VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN
Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de
VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique
9 7 8 3 8 3 5 9 6 6 3 5 2
ISBN: 978-3-8359-6635-2
Photo cover: ©
JULIA SABINE FRANCKE DIAGNOSTIK U. THERAPIE DER LISTERIOSE
Julia Sabine Francke
Untersuchungen zur Diagnostik und Therapie der Listeriose bei kleinen Wiederkäuern
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
Tierärztliche Hochschule Hannover - 2017 -
VVB
VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique
Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt.
Die rechtliche Verantwortung für den gesamten Inhalt dieses Buches liegt ausschließlich bei dem Autor dieses Werkes.
Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch
elektronische Systeme.
1. Auflage 2017
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted,
in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior
written permission of the Author or the Publishers.
1 Edition 2017st
© 2017 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890
email: redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de
édition linguistique
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Diagnostik und Therapie der Listeriose bei kleinen Wiederkäuern
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Julia Sabine Francke
Bad Hersfeld
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und ambulatorische Klinik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. A. Tipold
Tag der mündlichen Prüfung: 23.10.2017
Meinen Lieben
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Kongressen veröffentlicht:
FRANCKE J.,GANTER M.
Diagnostik und Therapie der Listeriose bei Schafen.
Workshop Kleine Wiederkäuer auf dem 7. Leipziger Tierärztekongress, 16.-18.01.2014, Congress Center Leipzig.
LBH: 7. Leipziger Tierärztekongress, Band 1, 226-228
FRANCKE J.,GANTER M.
Diagnostik und Behandlung der Listeriose
bpt-Kongress 2014, Hobbytier- und Herdenbetreuung bei kleinen Wiederkäuern, Hannover. Zusammenfassungen S. 78-81
13.11.2014
GANTER M.,FRANCKE J.
Investigations of the Cerebrospinal fluid in sheep and goats with CNS disorders.
9th Intern. Sheep Vet. Congress, Harrogate, UK, 22nd-26th May 2017 Proceedings.
GANTER M.,FRANCKE J.
Trials on Therapy of Listeriosis in Sheep.
9th Intern. Sheep Vet. Congress, Harrogate, UK, 22nd-26th May 2017 Proceedings.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 15
2 Literaturübersicht ... 17
2.1 Liquor cerebrospinalis ... 17
2.1.1 Liquorbildungsort, -räume, und –abfluss ... 17
2.1.2 Funktion und Zusammensetzung ... 18
2.2 Blut-Hirn-Schranke/Blut-Liquorschranke ... 18
2.3 Untersuchung von Liquor bei kleinen Wiederkäuern ... 19
2.3.1 ... Gesamtleukozytenzahl und Differentialzellbild des Liquor cerebrospinalis ... 20
2.3.2 Eiweißgehalt von Liquor cerebrospinalis ... 22
2.3.3 Proteinelektrophorese von Liquor cerebrospinalis ... 23
2.3.4 Albuminquotient ... 26
2.4 Listeriose ... 27
2.4.1 Ätiologie, Epidemiologie und Pathogenese ... 27
2.4.2 Klinik ... 30
2.4.3 Diagnostik ... 31
2.4.4 Differentialdiagnosen ... 32
2.4.5 Therapie ... 35
3 Material und Methoden ... 39
3.1 Probenmaterial ... 39
3.2 Probenentnahme ... 40
3.3 Probenbearbeitung ... 42
3.3.1 Liquor cerebrospinalis ... 42
3.3.2 Serumproben ... 42
3.4 Neurologische Untersuchung ... 42
3.5 Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Liquor ... 42
3.6 Differenzierung der Zellen im Liquor... 44
3.7 Listeriolysin-Antikörper-Immunblot ... 45
3.8 Bestimmung von Gesamteiweiß im Serum ... 45
3.9 Bestimmung von Gesamteiweiß im Liquor ... 45
3.10 Aufkonzentration der Liquores ... 47
3.11 Elektrophorese auf Celluloseacetat-Papier ... 48
3.12 Bestimmung des Albuminquotienten ... 49
3.13 Durchführung der Listeriose-Therapiestudie ... 49
3.14 Untersuchung von Futterproben ... 51
3.15 Statistische Auswertung ... 52
4 Ergebnisse ... 53
4.1 Gesunde Kontrollgruppe ... 53
4.1.1 Nachweis von Antikörpern gegen Listeriolysin im Liquor ... 53
4.1.2 Gesamtprotein im Liquor ... 53
4.1.3 Liquorelektrophorese ... 53
4.2 Listeriose-Therapiestudie ... 58
4.2.1 Neurologische Untersuchung ... 58
4.2.2 Therapieerfolg / Überlebensrate ... 58
4.2.3 Gesamtleukozytenzahl und Liquorzytologie ... 59
4.2.4 Gesamtproteingehalt und Proteinfraktionen im Liquor und in den korrespondierenden Seren, sowie Albuminquotienten ... 61
4.2.5 Pathologische und pathohistologische Untersuchungen ... 65
4.2.6 Mikrobiologische Untersuchungsergebnisse ... 66
4.2.7 Vorkommen von Antikörpern gegen Listeriolysin im Liquor ... 66
4.2.8 Untersuchungsergebnisse der Silageproben ... 66
4.3 Untersuchung von weiteren Liquores von kleinen Wiederkäuern ... 67
4.3.1 Gesamtproteingehalt und Elektrophorese ... 69
4.3.2 Gesamtleukozytenzahl und Differentialzytologie im Liquor ... 71
4.4 Übergreifender Vergleich aller untersuchten Liquorproben ... 72
4.5 Sensitivität und Spezifität des Listeriolysin-Antikörper-Immunblots ... 74
5 Diskussion ... 75
5.1 Gesunde Kontrollgruppe ... 75
5.2 Listeriose-Therapiestudie ... 76
5.2.1 Bewertung des Behandlungserfolgs ... 77
5.2.2 Bewertung der labordiagnostischen Ergebnisse der Therapiestudie .... 79
5.3 Bewertung der Ergebnisse der Zytologie und der Proteinzusammensetzung im Liquor der Klinikpatienten unter Mitberücksichtigung der Therapiestudienergebnisse ... 85
5.4 Anwendung eines Immunblots zum Nachweis von Antikörpern gegen Listeriolysin O im Liquor cerebrospinalis von kleinen Wiederkäuern ... 90
5.5 Schlussfolgerung ... 91
6 Zusammenfassung ... 95
7 Summary ... 99
8 Literaturverzeichnis ... 103
9 Anhang ... 124
Danksagung ... 127
Abkürzungsverzeichnis
x̅ arithmetischer Mittelwert i.m. intramuskulär
x̃ Median i.v. intravenös
Alb Albumin kg Kilogramm
AQ Albuminquotient L Liter
Aq. dest. Aqua destillata Lympho Lymphozyten
Baso Basophile Granulozyten Makroph Makrophagen
BHS Blut-Hirn-Schranke MWCO molecular weight cut off
BLS Blut-Liquor-Schranke mg Milligramm
CCN Cerebrocortikalnekrose mL Milliliter
CSF cerebrospinal fluid n Anzahl
EDTA Ethylendiamintetraacetat PCR Polymerase Chain Reaction
Eos Eosinophile Granulozyten pH-Wert negativ dekadischer Logarhitmus der H+-Ionen et al. et alii (und andere) s.c. subcutan
Fa. Firma SegGran Segmentierte
Granulozyten
g Gramm StabGran Stabkernige Granulozyten
g (physikalisch) Erdbeschleunigung TP total protein
GE Gesamteiweiß TS Trockensubstanz
GLZ Gesamtleukozytenzahl WdT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte
HCl Salzsäure ZNS zentrales Nervensystem
HES Hepatoenzephales
Syndrom
I.E. Internationale Einheiten
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Darstellung der verschiedenen Behandlungsgruppen und der
Überlebensrate ... 59 Abbildung 2: Albuminquotienten AQ1 (Tag 1) und AQ2 (Tag 7) der überlebenden Therapiestudientiere im Boxplot ... 64 Abbildung 3: Mittelwerte der Proteinfraktionen im Liquor der verschiedenen
Krankheitsgruppen (g/L) ... 71 Abbildung 4: Ergebnisse der Liquorelektrophorese der Klinikpatienten, Angabe der Mittelwerte der Eiweißfraktionen in g/L ... 89
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Referenzwerte für die Liquorelektrophorese gesunder Tiere (Angabe der Eiweißfraktionen in Prozent (%), Angabe der Mittelwerte (x̅) inklusive
Standardabweichung von Gesamteiweiß (GE) in g / L ... 25 Tabelle 2: Prozentuale Anteile der Proteinfraktionen (MW±SD), sowie der
Gesamteiweißgehalt (GE) im Liquor von Schafen mit ZNS-Störungen, nach Scott (1993b): ... 25 Tabelle 3: Absolute Konzentrationen der Gesamteiweißgehalte (GE), sowie der Proteinfraktionen (in g/L) im Liquor von Schafen mit ZNS-Störungen, nach SCOTT (1993b): ... 26 Tabelle 4: Proteinfraktionen der Liquorproben der gesunden Kontrollgruppe in
Prozent (%) ... 55 Tabelle 5: Proteinfraktionen der Liquorproben der gesunden Kontrollgruppe in g/L . 56 Tabelle 6: Referenzbereiche für Gesamteiweiß (GEL) und die Eiweißfraktionen Albumin, α1-, α2-, β- und γ-Globuline angeben in % (AlbLrel, α1Lrel, α2Lrel, βLrel, γLrel) und in g/L (AlbLabs, α1Labs, α2Labs, βLabs, γLabs), ermittelt aus den
Liquorproben der gesunden Kontrollgruppe (n=21) ... 57 Tabelle 7: Behandlungserfolg der einzelnen Therapiegruppen im Vergleich ... 59 Tabelle 8: Gesamtleukozytenzahl und Zytologie Liquor Therapiestudie, Angabe von Mittelwerten inklusive Standardabweichung (MW ± SD) ... 60 Tabelle 9: Mittelwerte von Gesamtleukozytenzahl (GLZ) und Segmentierten
Granulozyten (SegGran) an beiden Entnahmezeitpunkten der Gruppen geheilt/tot . 61
Tabelle 10: Proteinfraktionen in den Liquorproben der Therapiestudie in absoluten (g/L) und relativen Zahlen (%), Angabe der Mittelwerte inklusive
Standardabweichung ... 62 Tabelle 11: Proteinfraktionen in den Liquorproben der Therapiestudie in absoluten Zahlen (g/L) aufgeteilt nach überlebt/verendet, Angabe der Mittelwerte inklusive Standardabweichung ... 62 Tabelle 12: Entwicklung des Gesamteiweißgehaltes im Liquor (g/L) der
Therapiestudientiere sowie die Differenz (absolut und relativ) zwischen den
Entnahmezeitpunkten (MW ± SD, min-max) ... 63 Tabelle 13: Gesamtproteinkonzentrationen und Proteinfraktionen im Serum der der Therapiestudientiere in absoluten (g/L) und relativen (%) Zahlen, einschließlich der berechneten Albuminquotienten (AQ), Angabe der Mittelwerte inklusive der
Standardabweichung ... 65 Tabelle 14: Gruppeneinteilung der Klinikpatienten mit neurologischen Störungen ... 68 Tabelle 15: Mittelwerte ± SD der Gesamtproteingehalte (in g/L) und der
Proteinfraktionen in absoluten (g/L) und relativen Zahlen (%) ... 70 Tabelle 16: Gesamtleukozytenzahl (GLZ) und Differentialzellbild im Liquor der
Diagnosegruppen der Klinikpatienten (MW ± SD) ... 72 Tabelle 17: Signifikante Parameter der einzelnen Gruppen im Vergleich zu
Listeriose-kranken Tieren ... 73 Tabelle 18: Befunde der Listeriolysin O-Serologie (Schaf/Ziege) im Überblick ... 74 Tabelle 19: Geschätzte Sensitivitäten und Spezifitäten für Listeriolysin O-Serologie aus Liquor (Angabe in %) ... 74
Tabelle 20: Vergleich eigener Ergebnisse aus der Liquorelektrophorese mit Literaturangaben (Angabe von MW±SD absolute Werte (abs) in g/L und relative Werte (rel) in %): ... 76 Tabelle 21: Diagnosen Gruppe 9 der Klinikproben ... 124
Übersichtenverzeichnis
Übersicht 1: Gruppeneinteilung Therapiestudie………50
15
1 Einleitung
Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) spielen bei kleinen Wiederkäuern eine wichtige Rolle.
Problematisch sind dabei häufig die Abgrenzung von nicht-entzündlichen, metabolisch verursachten Erkrankungen des Organismus, sowie die Unterscheidung der verschiedenen infektiösen Erkrankungen des ZNS voneinander, da oft eine ähnliche klinische Symptomatik vorliegt (LIPPMANN 1969, SCOTT 2013).
In diesem Fall kann die Untersuchung des Liquor cerebrospinalis ein wichtiges Hilfsmittel in der Diagnostik sein.
In der vorliegenden Arbeit soll das Augenmerk vor allem auf der labordiagnostischen Untersuchung des Liquors von Schafen und Ziegen liegen. Einen besonderen Schwerpunkt bildet dabei die Diagnostik, aber auch die Prognostik der zentralnervösen Listeriose. Eine Erkrankung, die neben der häufig tödlich verlaufenden ZNS-Variante auch in anderen Ausprägungen (vor allem der metrogenen und septikämischen Form) zu weiteren Verlusten und somit zu nicht zu vernachlässigenden wirtschaftlichen Einbußen für den Betrieb führen kann (HELMER
et al. 2014).
Kleine Wiederkäuer besitzen gegenüber dieser Erkrankung eine hohe Empfänglichkeit (WAGNER et al. 2005), allerdings ist eine sichere ätiologische Diagnose bisher nur post mortem im Rahmen einer pathohistologischen Untersuchung des Hirnstammes, sowie eines mikrobiologischen Erregernachweises aus der Hirnstammregion möglich.
16
Aus diesem Grund sollen in dieser Arbeit, Sensitivität und Spezifität verschiedener labordiagnostischer Parameter zur Diagnose der zentralnervösen Form der Listeriose evaluiert werden.
Auch die Therapie der zentralnervösen Form der Listeriose bei kleinen Wiederkäuern gestaltet sich schwierig, da Schafe und Ziegen, im Vergleich zu Rindern, deutlich schlechter auf eine antibiotische Behandlung ansprechen (REBHUN und DELAHUNTA
1982; SCOTT 1993a).
Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich eine Listeriose-Therapiestudie durchgeführt, um neue Möglichkeiten hinsichtlich einer effektiven Therapie dieser Erkrankung zu eruieren.
17
2 Literaturübersicht
2.1 Liquor cerebrospinalis
2.1.1 Liquorbildungsort, -räume, und –abfluss
Die Bildung von Liquor cerebrospinalis erfolgt durch aktive Sekretion des isoprismatischen Ependyms der Adergeflechte (Plexus choroidei) aller vier Hirnventrikel (innerer Liquorraum), sowie der Filtration von Plasma durch das Endothel der Plexuskapillaren (REIBER 2003). Von den Hirnventrikeln fließt er caudal über die Foraminae luschkae in das Cavum leptomenicum und in den Zentralkanal des Rückenmarks (NICKEL et al. 2004) und umspült somit das gesamte zentrale Nervensystem (äußerer Liquorraum).
Die Pulsation der Blutgefäße und die Bewegung der Cilien des Ependyms bringen den Liquor in Fluss (NICKEL et al. 2004).
Die Resorption der Hirnflüssigkeit aus dem Cavum leptomenicum erfolgt hauptsächlich über dünnwandige Venen in den Durasinus, zudem soll weiterer Abfluss über das perineurale Bindegewebe an Gehirn- und Rückenmarksnerven und den Granula meningica (Arachnoidalzotten) der Arachnoidea encephali erfolgen (VANDEVELDE und FANKHAUSER 1987; NICKEL et al. 2004).
Nach PAPPENHEIMER et al. (1962) beläuft sich das Gesamtvolumen von Liquor cerebrospinalis bei adulten Ziegen zwischen 20-25 mL, davon befinden sich 8-12 mL im inneren Liquorraum. ARTRU (1999) gibt für Ziegen eine Gesamtliquormenge von 25-30 mL und für das Schaf von 14-17 mL an, bei Liquorproduktionsraten von 164 µL/Minute (Ziege) und 118 µL/Minute (Schaf).
18
2.1.2 Funktion und Zusammensetzung
Durch die Füllung der Hirnbinnenräume und die Umspülung des zentralen Nervensystems mit Liquor cerebrospinalis von außen, sind Hirn und Rückenmark vor mechanischen Einflüssen wie Kompression oder Stoß geschützt (TIPOLD 2003, NICKEL et al. 2004, REIBER 2008, SCOTT 2010). Zudem ist der Liquor am hydrostatischen Druckausgleich des Herz-Kreislaufsystems beteiligt (NEU und HERMANN 1908) und somit auch an der Konstanthaltung des intrakraniellen Druckes (TIPOLD 2003).
Physiologischer Liquor ist eine farblose, klare und zellarme Flüssigkeit, mit einem niedrigen Proteingehalt (DI TERLIZZI und PLATT 2006).
2.2 Blut-Hirn-Schranke/Blut-Liquor-Schranke
Die Schrankensysteme des zentralen Nervensystems werden in eine Blut-Hirn- Schranke (BHS) und eine Blut-Liquor-Schranke (BLS) unterteilt.
Dabei trennt die BHS den Extrazellulärraum des Hirnparenchyms vom vaskulären System, die BLS den Liquorraum von Selbigem (TUMANI und BRETTSCHNEIDER 2005).
Die Blut-Hirn-Schranke, beziehungsweise Blut-Liquor-Schranke, wird durch die Endothelzellen der Kapillaren des ZNS, sowie Peri- und Astrozyten, die die Kapillaren umgeben, gebildet. Anders als in der BLS, sind die Endothelien der BHS nicht fenestriert („gap-junctions“), sondern durch „tight-junctions“ verbunden (GOLDSTEIN u. BETZ 1986). Beide Schrankensysteme dienen als Barrieren zum Schutz des zentralen Nervensystems vor dem Eindringen von Erregern und Toxinen.
19
Zudem sorgen sie für einen konstanten pH-Wert, sowie einen ausgeglichenen Elektrolythaushalt des ZNS (LOHMANN 2003).
Die BHS/BLS ist eine Lipoidmembran, durch die ungeladene, lipidlösliche Teilchen durch Diffusion hindurchgelangen können. Der Transport von Aminosäuren und Glucose, sowie körperfremden Substanzen erfolgt teils durch Diffusion, aber auch durch aktiven Transport. Im Falle von Störungen der BHS/BLS, z.B. durch massive Entzündungen in der entsprechenden Region, kommt es zu einem Übertritt von unerwünschten Stoffen und Molekülen in das ZNS. Zudem können Erreger leichter eindringen. Gleichzeitig erleichtert eine Störung der Barriere allerdings auch die Erreichbarkeit des ZNS mit pharmazeutisch wirksamen Substanzen (Löscher 2014).
2.3 Untersuchung von Liquor bei kleinen Wiederkäuern
Die Untersuchung von Liquor cerebrospinalis ist ein bewährtes Mittel in der Diagnostik von zentralnervösen Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern und auch unter praktischen Bedingungen schnell und einfach durchführbar. Schon die makroskopische Untersuchung auf Farbe und Transparenz gibt erste Hinweise auf ein entzündliches Geschehen. Labordiagnostisch sind die Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl und das Differentialzellbild im Liquor, die Bestimmung des Proteingehaltes der Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF), sowie die Durchführung einer Proteinelektrophorese aus der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit von Bedeutung, um beim kleinen Wiederkäuer Erkrankungen mit zentralnervösen Störungen zu diagnostizieren und primär entzündliche von nicht entzündlichen Erkrankungen differenzieren zu können.
20
2.3.1 Gesamtleukozytenzahl und Differentialzellbild des Liquor cerebrospinalis
Liquor cerebrospinalis ist im physiologischen Zustand eine weitgehend zellarme Flüssigkeit und enthält hauptsächlich Lymphozyten und einen geringen Anteil an monozytären Zellen. Neutrophile Granulozyten finden sich nur vereinzelt (WELLES et al. 1992).
Bei gesunden Schafen und Ziegen wird ein Zellgehalt von < 10 M/L als physiologisch angesehen (SCOTT 2010). KÖNEKE (1988) konnte in ihrer Arbeit Gesamtzellzahlen zwischen 2,5-5,6 M/L bei gesunden Schafen ermitteln. Vergleichbare Ergebnisse stellte auch HIEPE (1958) mit 1,1-7,7 M/L Gesamtzellzahl fest.
Ein stark erhöhter Zellgehalt kann dabei schon zu einer makroskopisch sichtbaren Eintrübung des Liquors führen (SCOTT 2010, NAGY 2017).
Die Gesamtleukozytenzahl ist bei vielen infektionsbedingten Erkrankungen des Gehirns erhöht. Die Zelldifferenzierung gibt in diesem Fall Aufschluss über den vorherrschenden Zelltyp.
Metabolische/mangelbedingte ZNS-Erkrankungen wie Ketose/Trächtigkeitstoxikose, Urämie und hepatoenzephales Syndrom zeigen keine pathologischen Veränderungen hinsichtlich Gesamtzellzahl und vorherrschendem Zelltyp (HIEPE
1960, KÖNEKE 1988). Dies gilt nach Scott (1992) ebenso für Scrapie.
Für die, durch Vitamin B1-Mangel verursachte, Cerebrocorticalnekrose (CCN) wird von SCOTT (1992) eine leichte, mononukleär beherrschte Pleozytose beschrieben.
KÖNEKE (1988) konnte für CCN, sowie auch für Tetanus, dahingehend keine abweichenden Liquorbefunde ermitteln.
21
Eine Reihe von Autoren hat den Gesamtzellgehalt und die zytologische Zusammensetzung der Liquores von Schafen mit Listerienenzephalitis untersucht.
GRØNSTØl (1981) stellte dabei im Mittel einen Gesamtzellgehalt von 750 M/L fest, auch LIPPMANN (1969) konnte mit 955(±448) M/L ähnliche Werte ermitteln. In den Arbeiten von HIEPE (1960) und SCOTT (1993a) finden sich Gesamtzellzahlen zwischen 234 - 4000 M/L und 12 M/L – 2500 M/L bei Tieren mit zentralnervöser Listeriose.
KÖNEKE (1988) beschreibt bei Schafen mit listerienbedingter Meningoenzephalitis eine starke Pleozytose mit der Beteiligung von neutrophilen Granulozyten. Jedoch betont sie, dass die neutrophilen Granulozyten zwar anteilig erhöht seien, aber nicht den überwiegenden Anteil der Pleozytose darstellen. In den Untersuchungen von BRAUN et al. (2002) dominierte ebenfalls ein mononukleäres Zellbild.
HIEPE (1960) und LIPPMANN (1969) dagegen, konnten eine von neutrophilen Granulozyten dominierte Liquorzytologie feststellen. Dies deckt sich mit den von SCOTT (1992) durchgeführten Untersuchungen an Schafen (n=10) mit 44-48%
neutrophilen Granulozyten und nicht mehr als 20 % Lymphozyten in der Liquorzytologie bei Listerienenzephalitis.
Im Falle einer viral bedingten Enzephalitis, wie z.B. der Bornaschen Krankheit oder Visna finden sich meist moderate Pleozytosen mit einer eher mononukleär geprägten Zellantwort (HIEPE 1960, TVEDTEN 1987, CONSTABLE et al. 1996), insbesondere von Makrophagen (GANTER et al. 2007, NAGY 2017).
Beimengungen von Erythrozyten sind in der Regel punktionsbedingt, oder verursacht durch pathologische Blutungen in den Subarachnoidalraum (SCOTT 2004).
22
2.3.2 Eiweißgehalt von Liquor cerebrospinalis
Die in der Zerebrospinalflüssigkeit vorkommenden Proteine stammen zu 80% aus dem Blut, die restlichen 20% haben ihren Ursprung im Hirn, sind aber nicht unbedingt hirnspezifisch (REIBER 2008). Dabei bildet Albumin den größten Anteil der Liquorproteine (TIPOLD 2003).
Bereits durch die makroskopische Untersuchung kann der Totalproteingehalt der Hirnflüssigkeit geschätzt werden. Eine Trübung lässt dabei auf einen erhöhten Eiweißgehalt schließen (SCOTT 2010).
Im Liquor gesunder Schafe liegt der Gesamtproteingehalt unter 0,4 g/L (SCOTT
1993a, KUMAR et al. 2007). Dies deckt sich mit den Ergebnissen von HIEPE (1960) mit 0,16-0,36 g/L Gesamtprotein in der Zerebrospinalflüssigkeit.
GROTTKER et al. (1982), sowie BAILEY und HIGGINS (1985) beschreiben für Rind und Hund eine Zunahme des Eiweißgehaltes in physiologischem Liquor von cranial (CSF cisternal entnommen) nach caudal (CSF lumbal entnommen), je nach Lokalisation der Punktionsstelle.
Dies konnte von SCOTT und WILL (1991) bei Schafen bestätigt werden.
Auch das Alter eines Tieres beeinflusst die Eiweißmenge der Zerebrospinalflüssigkeit. So konnten EL AMROUSI et al. (1966) bei Lämmern höhere Eiweißkonzentrationen im Liquor feststellen, als bei adulten Tieren.
Liegt eine Entzündung im Hirnbereich vor, ist der Eiweißgehalt in der Zerebrospinalflüssigkeit erhöht. Ursachen für diese Erhöhung können eine gestörte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (SORJONEN 1987), ein abnehmender Liquorfluss (REIBER 1986) und/oder eine lokale, intrathekale Proteinsynthese (Sorjonen 1987) sein.
23
Wurden für das Rind im Median 0,8 g Protein / L Liquor bei listerienbedingten Meningoencephalitiden ermittelt (REBHUN und DELAHUNTA 1982), konnte SCOTT
(1993a) bei Schafen mit zentralnervöser Listeriose mit 1 g Protein / L Liquor (x~) geringfügig höhere Konzentrationen feststellen. Bei den Untersuchungen von KUMAR
et al. (2007) wurden bei Schafen mit Listerienenzephalitis Proteinkonzentrationen von 3,5 - 11 g / L Liquor gemessen, die sich signifikant von denen gesunder Schafen mit 0,45 g / L (x) unterschieden.
Jedoch besteht nach SCOTT (1993a) kein Zusammenhang zwischen der Schwere der neuronalen Dysfunktion und dem Gesamtproteingehalt im Liquor.
Liquores cerebrospinalis von leberkranken und ketotischen Tieren, sowie die Hirn- Rückenmarksflüssigkeit von kleinen Wiederkäuern mit CCN weisen keinen Anstieg des Proteingehaltes auf (HIEPE 1960, KÖNEKE 1988, SCOTT 1992). In Liquor von an Borna-erkrankten Schafen ist eine geringgradige Erhöhung des Eiweißgehaltes feststellbar (HIEPE 1960).
2.3.3 Proteinelektrophorese von Liquor cerebrospinalis
Die Durchführung einer Eiweißelektrophorese des Liquor cerebrospinalis gibt Aufschluss über die Intaktheit der Blut-Hirn-Schranke/Blut-Liquor-Schranke. Dabei kann Albumin eine Sentinel-Funktion zugeschrieben werden, da es ausschließlich in der Leber produziert wird (TOURTELOTTE 1970, CSERR 1971, SORJONEN 1987, SCOTT 2004, TUMANI und BRETTSCHNEIDER 2005).
24
Eine Erhöhung von Albumin im Liquor ist demnach auf eine Störung der BHS/BLS zurückzuführen, bei der es zur Transsudation von Serum-Protein in den Liquor kommt.
Des Weiteren können Veränderungen in der Proteinzusammensetzung im Liquor hinsichtlich ihrer Ursache in 3 Kategorien eingeteilt werden (SORJONEN 1987):
1. Störungen der Blut-Hirn-Schranke 2. Intrathekale Immunglobulin-Produktion
3. Störungen der Blut-Hirn-Schranke bei gleichzeitiger intrathekaler Immunglobulin-Produktion
Mittels Proteinelektrophorese können verschiedene Eiweißfraktionen im Liquor dargestellt werden. Dazu gehören Albumin, α1- und α2- Globuline, ß- und γ- Globuline.
Nach SCOTT (1993b) zeigen Schafe mit Meningoenzephalitiden/Enzephalopathien im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren allerdings keine signifikanten Veränderungen in der Zusammensetzung der einzelnen Proteinfraktionen.
In Tabelle 1 sind im Folgenden Referenzwerte von gesunden Tieren für die Spezies Hund (SORJONEN 1987), Rind (WELLES et al. 1992) und Schaf (SCOTT 1993b) prozentual aufgeführt. Dabei wird klar, dass die Werte von Tierart zu Tierart deutlich variieren.
25
Tabelle 1: Referenzwerte für die Liquorelektrophorese gesunder Tiere (Angabe der Eiweißfraktionen in Prozent (%), Angabe der Mittelwerte (x̅) inklusive Standardabweichung von Gesamteiweiß (GE) in g / L
Tierart Autor GE (g/L) Albumin (%) α (%) β (%) γ (%) Hund
(n=10) SORJONEN (1987) 0,27
(± 0,042) 37,0 28,0 25,0 7,75 Rind
(n=16) WELLES et al. (1992) 0,39
(± 0,034) 40,0 38,0 10,0 12,0 Schaf
(n=22) SCOTT (1993b) 0,26 48,6 24,4 13,0 13,9
Für die elektrophoretische Untersuchung von Liquor cerebrospinalis beim kleinen Wiederkäuer ist bisher nur wenig dokumentiert. SCOTT (1993b) ermittelte für verschiedene ovine ZNS-Erkrankungen, die in Tabelle 2 und Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse. Über die Eiweißfraktionen im Liquor von Ziegen, konnten bisher keine publizierten Daten ausfindig gemacht werden.
Tabelle 2: Prozentuale Anteile der Proteinfraktionen (MW±SD), sowie der Gesamteiweißgehalt (GE) im Liquor von Schafen mit ZNS-Störungen, nach SCOTT (1993b):
Erkrankung GE (g/L) Albumin (%) α 1 (%) α 2 (%) β (%) γ (%) Listerienenzephalitis
(n=4) 1,23 51,6
(± 9,80)
10,2 (± 4,80)
16,1 (± 5,70)
9,10 (± 0,60)
13,1 (± 7,60) Neonatale
Meningoenzephalitis (n=8)
2,36 58,0
(± 5,00)
7,20 (± 2,70)
15,2 (± 2,60)
8,9 (± 5,90)
10,6 (± 3,90)
CCN (n=4) 0,27 55,6
(± 6,20)
6,00 (± 4,40)
11,8 (± 6,70)
13,5 (± 8,60)
13,1 (± 6,40)
Scrapie (n=13) 0,54 45,4
(± 8,40)
7,20 (± 2,50)
18,0 (± 8,40)
18,5 (± 8,40)
9,2 (± 7,30)
26
Tabelle 3: Absolute Konzentrationen der Gesamteiweißgehalte (GE), sowie der
Proteinfraktionen (in g/L) im Liquor von Schafen mit ZNS-Störungen, nach SCOTT (1993b):
Erkrankung GE (g/L) Alb (g/L) α1 (g/L) α2 (g/L) β (g/L) γ (g/L) Listerienenzephalitis
(n=4) 1,23 0,58
(± 0,29)
0,15 (± 0,16)
0,23 (± 0,21)
0,12 (± 0,08)
0,15 (± 0,11) Neonatale
Meningoenzephalitis (n=8)
2,36 1,37 (± 0,42)
0,17 (± 0,08)
0,35 (± 0,07)
0,21 (± 0,14)
0,26 (± 0,14)
CCN (n=4) 0,27 0,14
(± 0,12)
0,01 (± 0,001)
0,022 (± 0,01)
0,042 (± 0,045)
0,032 (± 0,02) Scrapie (n=13) 0,54 0,24
(± 0,15)
0,038 (± 0,02)
0,10 (± 0,07)
0,10 (± 0,06)
0,06 (± 0,07)
2.3.4 Albuminquotient
Liegt zusätzlich zu einer Liquorprobe auch eine korrespondierende Serumprobe vor, kann eine Serumelektrophorese durchgeführt werden, um den Albuminquotienten (AQ) zu ermitteln (Formel in Kapitel 4.1). Dieser Quotient gibt weiteren Aufschluss, über eine intakte Funktion der BHS/BLS (SORJONEN 1987, BEHR et al. 2006, REIBER 2008). Jedoch liegen auch hier bisher keine Daten für Wiederkäuer vor.
SORJONEN (1987) beschreibt einen Referenz-AQ für gesunde Hunde von <0,3.
BEHR und Kollegen (2006) stellten ebenfalls signifikante Unterschiede im Albuminquotienten zwischen gesunden (AQ < 0,3) und neurologisch kranken Hunden (Neoplasien, infektiöse ZNS-Erkrankungen, nicht infektiöse Hirnentzündungen) mit einem AQ > 0,3 fest.
27
2.4 Listeriose
2.4.1 Ätiologie, Epidemiologie und Pathogenese
Die Listeriose ist eine weltweit verbreitete Erkrankung und eine in der Bundesrepublik Deutschland meldepflichtige Tierseuche (ANONYM 2011). Neben zahlreichen Säugetieren und Vögeln, kann auch der Mensch an Listeriose erkranken (BRUGÈRE-PICOUX 2008). Die erste Listerienenzephalitis bei einem Schaf aus Neuseeland wurde 1931 durch GILL beschrieben, der aufgrund der klinischen Symptomatik der Erkrankung den Begriff „circling disease“ prägte.
Listeriose wird durch Bakterien der Gattung Listeria ausgelöst. Bei diesen Erregern handelt es sich um ubiquitär vorkommende, regelmäßige, sporenlose, bewegliche, grampositive Stäbchen, die fakultative Anaerobier sind. Sie besitzen eine hohe Toleranz gegenüber Kälte, so dass eine Anzucht des Erregers auch bei Kälteanreicherung (4° Celcius) möglich ist (SELBITZ 2010).
Im Genus Listeria (L.) existieren derzeit zehn Spezies (MCLAUCHLIN et al. 2014).
Davon sind L. monocytogenes, insbesondere die Serotypen 2a und 4a, und L. ivanovii als pathogen einzustufen.
L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. marthii, L. rocourtiae, L. seeligeri L. weihenstephanensis und L. welshimeri gelten als apathogen.
Jedoch beschreiben GAYER (1988) und WALKER et al. (1994) den Nachweis von L. innocua aus Hirnstammgewebe bei spontan aufgetretenen ovinen Listerienenzephalitiden und auch ROCHA und Kollegen (2013) konnten Listeria innocua bei einem Bullen mit zerebraler Listeriose nachweisen.
28
Da es sich bei Listerien um ubiquitär vorkommende Saprophyten handelt, gibt es zahlreiche Infektionsmöglichkeiten. Eine besondere Bedeutung wird vor allem der Fütterung von mangelhaft durchsäuerter Silage (pH>5) beigemessen (GRAY 1960, LIPPMANN 1969, VAZQUEZ-BOLAND et al. 1992). Eine ungenügende Durchsäuerung der Silage, und ein damit verbundenes erhöhtes Kontaminationsrisiko des Futters mit Listerien, ist bei Aschegehalten ab 70 mg / kg Trockensubstanz (TS) aufwärts zu erwarten.
Aber auch ohne Silagefütterung kann eine infektiöse Listeriendosis auf schlechten Weideflächen oder mit verrottetem Pflanzenmaterial aufgenommen werden (KUMAR
et al. 2007). MOHAMMED et al. (2009) konnten zudem hohe Besiedlungsraten von Futter- und Wassertrögen mit Listeria monocytogenes nachweisen. Auch DREYER et al. (2015) bestätigten die hohe Erregerverbreitung im Erdreich und an den Wänden von Wassertanks.
Die Art der Infektion mit Listerien und die Ausbreitung im zentralen Nervensystem wurden in den vergangenen Jahrzehnten sehr kontrovers diskutiert.
ASAHI et al. vermuteten bereits 1957 eine Aufnahme von Listerien über die nasalen, oralen und konjunktivalen Schleimhäute und eine folgende neurogene bzw.
neurolymphogene Ausbreitung. Dabei kommt es bevorzugt zum Aufstieg des Erregers über Äste des N. trigeminus. Vor allem kleine Läsionen im Bereich der Maulhöhle, z.B. während des Zahnwechsels, spielen dabei eine Rolle (BARLOW und MCGORUM 1985). Diese These konnte durch die Arbeiten von BORMANN (1960), SCHLEICHER und URBANECK (1966), SCHLEICHER et al. (1968), KLAUS (1971), sowie PETERS und TRAUTWEIN (1996) gestützt werden. Auch eine Infektion über die Darmschleimhaut wurde als Möglichkeit diskutiert (LEHNERT 1963).
29
Die Arbeiten von OEVERMANN et al. (2010a) und HENKE et al. (2015) vertreten ebenfalls die Ansicht einer neurogenen/neurolymphogenen Erregerausbreitung über axonale Migration in das ZNS aufgrund von immunhistologischen Untersuchungen, sowie dem histopathologischen Verteilungsmuster der Hirnläsionen.
PRATS et al. (1992) dagegen postulierten eine hämatogene Verbreitung des Erregers.
Grundvoraussetzung für die ungehinderte Ausbreitung des Erregers ist eine Immunsuppression bedingt durch Trächtigkeit, Stress oder Sekundärerkrankungen (VANDEGRAAFF et al. 1981, BRUGÈRE-PICOUX 2008).
Je nach vorliegender Krankheitsform scheiden infizierte Tiere den Erreger vor allem über Milch und Kot (MIETTINEN et al. 1990), aber auch über Urin, Abortmaterial und Nachgeburtsbestandteile aus (BRUGÈRE-PICOUX 2008). Besondere Bedeutung hat dabei die Ausscheidung von Listeria monocytogenes über die Milch aufgrund des zoonotischen Potenzials. Denn durch den Verzehr von mit Listerien kontaminierter Rohmilch und Rohmilchprodukte durch nicht immunkompetente Personen (Säuglinge, Senioren, Schwangere und Immundefiziente) ist eine Übertragung des Erregers auf den Menschen möglich.
Die Ausscheidung von Listerien über die Faeces ist nach Untersuchungen von DREYER et al. (2015) hinsichtlich der Erregerverbreitung in der Umwelt zu vernachlässigen.
30
2.4.2 Klinik
Bei der Listeriose werden nach SELBITZ (2005) 5 Verlaufsformen unterschieden:
- latente Darmbesiedlung mit fäkaler Ausscheidung;
- cerebrale/zentralnervöse Form (Gehirnlisteriose) - septikämische Listeriose der Lämmer
- metrogene Form (Listerienabort, Metritis)
- Manifestation am Auge (Keratokonjunktivitis, Iritis, Uveitis)
FTHENAKIS et al. (1998), FINLEY und DENNIS (1999), MORIN (2004) und BRUGÈRE- PICOUX (2008) beschreiben zudem auch durch Listeria monocytogenes verursachte Mastitiden. Im Folgenden wird vor allem auf die zentralnervöse Form der Listeriose eingegangen.
Die Gehirnlisteriose ist die am häufigsten vorkommende Form der Listeriose beim Wiederkäuer (BRUGÉRE-PICOUX 2008, BOILEAU und Gilliam 2017). Eine hohe Empfänglichkeit weisen vor allem kleine Wiederkäuer auf (WAGNER et al. 2005).
Schafe und Ziegen zeigen dabei eher einen akuten, Rinder einen subakuten bis chronischen Krankheitsverlauf, bei einer Inkubationszeit von 2 bis 6 Wochen (LOW
und DONACHIE 1997).
Krankheitsfälle der neurogenen Form treten vor allem im Winter und Frühjahr auf, vermutlich bedingt durch Silagefütterung während der Stallhaltungsperiode und tiefen Außentemperaturen, die das Erregerwachstum begünstigen (BRUGÈRE-PICOUX 2008).
Die zerebrale Listeriose ist gekennzeichnet durch unilaterale Ausfallerscheinungen im Bereich des Kopfes (hängendes Ohr, Kopfschiefhaltung, Ptosis, hängende
31
Oberlippe) aufgrund des Befalls der Kopfnerven, insbesondere des Nervus facialis, starkes Speicheln und Wickelkauen, sowie dem Ausführen von Manegebewegungen.
Die Symptomatik wird durch die Lokalisation der Läsionen im ZNS bestimmt (REBHUN
und DELAHUNTA 1982). Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zum Festliegen der Tiere. Aufgrund der hohen Bicarbonatverluste durch das Speicheln entwickelt sich häufig eine sekundäre Azidose (BOILEAU und GILLIAM 2017). Zudem dehydrieren die Tiere, da mit der Lähmung der Angesichtmuskulatur, besonders der Lippenmuskulatur, nur noch ungenügend Wasser aufgenommen werden kann.
Unbehandelt führt diese Form der Listeriose fast immer zum Tod des Tieres.
2.4.3 Diagnostik
Eine Verdachtsdiagnose wird anhand der klinischen Symptomatik, häufig auch in Zusammenhang mit einer entsprechenden Fütterungsanamnese (Silagefütterung), gestellt und kann durch eine zytologische Untersuchung des Liquors gestützt werden. Die typischen Veränderungen der Neurolisteriose, wie das Vorliegen einer Pleozytose und einem häufig granulozytär dominierten Zellbild wurden bereits im Kapitel 2.3.1 erläutert. Wie im Kapitel 2.3.2 beschrieben, kann eine erhöhte Gesamtproteinmenge im Liquor den Verdacht der Listeriose stützen.
Die Bestätigung der Verdachtsdiagnose Listeriose erfolgt postmortal über eine pathohistologische Untersuchung des Hirnstammes. Die Gehirnlisteriose ist durch eine eitrig- bis nekrotisierende Entzündung des Hirnstammes mit lympho- histiozytärer Meningitis, sowie der Bildung von Mikroabszessen im Hirnstamm charakterisiert. Zudem finden sich lympho-histiozytäre Zellakkumulationen um die
32
Blutgefäße des Stammhirns, sogenannte „perivascular cuffs“ (VANDEGRAAFF et al.
1981, CAMPERO et al. 2002; LIGIOS et al. 2004).
Eine kulturelle Anzucht der Listerien aus Hirnstammgewebe mittels Kälteanreicherung, sowie ein immunhistologischer Nachweis des Erregers gelingen häufig (PETERS 1991). Eine kulturelle Anzucht, sowie der Nachweis von Listeria monocytogenes aus Liquor per PCR hingegen seltener (PETERS et al. 1995).
Eine weitere Option in der Listeriosediagnostik bietet der Nachweis von Antikörpern gegen das Listerienantigen Listeriolysin O (LLO) mittels Immunoblot im Serum kleiner Wiederkäuer (LOW et al. 1992). Dieser eignet sich zuverlässig zum Nachweis einer Serokonversion bei abortiven und septikämischen Formen der Listeriose. Bei Listerienenzephalitis dagegen können Antikörper gegen LLO nicht immer detektiert werden (LOW und DONACHIE 1997).
Auch ein Nachweis von Antikörpern gegen Listeriolysin O im Liquor cerebrospinalis von Schafen und Ziegen ist möglich. Erste Untersuchungen dahingehend wurden bereits von SCHENK (2005) an 37 Liquorproben von kleinen Wiederkäuern publiziert.
Die Anzahl der untersuchten Proben blieb allerdings zu gering, um diesen Test ausreichend zu evaluieren.
2.4.4 Differentialdiagnosen
Hinsichtlich der zentralnervösen Form der Listeriose sind eine Reihe von möglichen Differentialdiagnosen zu berücksichtigen. Dazu zählen zunächst die metabolisch degenerativen Erkrankungen des ZNS, wie die Cerebrocortikalnekrose (CCN) und die nervöse Ketose, BOSTEDT und DEDIÉ (1996) benennen als weitere
33
Differentialdiagnose auch die Pansenacidose. Unter den primär entzündlichen Erkrankungen ist die Bornasche Krankheit (BK), die Aujeszky’sche Krankheit, sowie die Coenurose (MORIN 2004, SELBITZ 2005) klinisch, insbesondere im Anfangsstadium nicht leicht abzugrenzen. Ebenso müssen auch Visna/Caprine Arthritis Enzephalitis (CAE) oder das Vorliegen einer Tollwuterkrankung differentialdiagnostisch in Betracht gezogen werden (SELBITZ 2005). Seltener wird ein Erkrankungsbild ähnlich der Gehirnlisteriose durch Hirnstammabszesse oder Neoplasien verursacht (MORIN 2004).
Bei ausgeprägter Kopfschiefhaltung muss auch eine Otitis media/interna als Differentialdiagnose berücksichtigt werden (REBHUN et al. 1982, MORIN 2004). Bei dieser Erkrankung weisen die betroffenen Tiere in der Regel neben der Kopfschiefhaltung allerdings kein gestörtes Sensorium auf (BOILEAU und GILLIAM
2017).
Besonders in den Anfangsstadien der verschiedenen Erkrankungen, in denen es zu unspezifischen neurologischen Ausfallserscheinungen, sowie Apathie und Bewegungsstörungen kommen kann, ist eine eindeutige Diagnose allein durch die klinische Untersuchung nicht immer einfach zu stellen.
Die nicht infektiöse, thiaminmangelbedingte CCN lässt sich bei auftretender Blindheit mit erhaltenem direktem Pupillarreflex beidseits und abwesenden indirekten Pupillarreflexen und dem Auftreten eines Opisthotonus in der Regel gut diagnostizieren. Diagnosestützend kann eine Thiaminbestimmung aus dem Blut erfolgen. Hinweisend ist auch eine konzentratreiche Fütterung, wie z.B. bei Mastlämmern und die damit im Pansen vorherrschenden acidotischen Verhältnisse,
34
die die Thiaminproduktion der Pansenbakterien negativ beeinflussen (BICKHARDT 2004).
Die nervöse Ketose tritt bei Schafen als Gestationsketose auf. Besonders betroffen sind dabei mehrlingsgravide Mutterschafe. Die Symptome variieren dabei von Bewegungsschwäche bis hin zu ZNS-Erscheinungen wie Hypersalivation, Krämpfen und verminderter Reflexantwort (BICKHARDT et al. 1998, HENZE et al. 1998).
Die Diagnose erfolgt über den Nachweis erhöhter β-Hydroxybutyrat-Gehalte im Blut.
Die Coenurose ist eine, durch die im Zentralnervensystem des Schafes parasitierende Larve, Coenurus cerebralis, des Hundebandwurmes Taenia multiceps (Multiceps multiceps), hervorgerufene Parasitose. Sie kommt in Deutschland sehr selten vor. Je nach Lokalisation der Finnen im Gehirn der Tiere, kommt es zu Bewegungsstörungen unterschiedlichen Ausmaßes, insbesondere zu Manegebewegungen, welche der Erkrankung auch den Namen „Drehkrankheit“
eingebracht haben. Die Diagnose erfolgt in der Regel postmortal (HIEPE 2004).
Die Bornasche Krankheit (BK) beim Schaf, hervorgerufen durch eine rhinogene Infektion mit dem Borna-Virus, ist charakterisiert durch eine Meningoenzephalitis nonpurulenta mit hoher Letalität. Die Tiere fallen durch unspezifische Symptome wie Apathie und Bewegungsstörungen auf (STAEHELI et al. 2000) und kommen mit Fortschreiten der Erkrankung zum Festliegen und verenden schließlich.
Daher ist intra vitam nur eine Verdachtsdiagnose möglich. Diese kann durch das Vorliegen einer mononukleären Pleozytose im Liquor cerebrospinalis (charakteristisch für virale Meningoenzephalitiden) gestützt werden (HIEPE 1958). Der Gesamteiweißgehalt des Liquors ist nur geringgradig erhöht (HIEPE 1960). Auch der Nachweis von Antikörpern gegen das Bornavirus ist sowohl im Liquor, als auch im
35
Serum möglich. Die Diagnose der Bornaschen Krankheit erfolgt heutzutage durch Nachweis von spezifischen Genomabschnitten des Bornavirus mittels PCR.
Der Verdacht auf das Vorliegen einer Visna-Erkrankung, als Folge einer Infektion mit dem Maedi/Visna-Virus (MVV), ist vor allem beim Auftreten von fortschreitenden Ataxien und Paresen in Zusammenhang mit starkem Gewichtsverlust gegeben und wurde bereits 1957 von SIGURDSSON et al. beschrieben. Der Erregerkontakt erfolgt bereits im Lämmeralter über die Aufnahme der Milch von infizierten Muttertieren. Im Liquor findet sich meist eine mononukleäre, von Makrophagen dominierte, Pleozytose (GANTER et al. 2007). Ein serologischer Nachweis entsprechender Virus- Antikörper aus dem Serum ist ebenfalls möglich.
2.4.5 Therapie
Die Grundlage der erfolgreichen Therapie der zentralnervösen Listeriose ist eine frühe Erkennung der erkrankten Tiere, sowie ein sofortiger Behandlungsbeginn (BRAUN et al. 2002). Erfolgt die Behandlung erst bei fortgeschrittener Krankheit mit bereits stark gestörtem Allgemeinbefinden, führt dies zu einer deutlichen Verschlechterung der Heilungschancen (KÜMPER 1991, BRAUN et al. 2002, BRUGÈRE- PICOUX 2008). Zudem ist eine Therapiedauer von mindestens 7 Tagen bis zu 2 Wochen anzustreben (REBHUHN u. DELAHUNTA 1982).
Im Gegensatz zu Rindern, zeigen kleine Wiederkäuer eine deutlich schlechtere Therapieansprache auf eine antibiotische Behandlung (REBHUN u. DELAHUNTA 1982, SCOTT 1993a).
36
Da es sich bei Listerien um fakultativ intrazelluläre Erreger handelt, ist bei der antibiotischen Therapie auf eine ausreichend hohe Dosierung zu achten, um einen zellpenetrierenden Wirkspiegel zu erreichen und auch die Blut-Hirn-Schranke/Blut- Liquor-Schranke zu durchdringen (REBHUN 1987; KÜMPER 1991).
Nach HOF (1991) erweisen sich in vitro alle gängigen Antibiotika, außer der Gruppe der Cephalosporine, als wirksam. Dieses Ergebnis lässt sich jedoch nicht auf die Wirksamkeit in vivo übertragen.
Zur Therapie der ovinen Listerienenzephalitis wird vor allem der Einsatz von Penicillin-G und Tetrazyklinen empfohlen. Behandlungshäufigkeit und Dosierung der Wirkstoffe variieren dabei von Autor zu Autor.
SCOTT (1993a) empfiehlt eine Behandlung mit Penicillin-G in einer Dosierung von 44.000 Internationalen Einheiten (I.E.) / kg Körpergewicht (KGW) zweimal täglich.
Dabei sollte die erste Applikation zur schnelleren Wirkstoffanflutung idealerweise intravenös erfolgen. Die weitere Behandlung soll intramuskulär fortgesetzt werden.
KÜMPER (1991) setzt ebenfalls Penicillin als Mittel der Wahl ein. Er bevorzugt die Verwendung von Procain-Penicillin in einer täglichen Dosis von 50.000 I.E. pro kg KGW, bei subkutaner Verabreichung.
FINLEY u. DENNIS (1999) befolgen ein ähnliches Schema. Der Behandlungsbeginn erfolgt mit 44.000 I.E. Penicillin-G / kg KGW intramuskulär über 7 Tage, danach erfolgt eine Fortsetzung der Behandlung mit 22.000 I.E. Penicillin-G über die folgenden Tage. Zudem bezeichnen sie den Einsatz von Penicillin in der Listeriosetherapie von Nutztieren als sehr ökonomisch und arm an Nebenwirkungen.
Für den Einsatz von Tetrazyklinen wird von FINLEY und DENNIS (1999) eine Dosierung von 10 mg Oxytetrazyklinhydrochlorid / kg KGW zweimal täglich
37
beschrieben, ebenso von MORIN (2004). Diese schlägt alternativ auch die Möglichkeit einer Gabe von 20 mg Oxytetrazyklin / kg KGW einmal täglich intravenös vor.
BRAUN et al. (2002) empfehlen eine Behandlung mittels der Kombination von Ampicillin und Gentamicin. Dies wird von MORIN (2004) aufgrund der schlechten zellpenetrierenden Eigenschaften von Aminoglykosiden abgelehnt. SMITH u.
SHERMAN (2009) kritisieren zudem lange Wartezeiten auf essbares Gewebe und Milch.
Auch in der Humanmedizin wird die Listerienencephalitis bevorzugt mit ß- Laktamantibiotika behandelt. Bei Patienten mit Unverträglichkeiten oder Allergien erfolgt die Behandlung mit Makroliden (HOF 1991). Diese Wirkstoffgruppe zeichnet sich durch eine gute intrazelluläre Anreicherung, besonders in Makrophagen, aus (BAUER et al. 1993) und ähnelt in ihrem Wirkungsspektrum den Tetrazyklinen.
Die zusätzliche Verabreichung von Glukokortikoiden in Kombination mit einer Antibiose wird in der Literatur kontrovers diskutiert. SMITH und SHERMAN (2009) empfehlen eine Behandlung mit Dexamethason in einer Dosierung von 0,1 mg/kg Körpergewicht intravenös täglich, um die Infiltration des Hirngewebes mit mononukleären Zellen zu verhindern und somit einer Bildung von Mikroabszessen vorzubeugen. SCOTT (1993a) bevorzugt eine einmalige Gabe von 1,1 mg Dexamethason/kg Körpergewicht intravenös zu Beginn der Behandlung.
DENNIS (1993) dagegen rät von einer Dexamethasongabe ab. Auch BRAUN und Kollegen (2002) verzichten auf den Einsatz von Glukokortikoiden in der Listeriosetherapie.
38
Unterstützend kann die Gabe von Vitamin B1 erfolgen, um einem Mangel desselben, verursacht durch die brachliegende Pansenaktivität, vorzubeugen (KÜMPER 1991, BRAUN et al. 2002, MORIN 2004).
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die intensive Pflege festliegender Patienten, insbesondere hinsichtlich der Wasserversorgung per Drench oder bei Verlust des Schluckreflexes über eine Nasenschlundsonde oder per infusionem, um eine Dehydratation und Übersäuerung durch den starken Speichelverlust zu vermeiden (REBHUN 1987, KÜMPER 1991, BRAUN 2002).
39
3 Material und Methoden
3.1 Probenmaterial
In der vorliegenden Arbeit wurde Liquor cerebrospinalis von kleinen Wiederkäuern (Schafen und Ziegen) untersucht. Falls vorhanden, wurden auch die korrespondierenden Serumproben zur Untersuchung herangezogen.
Dafür wurden zum einen Liquor- und Serumproben von Schaf-und Ziegenpatienten aus der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover verwendet, die im Rahmen der klinischen Diagnostik entnommen und bei -20° C asserviert wurden. Miteinbezogen wurden Proben aus den Jahren 1999 bis 2013 von 152 kleinen Wiederkäuern (112 Schafen, 40 Ziegen). Das Probenmaterial stammte hauptsächlich von Tieren mit zentralnervösen Erkrankungen, aber auch von Tieren mit Stoffwechselstörungen bei denen eine solche Erkrankung durch weiterführende Untersuchungen ausgeschlossen werden konnte. Vor der Liquorentnahme wurden die Tiere dazu einer klinischen Allgemeinuntersuchung, sowie einer neurologischen Untersuchung unterzogen.
Die Liquorproben der gesunden Kontrollgruppe (n=21) wurden von klinisch unauffälligen, männlichen Schwarzköpfigen Fleischschafen aus der Herde des Friedrich-Löffler-Instituts, Institut für Nutztiergenetik, Mariensee–Mecklenhorst gewonnen. Die Haltung dieser Tiere erfolgte sowohl im Stall (Silagefütterung), als auch auf der Weide (Aufwuchs).
Zusätzlich wurde im Zeitraum Februar bis März 2013 eine Listeriose-Therapiestudie in einer Hüteschäferei im niedersächsischen Landkreis Diepholz durchgeführt. In
40
diesem Betrieb treten seit mehreren Jahren während der Stallhaltungsperiode vermehrt zentralnervöse Listeriosen auf.
Die Fütterung erfolgte in diesem Zeitraum mittels Grassilage (Ballen) ad libitum und der Gabe einer täglichen Kraftfutterration mit beigemengtem Mineralfutter. Frisches Wasser stand ebenfalls ständig zur Verfügung.
In die Therapiestudie wurden 24 weibliche Moorschnucken aufgenommen, die alle klinisch an der zentralnervösen Form der Listeriose erkrankt waren.
3.2 Probenentnahme
Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis der Schaf- und Ziegenpatienten wurde nach einer klinischen Allgemeinuntersuchung, einschließlich neurologischen Untersuchungsgangs, im Rahmen weiterführender diagnostischer Maßnahmen nach ihrer Einlieferung in die Klinik für kleine Klauentiere vorgenommen. Die Punktion erfolgte lumbosakral zwischen dem Dornfortsatz des letzten Lendenwirbels und dem Dornfortsatz des ersten Kreuzwirbels unter Ketamin-Hydrochlorid-Anästhesie (Ketamin-HCl) (10 mg/kg KGW, i.v., Ursotamin 100 mg/mL, Serumwerk Bernburg- AG, Bernburg). Bei den Tieren der Therapiestudie und der Kontrollgruppe wurde das Ketamin-HCl aus Praktikabilitätsgründen intramuskulär verabreicht (15 mg Ketamin- HCl/kg KGW, Ursotamin 100 mg/mL, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg).
Die Liquorentnahme bei der gesunden Kontrollgruppe erfolgte im Rahmen einer Epiduralanästhesie, die für die Durchführung einer blutigen Kastration gesetzt wurde.
Die Probanden der Therapiestudie wurden jeweils am ersten Behandlungstag, unmittelbar vor Therapiebeginn und am siebten Behandlungstag beprobt. Bei Tieren die aufgrund starker Verschlechterung des Allgemeinbefindens und infauster
41
Prognose euthanasiert wurden, erfolgte die Liquorentnahme unter Allgemeinanästhesie im Verlauf der Euthanasie, d.h. vor der Applikation von T61 (T61 Injektionslösung, Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim). Bei verendeten Tieren wurde Liquor postmortal entnommen, soweit dies möglich war.
Im Bereich der Punktionsstelle wurde vorab mit einer Schermaschine das Vlies entfernt und die Haut mit 70%igem Alkohol entfettet. Danach wurde eine sterile Kanüle (BD Microlance 3, 1,1mm x 50mm, BD Medical Systems, Heidelberg) im 45°
Winkel zur Haut in den Epiduralraum vorgeschoben und der Liquor in einem EDTA- beschichteten Röhrchen (Monovette 9ml K3E, Sarstedt, Nümbrecht) aufgefangen bzw. aspiriert.
Nach Beendigung der Entnahme der Liquorprobe und Entfernung der Kanüle wurde die Punktionsstelle mit Jod desinfiziert.
Von den Therapiestudientieren wurde unmittelbar nach jeder Liquorentnahme zudem auch eine Serumprobe gewonnen.
Die Entnahme dieser Blutproben erfolgte in eine Serummonovette (Monovette 9ml Z, Sarstedt, Nümbrecht) mit aufgesetzter Kanüle (NEOJECT Einmal-Kanülen, 1,2mm x 40mm, Dispomed Witt oHG, Gelnhausen) im cranialen Halsdrittel aus der Vena jugularis ohne weitere Vorbereitungen des Punktionsfeldes.
Bei der Kontrollgruppe wurden keine Blutproben entnommen. Zu den Liquorproben aus dem Patientengut der Klinik waren vereinzelt korrespondierende Serumproben vorhanden.
42
3.3 Probenbearbeitung
3.3.1 Liquor cerebrospinalis
Die Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Liquor cerebrospinalis erfolgte unmittelbar im Anschluss an die Probenentnahme. Nach der Leukozytenzählung wurden Zytospots hergestellt und getrocknet. Die restliche Probenmenge wurde bis zur Vorbereitung für die Elektrophorese bei -20 °C aufbewahrt.
3.3.2 Serumproben
Nach Entnahme der Blutprobe und vollständiger Gerinnung im Probenröhrchen, erfolgte eine Zentrifugation über 15 Minuten bei 2000 x g. Das gewonnene Serum wurde abpippetiert und, sofern die Eiweißbestimmung nicht unmittelbar an die Zentrifugation erfolgte, ebenfalls bei -20° C bis zur weiteren Bearbeitung eingefroren.
3.4 Neurologische Untersuchung
Die neurologische Untersuchung der kleinen Wiederkäuer wurde anhand des Untersuchungsganges für kleine Wiederkäuer nach SCHENK (2005) vorgenommen.
3.5 Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Liquor
Die Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im CSF erfolgte unmittelbar nach der Probengewinnung mit Hilfe einer Neubauer Superior Zählkammer (Paul Marienfeld GmbH und Co. KG, Lauda Königshofen). Dazu wurde die Zählkammer mit
43
ausreichend Liquor befüllt. Anschließend erfolgte eine fünfminütige Zellsedimentation in einer feuchten Kammer und die lichtmikroskopische Auszählung (Axiostar plus, Carl Zeiss GmbH, Jena) mittels eines 40er-Objektivs. Es wurden jeweils 2 x 8 Großquadrate mit Hilfe eines elektronischen Zählgerätes (Counter AC-15, Karl-Hecht GmbH und Co. KG, Sondheim) ausgezählt.
Die gezählten Leukozyten und Erythrozyten werden in Mega Zellen je Liter Liquor (M/L) angegeben.
Im Falle einer entnahmebedingten Blutkontamination der Probe, wurde die Gesamtleukozytenzahl über folgende Formel korrigiert (nach KÖNEKE 1988):
Lkorr [M/L] = LLiq
ELiq [M/L] x LBl [G/L]
EBl [ T L ⁄ ] x 1.000
Lkorr: korrigierte Erythrozytenzahl inLiquorprobe LLiq: Leukozytenanzahl in Liquorprobe gezählt ELiq: Erythrozytenanzahl in Liquorprobe, gezählt LBl: Leuzkozytenzahl im Blut
EBl: Erythrozytenzahl im Blut
Sofern die Werte in der Routine nicht bestimmt wurden, wurden für LBl und EBl die Blutreferenzwerte für kleine Wiederkäuer nach BICKHARDT UND KÖNIG (1999) verwendet. Folglich wurden für LBl 8,5 G/L und für EBl 11,5 T/L angenommen.
44
3.6 Differenzierung der Zellen im Liquor
Zur Herstellung der Zytospots aus Liquor der Therapiestudientiere wurde das Hettich Zyto-System für die verwendete Rotafix A32-Zentrifuge (beides Andreas Hettich GmbH und Co. KG, Tuttlingen) nach Anleitung des Herstellers genutzt. Für die Anfertigung der Zytospots der Klinikpatienten wurde das Zentrifugensystem Multifuge 4KR (Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) eingesetzt. Es erfolgte jeweils eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 200 x g. In beiden Fällen wurden Superfrost Objektträger (Superfrost WEISS, geschnitten, Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe) verwendet. Die Trocknung der Objektträger erfolgte mittels eines Ventilators.
Zur Differenzierung der Zellen im Zytospot wurde eine Färbung nach Pappenheim vorgenommen. Dazu wurden die angefertigten Zytospots in Glasküvetten 5 Minuten in May-Grünwald-Lösung (May-Grünwalds-Eosin-Methylenblaulösung modifiziert für die Mikroskopie, Merck, Darmstadt) gefärbt, danach erfolgte ein Spülgang mit gepuffertem Aqua dest. (pH-Wert = 7,2). Es folgte eine weitere Färbung in den Glasküvetten mit verdünnter Giemsa-Lösung über 20 Minuten. Die verdünnte Giemsa-Lösung wurde aus 6 ml Giemsa-Lösung (Giemsa-Azur-Eosin- Methylenblaulösung für die Mikroskopie, Merck, Darmstadt) und 100 ml gepuffertem Aqua dest. (pH-Wert = 7,2) hergestellt.
Die Auszählung der Zellen erfolgte lichtmikroskopisch (DMLB, Leica Microsystems, Wetzlar) mit einem 63er Objektiv und Immersionsöl. Zur Differenzierung wurden pro Zytospot im repräsentativen Bereich 400 Zellen gezählt.
45
3.7 Listeriolysin-Antikörper-Immunblot
Die Liquorproben wurden im Institut für Medizinische Mikrobiologie der Justus-Liebig- Universität in Giessen auf das Vorkommen von Antikörpern gegen Listerien-Antigen untersucht. Dafür wurde gereinigtes Listeriolysin O verwendet, da es als dominanter Marker für Listerieninfektionen gilt (LOW et al. 1992). Die eingesandten Liquorproben wurden auf einem Listeriolysin-enthaltenden Immunblot (250 ng Listeriolysin O /slot) aufgetragen und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss erfolgte eine dreimalige Waschung mit TBS-Tween (Tris-Buffered Saline und Polysorbat 20).
Je nach Herkunft des untersuchten Liquors, wurden mit Alkalischer Phosphatase markierte anti-Schaf-IgG- bzw. anti-Ziege-IgG-Antikörper (beide Dianova GmbH, Hamburg) mit TBS-Tween 1:1000 verdünnt und auf den Blot aufgetragen. Es wurde eine erneute Inkubation über die Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Entwicklung erfolgt anschließend mit 1mg / mL BCIP (5-Brom-4- chlor-3-indolylphosphat) in Glycinpuffer für 10 Minuten.
3.8 Bestimmung von Gesamteiweiß im Serum
Der Gesamteiweißgehalt im Serum wurde mit der Biuret-Methode mittels Cobas Mira Plus (Roche, CH-Basel) im Labor der Klinik für kleine Klauentiere ermittelt.
3.9 Bestimmung von Gesamteiweiß im Liquor
Die Bestimmung von Gesamteiweiß im Liquor cerebrospinalis erfolgte mittels der Pyrogallolrot-Methode. Dafür wurde der Test LT-SYS® (Labor + Technik, Eberhard Lehmann GmbH, Berlin) gemäß der Empfehlung des Herstellers verwendet. Die
46
anschließende photometrische Auswertung erfolgte in Halbmikro-Küvetten (Ratiolab GmbH, Dreieich) mit dem Photometer Uvikon XL (BIO-TEK Instruments, Neufahm).
Der Gehalt an Protein im Liquor wurde nach folgender Formel berechnet:
Proteingehalt in g/L = (ExtinktionProbe – Leerwert) x F
Die Ermittlung des Faktor F erfolgte über folgende Formel:
F = Proteingehalt Standardlösung in g/L (( ExtStd1- LRW)+(ExtStd2 - LRW )) ⁄ 2
Ext: Extinktion Std1: Standard 1 Std2: Standard 2 LRW: Leerwert
Als Richtigkeitskontrolle wurden humane Proteinstandards (quanTtest Human Proteinstandards, Quantimetrix Corporation, Redondo Beach, USA) in den Proteinkonzentrationen 0,25; 0,5; 1 und 2 g/L mitgeführt, sowie Liquor eines klinisch- neurologisch gesunden Rindes mit einem Proteingehalt von 0,18 g/L. Begonnen wurde stets mit der Methode für eine Messung bis zu 2 g Gesamteiweiß pro Liter.
Wurde dieser Wert in der Probe überschritten, erfolgte eine erneute Messung mit der vom Hersteller empfohlenen Messung für einen Gesamteiweißgehalt von bis zu 4 g Gesamteiweiß/l im Liquor.
In zwei Proben, die aufgrund ihres sehr hohen Gesamteiweißgehaltes mit der Pyrogallolrot-Methode nicht untersucht werden konnten, wurde der Gehalt an GE
