2.2 Der DudFinder TM Spermien Bindungsassay (SBA)
2.3.1 Charakterisierung des Peptids .1 Vorkommen
Das menschliche Prosaposin ist ein gut charakterisiertes, annähernd 68- kDa großes Protein, welches als Homolog zum tierischen sulfatierten Glykoprotein 1 (SGP- 1) identifiziert wurde. Das Prosaposin wird in Lysosomen proteolytisch in 7- 10 kDa große Polypeptide, sogenannte Saposine A, B, C und D, sowie in drei Zwischensequenzen mit jeweils 15 bis ca. 50 Aminosäuren aufgespalten (O`BRIEN und KISHIMOTO, 1991).
Es kommt in einer großen Anzahl von Geweben des menschlichen und tierischen Körpers sowie in Flüssigkeiten des männlichen Reproduktionstraktes vor und wird von einem Gen produziert, welches viele Homogenitäten zwischen den Tierarten aufweist. Die Proteine sind üblicherweise mit dem lysosomalen Kompartiment assoziiert, wobei die Beziehung zwischen SGP- 1, welches in den Sertolizellen produziert wird, und den lysosomalen Saposinen noch nicht geklärt ist (SYLVESTER et al., 1984).
Die Saposine werden für die Hydrolyse von Glykosphingolipiden benötigt, aber die Funktion der Zwischensequenzen ist weitestgehend unbekannt (MORALES et al., 2000).
Sulfatiertes Glykoprotein- 1 der Ratte wurde aus einer Sertolizell- Kultur durch SYLVESTER et al. (1989) isoliert und als sekretorisches Produkt dieser Zellen betrachtet (COLLARD et al., 1988).
Die Prosaposin- Familie ist umfassend im Nervengewebe studiert wurden, wo die Saposine die Hydrolyse von Lipiden in Lysosomen modulieren. Im männlichen Reproduktionstrakt findet die Synthese des SGP- 1 in den Sertolizellen und den Epithelzellen der Ausführungsgänge statt. Im Hoden wurde SGP- 1 durch Immunfluoreszenz nachgewiesen, wobei in allen Tubuli
seminiferi eine ähnliche Verteilung vorhanden war, d.h. das Protein akkumuliert in keiner der 14 Entwicklungstufen des Samenepithels (LEBLOND und CLERMONT, 1952). Besonders hohe Konzentrationen von SGP- 1 konnten in der Zytoplasmaregion der Sertolizellen, in der Basalzellregion der Spermatogonien und dem Caput epididymidis nachgewiesen werden. Höchste Konzentrationen sind in der Flüssigkeit der Tubuli seminiferi und des Rete testis vorhanden, relativ niedrige Mengen wurden in der Flüssigkeit des Nebenhodenschwanzes und im Serum gefunden (Tabelle 4) (SYLVESTER et al., 1989).
Tabelle 4: SGP-1 Konzentration (Mittelwerte) in Körperflüssigkeiten von männlichen Ratten (nach SYLVESTER et al., 1989)
Flüssigkeit Konzentration (µg/ ml) n
Serum (Vena cava ) 1,5 10
Lymphonoduli testiculares 7,1 6
Tubuli seminiferi 60,2 9
Rete testis (Ausführungsgänge ) 108,9 3
Caput epididymidis 51,7 4
Cauda epididymidis 12,2 4
2.3.1.2 Struktur
Das typischerweise proteolytisch in die vier Saposine A ,B ,C und D und die drei Zwischensequenzen aufgespaltene Prosaposin- Molekül ist ein Polypeptid aus 524 Aminosäuren, welches eine Signalsequenz aus 16 Aminosäuren besitzt und fünf potentiell glykosilierte Seiten aufweist (O´BRIEN und KISHIMOTO, 1991).
Das SGP-1/ Prosaposin existiert in zwei Formen und wird initial als ein membranassoziierter 65- kDa Precursor glykosiliert und entweder zu den Lysosomen transportiert oder weiter in die höher sulfatierte 70 kDa- Form umgewandelt. Das 70 kDa Protein aggregiert leicht innerhalb des Golgi- Apparates und wird regelmäßig von diesem sezerniert. Diese nativ sezernierte Form ist ein nicht kovalentes Homodimer von 140 kDa. In den Lysosomen wird die 65 kDa- Form weiter in 15 kDa- kleine Saposine zerlegt (IGDOURA und MORALES, 1995; IGDOURA et al., 1996).
Aminosäuresequenz, Lokalisation der Disulfidbrücken und Präsenz der Wasserstoffbrücken zeigen, dass alle Saposine stabil sind, eine identische Sekundärstruktur und ähnliche Tertiärstruktur mit einem hydrophoben Kern besitzen (ZHAO et al., 1998).
Die in verschiedenen Saposinen vorhandenen sechs Cysteinreste, glykosilierte Seitenketten und konservierte Prolinreste besitzen eine identische Lokalisation, wenn menschliches Prosaposin mit dem Homolog anderer Spezies verglichen wird. Sequenzanalysen zeigten, dass zwischen testikulären Mäuse- SGP-1 und menschlichem Prosaposin 64% und zwischen Mäuse und Ratten- SGP-1 zu 88% Aminosäure- Identität besteht.
Ratten- Prosaposin (SGP-1) besitzt im Vergleich zu menschlichem 80%
identische Aminosäuren (O´BRIEN und KISHIMOTO, 1991).
2.3.1.3 Eigenschaften
Saposin A und C sind Cerebrosidase- Aktivator- Proteine, die die Hydrolyse von Glukosylceramiden durch ß- Glukosylceramidase und von Galaktosylceramide durch ß- Galaktosylceramidase bewirken. Saposin B ist der Aktivator der Arylsulfatase A, sowie der α- und β- Galaktosidase. Saposin D stimuliert auch den Abbau von Ceramiden (Tabelle 5). Ein Mangel an Saposin B führt zu einer lysosomalen Speicherkrankheit, der metachromatischen Leukodystrophie, und ein Mangel von Saposin C zu
einer Form der Gaucher´s Krankheit. Beide Krankheiten sind charakterisiert durch lysosomale Speicherung von entarteten Glykosphingolipiden. Bei einem Mangel von Saposin A oder D sind noch keine pathologischen Veränderungen beobachtet worden (MORALES et al., 2000 b).
Tabelle 5: Charakteristika der vier Saposine (nach O’BRIEN und KISHIMOTO, 1991)
Saposin Amino- säuren
Früherer Name Enzymaktivierung
A 60- 143 - ß- Glucosylceramidase
D 405- 487 Componente C Sphingomyelinase
Die Rolle von Seminal- Prosaposin / -SGP- 1 war unbekannt, bevor HAMMERSTEDT et al. (1997) nachwiesen, dass ein Fragment von Prosaposin die Bindung von Spermien an die perivitelline Membran von Hühnereiern im Spermien- Bindungsassay erhöht. Bei homozygoten knock- out Mäusen, die durch Punktmutation auf den Prosaposin- Gen kein Prosaposin/ SGP-1 besaßen, zeigten die männlichen Reproduktionsorgane
bei normalem Testosteronspiegel eine Verringerung der Hodengröße mit reduzierter Spermiogenese und eine Verkümmerung der Prostata, der Samenblasendrüse und des Nebenhodens. Diese Ergebnisse zeigten, dass Prosaposin in der Entwicklung und Erhaltung der Reproduktionsorgane der Mäuse involviert ist (MORALES et al., 2000 a, b).
Ein Fragment von Prosaposin mit zirkulärer Struktur, welches als „Universal Sperm Egg Binding Protein“ (UPSEBP) bezeichnet wird, ist als 60 Aminosäuresequenz auf der Basis des Rattenprosaposins definiert. Die aktiven Epitope liegen in der Zwischensequenz zwischen Saposin A und B und beziehen 6 Aminosäuren vom Saposin A und 4 Aminosäuren vom Saposin B mit ein (Abbildung 8). Die Peptide wurden synthetisiert und durch Reverse- Phase- High- Performance Flüssigchromatographie gereinigt (AMANN et al., 1999 a; HAMMERSTEDT et al., 2001).
Saposin A Saposin B Saposin C Saposin D
UPSEBP
Abbildung 8: Schematische Darstellung des UPSEBP- Moleküls, welches die für die biologische Aktivität notwendigen Epitope beinhaltet und bei Ratte bzw. Mensch aus 60 bzw. 61 Aminosäuren besteht (nach HAMMERSTEDT et al., 2001).
AMANN et al. (1999 b) zeigten, dass die ZP- Bindung der Spermien bei
>30% der subfertilen Männer nach in vitro Inkubation ihrer Spermien mit 1280 pM des synthetischen Fragmentes vom menschlichen Prosaposin (FertPlus- Peptid) erhöht wird. So sind einige Männer nach Meinung der Autoren subfertil, weil die Mehrzahl ihrer Spermien eine mangelhafte Anzahl Rezeptoren für das Molekül aufweisen, die Flüssigkeit des Reproduktionstraktes eine ungenügende Konzentration an UPSEBP besitzt
oder beides vorliegt. Weil die Verfügbarkeit von freien Spermienrezeptoren, die ein synthetisches Peptid binden, Voraussetzung für einen möglichen Nutzen ist, ist es nach Meinung der Autoren unlogisch anzunehmen, dass bei den Spermien aller Männer nach Inkubation mit dem FertPlus®- Peptid eine Verbesserung der Bindungsfähigkeit an ein Eizellmembran- Substrat im SBA oder an eine menschliche ZP erreicht wird (AMANN et al., 1999 a, b).
Dieses Fragment von Prosaposin soll nach HAMMERSTEDT et al. (2001) eine Bindung mit der Spermienoberfläche eingehen und diese während der initialen speziesunspezifischen Spermien- Eizell- Bindung schützen. Die Autoren stellten 25 verschiedene synthetische Peptide her, die alle auf dem Ratten- Prosaposin basierten. Die höchste Steigerung der Bindungsfähigkeit wurde nach Oxidation des endständigen Cysteins im Peptid gefunden.
Durch die Oxidation kommt es zur Disulfidbrückenbildung und das entstehende Peptid S12-Ox soll die Fertilität verbessern, wenn es in geeigneter Konzentration genutzt wird. Die Autoren gehen davon aus, dass es an die Spermien bindet und einen „Brückenliganden“ zwischen Zona pellucida- Rezeptor und Spermium bildet, wenn ungenügend UPSEBP vorhanden ist (Abbildung 9) oder kann endogenes Material vermehren und die Möglichkeit von Spermienbindung an den Rezeptor der Zona oder Vitellinmembran vergrößern (HAMMERSTEDT et al., 2001).
In vitro- Inkubation von Spermien mit S12-Ox vergrößerten die Teilungsraten bei in- vitro Fertilisation (IVF) von Mäusen (MARGAGREE et al., 2000) und von Rindereizellen (SEIDEL et al., 2001). Inkubation von Menschen-, Mäuse-, Eber- oder Bullensperma bzw. Bullen- TG- Sperma mit bis zu 1280 pMol FertPlus® vergrößerten die Befruchtungsrate und die Inkubation von Puten- oder Hahnsperma die Anzahl geschlüpfter Küken (AMANN et al., 1999 b;
GILL et al., 1999).
Abbildung 9: Das synthetische Peptid S17- Ox bindet an die Spermien und liefert die postulierte Brücke, wenn ungenügend UPSEBP vorhanden ist (HAMMERSTEDT et al., 2001)
Bei frischem Menschensperma nahmen die prozentual gebundenen Spermien nach Inkubation mit 640 pM FertPlus® (p< 0,01) zu. Für 11 der 25 mit 640 pM FertPlus® imkubiertenProben wurde eine Steigerung des Anteils gebundener Spermien nachgewiesen (Abbildung 10).
Abbildung 10: Steigerung der Bindungsrate von frischem menschlichen Sperma im SBA nach Inkubation mit sechs verschiedenen FertPlus®- Konzentrationen. Die Daten wurden als relative Bindung ausgedrückt (Prozent gebundene Spermien pro Peptidkonzentration/ Prozent gebundene Spermien bei der Kontrolle) (nach AMANN et al., 1999 a).
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 20 80 160 320 640
F e r t P l u s - P e p t i d (p M)
Relative Bindung (%)
Bei aufgetautem menschlichen TG- Sperma war die Bindungsfähigkeit bei 6 von 7 Proben 1,4 mal höher, nachdem sie mit 640 µM Peptid inkubiert wurden (Abbildung 11) (AMANN et al, 1999 a).
Abbildung 11: Darstellung des Anteils gebundener menschlicher Spermien (in %) im SBA. Die Kontrolle (gestreifte Säulen) des aufgetautem TG- Spermas der sieben Männer mit unbekannter Fertilität im Vergleich mit verdünntem Sperma, welches mit 640 pM FertPlus®- Peptid inkubiert wurde (schwarze Säulen) (AMANN et al., 1999 a).
0 5 10 15 20 25 30
I J K L M N O
Gebundene Spermien (in %)
K o n t r o l l e F e r t P l u s
Bei Ebersperma, welches 24 Stunden bei +18°C gelagert wurde, zeigten zahlreiche Proben, nach Inkubation mit 1280 pM FertPlus® eine Steigerung der prozentualen gebundenen Spermien (p< 0,01) im SBA gegenüber der Kontrolle. Bei 16 der 28 Proben erhöhte sich die prozentuale Anzahl gebundener Spermien um den Faktor 1,4 (Abbildung 12), wobei 12 dieser 16 Proben einen niedrigen Durchschnittswert gebundener Spermien in der Kontrolle (< 5,2% gebundene Spermien) aufwiesen. Ein Peptideffekt auf die Motilität der Spermien während der 60 minütigen Inkubationszeit war nicht vorhanden (AMANN et al., 1999 a).
Abbildung 12: Anteil gebundener Eberspermien (in %) im SBA nach Inkubation mit 1280 pM FertPlus®- Peptid (schwarze Säulen) und der Kontrolle (gestreifte Säulen) (nach AMANN et al., 1999 a).
0 5 10 15 20 25
P r o b e n
Gebundene Spermien (in %)
K o n t r o l l e F e r t P l u s
Bei aufgetautem TG- Bullensperma war die prozentuale Anzahl gebundener Spermien im SBA nach Inkubation mit 160 pMol Peptid bei 4 der 10 Proben, um > 1,4 mal höher (Abbildung 13).
Abbildung 13: Bindungsrate (in %) im SBA nach Inkubation von aufgetautem TG- Bullensperma unbekannter Fertilität mit 160 pMol FertPlus®- Peptid (schwarze Säulen) im Vergleich zur Kontrolle (gestreifte Säulen) (nach AMANN et al., 1999 a).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A B C D E F G H I J
Gebundene Spermien (in %)
K o n t r o l l e F e r t P l u s
Ausgehend von diesen in- vitro Daten wurde ein Besamungsversuch mit TG- Sperma von drei Bullen durchgeführt, welches nach dem Auftauen für 10 Minuten mit 30 µMol Peptid inkubiert und daraufhin zur künstlichen Besamung eingesetzt worden war. In Abbildung 14 sind die Besamungsergebnisse von insgesamt 180 Rindern der Kontrollgruppe und der FertPlus®- Gruppe dargestellt. Bei allen drei Bullen vergrößerte sich die Befruchtungsrate um 14% im Vergleich zur Kontrolle (AMANN et al., 1999 a,
d) .
Abbildung 14: Der Effekt auf die Befruchtungsrate durch Inkubation von aufgetautem TG- Bullensperma mit 0 (Kontrolle) oder 30 µMol FertPlus® (nach AMANN et al, 1999 d)
5 6 4 8
4 2 4 4
6 2 6 2 6 4 6 1
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0
Alle Bullen Bulle A Bulle B Bulle C
Tragende Rinder (in %)
Kontrolle F e r t P l u s
Die Autoren stellten zwei Thesen zum Wirkungsmechanismus von FertPlus® auf:
Das FertPlus®- Peptid vergrößert die Wahrscheinlichkeit, dass eine motile Samenzelle an der Außenhülle der Eizelle (Perivitellinmembran beim Vogel oder Zona pellucida beim Säugetier) fest binden wird. Demzufolge können mehr Spermien binden und penetrieren. Die Verbesserung der Bindungseigenschaften der Spermien und der mit der erhöhten Anzahl befruchteter Eier beim Geflügel zusammenhängende detaillierte Wirkungsmechanismus des FertPlus®- Peptids ist allerdings unbekannt (AMANN et al., 1999a).
Die Autoren spekulieren, dass Spermien mit genügend FertPlus® auf ihrer Oberfläche die Zona- Penetration der befruchtenden Samenzelle, die Aktivierung des Ooplasmas und die Anfangsschritte der Embryogenese stimulieren (AMANN et al., 1999 a).