aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover
Charakterisierung von zytotoxischen
Pseudomonas aeruginosa ‚small colony variants’
isoliert aus dem Respirationstrakt von Patienten mit Cystischer Fibrose
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Doris Jordan aus Mühlacker
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule:
Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach
Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:
Priv.-Doz. Dr. Ivo Steinmetz
1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach 2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. Stefan Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2004
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
In Erinnerung an meine Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung ...11
2. Schriftum...13
2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa... 13
2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa... 15
2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren... 20
2.4. P. aeruginosa und CF... 21
2.4.1. Allgemeines... 21
2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF... 24
2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell... 29
2.6. Zielsetzung der Arbeit... 33
3. Material und Methoden ...34
3.1. Bakterien... 34
3.1.1. Bakterienstämme... 34
3.1.2. Kulturbedingungen ... 38
3.1.3. Bestimmung der Keimzahl... 38
3.1.4. Kulturkonservierung... 38
3.1.5. Charakterisierung der Motilität... 39
3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar... 39
3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar ... 39
3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssysten-Proteinen im Überstand von Bakteriensuspensionen ... 39
3.1.6.1. Vorbereitung der Proben... 40
3.1.6.2. SDS-Page ... 40
3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung ... 41
3.1.6.4. Western Blot ... 41
3.2. Zellkultur... 43
3.2.1. Zelllinie ... 43
3.2.2. Anzucht der Zellen... 43
3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen ... 43
3.2.4. Lösen der Zellen... 44
3.2.5. Ermittlung der Zellzahl... 44
3.2.6. Zytotoxizitäts-Assay... 45
3.2.6.1. Versuchsprinzip ... 45
3.2.6.2. Durchführung des Assays... 46
3.3. Mausmodell... 48
3.3.1. Versuchstiere... 48
3.3.2. Infektion der Mäuse ... 48
3.3.3. Verlaufsuntersuchungen der Infektion ... 48
3.3.4. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Mäuse ... 48
3.3.5. Histopathologische Diagnostik an Lunge und Nasopharynx infizierter Tiere ... 49
3.4. Arbeiten mit Caenorhabditis elegans... 50
3.4.1. Versuchstiere... 50
3.4.2. Kulturerhaltung ... 50
3.4.3. Herstellung der bakteriellen Nahrungsquelle... 50
3.4.3.1. Futterplatten... 50
3.4.3.2. Pellets für Eipräparation... 51
3.4.4. Eipräparation ... 51
3.4.5. Infektionsmodelle... 52
3.4.5.1. Slowkilling... 52
3.4.5.2. Fastkilling... 53
3.4.5.3. Killing in Flüssigkultur ... 53
3.5. Molekularbiologische Arbeiten... 54
3.5.1. Materialien... 54
3.5.2. Molekularbiologische Methoden ... 54
3.5.2.1. Übertragung von DNA durch Elektroporation... 54
3.5.2.2. Mini-Plasmidpräparation ... 55
3.5.2.3. Präparation genomische DNA... 55
3.5.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 56
3.5.2.5. Agarose-Gelelektrophorese ... 57
4. Ergebnisse ...58
4.1. Charakterisierung von P. aeruginosa small colony variants (SCVs) und dem jeweiligen klonalen Wildtyp (WT) im Zytotoxizitäts-Assay mit J774.A1-Makrophagen... 58
4.1.1. Vergleich der Zytotoxizität der autoaggregativen SCVs mit ihrem klonalen WT ... 58
4.1.2. Vergleich der Zytotoxizität nicht-autoaggregativer SCVs mit ihrem klonalen WT ... 60
4.2. Nachweis von Typ III-Sekretionssystem-Proteinen im Kulturüberstand von P. aeruginosa SCVs... 62
4.2.1. SDS-Gele mit anschließender Silbernitrat-Färbung... 62
4.2.2. SDS-Gele mit anschließendem Western Blot... 64
4.3. Überexpression des pvrR-Gens in P. aeruginosa SCVs... 66
4.3.1. Nachweis des pvrR-Gens nach Übertragung mittels Elektroporation in den SCVs ... 66
4.3.2. Mikrobiologische Charakterisierung im Vergleich zu SCV und WT ... 69
4.3.2.1. Koloniemorphologie ... 69
4.3.2.2. Swimming motility... 71
4.3.2.3. Twitching motility und Autoaggregation ... 73
4.3.3. Verhalten im Zytotoxizitäts-Assay im Vergleich zu SCV und WT ... 74
4.4. Virulenzanalyse von zytotoxischen P. aeruginosa SCVs und den klonalen WT im BALB/c-Mausmodell nach intranasaler Infektion... 77
4.4.1. Untersuchungen zur Morbidität und Mortalität... 77
4.4.2. Vergleich der Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz... 79
4.4.3. Vergleich der histopathologischen Veränderungen in Lunge und Nasopharynx ... 81
4.5. Etablierung eines neuen C. elegans Pathogenitäts-Modells... 88
4.5.1. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch SCV und WT ... 88
4.5.2. Einfluss von exsA auf die Abtötung ... 91
4.5.3. Einfluss von ExoU auf die Abtötung ... 94
4.5.4. Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa CHA und ausgewählte Mutanten ... 97
4.5.5. Abtötung von C. elegans durch PA 14 und PAO 1 ... 102
4.5.6. Vergleich der Abtötung von C. elegans durch P. aeruginosa TB und ausgewählte Mutanten von TB ... 104
5. Diskussion ...110
5.1. Autoaggregatives Verhalten von SCVs korreliert mit erhöhter Zytotoxizität durch erhöhte Typ III Sekretion... 110
5.2. Erhöhte Zytotoxizität von autoaggregativen SCVs korreliert mit erhöhter in vivo Pathogenität... 114
5.3. Die Überexpression des pvrR-Gens führt zu einer teilweisen Wiederherstellung des WT-Phänotyps... 117
5.4. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Tiermodell zum Screening bakterieller Mutanten... 120
5.5. Eignung des neuen C. elegans-Modells als Pathogenitätsmodell zur Messung von Typ III Sekretionssystem-vermittelter Virulenz... 129
6. Zusammenfassung / Summary ...133
7. Literaturverzeichnis ...137
8. Anhang ...168
8.1. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis... 168
8.2. Geräte... 172
8.3. Gebrauchsmaterialien... 173
8.4. Medien und Zusätze... 174
8.5. Puffer und Lösungen... 176
8.6. Chemikalien... 178
8.7. Software... 180
Danksagungen ... 181
Veröffentlichung von Teilergebnissen... 183
Abkürzungsverzeichnis... 184
Eidesstattliche Erklärung ... 186
1. Einleitung
Die Cystische Fibrose (CF, syn. Mukoviszidose) ist eine auf einem Defekt im CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen beruhende, autosomal- rezessiv vererbte Erkrankung. Eine der Folgen dieser Erkrankung ist eine gestörte mukoziliäre Clearance in der Lunge und teilweise Verlegung von Atemwegen durch Bildung eines zähen Sekrets. Dieses Habitat schafft optimale Bedingungen für eine Kolonisation und Infektion der Lunge mit opportunistischen Keimen wie Hämophilus influenzae und Staphylococcus aureus in frühen Krankheitsstadien, sowie Pseudomonas aeruginosa bei älteren Patienten mit chronischen Lungeninfektionen (GOVAN u. DERETEC, 1996). P. aeruginosa stellt den Hauptgrund für Morbidität und Mortalität bei älteren Mukoviszidosepatienten dar.
Unterschiedliche Virulenzfaktoren werden mit dem Versagen der Lungenfunktion bei CF-Patienten in Verbindung gebracht. Bei P. aeruginosa wird die Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen diskutiert, da sich im Rahmen einer chronischen Infektion in der CF-Lunge mukoide Phänotypen bilden, die entscheidend zur Biofilmbildung beitragen (POSCHET et al., 2001). Eine besondere Bedeutung der sogenannten SCVs (small colony variants), kleinwüchsigen Varianten von P. aeruginosa, wird diskutiert (HÄUSSLER et al. ,1999a; DRENKARD u. AUSUBEL, 2002). Diesen SCVs wird eine erhöhte Resistenz gegenüber antibiotisch wirksamen Substanzen zugeschrieben. Ihre Bedeutung in der Pathogenese der CF-Lunge ist allerdings bisher ungeklärt. HÄUSSLER et al. beschrieben 2003 eine Subgruppe von SCVs, die befähigt war, im Vergleich zu den jeweiligen klonalen Wildtyp-Phänotypen (WT) vermehrt Biofilm zu produzieren, sie wiesen vermehrt Pili auf und zeigten verstärktes autoaggregatives Verhalten und größere Adhärenz an Oberflächen. Genexpressions- Analysen eines Vertreters dieser Subgruppe durch VON GÖTZ (2003) ergaben, dass die untersuchte SCV im Vergleich zum WT unter anderem eine Überexpression der Gene zeigte, die für die Struktur und Funktion eines Typ III Proteinsekretionssystems nötig sind. Diese Typ III Sekretion stellt einen bedeutenden Virulenzfaktor von P.
aeruginosa dar. Sie befähigt die Bakterien dazu, über eine Art Nadelstruktur oder Pore Toxine direkt in die Wirtszelle zu schleusen.
Im Rahmen dieser Studie sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum einen geklärt werden, ob diese verstärkte Expression der Typ III Gene eine funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte untersucht werden, ob die erhöhte Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses einzelnen Vertreters ist oder auch andere SCVs ein ähnliches Expressions-Profil zeigen. Des Weiteren sollte mit einem Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte Typ III Sekretion bei SCVs in vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie war es, ein Caenorhabditis elegans – Modell zu etablieren, mit dem es im Gegensatz zu den bestehenden Modellen möglich ist, Typ III Sekretions-vermittelte Virulenz zu detektieren.
2. Schriftum
2.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von P. aeruginosa
Die Gattung Pseudomonas wurde von MIGULA 1894 zum ersten Mal beschrieben (MIGULA 1894). Als Pseudomonaden wurden lange Zeit alle stäbchenförmigen, polar begeißelten und gramnegativen Bakterien zusammengefasst. Aufgrund dieser unspezifischen morphologischen Merkmale galt die Gattung Pseudomonas lange Zeit als Auffangbecken für unvollständig charakterisierte, bewegliche Bakterien (STANIER et al., 1966). Die zunächst ausschließlich auf phänotypischen Merkmalen beruhende Klassifizierung wurde später durch molekularbiologische Untersuchungsmethoden ergänzt, wodurch eine Einteilung in fünf Gruppen erfolgte.
Dabei dienten die 16S rRNA-Gene als Markermoleküle für die phylogenetische Zugehörigkeit. Alle fünf Gruppen werden den Proteobakterien zugeordnet; die Mitglieder der RNA-Homologiegruppe I, neben P. aeruginosa z.B. auch P. fluorescens, P. putida und P. syringae, werden als Pseudomonaden im engeren Sinne bezeichnet und gehören zu den γ-Proteobakterien (ANZAI et al., 2000). Die Pseudomonaden im weiteren Sinne aus den Gruppen II bis V wurden nach und nach unterschiedlichen Gattungen zugeordnet. So beinhalten die RNA-Gruppen II und III heute die Gattungen Acidovorax (WILLEMS et al. 1990, 1992) und Burkholderia (YABUUCHI et al. 1992) und einige Arten der Gruppe IV gehören zur Gattung Brevundimonas (SEGERS et al., 1994).
P. aeruginosa gehört durch seine Vielseitigkeit in der Substratverwertung und das lange Überleben unter extrem nährstoffarmen Bedingungen zu den anspruchslosesten Bakterien überhaupt und kommt ubiquitär in einer Vielzahl von Boden- und Wasserhabitaten in der freien Natur und in der direkten Umgebung des Menschen vor (SPIERS et al., 2000). P. aeruginosa ist aber auch in der Lage, Menschen, Tiere und Pflanzen zu besiedeln. Unter anderem können Leitungswasser, Waschbecken, Kosmetika und Lebensmittel mögliche Infektionsquellen darstellen.
P. aeruginosa betreibt Energiegewinnung durch Oxidation organischer Substanzen mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Des Weiteren ist P. aeruginosa in der Lage, Elektronen auf oxidierte Stickstoffverbindungen (NO2-, NO, N2O) oder Arginin zu übertragen und so auch unter anaeroben Bedingungen zu wachsen (STANIER et al., 1966). Insgesamt sind die Ansprüche an die Kulturbedingungen äußerst gering, die Generationszeit beträgt bei einer idealen Temperatur von 37°C ca. 20 min. Auch bei 42°C ist noch Wachstum möglich, jedoch nicht bei 4°C. Auf festen Nährböden bildet P. aeruginosa charakteristische, flache, an den Rändern leicht ausgefranste Kolonien. Neben der glatten, glänzenden S-Form kann auch die trockene, granulierte R-Form auftreten. Bei manchen Stämmen zeigen sich metallisch glänzende, eingesunkene Flecken, seltener kommen extrem schleimige Varianten vor. Letzteres ist vor allem bei Isolaten aus Mukoviszidose-Lungen der Fall. Das schleimige Aussehen entsteht durch Alginat, ein Polymer aus Mannuron- und Guluronsäure, welches von den Bakterien zum Schutz vor äußeren Einflüssen gebildet wird. P. aeruginosa ist sowohl Katalase- als auch Oxidase-positiv, der typische, süßlich-aromatische, „lindenblütenartige“ Geruch wird durch o- Aminoacetophenon verursacht. In flüssigen Nährmedien wächst der Keim vorwiegend an der Oberfläche, wo er eine Kahmhaut bildet. Zwei Pigmente sind charakteristisch für P. aeruginosa: das gelbgrüne, wasserlösliche Fluoreszein, auch Pyoverdin genannt, das auch bei anderen Pseudomonaden vorkommt, und das blaugrüne, chloroformlösliche Phenazinderivat Pyocyanin, welches ausschließlich von P aeruginosa produziert wird. Manche Stämme bilden weitere Pigmente, wie z.B. das rötliche Pyorubin oder das bräunliche Pyomelanin. Weiterhin verfügt P.
aeruginosa über Geißeln, Fimbrien und Pili, die ihm Motilität und Adhäsion ermöglichen (HAHN, 1999).
Die hohe Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen sowie die Vielseitigkeit in der Substratverwertung spiegeln sich in der Größe und Zusammensetzung des Genoms wieder. P. aeruginosa PAO1 besitzt mit 6,3 Mb das größte Genom sowie den mit ca. 9% höchsten Anteil an regulatorisch wirkenden
Genen unter den bisher bekannten, vollständig sequenzierten Bakteriengenomen (STOVER et al., 2000).
2.2. Pathogenität und Virulenzmechanismen von P. aeruginosa
P. aeruginosa gilt als opportunistischer Keim mit human-, tier- und pflanzenpathogenem Potential und gehört zu den am zweithäufigsten vorkommenden gram-negativen Verursachern nosokomialer Infektionen nach Escherichia coli (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Liegt keine lokale oder systemische Schwächung des Immunsystems vor, verläuft eine Kolonisation des Menschen mit P. aeruginosa meist harmlos (AEBI et al., 2001). Es kommt jedoch zu einer folgenschweren Infektion, wenn Patienten kolonisiert werden, die an Cystischer Fibrose (CF) erkrankt oder immunsupprimiert sind, größere Verbrennungen erlitten haben oder sonstige Störungen der Haut- oder Schleimhautbarriere aufweisen. Als so genannter „Nass- oder Pfützenkeim“ besiedelt P. aeruginosa im Krankenhaus unter anderem Waschbecken, Luftbefeuchter, Schläuche von Beatmungs- und Infusionsgeräten, Säuglingsinkubatoren, Desinfektionsmittel (quartenäre Ammoniumverbindungen) und Blumenvasen. P. aeruginosa ist in Europa und Nordamerika verantwortlich für 16 % der nosokomialen Pneumonien durch künstliche Beatmung (WIBLIN, 1997), 12% der im Hospital erworbenen Harnwegsinfektionen durch chirurgische Eingriffe am Urogenitaltrakt oder durch Dauerkatheter (POLLACK, 1995), 8 % der Wundinfektionen nach chirurgischen Eingriffen (KLUYTMANS, 1997) und 10 % der Sepsisfälle (GORDON et al., 1998). Patienten, die durch eine Knochenmarkstransplantation oder ein Krebsleiden mit Neutropenie extrem immunkompromittiert sind, zeigen sich besonders anfällig gegenüber Infektionen mit opportunistischen Erregern. In dieser Gruppe von Patienten sind Pneumonien und Sepsisfälle nach Infektion mit P. aeruginosa für 30 % der Todesfälle verantwortlich (FERGIE ei al., 1994). Auf Stationen mit Verbrennungsopfern können Ausbrüche von Infektionen mit P. aeruginosa zu 60 % Letalität führen (RICHARD et al., 1994). Hier
bietet nicht nur die lokale Zerstörung der Hautbarriere, sondern auch der begleitende immunsuppressive Effekt einer Verbrennung dem Erreger ideale Bedingungen für eine zunächst lokale und später systemische Ausbreitung (DERETIC, 2000).
P. aeruginosa produziert eine ganze Reihe von Virulenzfaktoren, die für die Entstehung lokaler Gewebsläsionen, die Invasion und Verbreitung der Bakterien und die Zerstörung verschiedener Bestandteile der Immunabwehr mit verantwortlich sind.
Zu nennen sind hier zwei Proteasen – Alkalische Protease und Elastase. Die Beteiligung der Alkalischen Protease an Gewebsinvasion und systemischer Infektion ist nicht geklärt, bei Infektionen der Kornea scheint sie jedoch eine zentrale Rolle zu spielen (HOWE u. IGLEWSKI, 1984). Elastin ist ein wichtiger Bestandteil von Lungengewebe und Blutgefäßen und bedingt in beiden Organen die Elastizität und Widerstandsfähigkeit des Gewebes. Daher ist die Fähigkeit Elastin zu spalten ein bedeutsamer Virulenzfaktor bei akuten Infektionen. Die beiden Elastasen LasA und LasB wirken synergistisch (GALLOWAY, 1991), im Mausmodell wurde nachgewiesen dass LasB-defiziente Mutanten deutlich weniger invasiv waren als der LasB-produzierende Elternstamm (TAMURA et al., 1992). Elastase spaltet nicht nur Elastin sondern auch Kollagen (HECK et al., 1986), inaktiviert Bestandteile des Immunsystems wie Immunglobulin A (HECK et al., 1990), Lysozym (JACQUOT, 1985), Komplementkomponenten (HONG u. GHEBREHIWET, 1992) und Substanzen, die am Schutz des Respirationstraktes vor Proteasen beteiligt sind, wie den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor (MORIHARA et al., 1979).
P. aeruginosa produziert die beiden Hämolysine Rhamnolipid und Phospholipase C.
Phospholipase C spaltet Lipide und Lecithin. Rhamnolipid ähnelt von seiner Struktur her einem Detergenz, vermutlich löst es die Phospholipide des Lungensurfactant und macht sie so einer Spaltung durch Phospholipase C zugänglich. Außerdem inhibiert es den mukoziliären Transport (READ et al., 1992).
Exotoxin A ist einer der Hauptvirulenzfaktoren von P. aeruginosa. Ebenso wie andere Exoprodukte verursacht es lokale Gewebsläsionen und trägt zur Invasivität der Bakterien bei, aufgereinigtes Exotoxin A ist tödlich für Mäuse (WOODS u.
IGLEWSKI, 1983). Das Toxin ist verantwortlich für die Inaktivierung des Elongationsfaktors 2 in der Proteinbiosynthese, was zu einer Unterbrechung der Synthese im Stadium der Verlängerung der Polypeptidkette führt. Dies Unterbrechung führt letzten Endes zum Zelltod (IGLEWSKI u. KABAT, 1975;
IGLEWSKI et al., 1977). Das Strukturgen toxA wird von RegA positiv transkriptionell reguliert; die Menge des sezernierten Exotoxin A hängt vom jeweiligen Bakterienstamm (BJORN et al., 1979) und, neben anderen Umweltfaktoren, von der Eisenkonzentration in der Umgebung ab. Mehr als 5µM Eisen im Medium reduziert die Exotoxin A-Produktion in vitro beträchtlich (BJORN et al., 1979). Die Bedeutung von Exotoxin A bei systemischen Infektionen zeigt sich darin, dass Patienten mit einem hohen Antikörpertiter gegen Exotoxin A eine deutlich höhere Überlebenschance bei einer P. aeruginosa-Bakteriämie haben (CROSS et al., 1980).
Außerdem inhibiert Exotoxin A in vitro die Proliferation von B-Zellen sowie die Produktion von Immunglobulin G und M und hat somit möglicherweise einen immunsuppressiven Effekt (VIDAL et al., 1993).
Das Pigment Pyocyanin ist für die charakteristische blau-grüne Koloniefärbung auf bestimmten Selektivmedien verantwortlich und wirkt toxisch auf den Fadenwurm Caenorhabditis elegans (MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999) und induziert Apoptose bei neutrophilen Granulozyten (USHER et al., 2002). In vitro wurden eine Vielzahl von Auswirkungen auf humane Lungenepithelzellen nachgewiesen: so führt das redox- aktive Pyocyanin über die Bildung von Superoxid und Wasserstoffperoxid zu oxidativem Stress in der Zelle und somit wahrscheinlich zum Zelluntergang (GARDNER, 1996). Es inhibiert die zelluläre Katalase-Aktivität (O’MALLEY et al., 2003b), inaktiviert, ebenso wie Elastase, den humanen Alpha1 Proteaseinhibitor (BRITIGAN et al. 1999), führt zu ATP-Abnahme in der Zelle (O’MALLEY et al., 2003a) und erhöht die Freisetzung von Interleukin 8, einem Chemoattraktant für neutrophile Granulozyten (DENNING et al., 1998). In den Luftwegen von Schafen induzieren Pyocyanin und 1-hydroxy-Phenazin Entzündungsreaktionen mit Neutrophilie, was vermutlich auf die erhöhte Produktion von chemoattraktiven Substanzen zurückzuführen ist (LAUREDO et al., 1998). In pulmonalen
Arterienendothelzellen unterdrückt Pyocyanin die Freisetzung von Prostacyclin, möglicherweise eine Erklärung dafür, dass bei einer durch P. aeruginosa verursachten Vasculitis das Endothel relativ lange intakt bleibt, während die äußeren Schichten der Gefäßwand bereits stark in Mitleidenschaft gezogen sind (KAMATH et al.,1995).
Siderophore werden zu den passiven Pathogenitätsfaktoren gerechnet. Eisen ist Bestandteil vieler essentieller Enzyme, so dass ca. 105 Eisenionen pro Bakterienzelle benötigt werden. (BRAUN, 2001). P. aeruginosa bildet die beiden Fe(III)-Siderophore Pyoverdin und Pyochelin, um mit hoher Affinität extrazellulär vorliegendes Eisen zu binden und aufzunehmen (COX ,1980; COX et al., 1981), und kann so auch unter Eisenmangelbedingungen, wie sie unter anderem im menschlichen Körper herrschen, existieren. Zudem verwendet P. aeruginosa die beiden Systeme has und phu, um Häm-gebundenes Eisen in die Zelle zu transportieren (OCHSNER et al., 2000). Die verschiedenen Mechanismen zur Eisenaufnahme werden vom negativen Regulatorprotein Fur kontrolliert (VASIL u. OCHSNER, 1999). Siderophore spielen außerdem möglicherweise eine Rolle beim Entstehen des Entzündungsprozesses, da pyochelingebundenes Eisen die Bildung von Hydroxylradikalen katalysiert (COFFMAN et al., 1990).
Neben den Virulenzfaktoren, die in die Umgebung abgegeben werden, verwendet P. aeruginosa ein Typ III Sekretionssystem, um Effektorproteine in die eukaryotische Zielzelle zu injizieren. Der Sekretionsapparat besteht aus Translokatorproteinen, die eine Nadelstruktur oder Pore bilden, durch die bei direktem Zellkontakt Effektorproteine in das Zytoplasma des Wirts geschleust werden (FRANK, 1997;
GALAN u. COLLMER, 1999; CORNELIS u. VAN GIJSEGEM, 2000). Zu den Effektorproteinen gehören Exoenzym S (ExoS) und Exoenzym T (ExoT), die von P. aeruginosa meist als Aggregat sezerniert werden (COBURN, 1992). ExoS und ExoT haben ebenso wie Exotoxin A ADP-ribosylierende Eigenschaften, aber andere Zielmoleküle. In vitro werden diverse Proteine von ExoS und ExoT ribosyliert, darunter Crk I und II, die eine Rolle in der Signaltransduktion bei der Phagozytose von Bakterien spielen (BARBIERI, 2000). Eine ExoS-defiziente Mutante zeigt im
Tiermodell verglichen mit dem Wildtyp eine verminderte Invasivität (NICAS et al., 1985a) sowie eine weniger umfangreiche Zerstörung von Lungengewebe (NICAS et al., 1985b). Weitere Effektorproteine sind ExoU, ein akut wirkendes Cytotoxin, welches Epithelläsionen verursacht (FINCK-BARBANCON et al., 1997), und die Adenylatcyclase ExoY, die in der Zielzelle eine Anreicherung von cAMP induziert (YAHR et al., 1998). Der eigentliche Sekretionsapparat wird durch die Translokatorproteine PopB und PopD gebildet. Diese Translokatorproteine haben zum einen die Funktion, Poren zur Translokation der Effektorproteine in der Wirtszellmembran zu bilden (FRITHZ-LINDSTEN et al., 1998), andererseits wirken sie bereits durch die Bildung dieser Pore zytotoxisch (DACHEUX et al., 2001b). Die genaue Rolle des ebenfalls vorhandenen PcrV ist bisher nicht vollständig geklärt (SCHOEHN et al., 2003). Versuche mit monoklonalen Antikörpern gegen PcrV in einem Mausmodell konnten eine Protektion bei Sepsis zeigen und die Mortalitätsrate deutlich senken (FRANK et al., 2002).
Abb. 1
periplasmatischer Raum äußere Bakterienmembran
Zytoplasma Bakterium innere Bakterienmembran
translozierte Effektorproteine Zytoplasma Zielzelle
Membran der Zielzelle
Abb. 1: Schematische Darstellung des Typ III Sekretionssystems gramnegativer Bakterien (aus der Arbeit von C. Rappl, Ludwig-Maximilians-Universität München, 2001).
2.3. Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren
Aufgrund des breiten Wirtsspektrums von P. aeruginosa können sowohl Nutztiere als auch Haus- und Zootiere, insbesondere Reptilien, von einer Infektion betroffen sein.
Sie treten gehäuft bei Jungtieren und als Sekundärinfektionen auf, da ebenso wie beim Menschen eine geschwächte Abwehrlage Vorrausetzung für die Invasion des Erregers ist (SELBITZ, 1992). P. aeruginosa ist bei Tieren an verschiedenen lokalen Infektionen beteiligt, septische Allgemeininfektionen sind seltener und führen in der Regel zum Tod des Tieres (MAYR et al., 2001).
Beispiele für lokale Infektionen sind Wundinfektionen bei allen Arten, Abszesse, Infektionen des Respirationstraktes, chronisch purulente Otitis externa beim Hund, ulzerative Keratitis bei Hund und Pferd, Stomatitiden bei Reptilien und Genitalinfektionen mit möglichem Abort bei der Stute. Harnwegsinfektionen bei Hund und Katze sind in der Regel die Folge tierärztlicher Manipulationen wie z.B.
Katheterisierung (ATHERTON u. PITT, 1982). Durch P. aeruginosa hervorgerufene Mastitiden kommen bei der Ziege (BOSTEDT u. DEDIÉ, 1996), seltener beim Rind (GRUNERT, 1996) vor. Die Erkrankung entsteht galaktogen und kann auch enzootisch auftreten. Sie verläuft beim Rind lokal akut, (meistens) chronisch- rezidivierend oder subklinisch, bei der Ziege in der Regel akut eitrig, manchmal gangränös. Sie kann sich aber auch zur systemischen Infektion entwickeln und in den schwersten Fällen tödlich enden. Beim Rind sind häufig Betriebe betroffen, die als Desinfektionsmittel für die Melkgeräte quaternäre Ammoniumsalze benutzen (KLASTRUP, 1994). Bei Schafen wird die sogenannte Vliesfäule durch P. aeruginosa verursacht. Der Keim kommt bei gesunden Schafen auf der Haut und im Vlies vor.
Bleibt dieses für mehrere Tage feucht. bildet die Mischung aus abgeschilferten Epithelzellen, Schweißdrüsenexsudat und Hautfett ein ideales Nährmedium, das den Pseudomonaden eine rasche Vermehrung ermöglicht. Empfängliche Tiere entwickeln eine exsudative Dermatitis, die zu einer Verfärbung der Wolle und in dessen Folge zu wirtschaftlichen Verlusten führen kann (PLANT, 2000).
Septische Allgemeininfektionen kommen vor allem beim Geflügel, Nerz, Chinchilla und bei Laborratten vor (GYLES, 1993). Beim Geflügel sind besonders Küken, die sich über Tränksysteme, Brutschränke oder kontaminierte Injektionsspritzen infizieren können, betroffen (SIEGMANN, 1993). Chinchillas können neben der akut septikämischen auch eine mehr chronisch lokalisierte Form der Infektion entwickeln, bei der sich die Erkrankung bevorzugt in Darm, Uterus, Harnwegen und Haut manifestiert. Die Prognose ist in beiden Fällen zweifelhaft bis ungünstig (EGEN u.
ERNST, 1998).
2.4. P. aeruginosa und CF
2.4.1. Allgemeines
Die Cystische Fibrose (CF) ist die zweithäufigste, autosomal rezessiv vererbte Erkrankung der weißen (kaukasischen) Bevölkerung, an der weltweit über 60.000 Menschen leiden (RAJAN u. SAIMAN, 2002). In Europa und Amerika erkrankt ca. 1 Kind von 2000 bis 1 von 4500 (KOCH u. HØIBY, 1993). Die CF beruht auf einem Gendefekt im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR (BEAR et al., 1992). CFTR ist ein Chlorid-ABC Transporter mit zusätzlichen Funktionen regulatorischer Natur (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Die häufigste Mutation (~ 70%) ist die inframe 3-Basenpaar-Deletion im CFTR-Gen (F508), welche zum Verlust der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 führt (PIER, 1998; TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Die Abwesenheit von CFTR in der apikalen Membran von Epithelzellen bewirkt einerseits die Verringerung der Cl--Sekretion und andererseits die beschleunigte Na+-Absorption durch die wegfallende inhibitorische Wirkung von CFTR auf den epithelialen Na+-Kanal (ENaC) (BEAR et al., 1992; STUTTS et al., 1995). Die dabei entstehende Dysregulation des Na+ und Cl--Haushalts bewirkt eine erhöhte Viskosität epithelialer Sekrete. Auf klinischer Ebene sind die Hauptcharakteristika der CF-Erkrankung – aufgrund von Obstruktionen in den Organen durch Bildung eines wasserarmen, hoch viskösen Sekretes – Malabsorption
(entsprechend der exokrinen Pankreasinsuffizienz), Beeinträchtigung der Lungenfunktion mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen, zunehmender Salzverlust im Schweiß und männliche Infertilität durch Stenose in den Vasa deferentia (KOCH u. HØIBY, 1993). Auch das hepatobiliäre System ist betroffen (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Während die exokrine Pankreasinsuffizienz durch Enzymsubstitution nicht mehr den limitierenden Faktor darstellt und die meisten Patienten das Erwachsenenalter erreichen, ist und bleibt heute die CF-Lunge aufgrund der chronischen Infektionen die Hauptrsache für die Morbidität und Mortalität der Erkrankung (GOVAN u. DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ 1999;
RAJAN u. SAIMAN 2002).
Die Luftwege von CF-Patienten werden hauptsächlich mit opportunistischen Erregern – besonders S. aureus und H. influenzae im frühen Lebensalter und P. aeruginosa und Vertretern des Burkholderia cepacia-Komplexes im späteren Lebensalter – besiedelt und infiziert (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Neben diesen Erregern werden weitere Mikroorganismen wie Moraxella catarrhalis, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia gladioli, Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae (KNOWLES, 2000), atypische Mykobakterien (KILBY et al., 1992), sowie Aspergillus fumigatus (GILLIGAN, 1991) im Respirationstrakt vorgefunden.
P. aeruginosa ist der häufigste und verbreitetste Lungeninfektionserreger in CF- Patienten und wird deshalb auch als CF-Leitkeim bezeichnet (SMITH et al., 1996;
LYCZAK et al., 2002). Bei 75-90% der Patienten entsteht eine chronische Infektion mit diesem Bakterium (PIER, 2000). In Krankenhäusern stellen Waschbecken, Toiletten und Duschen, aber auch das Klinikpersonal und bereits infizierte Patienten ein Infektionsrisiko dar (SCHAAL u. v. GRAEVENITZ, 1994). Studien von RÖMLING et al. (1994) haben gezeigt, dass Infektionen mit P. aeruginosa beinahe überall in der Umwelt stattfinden können. Das heißt, nicht nur das Krankenhaus stellt ein Risiko dar, sondern auch die häusliche Umgebung der Patienten. Die meisten Patienten werden in der Schulzeit oder der frühen Pubertät kolonisiert (TÜMMLER u. KIEWITZ,
1999). Ist die CF-Lunge chronisch infiziert, können die meisten Chemotherapeutika die Bakterien nicht mehr vollständig eliminieren (DERETIC, 2000).
Man geht davon aus, dass eine Besiedelung der Lunge mit P. aeruginosa nach erfolgreicher Infektion mit Erregern wie S. aureus oder H. influenzae stattfindet, wobei P. aeruginosa diese Keime verdrängt (DERETIC, 2000).
In der CF-Lunge ist eine Senkung der mukoziliären Clearance und somit eine Störung in der primären natürlichen Abwehr der Lunge vorzufinden. Über die Pathogenese und die hohe Empfänglichkeit für chronische Infektionen gibt es heute mehrere Hypothesen. Einige dieser Hypothesen stellen eine besondere Adhärenz von P. aeruginosa an CF-Epithelzellen in den Vordergrund (de BENTZMANN et al., 1996), eine verschlechterte Internalisierung und Abschilferung von P. aeruginosa enthaltenden Epithelzellen durch Abwesenheit von CFTR (PIER et al., 1996) oder eine Inaktivierung der Salz-sensiblen Defensine in der ASL (airway surface liquid) (GOLDMANN et al., 1997). Eine neuere Hypothese geht von speziellen Wachstumsbedingungen für die Bakterien in der CF-Lunge aus. Diese sind eng mit der bei CF veränderten Zusammensetzung des ASL verknüpft. Es wird vermutet, dass es zu einer Volumenabnahme der die Zilien umgebenden Flüssigkeit durch erhöhte Absorption von Natrium-Ionen und einer Senkung in der Sekretion der Chlorid-Ionen kommt. Die ASL, welche die Lungenoberfläche bedeckt, besteht aus einer Mukusschicht (stark vernetzte, hoch glykosylierte Proteine) und einer periziliären Flüssigkeitsschicht. Die periziliäre Flüssigkeitsschicht auf der Zelloberfläche umgibt die Zilien des Flimmerepithels und ist von niedriger Viskosität, in der sich die Zilien schnell bewegen können. Zusätzlich schützt sie die Epithelzelloberfläche vor der darüberliegenden Mukusschicht. Besteht eine physiologische Funktion, so fängt das mukoziliäre Clearance-System mit der Mukusschicht fremde inhalierte Partikel und Mikroorganismen ab und transportiert diese zum Nasopharynx, wo sie abgeschluckt oder abgehustet werden (KOCH u.
HØIBY, 1993; KNOWLES u. BOUCHER, 2002; LYCZAK, 2002). Durch die chronische Volumenabnahme der periziliären Flüssigkeitsschicht kommt es vermutlich zu einer Interaktion zwischen der Mukusschicht mit der Epithelzelloberfläche und es bilden sich dicke Mucusplaques. Hierdurch kommt es
zur Störung der Zilienbewegung, was eine Reduktion der Clearancerate zur Folge hat (KNOWLES u. BOUCHER, 2002). Da die Mucin-Sekretion unverändert bleibt, kommt es zu einem Dickenzunahme der Mucus-Schicht.
Inhalierte P. aeruginosa gelangen aktiv (flagelläre Motilität) und/oder passiv (Turbulenzen der Mukusoberfläche) in die Mukusmasse, bilden dort Mikrokolonien und reduzieren hier den Sauerstoffgehalt. Beim anschließenden anaeroben Wachstum verwenden sie vermutlich Nitrit als terminalen Elektronenakzeptor (HASSETT et al., 1999; WORLITZSCH et al., 2002). P. aeruginosa passen sich also den veränderten Lebensbedingungen in der CF-Lunge an, indem sie die Fähigkeiten besitzen, Mikrokolonien in anaeroben Mukusplaques bilden zu können (WORLITZSCH et al., 2002). Diese Hypothese wird durch Untersuchungen an humanen Lungenpräparaten (BALTIMORE et al., 1989; WORLITZSCH et al., 2002) sowie durch Studien an Tiermodellen (NIEDERMAN et al., 1983; MARCUS u.
BAKER, 1985) unterstützt. Dazu passen Beobachtungen, dass P. aeruginosa unter niedrigen O2-Partialdrücken bzw. mikroaerophilen Bedingungen gut wächst und unter anaeroben Bedingungen besonders dicke Biofilme ausbildet (YOON et al., 2002).
Biofilme schützen P. aeruginosa vor der Immunantwort ihres Wirts, da opsonisierende Antikörper und Phagozyten wenig Angriffsfläche finden (HØIBY et al., 2001). Außerdem vermitteln sie eine erhöhte Resistenz gegen Antibiotika (HANCOCK, 1998).
2.4.2. Phänotypische Variationen von P. aeruginosa bei CF
Die meisten CF-Patienten sind mit einem P. aeruginosa Genotyp chronisch infiziert (BREITENSTEIN et al., 1997), die Isolate können jedoch unterschiedliche Kolonie- Morphologien aufweisen. Dieses Verhalten wurde von ZIERDT u. SCHMIDT bereits 1964 als “dissoziatives Verhalten“ beschrieben. CF-assoziierte Isolate sind oft mukoid, was auf einer Überproduktion von Alginat aufgrund einer Mutation im Regulatorprotein MucB beruht. Diese Mutation kann zum Beispiel durch Sauerstoffradikale induziert werden, die von PMNs während der inflammatorischen Antwort gebildet werden (GOVAN u. DERETIC, 1996). Auch sind CF-Isolate meist nicht motil aufgrund fehlender Typ IV Pili oder Flagellen (LUZAR et al., 1985). Das
Fehlen von Typ IV Pili und Flagellen kann auch bei P. aeruginosa in Biofilmen beobachtet werden (WHITELEY et al., 2001). Außerdem zeigen CF-Isolate eine verminderte Virulenz bei akuten respiratorischen Infektionen im Maus-Modell (LUZAR u. MONTIE, 1985).
Zu Beginn werden CF-Patienten mit dem nicht-mukoiden Phänotyp, wie er ubiquitär in der Umwelt zu finden ist, kolonisiert (PIER, 1998). Im Laufe der Erkrankung tendiert das Bakterium dazu, zum mukoiden Phänotyp zu konvertieren und so vermutlich die chronische Infektionsphase für die CF-Patienten einzuleiten (KOCH u.
HØIBY, 1993; LYCZAK et al., 2002). Somit beherbergen die meisten Patienten den nicht-mukoiden Phänotyp nur für eine kurze Periode und den mukoiden Phänotyp für Jahre (PIER, 1998). Selten wird der mukoide Phänotyp von P. aeruginosa bei anderen Infektionen als CF vorgefunden (DERETIC, 2000).
Neben dem mukoiden wurde ein weiterer Morphotyp von P. aeruginosa mit CF in Verbindung gebracht. Dieser wird aufgrund der Bildung von extrem kleinen Kolonien als small colony variant (SCV) beschrieben.
SCVs sind bei P. aeruginosa schon länger bekannt (BAYER, 1989). Ähnliche Morphotypen wurden auch bei einer Reihe weiterer bakterieller Erreger, wie S.
aureus (LACEY, 1969; BULGER, 1969), Salmonella Typhimurium (SASARMAN et al., 1970), Klebsiella pneumoniae (MURRAY u. MOELLERING, 1982), Escherichia coli (ROGGENKAMP et al., 1998) und Burkholderia pseudomallei (HÄUSSLER et al., 1999b) beobachtet. Für die meisten dieser SCVs wird eine Einschränkung des aeroben respiratorischen Systems oder genauer der Häm Biosynthese angenommen (ROGGENKAMP et al., 1998). Die SCVs von S. aureus und E. coli sind neben den SCVs von P. aeruginosa am besten charakterisiert, ihr Auftreten korreliert ebenfalls mit chronischen Infektionen (ROGGENKAMP et al., 1998). SCVs von E. coli und S.
aureus weisen eine Auxotrophie gegenüber Menadion oder Hämin auf, was in diesen Arten darauf hindeutet, dass das verlangsamte Wachstum auf eine Beeinträchtigung der Biosynthese von Menachinon und Cytochromen, beides essentielle Bestandteile der Elektronentransport-Kette, zurückzuführen ist. In der Tat zeigte eine in vitro Mutante des für die Häm-Biosynthese essentiellen hemB Gens in S. aureus einen
SCV-Phänotyp (VON EIFF et al., 1997; VAUDAUX et al., 2002), was ebenfalls für ein hemB-defizientes klinisches Isolat von E. coli der Fall war (ROGGENKAMP et al., 1998). Mutationen im hemB Gen verursachen also eine Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels und sind eine mögliche Ursache für das Auftreten von SCVs in S. aureus und E. coli.
Entsprechende metabolische Beeinträchtigungen konnten für die P. aeruginosa SCVs nicht gefunden werden, Hämin und Menadion im Medium konnten die Koloniegröße der SCVs nicht verändern. HÄUSSLER et al. (1999a) untersuchten Isolate von CF-Patienten, die in einem Zeitraum von 2 Jahren regelmäßig in der Pädiatrie und CF-Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover betreut wurden.
Von diesen 86 P. aeruginosa positiven Patienten waren 33 mit SCVs kolonisiert.
Patienten, bei denen SCVs isoliert wurden, wiesen eine stärkere Beeinträchtigung ihrer Lungenfunktion auf als Patienten ohne SCVs. Außerdem bildeten SCVs eine 2 bis 8-fach höhere Resistenz gegenüber gebräuchlichen Antibiotika (Aminoglykoside, Quinolone, β-Lactame, Colistin) aus, die zur Behandlung von CF-Patienten eingesetzt werden. Der durch Antibiotikagabe verursachte selektive Druck könnte u.a. für das Entstehen von SCVs verantwortlich sein, da diese vermehrt aus Patienten isoliert wurden, die täglich das Aminoglykosid Tobramycin als antipseudomonale Aerosol-Therapie anwendeten.
Abb. 2
SCV WT
Abb. 2: Wachstum der beiden Morphotypen WT und SCV von P. aeruginosa 20265 auf Columbia-Blutagar nach 48-stündiger Inkubation bei 37 °C.
Die vorliegende Arbeit baut auf den beschriebenen Untersuchungen von HÄUSSLER et al. (1999a) auf. In phänotypischen Analysen von SCVs wurde von HÄUSSLER et al. (2003) ein Pool von 12 Isolaten klonaler SCVs und Wildtypen und ihrer in vitro generierten Revertanten untersucht. Sechs der SCVs zeigten ein stark autoaggregatives Verhalten im Vergleich zu Wildtyp und Revertante bei Anzucht in Vogel-Bonner-Medium. In LB-Medium war dieses autoaggregative Verhalten nicht so stark ausgeprägt. Ausgehend von dieser Subgruppe wurden weitere Tests durchgeführt. Alle SCVs zeigten eine verstärkte Biofilmproduktion, vier der sechs autoaggregativen SCVs zeigten eine stärkere Assoziation mit der Pneumozyten- Zellinie A549. Alle wiesen eine erhöhte Hydrophobizität auf und fünf zeigten in elektronenmikroskopischen Untersuchungen vermehrt Pili im Vergleich zum Wildtyp.
Die in vitro generierten Revertanten waren durch eine noch größere Anzahl Pili gekennzeichnet. Alle SCVs zeigten ein gegenüber dem Wildtyp und der Revertante vermindertes Schwimmverhalten, wogegen das durch Pili vermittelte Twitching im Vergleich zum Wildtyp erhöht war. Die Revertanten zeigten die höchste Twitching- Motilität. Bei Kokultivierungsversuchen mit ihren Wildtypen in LB-Medium wiesen die SCVs in der exponentiellen Phase ein geringeres Wachstum auf, wogegen die Überlebensrate in der stationären Phase deutlich höher war.
WEHMHÖNER (2002) konnte bei der autoaggregativen SCV 20265 im Vergleich zum WT 20265 eine verstärkte Typ I Sekretion (alkalische Protease, Hämophore HasAp) und verstärkte Typ III Proteinsekretion (Effektorproteine ExoS und ExoT, Porenproteine PopB, PopD, PcrV) nachweisen und zeigen, dass vermehrt Proteine zur Eisenaufnahme gebildet werden. Außerdem zeigt diese SCV eine geringe Expression von Strukturproteinen des Flagellen-Apparats.
VON GÖTZ (2003) führte zur gleichen Zeit Transkriptom-Analysen mit SCV 20265 und klonalem WT durch und konnte feststellen, dass auch auf Transkriptom-Ebene eine verstärkte Expression der Gene auftrat, die für die Struktur und Funktion eines Typ III Sekretionsapparats nötig sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die SCV 20265 eine geringere Expression von Genen aufwies, die der Motilität dienen, sowie eine Erhöhung von Genen, die für eine Eisenaquirierung nötig sind.
Das Auftreten von SCVs in vitro konnte auch in anderen Arbeitsgruppen festgestellt werden. DEZIEL et al. (2001) konnten zeigen, dass P. aeruginosa 57RP SCVs gegenüber dem Wildtyp eine Hyperpilierung der Typ IV Pili auf der Zelloberfläche aufwiesen, jedoch trotzdem eine verminderte twitching-Motilität besaßen. Außerdem waren die Flagellen-abhängigen Fortbewegungsarten Schwimmen und Schwärmen, sowie die allgemeine chemotaktische Orientierung der Bakterien beeinträchtigt.
57RP SCVs zeigten eine gesteigerte Fähigkeit zur Initiierung von Biofilmen, die mit einer starken Adhärenz zu abiotischen Oberflächen, erhöhter Hydrophobizität und Autoaggregation einherging. Es zeigten sich auch Unterschiede in der Sezernierung von Exoprodukten. So war der Gehalt von Pyocyanin und Pyoverdin erhöht, die Menge an Elastase im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt. Die 57RP SCVs wiesen darüber hinaus eine höhere Sensitivität gegenüber H2O2 auf.
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) bestätigten die guten Biofilm- Bildungseigenschaften und die erhöhte Resistenz von SCVs gegenüber Antibiotika (HÄUSSLER et al., 1999a). Sie stellten fest, dass die Anzahl aus dem Wildtyp gebildeter SCVs von den in vitro Kulturbedingungen abhing. Daraus zogen sie den Schluss, dass das Auftreten von SCVs ein von den Umweltbedingungen induzierter Prozess sei und schlugen wie vor ihnen auch DÉZIEL et al. (2001) als Mechanismus eine gerichtete Phasenvariation vor. DRENKARD u. AUSUBEL (2002) identifizierten mit pvrR ein Gen, das, wenn es in PA14 SCVs überexprimiert wurde, diesen SCVs Wildtyp-Eigenschaften verlieh. Eine Mutagenese im Wildtyp führte nicht zu einem ausschließlichen SCV-Phänotyp, sondern lediglich zu einem gehäuften Auftreten von SCVs in der WT-Population. Daraus ist zu schließen, dass pvrR vermutlich eine Rolle in der Morphotyp-Konversion spielt, jedoch nicht allein dafür verantwortlich zu sein scheint. Dieses Gen konnte in der Mehrzahl von getesteten CF- und Klinik- Isolaten sowie Standard-Laborstämmen nachgewiesen werden. In P. aeruginosa PAO1 konnte jedoch kein homologes Gen gefunden werden.
2.5. Der Nematode C. elegans als Infektionsmodell
C. elegans ist ein freilebender, anspruchsloser Bodennematode der meisten gemäßigten Zonen. Er lebt im Erdreich und ernährt sich von den dort vorkommenden Mikroorganismen. Außerdem benötigt er für Wachstum und Reproduktion lediglich eine feuchte Umgebung mit gemäßigten Temperaturen und ausreichend Sauerstoff.
Aufgrund dieser Anspruchslosigkeit ist C. elegans problemlos im Labor auf Agarplatten mit E. coli als Nahrungsquelle zu halten. Aufgrund seiner geringen Größe von etwa 2 mm ist die Kultivierung einer großen Anzahl von Würmern auf kleinstem Raum möglich. Die Dauer der Entwicklung vom Ei bis zum reproduktionsfähigen adulten Wurm beträgt temperaturabhängig etwa drei (25 °C) bis sechs (15 °C) Tage, wobei sich diese Entwicklung über vier Larvenstadien (L1 bis L4) erstreckt. Die maximale Lebenszeit des adulten Wurms beträgt etwa vier Wochen, bei Nahrungsmangel oder zu hoher Populationsdichte ist die Entstehung eines resistenteren Dauerstadiums möglich (RIDDLE et al., 1997).
Abb. 3
A B
Abb. 3: Der Nematode Caenorhabditis elegans. (A) zeigt den anatomischen Aufbau einen adulten Wurms. (B) ist ein Ausschnitt aus einer Mischkulturplatte. Es sind Eier, Larven in verschiedenen Entwicklungsstufen sowie adulte Würmer zu sehen.
Jeder adulte, selbstbefruchtende Hermaphrodit legt in einem Zeitraum von 4 Tagen bis zu 300 Eier. Ebenfalls existierende männliche Würmer – weibliche Tiere gibt es nicht – lassen sich beliebig mit diesen Hermaphroditen paaren, was für die genetische Forschung von Bedeutung ist.
Der Wurm ist mechanisch sehr robust: er lässt sich schütteln, zentrifugieren, einfrieren und lebendig wieder auftauen. Die Basistechniken zur Kultivierung sind einfach und ohne großen Aufwand durchzuführen (HOPE, 1999). Die Anatomie des Wurms ist sehr übersichtlich – exakt 959 somatische Zellen bei Hermaphroditen, davon 302 Nervenzellen – und die Erscheinung unter dem Durchlichtmikroskop transparent, was für die Erforschung innerer Vorgänge von großem Vorteil ist (RIDDLE et al., 1997).
Diese Argumente veranlassten schon 1965 den britischen Molekularbiologen SYDNEY BRENNER, C. elegans als Modellorganismus in die Biologie einzuführen (BRENNER, 1974). Seit dem gewann der Wurm zunehmend an Interesse. Bereits im Jahr 1998 war das Genom von C. elegans als erstem multizellulären Organismus vollständig sequenziert (THE C. ELEGANS SEQUENCING CONSORTIUM, 1998).
Das Genom von C. elegans umfasst etwa 19000 Gene bei einer Größe von 97 Mb, was nach aktuellen Schätzungen mehr als halb so vielen Genen wie beim Mensch entspricht (INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM, 2001). Die Sequenzierung hat gezeigt, dass mindestens 37% der exprimierten Proteine von C. elegans Äquivalente in anderen Organismen wie dem Mensch und anderen Säugern besitzen. So kann, trotz der großen evolutionären Distanz zwischen Mensch und Nematode, C. elegans als ein gültiges, auch auf den Säugetierwirt übertragbares Modell für infektionsbiologische Studien herangezogen werden (MAHAJAN-MIKLOS et al., 2000).
Die bekannte Genomsequenz und die daraus resultierende Möglichkeit, diese genetisch zu manipulieren, machen für die Aufklärung grundlegender biologischer Vorgänge auch ein Arbeiten mit definierten Wurmmutanten möglich. Insbesondere in Verbindung mir bakteriellen Pathogenen, deren Genom ebenfalls bekannt ist, bieten sich optimale Bedingungen zur systematischen Analyse von Interaktionen zwischen einem bakteriellen Pathogen und einem eukaryotischen Wirt (TAN et al., 1999a).
Viele Virulenzfaktoren werden erst durch den Wirt induziert und können nur mit Hilfe von Techniken identifiziert werden, die den Wirt mit einbeziehen. Aus diesem Grund stellte die Gruppe um FREDERICK AUSUBEL im Januar 1999 ein Nematoden- Bakterien-Pathogenitätsmodell vor, welches sich mit den Einflüssen von P.
aeruginosa auf C. elegans befasst (TAN et al., 1999a; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999; TAN et al., 2000), und mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen Virulenzfaktoren des Bakterienstammes und den Wirtsabwehrmechanismen analysiert werden können. P. aeruginosa besitzt die Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu produzieren, die in so unterschiedlichen Wirten wie Pflanzen (Arabidopsis thaliana), Nematoden und Säugern Krankheiten verursachen (RAHME et al. 1995; TAN et al., 1999b; MAHAJAN-MIKLOS et al., 1999), so dass Vergleiche zwischen seinem Verhalten in den unterschiedlichen Wirtssystemen gezogen werden können. TAN et al. (1999a, b; 2000) und MAHAJAN-MIKLOS et al. (1999) konnten mit ihrem Modell Mutanten des P. aeruginosa-Stammes PA 14 isolieren, die sowohl im C. elegans- als auch im Mausmodell attenuiert waren. Diese Tatsache zeigt die Möglichkeit, Pathomechanismen zu detektieren, die auch für den Säugetierwirt von Bedeutung sind.
P. aeruginosa PA 14 hat ein breites Wirtsspektrum und zeigt auf C. elegans letale Wirkung. Es wurden zwei unterschiedliche Arten des Wurmsterbens beschrieben:
das durch Infektion ausgelöste langsame Sterben slowkilling und das schnellere Sterben fastkilling, das durch die Ausschüttung von Toxinen bedingt ist. Der unterschiedliche Sterbeverlauf ist von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig.
Eine dritte Art des Sterbens von C. elegans durch PA 14 wurde wenige Monate später als letale Paralyse beschrieben (DARBY et al., 1999), die auf einer Cyanid- Produktion durch P. aeruginosa beruht.
Es sollte jedoch auch in Betracht gezogen werden, dass das C. elegans-Bakterien- Modell einige Einschränkungen aufweist. So wird das System zum Beispiel dadurch limitiert, dass nicht alle Bakterien C. elegans unter Laborbedingungen infizieren können. Bisher ist eine letale Wirkung auf C. elegans nur für folgende Bakterien
beschrieben: die gramnegativen Pathogene P. aeruginosa, P. fluorescens, B.
cepacia (TAN et al., 1999a, 2000), B. pseudomallei, B. thailandensis (O’QUINN et al., 2001), S. Thyphimurium (ABALLAY et al., 2000), Serratia marcescens (KURZ et al., 2000) und Yersinia spp. (DARBY u. FALKOW, 1999) sowie die grampositiven Pathogene Bacillus megaterium (ANDREW et al., 1976), Bacillus thuringiensis (LEYNS et al., 1995), Microbacterium nematophylum (HODGKIN et al., 2000), Enterococcus faecalis, S. aureus und Streptococcus pneumoniae (GARSIN et al., 2001). Zudem fehlt den Nematoden ein entwickeltes (adaptives) Immunsystem; die Aufgabe mancher Virulenzfaktoren besteht jedoch darin, die Immunantwort des Wirtes zu neutralisieren (FINLAY et al., 1999). Des Weiteren wird die Expression vieler Virulenzmechanismen im Säugetierwirt durch das Wirtsmillieu oder durch spezifische Wirtsmoleküle induziert, wobei die Temperatur (in den meisten Fällen 37 °C) oftmals ein Schlüsselsignal ist. Dementsprechend könnte man einwenden, dass einige für Säugetiere relevante Virulenzfaktoren nicht im Nematoden exprimiert werden, da diese bei Raumtemperatur gehalten werden. Trotz dieser Einschränkungen konnte in den oben genannten Studien von TAN et al. (1999a, b;
2000) gezeigt werden, dass es eine Vielzahl von Virulenzfaktoren gibt, die gleichzeitig Bedeutung für Nematoden und Säuger haben.
2.6. Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Studie sollten unterschiedliche klinische P. aeruginosa SCVs und ihre klonalen Wildtyp-Phänotypen charakterisiert werden. Dabei lag der Schwerpunkt darauf, das Typ III Sekretionssystem bei SCVs im Gegensatz zu den WT näher zu charakterisieren.
Zunächst sollte unter Verwendung eines Zellkultur-Modells zum einen geklärt werden, ob eine verstärkte Expression von Typ III Genen, wie sie für einen Vertreter der SCVs beschrieben wurde, eine funktionelle Rolle spielt und zum anderen sollte untersucht werden, ob die erhöhte Typ III Sekretion nur ein Phänomen dieses einzelnen Vertreters war oder auch andere SCVs ein ähnliches Expressions-Profil zeigen. Durch Überexpression des Zwei-Komponenten-Regulators pvrR in den SCVs sollte der Einfluss dieses Gens auf den SCV-Phänotyp überprüft werden.
Des Weiteren sollte mit einem Mausmodell geklärt werden, in wie weit eine erhöhte Typ III Sekretion bei SCVs in vivo eine Rolle spielt. Ein dritter Punkt dieser Studie war es, ein Caenorhabditis elegans – Modell zu etablieren, mit dem im Gegensatz zu bereits bestehenden Modellen Typ III Sekretion-vermittelte Virulenz detektiert werden kann. Dies sollte neben der Untersuchung von P. aeruginosa WT- und SCV-Isolaten zusätzlich durch den Einsatz von P. aeruginosa-Mutanten mit Defekten im Typ III Sekretionssystem erreicht werden.
3. Material und Methoden
3.1. Bakterien
3.1.1. Bakterienstämme
Die in dieser Studie verwendeten Stämme von P. aeruginosa sowie verwendete Mutanten werden im Folgenden unter Nennung ihrer relevanten phäno- oder genotypischen Eigenschaften aufgeführt.
Die untersuchten SCVs sowie ihre klonalen Wildtypen wurden aus dem Respirationstrakt chronisch infizierter CF-Patienten, die in der Medizinischen Hochschule Hannover behandelt wurden, isoliert. Die Klonalität von SCV und WT wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese überprüft. Diese Prüfung erfolgte im Bereich Krankenhaushygiene des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene nach der Methode von RÖMLING et al. (1994).
Die verwendete P. aeruginosa Mutante 20265 SCVexsA wurde von I. Attree, CEA Grenoble, Frankreich konstruiert und zur Verfügung gestellt (Tab. 1).
Tab. 1: Verwendete Isolate von P. aeruginosa SCVs und Wildtypen
Patient Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp
Herkunft
A 20265 WT klonal identisch mit SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 20265 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
20265 SCVexsA Insertionsmutation in exsA,
Regulator für Typ III Sekretion; Gmr
I. Attree, CEA Grenoble 20265
SCVpED202 Komplementation des pvrR-Gens;
Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr
F. v. Götz MH Hannover B 52 WT klonal identisch mit 52 SCV,
schnell wachsender WT
MH Hannover 52 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
C 8226 WT klonal identisch mit 8226 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 8226 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
D 231 WT klonal identisch mit 231 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 231 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
E 29 WT klonal identisch mit 29 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover 29 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
29 SCVpED202 Komplementation des pvrR-Gens;
Hypothese : Beteiligung an der SCV-Entstehung ; Cbr
F. v. Götz MH Hannover F 10 WT klonal identisch mit 10 SCV,
schnell wachsender WT
MH Hannover 10 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
G 17997 WT klonal identisch mit 17997 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover 17997 SCV SCV, hyperpiliert, autoaggregativ
H 18 WT klonal identisch mit 18 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 18 SCV SCV, nicht autoaggregativ u.
hyperpiliert
I 211 WT klonal identisch mit 211 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover 211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
J 35 WT klonal identisch mit 35 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 35 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
K 6998 WT klonal identisch mit 6998 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 6998 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
L 50 WT klonal identisch mit 50 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover 50 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
M 26 WT klonal identisch mit 26 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 26 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
N 4211 WT klonal identisch mit 4211 SCV,
schnell wachsender WT MH Hannover 4211 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
O 113 WT klonal identisch mit 113 SCV, schnell wachsender WT
MH Hannover 113 SCV SCV, nicht autoaggr. u. hyperpiliert
Bezeichnung der Phänotypen: WT, Wildtyp; SCV, small colony variant; Gmr, Gentamicin- Resistenz; Cbr, Carbenicillin-Resistenz
P. aeruginosa TB und eine Gruppe von 65 daraus generierte Transposon-Mutanten wurden freundlicherweise von der Klinischen Forschergruppe (L. Wiehlmann, B.
Tümmler) der Kinderklinik der MHH zur Verfügung gestellt. Sechs Mutanten konnten zur Veröffentlichung im Rahmen dieser Arbeit verwendet werden. Außerdem wurde die von I. Attree konstruierte Mutante TBexsA eingesetzt (Tab. 2).
Tab. 2: P. aeruginosa TB und Transposon-Mutanten
Stamm Relevanter Phäno- oder
Genotyp
Herkunft
TB Klinisches Isolat CF L. Wiehlmann,
MHH 9B9 intergenic region zwischen
mechanosensitivem Kanal mscL und Katalase katB
L. Wiehlmann, MHH
18A8 knock out im Transkriptiosregulator RhlR, quorum sensing
L. Wiehlmann, MHH
20D1 knock out von xcpS, Protein F eines allg. Sekretionsapparats
L. Wiehlmann, MHH
25C8 knock out im Typ IV Strukturprotein
für TypIV-Pili, PilY L. Wiehlmann, MHH
D8A3 knock out im Regulator des quorum
sensing, vfr L. Wiehlmann,
MHH D10B10 knock out in mögl. Ferrichrome-
Eisen-Rezeptor
L. Wiehlmann, MHH
TBexsA Insertionsmutation in exsA, Regulator für Typ III Sekretion; Gmr
I. Attree, CEA Grenoble Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz
P. aeruginosa CHA und daraus generierte Mutanten, sowie P. aeruginosa PA34 und eine ExoU-defiziente Mutante von PA34 wurden freundlicherweise von I. Attree, CEA, Biochimie et Biophysique des Systemes Intégrés, Grenoble, Frankreich, zur Verfügung gestellt (Tab. 3).
Tab. 3: P. aeruginosa -Stämme aus Frankreich
Stamm Relevanter Phäno- oder Genotyp
Herkunft/Referenz
CHA CF-Isolat, Wildtyp DACHEUX et al.,
1999 CHA-D1 Insertionsmutation in exsA,
Regulator für Typ III Sekretion; Gmr
s.o.
CHAdsbA Defekt in Thiol-Disulfid-
Oxidoreduktase; nötig für korrekte Faltung von Proteinen über Disulfid- Brücken; Tcr
FAUVARQUE et al.
2002
CHApilV knock out in einem Strukturprotein
für TypIV-Pili, PilV; Tcr FAUVARQUE et al.
2002
CHAcheZ Chemotaxis ; Gmr FAUVARQUE et al.
2002 CHAexsD knock out im TTSS-Regulator ExsD;
Tcr
FAUVARQUE et al.
2002
PA 34 CF-Isolat, Wildtyp FAUVARQUE et al.
2002 PA34∆U knock out im TTSS-Effektorprotein
ExoU; Gmr
FAUVARQUE et al.
2002
Bezeichnung der Phänotypen: Gmr, Gentamicin-Resistenz; Tcr, Tetracyclin-Resistenz
Außerdem wurden die Stämme P. aeruginosa PA14 – klinisches CF-Isolat – und P.
aeruginosa PAO1 – Wundisolat (DSM 1707) – eingesetzt (TAN et al., 1999; DARBY et al., 1999).
Als Futterquelle für den Nematoden C. elegans wurde der Stamm E. coli OP50 verwendet, freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Caenorhabditis Genetic
Center (CGC), University of Minnesota, St. Paul, MN, USA. Als apathogener Referenzkeim in den C. elegans -Assays in Flüssigkultur wurde der E. coli -Stamm DH5α verwendet.
3.1.2. Kulturbedingungen
Alle Bakterienstämme wurden zunächst auf Columbia-Agar mit 5% Schafblut oder auf LB (Luria-Bertani)-Platten mit Antibiotikazusatz bei 37 °C angezüchtet.
Bakterienvorkulturen wurden angelegt, indem etwa 5 ml LB-Medium oder Vogel- Bonner-Medium (einfach oder Calcium-depletiert) mit Koloniematerial von 3 bis 5 Kolonien beimpft und bei 37 °C im Schüttelinkubator bebrütet wurden.
Versuchskulturen wurden angelegt, indem von der Bakteriensuspension aus den Vorkulturen so viel in Erlenmeyerkolben mit etwa 20 ml des entsprechenden Mediums überführt wurde, dass die Ausgangsdichte der Versuchskulturen bei 650 nm (OD650) 0,1 betrug. Je nach Fragestellung erfolgte eine Bebrütung im Schüttelinkubator bei 37 °C bis zu einer OD650 von 1,0 oder 0,5.
3.1.3. Bestimmung der Keimzahl
Die Bakterienzelldichte erfolgte durch die Messung der optischen Dichte von Flüssigkulturen bei 650 nm im Photometer. Die anschließende Keimzahlbestimmung pro ml Bakteriensuspension erfolgte anhand einer für die jeweilige Bakteriespezies angelegten Eichkurve. Als Leerwert wurde unbeimpftes Medium eingesetzt.
3.1.4. Kulturkonservierung
Von allen verwendeten Bakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen angelegt. Dazu wurde das Koloniematerial von über Nacht bewachsenen Agarplatten in 1 ml LB-Medium mit 10% Glycerin-Zusatz eingerieben. Diese Stammkulturen wurden bei – 70 °C konserviert und dienten als Ausgangsmaterial zur Anzucht der Stämme.
3.1.5. Charakterisierung der Motilität 3.1.5.1. Motilitätstest auf Swimming-Agar
Unter Swimming versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von Flagellen fortzubewegen. Die unterschiedlichen Morphotypen (WT, SCV und SCV mit pvrR-Vektor) wurden 24 bis 48 Stunden auf Columbia-Blutagar (WT, SCV), beziehungsweise LB-Agar mit Carbenicillin als Antibiotikazusatz (SCV mit pvrR- Vektor) bei 37 °C kultiviert. Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurde etwas Koloniematerial von der Agarplatte genommen und punktförmig auf die Oberfläche des Swimming-Agars (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,3% Bitek-Agar) gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Die Ausdehnung der einzelnen Stämme wurde durch die Messung des Durchmessers des Bakterienrasens nach 24 und 48 Stunden bestimmt.
3.1.5.2. Motilitätstest auf Twitching-Agar
Unter Twitching versteht man die Fähigkeit von Bakterien, sich mit Hilfe von Pili an Oberflächen vorwärts zu bewegen. Das Twitching-Vermögen der unterschiedlichen Morphotypen wurde auf 1%igem Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1% Bitek-Agar) getestet. Dabei erfolgte die Vorbereitung wie beim Swimming- Motilitätstest. Allerdings wurde beim Twitching-Test das Koloniematerial mit dem sterilen Zahnstocher durch den Agar auf die Platte inokuliert. Die Bebrütung erfolgte bei 37 °C. Hatten die Bakterien ein Twitching-Vermögen, konnte dies als kreisförmige Ausdehnung der Bakterien zwischen Agar und Boden der Petrischale festgestellt werden. Diese Ausdehnung wurde durch Messung des Durchmessers nach 24 und 48 Stunden quantifiziert.
3.1.6. Methoden zur Bestimmung von Typ III Sekretionssystem-Proteinen im Überstand von Bakteriensuspensionen
Zum Nachweis der aktiven Typ III Sekretion erfolgte eine Untersuchung der Bakteriensuspensionen, bzw. der zellfreien Überstände auf das Vorhandensein der einzelnen Effektor- und Translokatorproteine des Sekretionsapparats. Hierzu erfolgte zunächst die Auftrennung der bakteriellen Proteine durch eine Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-Page) und anschließend eine Sichtbarmachung der Banden entweder mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen ExoS und PcrV (J. Heesemann, Max von Pettenkofer-Institut, München).
3.1.6.1. Vorbereitung der Proben
Die Proben wurden aus Versuchskulturen, die in den Zytotoxizitäts-Assays eingesetzt werden sollten, entnommen. Von allen Bakteriensuspensionen wurde 1 ml bei einer OD650 von 1,0 entnommen. Diese Proben wurden auf ein Volumen von 50 µl konzentriert (SpeedVac Concentrator, Fa. Savant) und anschließend mit Probenpuffer (SDS; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 50% Glycerin, Bromphenolblau; β- Mercaptoethanol) versetzt und für 10 min aufgekocht. Anschließend waren die Proben einsatzbereit.
3.1.6.2. SDS-Page
Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit 12%igen Polyacrylamid-Gelen. Zunächst wurden die Lösungen für das Trenngel (30% Acrylamid; 1,5 M Tris-HCl pH 8,0; 10%
SDS; Aqua dest.; Temed und 10% Ammoniumpersulfat) in entsprechender Menge zusammenpipettiert und in die Gelkammer gefüllt. Um eine glatte Oberfläche zu erhalten, wurde das Trenngel mit Butanol überschichtet. Nach einer Polymerisationszeit von etwa 30 min wurde das Butanol abgespült, die Lösungen für das Sammelgel (30% Acrylamid; 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS; Aqua dest.;
Temed; 10% Ammoniumpersulfat) zusammenpipettiert und ebenfalls in die Gelkammer auf das Trenngel gegeben. In das Sammelgel wurde ein Kamm für die Geltaschen gesteckt. Nach einer erneuten Polymerisationszeit von etwa 30 min war das Gel einsatzbereit. Von den vorbereiteten Proben wurden jeweils 15 µl in die Geltaschen gefüllt, als Proteinstandard wurde der BENCHMARKTM Prestained Protein Ladder der Fa. GIBCO BRL verwendet. Die Gelelektrophorese erfolgte in der Gelkammer der Fa. Biometra zunächst bei 100 V. Nach dem Übertritt der Proben aus dem Sammelgel in das Trenngel wurde die Voltzahl auf 150 erhöht. Die Dauer der Elektrophorese betrug etwa 3 h. Nach der Elektrophorese erfolgte eine Sichtbarmachung der Banden mittels Silbernitrat-Färbung oder Western Blot.
3.1.6.3. Silbernitrat-Färbung
Die Färbung der SDS-Gele erfolgte nach einem Protokoll von HAUKESHAVEN u.
DAMIK von 1986. Zunächst wurden die Gele in einem Fixierer (Ethanol 30%, Essigsäure 10%, Aqua bidest.) für 15 min fixiert. Anschließend erfolgte für 15 min eine Inkubation in Lösung II (Ethanol 30%, Na-Acetat 0,5 M, Glutaraldehyd 0,5%, Na-Thiosulfat 0,2%, Aqua bidest.), dann wurde 3 mal für 10 min mit Aqua bidest.
gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation mit 0,1%iger Silbernitrat-Lösung, der Formaldehyd (0,01%) beigegeben war. Hierauf folgte eine Inkubation mit Na- Carbonat-Lösung (2,5%), dem ebenfalls Formaldehyd (0,01%) beigegeben wurde.
Die Proteinbanden wurden innerhalb von 5 bis 10 min sichtbar. Nach Erreichen der erwünschten Färbeintensität wurde der Prozess mit 0,05 M EDTA-Lösung abgestoppt.
3.1.6.4. Western Blot
Nach erfolgter Gelelektrophorese wurde das Gel zunächst in Blotpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, Aqua bidest.) aufgenommen. In die Blotkammer wurde zunächst ein Stück Filterpapier gelegt, das zuvor mit Blotpuffer angefeuchtet wurde. Dieses Filterpapier sollte an allen Seiten etwa 1 cm größer sein als das Gel. Auf dieses Filterpapier wurde ein, ebenfalls in Blotpuffer angefeuchtet, Streifen Nitrozellulose gelegt, dessen Größe der des Gels entsprach. Auf diese Nitrozellulose wurde das Gel gelegt und obenauf kam ein weiteres Stück in Blotpuffer angefeuchtetes Filterpapier. Danach wurde die Blotkammer geschlossen und der Blotvorgang gestartet. Geblottet wurde für 1,5 h bei 140 mA (für ein Gel mit 8,5 x 8,0 cm). Im Anschluss an den Blotvorgang wurde der Nitrozellulose-Streifen in 3%iger Magermilch für mindestens 1 h oder ÜN abgesättigt. Danach wurde der Nitrozellulose-Streifen mit Aqua bidest. abgespült und in 1%ige Magermilch überführt und die entsprechenden Primär-Antikörper (Kaninchen-Antikörper Anti-ExoS, Anti- PcrV) zugegeben. Dieser Ansatz wurde dann für 1,5 bis 2 h auf einem Schüttler (Vari-Mix, Fa. Thermolyne) inkubiert. Anschließend wurde der Nitrozellulose-Streifen erneut mit Aqua bidest. abgespült und dann in 1%ige Magermilch mit dem entsprechenden Sekundär-Antikörper (α-Rabbit-Peroxidase) gegeben. Nach einer
weiteren Inkubationszeit von 1 h erfolgte eine Chemolumineszenz-Entwicklung mit dem Lumi-Light Western Blotting Substrate der Fa. ROCHE BIOCHEMICALS. Dazu wurde der Nitrozellulose-Streifen zunächst 3 mal für 10 min mit TBS-T Puffer (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 500 µl Tween 20, ad 1000 ml Aqua bidest., pH 7,5) gewaschen, dann mit dem Substrat für 2 min inkubiert und anschließend in Folie eingeschweißt.
In der Dunkelkammer wurde ein Röntgenfilm für 2, 5 oder 10 s belichtet und anschließend im Röntgenfilm-Entwickler entwickelt.
3.2. Zellkultur
3.2.1. Zelllinie
Für die Infektionsversuche wurden Zellen der Makrophagenzelllinie J774.A1 (adhärente Maus-Monozyten-Makrophagen) verwendet, die von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) stammen. Diese Makrophagenzelllinie wurde 1968 aus einem Tumor einer weiblichen BALB/c Maus etabliert. Die Zellen synthetisieren Lysozym und Interleukin- 1 und besitzen Rezeptoren für Immunglobulin und Komplement. Gelagert wurden die Makrophagen in Tanks mit flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von –196 °C.
3.2.2. Anzucht der Zellen
Die Zellkulturen wurden in Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM; Fa. Biochrom AG) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) in Zellkulturflaschen bei einer Temperatur von 37 °C mit 5% CO2 im Brutschrank angezüchtet etwa 8 bis 10 Wochen in Kultur gehalten. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen in eine neue Zellkulturflasche überführt und mit frischem Nährmedium versetzt. Nach 8 bis 10 Wochen wurde die Kultur aufgegeben und eine frische Kultur von den im Stickstofftank gelagerten Zellen angesetzt. Für die Infektionsversuche wurden die Makrophagen in Zellkulturplatten (24 wells) 24 Stunden vor Versuchsbeginn ausgesät.
3.2.3. Einfrieren und Auftauen der Zellen
Frische Zellen von der DSMZ wurden nach 3 bis 4 Tagen in Kultur zur Konservierung eingefroren. Hierzu wurden die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen gelöst (siehe 3.3.4.), in ein Falcon-Röhrchen überführt und anschließend 10 min bei 150 g (1000 rpm in einer Minifuge 2, Heraeus) zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde abgenommen, das Zellpellet tröpfchenweise in Einfriermedium (DMEM mit 10%
Dimethylsulfoxid, DMSO) aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. In Einfriergefäße (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurde jeweils 1 ml der Zellsuspension pipettiert. Die Einfriergefäße mit der Zellsuspension wurde anschließend zunächst
