind spermienspezifisch, andere wiederum zeigen weitgehende Homologien zu Proteinen somatischer Zellen.
Die meisten besitzen ein geringes Molekulargewicht, sind hochglykosiliert und zeichnen sich durch eine ausgesprochene Tierartspezifität aus (KIRCHHOFF und IVELL, 1995).
Für die Penetration der ZP scheinen die Hyperaktivität der Spermien und die enzymatische Hydrolyse der ZP durch die Serinprotease Akrosin und andere nicht identifizierte Enzyme verantwortlich zu sein (TOEPFER-PETERSEN, 1992).
2.2 Der DudFinder
TMSpermien Bindungsassay (SBA)
2.2.1 Entwicklung
Eine Serie von in vitro Tests der Spermien- Eizell- Bindung wurden seit über 80 Jahren entwickelt, um potentiell subfertile Männer und männliche Tiere zu identifizieren bzw. deren Spermien- und Samenqualität zu bewerten.
BARBATO et al. (1998) ermittelten bei Truthähnen zwischen der Spermien- Eizellbindung in vitro und Fertilität eine hochsignifikante Korrelation (0,83;
p<0,0001). Die Spermienkonzentration im Inkubationsansatz hatte eine signifikant positive Korrelation mit der Spermien- Eizellbindung, mit der Fertilität und dem Samenvolumen, wohingegen die Motilität keine positive Korrelation mit der Fertilität aufwies.
Ausgehend von diesen Daten planten AMANN et al. (1999 a, b) einen in- vitro- Bindungstest, der in der Diagnostik bei subfertilen Männern und männlichen Tieren nützlich sein könnte. Die Anzahl gebundener Spermien von Hähnen, Truthähnen, Widdern, Bullen, Mäusen, Hengsten und Menschen war konzentrationsabhängig und wurde mittels Scanning- und
Transmissionselektronenmikroskopie ausgewertet. Nach Meinung der Autoren könnte der Test bei Männern oder männlichen Tieren zur Anwendung kommen, deren Samen bei einer konventionellen spermatologischen Untersuchung den Mindestanforderungen entspricht, aber in der Spermien- Eizell- Bindung von der Norm abweicht.
In Untersuchungen beim Geflügel ermittelte WISHART (1995) hohe Korrelationen zwischen der Anzahl gebundener Spermien an der äußeren Perivitellinmembran (PVM) der ersten Eizelle nach Befruchtung oder künstlicher Besamung und
der Wahrscheinlichkeit, dass die folgenden Eier befruchtet wurden bzw.
der Wahrscheinlichkeit, dass am darauffolgenden Tag diese befruchteten Eier gelegt werden (Dauer der Befruchtung).
Ähnliche Beobachtungen liegen für Spermien- Eizell- Interaktionen vor, die sich auf gebundene Spermien (sogenannte „akzessorische Spermien“) innerhalb der ZP bei Rind und Mensch beziehen (NADIR et al., 1993).
ALEXANDER et al. (1993) bestätigten diese Beobachtungen und fanden, dass TG- Hahnsperma mit sehr guter Motilität, aber stark reduzierter Fertilität ein signifikantes Absinken der gebundenen Spermien in der PVM aufwies.
BARBATO et al. (1998) etablierten erstmals einen Versuchsansatz, um die Bindung von Spermien an die PVM in vitro zu untersuchen. Isolierte PVM von gelegten Hühnereiern wurde in drei in- vitro Spermien- Bindungsassays benutzt. In einem ersten Test wurde intakte, native PVM von gelegten Hühnereiern auf einen Objektträger aufgebracht und die gebundenen Spermien wurden mit einem Lichtmikroskop ausgezählt.
Test Nr.2 nutzte ein hitzelösliches PVM-Extrakt (HS-PVM) gelegter Hühnereier, die in einer 96- Well- Platte positioniert waren. Die Bestimmung der Anzahl gebundener Spermien erfolgte durch lichtmikroskopische Auszählung.
In einem weiteren Versuchsansatz (Test Nr.3) wurde ebenfalls HS-PVM benutzt. Die Auszählung gebundener Spermien erfolgte allerdings automatisiert durch fluorimetrische Bestimmung der Spermien- DNA, die
vorher mit YO- PRO- 1, einem DNA- Farbstoff, angefärbt wurden war (BARBATO et al. 1998).
Hähne, deren Ergebnisse der konventionellen spermatologischen Untersuchungen über den Mindestanforderungen lagen, die aber im Spermien- Bindungstest der 3. Variante eine niedrige Bindungskapazität aufwiesen, wurden als subfertil charakterisiert (HAMMERSTEDT et al.,1997).