3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methode
3.2.2 In-vitro Ergebnisse
3.2.2.1 Motilität
Bei der Untersuchung des Prozentsatzes motiler Spermien war die Frage zu klären, ob am Tag der Samenentnahme (Tag 1) die Mindestanforderungen bei nativem Sperma (>70% motile Spermien) vorhanden waren und ob nach fünftägiger Lagerung bei +18°C von dem FertPlus®- Peptid ein positiver oder negativer Einfluss ausging. Die Untersuchungen wurden an Tag 1 (nativ und verdünnt), 2, 3 und 5 (jeweils verdünnt) durchgeführt, jedoch gingen in die statistische Auswertung nur Tag 1 und 5 ein.
Die Tabellen 10 und 11 zeigen den Anteil motiler Spermien getrennt nach den drei Ebern, drei Peptidkonzentrationen und den zwei Untersuchungstagen.
Bei keinem der getesteten Eber ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen den drei Peptidkonzentrationen. Nur bei Tag 5- Sperma war ein signifikanter Eberunterschied nachweisbar.
Die Motilitätsraten fallen innerhalb aller FertPlus®- Konzentration (einschließlich der Kontrolle) von Tag 1 auf Tag 5 signifikant ab (p< 0,05).
Tabelle 10: Motilität der Spermien bei den drei FertPlus®- Konzentrationen unter besonderer Berücksichtigung der Eber an Tag 1
Eber FertPlus Ejakulate Konzentration
Motilität (%)
(µMol) n
_
X SD
A 0 12 81,3 3,1
A 0,2 12 81,7 3,9
A 1 12 81,3 3,8
B 0 9 82,8 6,2
B 0,2 9 82,2 5,7
B 1 9 81,7 6,1
C 0 13 85,4 3,8
C 0,2 13 84,6 3,8
C 1 13 85,0 3,5
Zwischen den verschiedenen FertPlus®- Konzentrationen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (p< 0,05).
Tabelle 11: Motilität der Spermien bei den drei FertPlus®- Konzentrationen unter besonderer Berücksichtigung der Eber an Tag 5
Eber FertPlus Ejakulate Konzentration
Motilität (%)
(µMol) n
_
X SD
A 0 12 45,8 a 19,6
A 0,2 12 43,3 a 20,7
A 1 12 41,7 a 22,2
B 0 9 62,8 b 6,2
B 0,2 9 60,6 b 6,8
B 1 9 55,0 b 10,6
C 0 13 28,8 c 18,5
C 0,2 13 30,0 c 20,4
C 1 13 27,7 c 20,1
a-c: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant (p<0,05).
In Tabelle 12 sind die Ergebnisse bei den drei unterschiedlichen FertPlus -Konzentrationen an beiden Untersuchungstagen zusammenfassend über alle Eber dargestellt. Es ergab sich kein Konzentrationseffekt, aber der Vergleich zwischen Tag 1 und 5 innerhalb einer Peptidkonzentration lieferte einen signifikanten Motilitätsabfall (p<0,05).
Tabelle 12: Einfluss der FertPlus- Konzentration auf die Motilität auf die Spermien an Tag 1 und 5.
Motilität (%) FertPlus?-
Konzentration (µMol) 0 0,2 1
n (Ejakulate) 34 34 34
Tag 1 83,2 a 82,9 a 82,8 a
Tag 5 43,8 b 42,8 b 39,9 b
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p< 0,05).
Die Einflüsse „Eber“ und „Untersuchungstage“ auf die Motilität, sowie die Wechselwirkungen zwischen Eber und Tag waren signifikant (p<0,05) (nicht gezeigt).
3.2.2.2 Morphologische Untersuchung
Bei der morphologischen Untersuchung der Spermien ergaben sich drei Gruppierungen:
(1) Spermien mit normalem apikalem Rand (NAR)
(2) Morphologisch abweichende Spermien ohne Plasmatropfen (MAS) (3) Spermien mit anhaftenden Plasmatropfen (PT).
(1) Spermien mit normalem apikalem Rand (NAR)
Die Unterschiede zwischen den Ebern und den Untersuchungstagen waren teilweise signifikant (p< 0,05) (Tabelle 13 bzw. 14), ein Peptideinfluß war jedoch statistisch nicht nachweisbar.
Tabelle 13: Spermien mit normalem apikalem Rand (in %) bei den drei FertPlus®- Konzentrationen an Tag 1
Eber Ejakulate
Spermien
mit normalem apikalem Rand (%)
n
_
X SD
A 12 99,0 a 0,8
B 9 99,5 a 0,7
C 13 98,6 b 1,4
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant.
Tabelle 14: Spermien mit normalem apikalem Rand (in %) bei den drei FertPlus®- Konzentrationen an Tag 5
FertPlus Ejakulate Eber Konzentration
Spermien
mit normalem apikalem Rand (%)
(µMol) n
_
X SD
A 0 12 93,8 a 3,8
A 0,2 12 93,1 a 3,7
A 1 12 91,5 a 4,3
B 0 9 95,1 a 2,4
B 0,2 9 95,6 a 2,8
B 1 9 95,0 a 3,1
C 0 13 90,7 b 4,3
C 0,2 13 89,8 b 3,8
C 1 13 90,0 b 3,6
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant (p<0,05).
Eine signifikante Abnahme der Spermien mit normalem apikalem Rand zwischen Tag 1 und 5 ergab sich auch bei der Zusammenfassung über alle Eber (p< 0,05) (Tabelle 15).
Tabelle 15: Spermien mit normalem apikalem Rand (in %) bei den drei FertPlus®- Konzentrationen an Tag 1 und 5
Spermien mit normalem apikalem Rand (%)
FertPlus®-Konzentration
(µMol) 0 0,2 1
n (Ejakulate) 34 34 34
Tag 1 99,0 a 99,0 a 99,0 a
Tag 5 93,2 b 92,8 b 92,6 b
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p<0,05).
(2) Morphologisch abweichende Spermien (ohne Plasmatropfen)
Der prozentuale Anteil der morphologisch abweichenden Spermien (MAS) ohne Plasmatropfen wies nur geringgradige, statistisch nicht nachweisbare Differenzen zwischen den drei FertPlus®- Konzentrationen auf, wohingegen die Unterschiede zwischen Tag 1 und 5 hochsignifikant (p<0,0001) sind (Tabellen 16 und 17).
Die Spermien von Eber C wiesen an Tag 1 und 5 signifikant mehr morphologische Veränderungen auf als die von Eber A und Eber B.
Tabelle 16: Eberunterschiede hinsichtlich der morphologisch abweichende Spermien (ohne Plasmatropfen) an Tag 1
Eber Ejakulate
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p<0,05)
Tabelle 17: Einfluss des FertPlus-- Peptids auf die morphologisch abweichende Spermien (ohne Plasmatropfen) der drei Eber an Tag 5
Eber FertPlus- Ejakulate
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus- Konzentration signifikant (p<0,05)
In Tabelle 18 ist die signifikante Zunahme des prozentuellen Anteils morphologisch abweichender Spermien innerhalb von fünf Tagen bei allen FertPlus- Konzentrationen zusammengefaßt über alle Eber dargestellt (p<0,0001), ohne dass zwischen den Peptid- Konzentrationen Unterschiede festgestellt werden konnten.
Tabelle 18: Morphologisch abweichende Spermien (MAS) ohne Plasmatropfen (in %) am 1. und 5. Untersuchungstag zusammengefaßt über alle Eber
Morphologisch abweichende Spermien (%) FertPlus®- Konzentration
(µMol) 0 0,2 1
n (Ejakulate) 34 34 34
Tag 1 6,4 a 6,4 a 6,4 a
Tag 5 11,3 b 11,6 b 12,4 b
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p<0,0001).
3.2.2.3 Plasmatropfen
Die Anzahl der Plasmatropfen ist bei den Ebern (p< 0,0001) und auch an den Untersuchungstagen (p< 0,05) signifikant unterschiedlich (Tabelle 19 und 20).
Eber C hat signifikant weniger Plasmatropfen, aber mehr morphologisch veränderte Spermien als Eber A und Eber B (Abbildung 17).
Tabelle 19: Prozentualer Anteil von Plasmatropfen im Ejakulat der drei Eber an Tag 1
Eber Ejakulate Plasmatropfen (%)
n
_
X SD
A 12 18,7 a 6,2
B 9 20,1 a 4,1
C 13 5,2 b 2,5
b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p<0,0001).
Tabelle 20: Prozentueller Anteil von Plasmatropfen unter Berücksichtigung des Ebers und der FertPlus®- Konzentration an Tag 5
Eber FertPlus- Ejakulate Konzentration
Plasmatropfen (%)
(µMol) n
_
X SD
A 0 12 25,1 a 4,8
A 0,2 12 26,0 a 5,2
A 1 12 24,5 a 5,2
B 0 9 23,6 a 6,2
B 0,2 9 24,0 a 7,3
B 1 9 24,0 a 7,3
C 0 13 4,8 b 2,3
C 0,2 13 5,4 b 3,0
C 1 13 4,8 b 2,7
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant.
a a
a a
b
b
0 5 10 15 20 25
%
Eber A Eber B Eber C
MAS ohne PT% PT%
Abbildung 17: Prozentualer Anteil der morphologisch abweichenden Spermien (MAS) ohne Plasmatropfen (PT) und Spermien mit Plasmatropfen bei den drei Ebern an Tag 1 (n= 34 Ejakulate)
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb eines Kriteriums signifikant (p< 0,05).
3.2.2.4 Propidiumiodid
Eine Propidiumiodid (PI)- Färbung gibt Hinweise auf den Anteil Spermien mit defekter Plasmamembranintegrität.
In Tabelle 21 und 22 sind die PI- positiven Spermien, also die mit gestörter Plasmamembranintegrität unter besonderer Berücksichtigung der Eber und der unterschiedlichen Peptidkonzentrationen dargestellt. Bei keinem der Eber ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den FertPlus®- Konzentrationen.
Tabelle 21: Anteil der Spermien mit gestörter Plasmamembranintegrität (PI- positiv) unter besonderer Berücksichtigung der Eber und FertPlus®- Konzentrationen an Tag 1
Eber FertPlus- Ejakulate Konzentration
PI- positive Spermien (%)
(µMol) n
_
X SD
A 0 12 11,0 3,3
A 0,2 12 12,7 3,3
A 1 12 13,3 2,7
B 0 9 8,8 2,3
B 0,2 9 11,1 2,8
B 1 9 10,3 2,9
C 0 13 11,7 3,4
C 0,2 13 11,8 3,3
C 1 13 13,2 4,7
Zwischen den FertPlus®- Konzentrationen ergab sich kein signifikanter Unterschied (p> 0,05).
Tabelle 22: Anteil der Spermien mit gestörter Plasmamembranintegrität (PI- positiv) unter besonderer Berücksichtigung der Eber und FertPlus®- Konzentrationen an Tag 5
Eber
FertPlus-
Konzentration Ejakulate
PI- positive Spermien (%)
(µMol) n
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant (p<0,05).
Eber (Tabelle 23) und Untersuchungstage (Abbildung 18) hatten auf die Plasmamembranintegrität einen signifikanten Einfluß (p< 0,05).
Tabelle 23: Plasmamembranintegrität der Spermien aller Eber zusammengefaßt über beide Tage
FertPlus®-
Konzentration (µMol) PI- positive Spermien (%)
0 0,2 1
Eber A 15,6 a 15,7 a 16,8 a
Eber B 10,7 b 13,0 a, b 12,6 b
Eber C 16,9 a 17,6 a, c 18,3 a
a- c: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p< 0,05).
Die Anzahl der Spermien mit gestörter Plasmamembranintegrität, also die Anzahl rotgefärbter Spermien, nimmt nach fünf Tagen Lagerung signifikant zu (p<0,05) (Abbildung 18), wobei der Unterschied zwischen den Peptidkonzentrationen statistisch nicht abzusichern war.
a b
a b
a b
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
%
0 0,2 1 uMol
Tag 1 Tag 5
Abbildung 18: Vergleich der Plasmamembranintegrität nach Anwendung unterschiedlicher FertPlus®- Konzentrationen zusammengefaßt über alle Eber a, b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant (p<0,05).
3.2.2.5 Spermienbindungsassay
Insgesamt wurden pro FertPlus®- Konzentration 33 Ejakulate jeweils an Tag 1 und 5 im Spermienbindungsassay untersucht.
Tabelle 24 faßt die Bindungsresultate für die individuellen Eber zusammen, wobei sich die Werte von Eber A signifikant von den Werten der anderen beiden Eber unterscheiden.
Tabelle 24: Spermienbindungsfähigkeit im SBA bei den drei FertPlus®- Konzentrationen unter besonderer Berücksichtigung der drei Eber zusammengefaßt über beide Untersuchungstage (Tag 1 und 5)
Mittelwert gebundener Spermien im SBA/
6 Wells FertPlus®-
Konzentration (µMol)
0 0,2 1
Eber A 1,6 a 1,5 a 1,6 a
Eber B 2,7 b 2,7 b 2,6 b
Eber C 2,7 b 2,7 b 2,6 b
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p< 0,05).
Werden die SBA- Daten von Tag 1 Eber- bezogen dargestellt (Tabelle 25), ergeben sich zwischen den Peptidkonzentrationen bei allen Ebern keine signifikanten Unterschiede, wohingegen zwischen Eber A und C bei allen Peptidkonzentrationen signifikante Unterschiede der Bindung vorliegen.
Tabelle 25: Spermienbindungsfähigkeit im SBA bei den drei FertPlus®- Konzentrationenunter besonderer Berücksichtigung der drei Eber an Tag 1
Mittelwert gebundener Spermien im SBA/
6 Wells FertPlus®-
Konzentration (µMol)
0 0,2 1
Eber A 1,94 a 2,06 a 2,25 a
Eber B 2,81 a, b 3,11 a, b 3,13 a, b
Eber C 3,43 b 3,79 b 3,42 b
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p< 0,05).
Im 5 Tage gelagerten Sperma (Tabelle 26) ergeben sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den FertPlus®- Konzentrationen, wobei signifikante Eberunterschiede lediglich zwischen Eber A und B bei der Nullkontrolle vorhanden sind.
Tabelle 26: Spermienbindungsfähigkeit im SBA bei den drei FertPlus®- Konzentrationenunter besonderer Berücksichtigung der drei Eber an Tag 5
Mittelwert gebundener Spermien im SBA/
6 Wells FertPlus®-
Konzentration (µMol)
0 0,2 1
Eber A 1,17 a 0,98 a 0,98 a
Eber B 2,68 b 2,26 a 2,07 a
Eber C 1,87 a, b 1,67 a 1,64 a
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p< 0,05).
In Abbildung 19 wird ein signifikanten Abfall der Bindungsfähigkeit zwischen Tag 1- und Tag 5- Sperma aller Eber ohne Unterschied zwischen den verschiedenen Peptidkonzentrationen gezeigt.
a
b
a
b
a
b
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
%
0 0,2 1 uMol
Tag 1 Tag 5
Abbildung 19: Einfluss der FertPlus®- Konzentration auf die Spermienbindungsfähigkeit im SBA über alle Eber (34 Ejakulate)
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p<0,05).
3.2.3 Befruchtungsergebnisse
3.2.3.1 Corpora lutea, Embryonen und Eizellen
Von den 99 besamten Jungsauen konnten 96 für die Auswertung berücksichtigt werden, da 3 postovulatorisch besamt worden waren.
Die Anzahl der Sauen pro FertPlus®- Konzentration, die Anzahl Corpora lutea und der zurückgewonnenen Embryonen bzw. Eizellen sind in Tabelle 27 dargestellt.
Insgesamt wurden 1244 Corpora lutea und 1119 Embryonen/ Eizellen ermittelt, was einer durchschnittlichen Spülrate von 89,9% entspricht.
Tabelle 27: Anzahl der Corpora lutea, Embryonen und Eizellen sowie die Spülrate nach Besamung mit den unterschiedlichen FertPlus®- Konzentrationen
FertPlus®- Konzentration
µMol
Sauen n
Corpora lutea n
Embryonen/
Eizellen n
Spülrate
%
0 34 435 395 90,8
0,2 31 403 360 89,3
1 31 406 364 89,6
Durchschnittlich wurden 13,0 Corpora lutea gezählt und 11,7 Eizellen/
Embryonen gewonnen. Die Befruchtungsrate betrug 87,8 %.
Es wurden Embryonen vom 2- Zellstadium bis zur Blastozyste gewonnen, von denen 81,6 % als entwicklungsfähige Embryonen eingestuft wurden.
In Abbildung 20 ist die prozentuale Häufigkeit der Entwicklungstadien aller 817 Embryonen, die als normal beurteilt wurden, in Abhängigkeit vom Intervall Ovulation- Embryonengewinnung dargestellt. In den ersten zwei Tagen (bis 49 Stunden p. Ov.) liegen nur 2- bis 7- zellige Embryonen vor, während am Ende des dritten Tages (nach 85 Stunden p. Ov.) 59,8 % Morulae und am 5. Tag (>120 Stunden p. Ov.) fast ausschließlich Blastozysten (96,8%) vorkommen.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
37- 49h 49-61h 61-73h 73-85h 85-97h
97-109h 109-121h 121-133h
Intervall Ovulation- Spülung
2-3 Blastomerenkerne 4-7 Blastomerenkerne 8-11Blastomerenkerne
Morula Blastozyste
Abbildung 20: Häufigkeitsverteilung der embryonalen Stadien in Abhängigkeit vom Intervall Ovulation- Embryonengewinnung (Embryonenalter)
3.2.3.2 Befruchtungsdaten
In wieweit die
• FertPlus®- Konzentration,
• der Eber,
• das Intervall künstliche Besamung- Ovulation und/ oder
• Eber und FertPlus®- Konzentration gemeinsam
die Befruchtungsdaten beeinflussen, wollten wir in diesem Besamungsversuch klären.
In Tabelle 28 sind die Befruchtungsergebnisse der beiden FertPlus -Konzentrationen und der Nullprobe dargestellt.
Die signifikant höchsten Ergebnisse hinsichtlich Befruchtungsrate und Anzahl akzessorischer Spermien wurde bei der Kontrollgruppe (0 µMol FertPlus) erzielt (p<0,05).
Der Befruchtungsrate, dem Mittelwert und dem Median der akzessorischen Spermien liegen nur die normalen Embryonen (sehr gute/ gute Qualität) zugrunde.
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p<0,05).
Die Befruchtungsdaten der drei Eber sind in Tabelle 29 dargestellt. Eber A und Eber C hatten im Vergleich zu Eber B die signifikant besseren Befruchtungsrate und durchschnittlich auch mehr akzessorische Spermien (p<0,05).
Tabelle 29: Befruchtungsdaten der drei Eber
Eber Sauen Embryonen und Eizellen
Normale Embryonen
Befruchtungs- rate
Akzessorische Spermien
n n n %
_
X Median
A 33 387 271 70,0 a 38,3 a 38,3 a
B 27 322 197 61,2 b 14,2 b 14,0 b
C 36 410 319 77,8 c 58,9 a 47,1a
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich in Spalten signifikant (p<0,05).
In Abbildung 21 werden die Befruchtungsraten und Mittelwerte der akzessorischen Spermien/ Zonae normaler Embryonen dargestellt. Es deuten sich Parallelitäten der Befruchtungsrate (in %) und der Mittelwerte der akzessorischen Spermien/ Zona an, die statistisch jedoch nicht abgesichert werden konnten.
a
a
b
b
c
a
0 10 20 30 40 50 60 70 80%
Eber A Eber B Eber C
Befruchtungsrate (in %) Mittelwert AS
Abbildung 21: Befruchtungsraten und Mittelwerte akzessorischer Spermien (AS) auf der Basis normaler Embryonen zwischen den Ebern
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb eines Kriteriums signifikant.
Mit Hilfe der sonographischen Ovardiagnostik teilten wir die Sauen in zwei Gruppen ein:
• Sauen, bei denen die Ovulation nach 0- <12 h oder
• Sauen, bei denen die Ovulation nach 12- 30 Stunden erfolgte.
Das Intervall zwischen künstlicher Besamung und Ovulation beeinflusst die Befruchtungsdaten aller 96 Sauen deutlich (Tabelle 30). Ovulierten die Sauen innerhalb von 12 Stunden nach der Besamung, waren die Befruchtungsraten und akzessorischen Spermien pro Zona signifikant (p<0,05) höher.
Tabelle 30: Einfluß des Intervalls künstliche Besamung (K.B.)- Ovulation auf die Befruchtungsergebnisse und akzessorische Spermien
Intervall K.B.- Ovulation
SauenEmbryonen und Eizellen
Normale Embryonen
Befruchtungs- rate
Akzessorische Spermien
h n n n %
_
X Median
0- <12 48 557 422 81,5 a 47,8 a 32,5 a
13- 30 48 561 370 67,5 b 39,3 b 30,7 a
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p<0,05).
Tabelle 31 und Abbildung 20 verdeutlichen die Befruchtungsergebnisse mit und ohne Peptidbehandlung der Spermien vor dem Besamungseinsatz bei den Ebern. Bei der gleichzeitigen Betrachtung der Befruchtungsrate aller drei Peptidkonzentrationen werden bei den Ebern die besten Ergebnisse in der Kontrollgruppe (0 µMol) erzielt, was bei Eber A und B statistisch abgesichert werden konnte (p<0,05). Auch die Mittelwerte und Mediane der akzessorischen Spermien/ Zona sind bei der Kontrollgruppe höher als bei Einsatz des Verdünners mit FertPlus.
Tabelle 31: Einfluss der Peptidkonzentration auf die Befruchtungsrate innerhalb der Eber
Eber FertPlus Sauen Embryonen/Befruchtungs- Konzentration Eizellen rate
Akzessorische Spermien
(µMol) n n %
_
X Median
A 0 13 154 80,5 a 53,9 c, d 41,5 c
A 0,2 10 118 64,1 b 18,4 c 33,5 c, d
A 1 10 115 62,3 b 37,9 c 39,9 c, d
B 0 9 103 80,5 a 27,7 c 32,3 c
B 0,2 9 112 51,5 b 6,7 d 6,1 c
B 1 9 107 51,6 b 8,3 c 3,4 c
C 0 12 138 83,7 a 70,2 d 54,4 c
C 0,2 12 130 76,3 a 61,6 c 50,4 d
C 1 12 142 73,4 a 44,9 c 36,5 d
a-b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb der Eber signifikant (p< 0,05);
c-d: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant.
Die Abbildung 22 verdeutlicht den Abfall der Befruchtungsraten bei Einsatz des Verdünners mit FertPlus® in Besamungsdosen.
Abbildung 22: Befruchtungsraten der Eber bei den drei verschiedenen FertPlus®- Konzentrationen
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb der Eber signifikant (p< 0,05).
a
b b
a
b b
a
a a
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
%
Eber A Eber B Eber C
0 uMol 0,2 uMol 1 uMol
3.2.3.3 Akzessorische Spermien
Neben den Befruchtungsergebnissen (Qualität der Embryonen; befruchtet oder unbefruchtet) wurden die akzessorischen Spermien in den Zonae pellucidae der normalen Embryonen getrennt nach den Ebern und FertPlus®- Konzentration verglichen (Abbildung 23). Zwischen den Ebern innerhalb einer FertPlus®- Konzentrationen liegen signifikante Unterschiede vor (p<0,05), aber zwischen den Peptid- Konzentrationen innerhalb der Eber konnten keine Unterschiede statisch abgesichert werden.
Abbildung 23: Mittelwerte der akzessorischen Spermien pro Zona getrennt nach Eber und FertPlus®- Konzentration.
a- b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer FertPlus®- Konzentration signifikant.
a, b
Desweiteren teilten wir die akzessorischen Spermien pro Zona in eine der drei verschiedene Gruppen ein:
• 0-20 Spermien/ Zona
• 21- 80 Spermien/ Zona
• 81->200 Spermien/ Zona.
Da wir suboptimale Spermienkonzentrationen in den Besamungsdosen einsetzten, sollten so mögliche Auswirkungen auf die Anzahl der akzessorischen Spermien/ Zona dokumentiert werden, wobei <20 akzessorischen Spermien/ Zona zu den suboptimalen und >80 AS/ Zona zu den optimalen Befruchtungsbedingungen zählten (WEITZE, pers. Mitt.).
Diese drei Gruppen wurde in den drei Verdünnervarianten miteinander verglichen (Abbildung 24), wobei die Verteilung zugunsten der höheren Spermienzahlen pro Zona bei der Kontrollgruppe statistisch nicht abgesichert werden konnte. Der Einfluß der Eber auf die Spermienverteilung ist jedoch signifikant (p< 0,05).
0 uMol 0,2 uMol 1uMol
0-20 21-80 81->200
Abbildung 24: Häufigkeitsverteilung der akzessorischen Spermien in den drei FertPlus®- Gruppen
0- 20 : 0- 20 akzessorische Spermien/ Zona, 21- 80 : 21- 80 akzessorische Spermien/ Zona, 81- > 200 : 81- 200 akzessorische Spermien/ Zona
Zwischen den FertPlus®- Konzentrationen ergab sich kein signifikanter Unterschied (p> 0,05).
Die Unterschiede bei den drei Eber hinsichtlich der Verteilung der akzessorischen Spermien/ Zona sind in Abbildung 25 dargestellt.
Bei Eber B (mit der geringsten Fertilität) ist im Vergleich zu Eber A und Eber C eine starke Linksverschiebung auffällig, d.h. es traten vermehrt Embryonen mit
< 20 akzessorischen Soermien/ Zona auf.
Bei allen drei Gruppierungen hatten die Eber einen signifikanten Einfluß auf die Verteilungn (p<0,05).
Abbildung 25: Gruppierung der akzessorischen Spermien/ Zona bei den drei Ebern 0- 20 : 0- 20 akzessorische Spermien/ Zona,
21- 80 : 21- 80 akzessorische Spermien/ Zona, 81- > 200 : 81- 200 akzessorische Spermien/ Zona
a- c: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppierung signifikant (p<0,05).
a
4 Diskussion
Ursachen der Subfertilität sind für Mensch und Tier von großer Bedeutung. Die Erforschung des komplexen Mechanismus der Spermien- Eizell- Interaktionen gewinnen in diesem Zusammenhang zunehmend an Bedeutung. Die molekularen Abläufe der Gameteninteraktionen sind derzeit bei Maus und Schwein am besten untersucht. Die Bedeutung des Prosaposin- oder SGP 1-Fragmentes, dem „Universal Sperm Egg Binding Protein“ (UPSEBP), welches die Menschen- bzw. Rattensequenz als molekulare Basisstruktur aufweist, war in den vergangenen Jahren häufig Gegenstand von Untersuchungen über die molekularen Bindungsvorgänge. UPSEBP liegt in synthetischer Form vor und könnte an der primären wahrscheinlich speziesunspezifischen Spermien- Zona pellucida- Bindung beteiligt sein. Als Samenzusatz soll es an Spermien binden und als „Brücke“ zwischen Spermatozoon und Zona pellucida wirken, insbesondere in den Fällen, wenn dieses Molekül in nicht ausreichender Konzentration an der Spermienoberfläche vorhanden ist, so dass die Spermienbindung in vivo an den Zona- Rezeptor oder an die Substratmembran des Spermien- Bindungs- Assays (SBA) in vitro verbessert und somit die Befruchtungschancen bzw. der Anteil bindender Spermien erhöht werden (AMANN et al., 1999 a, b; HAMMERSTEDT et al. 2001).
4.1 Spermienunterschiede
Ziel der spermatologischen in vitro-Untersuchungen von nativem und flüssigkonserviertem Sperma in der vorliegenden Arbeit war, die Einflußfaktoren FertPlus®-Peptid, Lagerungszeit und Eber auf die Samenqualität zu ermitteln.
Im Verlaufe der Lagerung des Samens von Tag 1 auf Tag 5 wurde ein zu erwartender signifikanter Abfall der Spermienqualität beobachtet, wobei jedoch bei keinem der in- vitro untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Peptidkonzentrationen und der Kontrolle nachzuweisen war (Tabelle 10- 26). Alterungsphänomene dieser Art sind bei einer fünftägigen
Lagerung von bei +18°C flüssigkonserviertem Ebersperma zu erwarten und bestätigen insofern vorherige Arbeiten (LIETMANN, 1992; WABERSKI et al.
1994 und 1996).
In der vorliegenden Arbeit diente die in- vitro Lagerung des Spermas daher auch vorzugsweise der Überprüfung eines möglichen Einflusses des FertPlus® -Peptids auf die Standard- Samenparameter, ohne dass hieraus definitive Schlüsse auf eine mögliche Beeinträchtigung der Befruchtungspotenz durch den Peptidzusatz gezogen werden können, da Leitparameter, wie Spermienmotilität, Membranintegrität und Anteil formveränderter Samenzellen- und hier insbesondere Veränderungen im Membranbereich des Akrosoms - lediglich den Schluß zulassen, daß keine substantiellen Defekte der Samenzelle vorliegen, ohne eine endgültige Information über Membranveränderungen im biochemisch- molekularen Bereich der für die Spermien- Eizellbindung kompetenten Domänen der Samenzelle zu erlauben (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001).
• Motilität
Wie bereits dargelegt, ergab sich ohne Unterschied zwischen den Samenbehandlungen ein signifikanter Motilitätsabfall von Tag 1 auf Tag 5. Da in der Besamungspraxis davon ausgegangen wird, dass bei den üblichen Spermienzahlen pro Besamungsdosis von 2 bis 3 Milliarden ein Einsatz ohne signifikanten Fruchtbarkeitsabfall von bis zu 3 Tagen und bei über- durchschnittlich fertilen Vatertieren unter Verwendung sogenannter Langzeitverdünner ein Einsatz von bis zu 5 Tagen zu vertreten ist (WABERSKI et al., 1988), ist dieses Intervall sehr gut geeignet, Aussagen über fertilitätsrelevante Veränderungen der in vitro-Parameter zu treffen.
Die Spermienmotilität als wesentlicher Qualitätsparameter ist ein Beleg für den ungestörten Ablauf des Energiestoffwechsels und gibt Informationen über den Funktionszustand von Mitochondrien und Kontraktionsapparat der
Spermiengeißel. Als solche ist die ungestörte Beweglichkeit essentiell für die Überwindung der Barrieren des weiblichen Genitales, insbesondere der uterotubalen Verbindung und nach Kapazitation in ihrer hyperaktivierten Form auch voraussetzend für das Zusammentreffen der Gameten im mittleren Eileiter (TOEPFER-PETERSEN und WABERSKI, 2001), und ist auch essentiell beteiligt an der nach Zona- Bindung erforderlichen Penetration der Zona pellucida.
Eine statistisch nachweisbare Beziehung zwischen in- vitro- Motilität und in- vitro- bzw. in- vivo- Befruchtungserfolgen läßt sich jedoch erst von Fall zu Fall belegen, wenn die Motilitätsrate unter 60 % sinkt bzw. bei der in- vitro- Befruchtung die Spermienzahl pro Well unter 5000 eingestellt wird. Also wenn sich die Spermienzahl in einem Bereich liegt, der sich nach biologischer Erfahrung unter der Norm befindet, welche nach den bisher vorliegenden Ergebnissen von in- vitro- Befruchtungsversuchen beim Schwein als Minimum angesehen werden (WABERSKI et al., 1988 und 1996; KRUEGER, 2000) bzw.
bei Besamungs-Feldstudien im Bereich von 70 % vorwärtsbeweglichen Spermien liegen (WABERSKI et al., 1999; FLOWERS, 2001).
Daß auch Eber und die Wechselwirkung zwischen Eber und Untersuchungstag in der vorliegenden Arbeit einen signifikanten Einfluß auf die Spermienmotilität hatten, kann als Hinweis darauf angesehen werden, dass weitere Eigenschaften der Spermien als die Vorwärtsbeweglichkeit für die Befruchtungskompetenz eine Rolle spielen, wie beispielsweise individuelle Ebereffekte innerhalb ein und derselben Motilitätskategorie, die bisher an keinem in- vitro- Parameter festgemacht werden konnten, jedoch in der Besamungspraxis von erheblicher Bedeutung für die Selektion von besonders fertilen Vatertieren sind und nur hypothetisch unterschiedlicher Kompetenz im Sinne von Fitness-Unterschieden bei der Überwindung der Barrieren von Uterus, Eileiter und Zona pellucida zugeordnet werden (WABERSKI et al.
1999).
• Morphologische Samenparameter
Der signifikante Anstieg des Anteiles morphologisch abweichender Spermienformen zwischen Tag 1 und 5 ist ein Hinweis, daß über Motilitätsveränderungen hinaus alterungsbedingte Veränderungen an den Samenzellen ablaufen, die eine Verringerung der Befruchtungsfähigkeit signalisieren. Den morphologischen in- vitro- Befunden bei Spermien wird von vielen Autoren eine höhere Einflußnahme auf die Befruchtungsfähigkeit zugemessen als dem Motilitätsverhalten (LARSSON et al., 1980;
FALKENBERG et al., 1984; DIRKSEN, 1991; WABERSKI et al., 1994), da diese besonders bei zunehmender Lagerungsdauer (Konservierung über 5 Tage) zu signifikant negativen Korrelationen zwischen Anteil formveränderten Samenzellen und Abferkelraten bzw. Wurfgrößen führt.
Obwohl in der vorliegenden Arbeit maximal für 30 h konserviertes, d.h.
theoretisch nicht oder geringfügig gealtertes Sperma unter experimentellen Bedingungen eingesetzt wurde- (exakte Feststellung von Brunstbeginn und
-ende, Erkennung des Ovulationszeitpunktes mittels Ultraschall und damit Einengung der wahrscheinlichen Befruchtungszeit, einmalige Insemination 12 h Stunden nach Brunsterkennung, Präzisierung des Intervalles Insemination- Befruchtung als Maß für die in vivo- Alterung des Inseminates im Genitale der Sau)- scheint der Anteil morphologisch veränderter Samenzellen (MAS) die Befruchtungsraten per se, d.h. unabhängig von einer eventuell noch zusätzlich einwirkenden Alterung signifikant zu beeinflussen. Denn die ermittelten signifikanten Eberunterschiede gehen hinsichtlich des Anteiles morphologischer Veränderungen ohne Plasmatropfen sowie des Anteils an der Geißel
-ende, Erkennung des Ovulationszeitpunktes mittels Ultraschall und damit Einengung der wahrscheinlichen Befruchtungszeit, einmalige Insemination 12 h Stunden nach Brunsterkennung, Präzisierung des Intervalles Insemination- Befruchtung als Maß für die in vivo- Alterung des Inseminates im Genitale der Sau)- scheint der Anteil morphologisch veränderter Samenzellen (MAS) die Befruchtungsraten per se, d.h. unabhängig von einer eventuell noch zusätzlich einwirkenden Alterung signifikant zu beeinflussen. Denn die ermittelten signifikanten Eberunterschiede gehen hinsichtlich des Anteiles morphologischer Veränderungen ohne Plasmatropfen sowie des Anteils an der Geißel