Analyse der humoralen und zellulären Abstossung bei Xenotransplantation im diskordanten Kleintiermodell: eine tierexperimentelle Studie

Aus dem Zentrum Chirurgie

Klinik für Allgemein- Viszeral- und Transplantationschirurgie

der

Medizinischen Hochschule Hannover

Analyse der humoralen und zellulären Abstossung bei Xenotransplantation im diskordanten Kleintiermodell

- Eine tierexperimentelle Studie -

Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

in der

Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Sebastian Wyszomirski

aus

Ząbkowice Sląskie

Hannover, 2007

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 06.11.2007

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Professor Dr. med. Axel Haverich /

Referent: Professor Dr. med. Thomas Buhr

Korreferent: Professor Dr. med. Michael Winkler

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2007

Promotionsausschussmitglieder: Professor Dr. Hermann Haller Professor Dr. Klaus Otto Professor Dr. Christoph Klein

MEINEN ELTERN

gewidmet

INHALTSVERZEICHNIS:

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... V TABELLENVERZEICHNIS ... V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...VI

1 EINLEITUNG ... 1

1.1. GRUNDLAGEN DER TRANSPLANTATABSTOSSUNG... 2

1.1.1. HYPERAKUTE ABSTOSSUNG... 2

1.1.1.1 REDUKTION DER XENOREAKTIVEN ANTIKÖRPER... 3

1.1.1.2 KOMPLEMENTINHIBIERUNG... 3

1.1.2 AKUTE ABSTOSSUNG... 4

1.1.2.1 MONOZYTEN /MAKROPHAGEN... 4

1.1.2.2 NATÜRLICHE KILLERZELLEN... 5

1.1.3 CHRONISCHE ABSTOSSUNG... 5

1.1.3.1 T-ZELL VERMITTELTE ABSTOSSUNG... 6

1.2 PHYSIOLOGISCHE BARRIEREN... 6

1.3 TOLERANZ... 7

1.4 VERWENDETE IMMUNSUPPRESSIVA... 8

1.4.1 CYCLOSPORIN A... 8

1.4.2 LEFLUNOMID... 8

1.4.3 COBRA VENOM FAKTOR... 9

1.4.4 ANTIKÖRPER ZUR NK-ZELL-DEPLETION... 9

1.5 ZIEL DER ARBEIT... 10

2 METHODIK ... 11

2.1 HETEROTOPE HERZTRANSPLANTATION VOM MEERSCHWEINCHEN AUF DIE RATTE11 2.1.1 VERSUCHSTIERE UND HALTUNGSBEDINGUNGEN... 11

2.1.2 INSTRUMENTARIUM UND OPERATIONSHILFSMITTEL... 12

2.1.3 OPERATIVE UND NICHTOPERATIVE EINGRIFFE AN DEN KLEINTIEREN... 13

2.1.3.1 HETEROTOPE TRANSPLANTATION DES HERZENS... 13

2.1.3.1.1 ORGANENTNAHME BEIM MEERSCHWEINCHEN... 13

2.1.3.1.2 ABDOMINELLE HERZTRANSPLANTATION... 14

2.1.3.2 ÜBERWACHUNG DER TRANSPLANTATFUNKTION... 15

2.1.3.3 ORGANENTNAHME NACH ABSTOSSUNG... 15

2.1.3.4 INTRAPORTALE INJEKTION VON MEERSCHWEINCHEN-LEBERZELLEN... 15

2.1.3.4.1 PRÄPARATION DER MEERSCHEINCHEN-LEBERZELLEN FÜR DIE INTRAPORTALE INJEKTION... 16

2.1.3.5 BLUTENTNAHME... 16

2.2 IMMUNSUPPRESSION... 17

2.2.1 INHIBITION DES KOMPLEMENTSYSTEMS... 17

2.2.2 B-ZELLSUPPRESSION... 17

2.2.3 T-ZELLSUPPRESSION... 18

2.2.4 INHIBITION DER NK-ZELLEN... 18

2.2.5 ADSORPTION DER PRÄFORMIERTEN XENOREAKTIVEN ANTIKÖRPER... 18

2.3 TIERVERSUCHSGRUPPEN... 19

2.3.1 GRUPPE A(UNBEHANDELTE EMPFÄNGER) ... 19

2.3.2 GRUPPE B(KOMPLEMENTINHIBIERTE EMPFÄNGER)... 20

2.3.3 GRUPPE C(B-ZELL-SUPPRESSION OHNE KOMPLEMENTINHIBITION) ... 20

2.3.4 GRUPPE D(B-ZELL-SUPPRESSION MIT KOMPLEMENTHINHIBITION)... 20

2.3.5 GRUPPE E(B-ZELL-SUPPRESSION MIT NK-ZELL DEPLETION UND KOMPLEMENTINHIBITION)... 21

2.3.6 GRUPPE BB(KOMPLEMENTDEFIZIENTE EMPFÄNGER) ... 21

2.3.7 GRUPPE DD(B-ZELL-SUPPRESSION BEI KOMPLEMENTDEFEKT) ... 22

2.3.8 GRUPPE EE(VERSTÄRKTE B-ZELL-SUPPRESSION MIT T-ZELL-SUPPRESSION,NK- ZELL DEPLETION UND KOMPLEMENTDEFEKT) ... 22

2.3.9 GRUPPE EEE(B-ZELL-SUPPRESSION MIT T-ZELL-SUPPRESSION,NK-ZELL DEPLETION,KOMPLEMENTDEFEKT UND KOMPLEMENTINHIBITION)... 23

2.3.10 GRUPPE BBB(KOMPLEMENTINHIBIERT, KEINE TRANSPLANTATION)... 23

2.3.11 GRUPPE DDD(B-ZELL-SUPPRESSION MIT KOMPLEMENTINHIBITION, KEINE TRANSPLANTATION)... 24

2.4 SEROLOGISCHE NACHWEISMETHODEN... 26

2.4.1 NACHWEIS VON NATÜRLICHEN, XENOREAKTIVEN ANTIKÖRPERN... 26

2.5 HISTOLOGISCHE ANALYSEN... 26

2.5.1 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG (HE-FÄRBUNG)... 27

2.5.2 IMMUNHISTOLOGISCHE FÄRBUNGEN... 27

2.5.2.1 ANTIKÖRPER BEI DER IMMUNHISTOLOGIE... 27

2.6 STATISTIK... 29

3. ERGEBNISSE ... 30

3.1 TRANSPLANTATÜBERLEBENSZEITEN UND HISTOLOGISCHE ERGEBNISSE... 30

3.1.1 UNBEHANDELTE EMPFÄNGER (GRUPPE A)... 30

3.1.2 KOMPLEMENTINHIBIERTE EMPFÄNGER (GRUPPE B) ... 30

3.1.3 KOMPLEMENTDEFIZIENTE EMPFÄNGER (GRUPPE BB) ... 32

3.1.4 B-ZELL-SUPPRESSION OHNE KOMPLEMENTINHIBITION (GRUPPE C) ... 32

3.1.5 B-ZELL-SUPPRESSION MIT KOMPLEMENTINHIBITION (GRUPPE D) ... 33

3.1.6 B-ZELL-SUPPRESSION BEI KOMPLEMENTDEFEKT (GRUPPE DD) ... 33

3.1.7 B-ZELL-SUPPRESSION MIT T-ZELL-SUPPRESSION,NK-ZELL DEPLETION UND KOMPLEMENTINHIBITION (GRUPPE E)... 34

3.1.8 VERSTÄRKTE B-ZELL-SUPPRESSION MIT T-ZELL-SUPPRESSION,NK-ZELL DEPLETION UND KOMPLEMENTDEFEKT (GRUPPE EE) ... 34

3.1.9 B-ZELL-SUPPRESSION MIT T-ZELL-SUPPRESSION,NK-ZELL DEPLETION, KOMPLEMENTDEFEKT UND KOMPLEMENTINHIBITION (GRUPPE EEE)... 35

3.2 ERGEBNISSE DER SEROLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN... 37

3.2.1 ZUSÄTZLICHE SEROLOGIEN BEI DEN GRUPPEN E,EE UND EEE ... 37

3.2.2 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN BEI DEN GRUPPEN BBB UND DDD NACH IMMUNSUPPRESSIVER THERAPIE UND LEBERZELLINFUSION... 38

4. DISKUSSION ... 40

ZUSAMMENFASSUNG ... 49

DANKSAGUNG... 52

LITERATURVERZEICHNIS ... 53

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Gruppe EEE: HE Färbung 100 fach... 35

Abbildung 2: Gruppe EEE: ED1 (Makrophagenfärbung) 100 fach... 36

Abbildung 3: Gruppe EEE: NK3.2.3 (NK-Zell Färbung) 100 fach ... 36

Abbildung 4: Titerverläufe von IgM bei den Gruppen E, EE und EEE... 37

Abbildung 5: Antikörperspiegel bei den Gruppen BBB und DDD vor/nach LZI ... 38

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2: Antikörper für die Immunhistologie ... 28

Tabelle 3: Tierversuchsgruppen, Behandlungsschemata und Ergebnisse... 31

Abkürzungsverzeichnis

ACD Acid-Citrat-Dextrose

ASGM1 Asialogangliosidose (Glycopeptid auf NK-Zelloberfläche) B7 Rezeptor auf Antigenpräsentierender Zelle

C2BB/R+ Meerschweinchenstamm, eigene Zucht Zentrales Tierlabor der MHH C3 / C4 / C5 / C12 Komplementfaktor C3 / C4 / C5 / C12

CD Cluster Destignation

Crl:HA Meerschweinchenstamm, von Charles River Laboratories)

CsA Cyclosporin A

CVF Cobra Venom Faktor

DAB-H2O2 Diaminobenzidine Perhydrol

DXR delayed xenograft rejection (verzögerte Xenotransplantatabstossung) ELISA Enzyme-linked immunosorbent Assay

HAR hyperacute xenograft rejection (hyperakute Abstossung) HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

IgG Immunglobulin der Klasse G

IgM Immunglobulin der Klasse M

kD kilo Dalton

Lef Leflunomid

LEW Lewis-Ratten

mAB monoklonale Antikörper

MHC major histocompatibility complex (Genkomplex in Centromer-Nähe auf Chromosom 6)

mRNA Messenger-Ribonucleinacid (Boten-Ribonucleinsäure) NKR-P1-Antigen Spezifisches Antigen der NK-Zellen

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

PBS phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) PVG/C6def Rattenstamm mit autosomal-rezessivem Erbgang, dem die

Fähigkeit zur Aktivierung des C5b-9-Membranangriff-Komplexes fehlt

SPX Splenektomie

TNFα Tumornekrosefaktor alpha

T-Zellen thymusabhängige Lymphozyten (T-Lymphozyten) X-HTX auxiliäre diskordante Herztransplantation

XNA xenoreaktive natürliche Antikörper

Einleitung

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1 Einleitung

Die Xenotransplantation ist die Transplantation von Organen, Geweben oder Zellen zwischen verschiedenen Arten. Auch die Transplantation, Implantation oder Infusion menschlicher Körperflüssigkeiten, Zellen, Gewebe oder Organe, die ex vivo in Kontakt mit lebenden tierischen Zellen, Geweben oder Organen gekommen sind, wird als Xenotransplantation bezeichnet (1).

Die großen Primaten, wie z. B. Schimpansen, wären aufgrund von ähnlichen physiologischen und morphologischen Charakteristika geeignete Organspender für den Menschen. Die zunehmende Gefährdung dieser Tierarten spricht dagegen. Sowohl aus tier-, artenschutzrechtlichen und ethischen Gründen wird zurzeit das Schwein als Organspender für den Menschen favorisiert. Die Schweinehaltung für den menschlichen Verzehr findet in vielen Kulturen Akzeptanz. Die Schweineaufzucht in Gefangenschaft ist erprobt und die hohe Reproduktionsrate könnte eine ausreichende Versorgung mit Organen gewährleisten.

Das für diese Versuche gewählte Meerschweinchen/Ratte Modell ist eine diskordante Spezieskombination. Vergleichbar mit einer möglichen Kombination Schwein/Mensch liegen hier bereits präformierte xenoreaktive IgM Antikörper vor. Umfangreiche Studien mit statistisch verlässlichen Zahlenwerten lassen sich im Gegensatz zu Großtiermodellen wie Schwein/Affe in der gewählten Kombination Meerschweinchen/Ratte besser realisieren.

Im Folgenden soll auf die Transplantation primär vaskularisierter Organe eingegangen werden, d.h. die artfremden Organe, wie Herz, Niere, Leber oder Lunge, werden bei der Transplantation direkt an die Blutgefäße des Empfängers angeschlossen, um ihre Funktion aufzunehmen. Im Gegensatz dazu stehen sekundär vaskularisierte Xenotransplantate, wie artfremde Inselzellen oder Haut, die erst im Laufe der Zeit Anschluss an die Blutbahn des Empfängers finden und dementsprechend andere Abstossungsreaktionen hervorrufen.

Diese Dissertation wurde im Rahmen des SFB 265 an der Medizinischen Hochschule Hannover, unter der Leitung von Prof. Dr. Manns „Immunreaktionen und Pathomechanismen bei Organtransplantationen“, Teilprojekt B16, Leiter Prof. Dr. Dr. Nagel, Prof. Dr. Köhl, Dr.

A. Meyer zu Vilsendorf „Untersuchung der funktionellen Kompatibilität von Serumproteinen

Einleitung

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nach orthotoper Lebertransplantation im xenogenen Tiermodell: Auswirkungen der Komplementkonversion auf Transplantat und Empfänger“, und anschliessend „Analyse humoraler und zellulärer Effektorsysteme bei der Xenotransplantation im diskordanten Kleintiermodell Meerschweinchen/Ratte“ angefertigt. Das Forschungsprojekt wurde von 1997 bis 2003 von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Immunsuppression für die diskordante Xenotransplantation evaluiert werden. Ein verwandtes immunsuppressives Regime wurde zuvor lediglich im konkordanten Modell: Hamster-Ratte beschrieben. Die Unterscheide im diskordanten Modell sollen untersucht und die Therapie erweitert werden.

1.1. Grundlagen der Transplantatabstossung

Zelluläre und humorale Faktoren vermitteln die Transplantatabstossung in vivo. Die Einteilung der Abstossungsreaktionen ist primär klinisch ausgerichtet. Sie basiert auf dem zeitlichen Verlauf, ohne dabei immunologische Mechanismen zu berücksichtigen. Man unterscheidet hyperakute, akute und chronische Abstossung (2,3). Bei der Xenotransplantation erfolgt die Einteilung chronologisch.

1.1.1. Hyperakute Abstossung

Die hyperakute Abstossung entspricht einer gegen das Gefäßsystem des Transplantats gerichteten humoralen Reaktion. An der hyperakuten Abstossung bei der Xenotransplantation sind präformierte xenoreaktive Antikörper, das Komplementsystem und neutrophile Granulozyten beteiligt. Präformierte Antikörper binden sich an das Gefäßendothel, wodurch die Komplement- und die Gerinnungskaskade aktiviert werden. In der Folge kommt es zu einem Influx von Granulozyten und zu einer intravasalen Gerinnung. Stauung, Ödem und interstitielle Blutung sind die Folge. Innerhalb von Minuten bis Stunden münden die Prozesse in Zelltod und Transplantatverlust (4). Bei der Allotransplantation lässt sich die hyperakute Abstossung unter anderem durch Blutgruppenmatching umgehen. Die vorhandenen präformierten xenoreaktiven Antikörper machen eine Vorbehandlung des Empfängers bei der

Einleitung

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Xenotransplantation unumgänglich. Zur Überwindung der hyperakuten Abstossung sind Reduktion/Depletion der xenoreaktiven Antikörper sowie eine Komplementinhibierung notwendig.

1.1.1.1 Reduktion der Xenoreaktiven Antikörper

Leflunomid ist ein Prodrug, das im tierischen und menschlichen Organismus in den aktiven Metaboliten A77 1726 umgewandelt wird. Dieser bewirkt unter anderem eine direkte Inhibition der B-Zell-Proliferation und Antikörper-Synthese (5). Dadurch kann die Konzentration der präformierten Xenoreaktiven Antikörper gesenkt werden (6,7). In Kombination mit dem Komplementinhibitor Cobra Venom Faktor wurde durch Leflunomid eine Erhöhung der Funktionszeit eines heterotop in Ratten transplantierten MS-Herzens auf 129 Stunden erzielt. Die alleinige Gabe von Cobra Venom Faktor hingegen bewirkte ein Transplantatüberleben von 62 Stunden (8).

1.1.1.2 Komplementinhibierung

Zur Inhibition des Komplementsystems bei der Xenontransplantation von MS auf Ratte wurde Cobra Venom Faktor (CVF) eingesetzt (9).

Als zweiter Weg - Vermeidung der HAR durch Aktivierung des Komplementsystems - wurde eine defiziente Empfängerspezies verwendet. Ein C6-defizienter Rattenstamm (PVG/C6def) wurde als Empfänger eingesetzt. Diesem Rattenstamm mit autosomal rezessivem Erbgang fehlt die Fähigkeit zur Bildung des C5b-9 MAC Komplexes (10). Die C6 Defizienz beruht möglicherweise auf einer instabilen mRNA, einer Punktmutation im C6-Gen und damit einer aberranten Transkription oder auf einer Mutation in einem Gen, das für ein in die C6- Biosynthese involviertes Produkt kodiert. Die PVG/C6def Ratten zeigen trotz C6-Defizienz und nur 10% C2 gegenüber Komplement-kompetenten Tieren (PVG/C6+) keine Krankheitsanzeichen. Werden die PVG/C6def Ratten mit Defekt in der terminalen Endstrecke des Komplementsystems als Empfänger eines heterotop transplantierten MS-Herzens

Einleitung

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eingesetzt, so verlängert sich das Transplantatüberleben von 26 Minuten (komplementkompetenter PVG-Stamm) auf 24 bis 48 Stunden (11).

Ein weiterer Ansatz zur Verhinderung einer HAR durch Komplementaktivierung, der in der vorliegenden Arbeit aber nicht verfolgt wurde, ist die Expression der Komplementregulatoren des Empfängers auf dem Transplantat. Gerade bei der Kombination Schwein/Mensch wurde gezeigt dass Schweine gezüchtet werden können, die humane Komplementregulatorproteine exprimieren (12,13,14). Mittlerweile haben mehrere Arbeitsgruppen verschiedene humane Komplementregulatoren in transgenen Schweinen exprimieren können (15,16,17).

1.1.2 Akute Abstossung

Die akute Abstossung ist die Hauptursache für den frühen Transplantatverlust bei der Allotransplantation. Sie ist definiert als eine früh nach der Transplantation auftretende, rasch verlaufende Transplantatdysfunktion immunologischer, T-Zell-unabhängiger Genese. Dabei liegt oft eine Diskrepanz zwischen zellulärem Infiltrationsmuster und klinischem Verlauf vor.

Bei Herztransplantaten liegen die Infiltrate perivaskulär und endokardial. Diese akute vaskuläre Abstossung wird auch als verzögerte Xenotransplantatabstossung (DXR) bezeichnet. Sie ist gekennzeichnet durch die Aktivierung mononukleärer Zellen des Empfängers (fortschreitende Infiltration des Transplantates mit Monozyten, Makrophagen und Natürlichen Killerzellen). Blutplättchen-Aggregation und Fibrinablagerungen wie auch die Aktivierung von Endothelzellen des Transplantates sind weitere Merkmale (18).

Pathologisch ist der Prozess durch Endothelzellschädigung und Schwellung, Ischämie und Thrombose gekennzeichnet.

1.1.2.1 Monozyten / Makrophagen

Nach Einwanderung von Monozyten in das Gewebe wandeln sich diese in Makrophagen um.

Makrophagen haben auf der Oberfläche Rezeptoren für den Fc-Teil von Immunoglobinen.

Diese vermitteln die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität der markierten Zelle.

Einleitung

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Die Komplementrezeptoren für C3b und C4d, die die Makrophagen auf der Oberfläche tragen, stimulieren die Phagozytose. Daneben besitzen sie auch Rezeptoren für verschiedene Bestandteile von Mikroorganismen, wie Mannoserezeptoren, Scavenger Rezeptoren und Rezeptoren für Lipopolysaccharide.

Nach der Phagozytose werden Fremdpeptide auf den MHC-II-Molekülen des Makrophagen präsentiert. Bei gleichzeitiger Expression von Kostimulatoren, wie B7, kommt es zur Proliferation und Differenzierung von T-Zellen. Aktivierte Makrophagen setzen proinflammatorische Zytokine, wie TNF α und IL12 frei (19).

1.1.2.2 Natürliche Killerzellen

Mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers 3.2.3, der das NKR-P1-Antigen auf NK-Zellen erkennt, wurde nachgewiesen, dass Ratten NK-Zellen während der DXR Meerscheinchentransplantate in großer Anzahl infiltrieren (20,21). Allerdings wurden bei der DXR immer gleichzeitig NK-Infiltration und Ablagerungen von xenoreaktiven Antikörpern, auch bei vorheriger Depletion der xenoreaktiven Antikörper, im Transplantat festgestellt.

Unklar war, ob die Zytotoxizität der NK-Zellen entweder durch direkte Mechanismen und/oder die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität bedingt ist (22,23). Es wurde sowohl eine direkte als auch eine antikörperabhängige NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität beschrieben, die in der Lyse der xenogenen Zellen resultiert (24). In der konkordanten Kombination Hamster/Nacktratte wurde bestätigt, dass die NK-Zellen zusätzlich zur antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität eine Abstossung auch durch direkte Zytotoxizität verursachen (25). NK-Zellen wurden mit dem Kaninchen anti-asialo GM1 (Wako, Neuss) Antikörper depletiert. Zur Wirkung des Antikörpers muss Komplement vorhanden sein.

1.1.3 Chronische Abstossung

Die chronische Abstossung ist definiert als graduell progrediente Einschränkung der Transplantatfunktion in Abwesenheit anderer spezifischer Erkrankungen, die in der Regel

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nicht vor dem 6. bis 12. Monat nach Transplantation auftritt. Sie zeigt sowohl humorale als auch zelluläre Bestandteile und geht mit chronisch entzündlichen Veränderungen an den Gefäßen und im Interstitium einher. Es kommt zu einer myointimalen Proliferation der Arterien und Arteriolen im Sinne einer Transplantatvaskulopathie mit schließlich signifikanter Lumeneinengung. Histologisch findet man eine relativ milde monoklonale Zellinfiltration mit Sklerosierung des Gewebes. Bei der Allotransplantation ist die chronische Abstossung die häufigste Indikation zur Retransplantation. Sie äußert sich bei Herztransplantierten in Leistungsabfall, subfebrilen Temperaturen, leichtem RR-Abfall, Herzschattenvergrößerung im Röntgen-Thorax, eingeschränkter Ventrikelfunktion im Herzecho, Auftreten von Herzrhythmusstörungen und in zumeist stumm verlaufenden Myokardinfarkten. Da den T- Zell-vermittelten Reaktionen eine Schlüsselrolle zugeschrieben wird, muß bei der Xenotransplantation mit einer chronischen Abstossung gerechnet werden, die mit Sicherheit ausgeprägter, häufiger und ggf. auch früher eintritt als bei der Allotransplantation (26).

1.1.3.1 T-Zell vermittelte Abstossung

Ein bekanntes Phänomen bei der Allotransplantation ist die Erkennung der Transplantatantigene durch T-Zellen. Die Rolle der T-Zell vermittelten Abstossung wird derzeit diskutiert. Aufgrund der limitierten Transplantatüberlebenszeiten und einem massiven Einsatz immunsuppressiver Medikamente ist die Rolle der T-Zell-vermittelten Abstossung nur schwer zu klären. Die Interaktionen der T-Zellen mit den xenogenen Antigenen sind abhängig von der Spezieskombination. In der potentiell relevanten Kombination Schwein/Primat fällt die zelluläre Antwort stärker als bei der Allotransplantation aus. In vitro Studien zeigen, dass porcine Antigene von menschlichen T-Lymphozyten erkannt werden und zur Proliferation und Zytotoxizität führen (27,28,29).

1.2 Physiologische Barrieren

Die physiologische Kompatibilität ist neben der immunologischen eine wichtige Vorraussetzung für das Gelingen der Xenotransplantation. Die pysiologische Kompatibilität

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von Schweineherzen ist nach ersten Untersuchungen (30) anscheinend gegeben. Schweine haben bei einem ähnlichen Gewicht wie Menschen ein Herz mit vergleichbarem Gewicht und Größe. Auch die kardiovaskulären Parameter scheinen vergleichbar zu sein (31).

Darüber hinaus ist noch die Frage nach der molekularen Kompatibilität offen. Besonders bei der Xenotransplantation der Leber ist diese Frage von zentraler Bedeutung. Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan des Körpers und Syntheseort vieler Mediatoren. Es stellt sich die Frage nach der molekularen Kompatibilität der von dem Xenotransplantat gebildeten Stoffwechselprodukte mit den entsprechenden Rezeptoren im Empfängerorganismus.

1.3 Toleranz

Eine chronische immunsuppressive Therapie würde überflüssig werden, und somit wären die Nebenwirkungen der Immunsuppression eliminiert, wenn eine Toleranz erreicht werden könnte. Um eine Toleranz zu erreichen, gibt es zwei Möglichkeiten. Zum einen, die Spenderorgane dem Empfänger mit molekulargenetischen Maßnahmen so sehr anzupassen, dass sie nicht mehr abgestossen werden, zum anderen, durch geeignete Maßnahmen eine Toleranz beim Empfänger zu induzieren. Da dies aber selbst bei der Allotransplantation noch nicht möglich ist, ist auch abzusehen, dass es bei der Xenotransplantation große Schwierigkeiten bereiten wird. Zur Zeit werden die Ansätze zur Erzeugung von B- und T- Zell-Toleranz durch xenogene Thymustransplantation und durch einen Zustand des gemischten Blutstammzell-chimärismus nach Knochenmarkstransplantation untersucht (32,33,34). Im konkordanten Tiermodell Hamster/Ratte konnte eine B-Zell- und NK-Zell- Toleranz erreicht werden (35).

Einleitung

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1.4 Verwendete Immunsuppressiva

1.4.1 Cyclosporin A

Cyclosporin A ist ein cyclisches Undecapeptid, welches schon seit über 25 Jahren bekannt ist.

Das zur T-Zell-Suppression verabreichte Cyclosporin A (CsA) ist ein Pilzmetabolit aus Tolypocladium inflatum Gams und bewirkt eine selektive Inhibition der T-Zellen, insbesondere der T-Helfer-Zellen, ohne jedoch eine Myelosuppression hervorzurufen (36).

CsA wird in die Zielzelle aufgenommen, an ein zytoplasmatisches Protein (Cyclophilin) gebunden und in den Zellkern transportiert. Hier findet eine Hemmung der Produktion von Interleukinen auf Transkriptionsebene statt. Zielzellen sind besonders jene der T-Zell- vermittelten, zellulären Immunantwort (37,38).Cyclosporin wird mit sehr großem Erfolg verwendet, um Abstossungsreaktionen nach Organtransplantationen zu verhindern. Es wurde eine Toleranzinduktion über MHC-Grenzen hinweg ebenso wie eine wirksame Unterdrückung der graft versus host disease für diese Substanz bewiesen (39,40,41). Neben dem Cyclosporin A gibt es weitere Vertreter, wie Cyclosporin B, -C und -D; diese Verbindungen weisen verschiedene Strukturvariationen auf.

1.4.2 Leflunomid

Die immunsuppressive Wirkung des Isoxazol-Derivates Leflunomid (N-(4’- trifluoromethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid) wurde in den frühen 80er Jahren zuerst beschrieben. Es hatte die Fähigkeit, die Entwicklung von Arthritis in Ratten zu inhibieren (42). In vivo wird Leflunomid in den Metaboliten A77 1726 konvertiert. A77 1726 hat zwei biochemische Aktivitäten. Zum einen die Inhibition der Protein-Tyrosin-Kinasen und der Dihydroorotat-Dehydrogenase. Die Dihydroorotat-Dehydrogenase ist als Schlüsselenzym bei der de novo Synthese von Pyrimidin Nukleotiden beteiligt (43,44,45).

Pyrimidin Nukleotide wiederum werden für Zellfunktionen benötigt, wie zur Synthese von RNA, DNA, Glykoproteinen und Phospholipiden. Die Behandlung mit Leflunomid führt unter anderem zur direkten Inhibition der B-Zell-Proliferation und Antikörper-Synthese (5).

Einleitung

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Daneben inhibiert Leflunomid auch Funktionen von T-Zellen und Makrophagen (46).

Leflunomid wurde erfolgreich in der Allotransplantation (47) und auch in der Xenotransplantation zur Verlängerung des Transplantatüberlebens eingesetzt. Neben der Hemmung der T-Zell-unabhängigen Bildung von XNA des IgM-Isotyps durch Reduktion der CD5+ B-Lymphozyten (48) blockiert Leflunomid zudem die Induktion solcher Antikörper durch Inhibition der Expression induzierbarer Xenoantigene wie E- und P-Selektin (35).

Aufgrund der langen in vivo Halbwertszeit von Leflunomid scheint sein Einsatz in der Organtransplantation limitiert. Die strukturanalogen Malononitrilamide könnten insbesondere unter diesem Gesichtspunkt besser geeignet sein (49).

1.4.3 Cobra Venom Faktor

Cobra Venom Faktor (CVF), ein etwa 140 kD schweres Glycoprotein, ist ein Bestandteil des Schlangengiftes der Königskobra (Naja naja kouthia). Bereits 1903 wurde die antikomplementäre Wirkung von CVF beschrieben (50). Durch Abbau von C3 führt CVF zur Ausschaltung der nachfolgenden Komplementkaskade (51). Der hochaufgereinigte CVF funktioniert wie C3b, das die Ketten von C3 und C5 spaltet und die Anaphylotoxine C3a und C5a freisetzt. Der wichtigste Unterschied zu C3b ist der wesentlich langsamere Abbau (52) und die Resistenz gegenüber der Inaktivierung durch Regulatorproteine (53).

CVF hat auch einige Nachteile. So muss die Dosierung immer ausreichend hoch sein, denn auch nur kleine funktionelle Komplement-Konzentrationen können eine hyperakute Abstossung induzieren. Die gebildeten Anaphylatoxine wie C3a und C5a können ihrerseits Veränderungen in der Lunge hervorrufen (54) oder auch an den morphologischen Veränderungen des Transplantats durch Erhöhung der Zellinfiltrate beteiligt sein (55).

1.4.4 Antikörper zur NK-Zell-Depletion

NK-Zellen können tierexperimentell gezielt depletiert werden. Auf der NK-Zelloberfläche findet man in hoher Konzentration ein neutrales Glykolipid, das Ganglio-N-tetraosylceramid (ASGM1) (56,57), das in geringerer Konzentration auch auf anderen Zellen, wie Monozyten,

Einleitung

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polymorphkernigen Leukozyten und T-Zellen exprimiert wird (58). Ein gegen dieses Antigen gerichtetes Antiserum (Anti-ASGM1) eliminiert die NK-Zell-Aktivität selektiv in vitro (58,59) und in vivo (60,61). Die Aktivität von Makrophagen (62) und die von zytotoxischen T-Zellen (57,56,59,63) hingegen bleibt unbeeinflusst. Zur Wirkung des Antikörpers muss Komplement vorhanden sein. NK-Zellen wurden mit dem Kaninchen anti-asialo GM1 (Wako, Neuss) Antikörper depletiert.

1.5 Ziel der Arbeit

Die Möglichkeiten einer zellulären und humoralen Immunsuppression sollten in der Vorliegenden Arbeit im Hinblick auf die Anwendung bei diskordanter Xenotransplantation evaluiert werden. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Hemmung der humoralen Abwehrreaktion und auf die Hemmung des Komplementsystems gelegt.

Nach Überwindung der HAR unterliegt das Xenotransplantat einer verzögerten Abstossung, während der es unter anderem zur Infiltration mit Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen kommt. Im konkordanten Hamster/Ratte Modell wurde bereits durch die Kombination von B-Zellsuppression, Infusion von Donor-Antigen sowie Depletion der NK- Zellen in T-Zell-defizienten Empfängern ein Transplantatüberleben von mehr als 60 Tagen erzielt (64). In Anlehnung daran sollte überprüft werden, ob durch den gezielten Einsatz immunsuppressiver Medikamente wie Leflunomid und Cyclosporin A kombiniert mit Applikation von Donor-Antigen und NK-Zell-Depletion eine Verlängerung des Transplantatüberlebens auch in der diskordanten Spezieskombination MS/Ratte erzielt werden kann. In histologischen Untersuchungen sollte überprüft werden, welche Auswirkungen die angewandten Therapieschemata auf die zellulären und vaskulären Abstossungsreaktionen haben.

Methodik

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2 Methodik

Diskordante Xenotransplantationen des Herzens wurden am Tiermodell von Meerschweinchen auf die Ratte ausgeführt. Dabei wurden auxiliäre abdominelle Herztransplantationen durchgeführt. Organbiopsien wurden histologisch aufgearbeitet, um eine Aussage über die Schädigungsmechanismen und die Auswirkungen der angewandten Schemata auf die Transplantatabstossung zu ermöglichen. Ebenfalls wurden serologisch Titerverläufe von Antikörpern und Komplementfaktoren untersucht.

2.1 Heterotope Herztransplantation vom Meerschweinchen auf die Ratte

2.1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen

Die Versuche wurden an 3-4 Monate alten männlichen Inzuchtratten mit einem Gewicht von 250 bis 350 g durchgeführt. Es wurden Lewis Ratten des Stammes LEW/ Ztm (in der Folge mit LEW bezeichnet) als Organempfänger verwendet, diese wurden aus der Aufzucht vom Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover bezogen. Zusätzlich wurden PVG Ratten, ein Rattenstamm mit autosomal-rezessivem Erbgang, dem die Fähigkeit zur Aktivierung des C5b-9-Membranangriff-Komplexes fehlt, (PVG/C6def Ratten), für die Tierexperimente als Organempfänger eingesetzt. Diese Ratten wurden im Zentralen Tierlabor der MHH gezüchtet, nachdem die ersten Zuchtpaare von M. Daha, Universität Leiden, zur Verfügung gestellt wurden.

Die Tiere wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen in Gruppen bis zu 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ III auf staubfreiem Weichholzgranulat bei einer durchschnittlichen Raumtemperatur von 22°C, 55% Luftfeuchtigkeit und einem 12 h Helldunkel Rhythmus in den zentralen Tierlaboratorien der MHH gehalten. Die Tiere erhielten über die gesamte Versuchsdauer, prä- und postoperativ, pelletiertes, autoklaviertes Haltungsfutter für Ratten/

Mäuse der Firma Altromin (Lage) sowie steriles Leitungswasser aus Tränkflaschen ad libidum.

Methodik

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Als Organspender wurden Dunkin Hartley Meerschweinchen (Stamm Crl:HA) von Charles River Laboratories (Sulzfed) mit einem Gewicht von 300 bis 400 g für die Transplantation eingesetzt. C2BB/R+ Meerschweinchen aus der Zucht des zentralen Tierlabors der MHH mit Gewichten zwischen 400 und 600 g wurden für den Zytotoxititätstest und für die Präparation von Membranextrakten zum Nachweis von XNA verwendet. Die Meerschweinchen wurden in Gruppen mit bis zu 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ IV gehalten. Diese Tiere erhielten ein pelletiertes, autoklaviertes V-Alleinfutter für Meerschweinchen-Zucht der Firma Ssniff Spezialitäten GmbH (Soest) sowie Wasser ad libidum. Als Nahrungsergänzung bekamen sie autoklaviertes Heu.

Das Tierversuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Hannover unter den Nummen TS 97/970 und 02/555 genehmigt. Eine Ausnahmegenehmigung für die Durchführung der Tierexperimente wurde mir am 21.09.1999 für die Zeit vom 24.09.1999 bis 23.09.2004 von der Bezirksregierung Hannover erteilt.

2.1.2 Instrumentarium und Operationshilfsmittel

Für die operativen Eingriffe wurden Mikro Nadelhalter, Schere, Pinzetten und Knüpfpinzetten der Firma Müller (Aesculap) benutzt. Außerdem wurden chirurgische Pinzetten, gerade und gebogene chirurgische Scheren, Pean-Klemmen und eine Baby- Satinsky Klemme eingesetzt.

Ligaturen von Gefäßen wurden mit Perma Handseide der Stärke 6-0 (Firma Ethicon, Norderstedt) durchgeführt. Die Gefäßanastomosen wurden mit Ethilon Fäden der Stärken 8-0 (Fa. Ethicon, Norderstedt) durchgeführt. Die Polyamidfäden waren mit Nadeln der Stärke BV-2 bzw. BV-4 armiert. Der zweischichtige Bauchdeckenverschluß erfolgte mit einem Dexon 3-0 Faden (Fa. Braun-Dexon, Spangenberg). Für die intraoperative Koagulation kleinerer Gefäße wurde ein Elektrokoagulator verwendet (Minicutter 80, Hüttinger Medizintechnik GmbH & Co KG, Umkirch). Die mikrochirurgischen Eingriffe wurden unter dem Operationsmikroskop Typ OPMI-M1 (Fa. Zeiss, Oberkochen) bei 7,2 bis 18 facher Vergrößerung durchgeführt.

Methodik

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2.1.3 Operative und nichtoperative Eingriffe an den Kleintieren

2.1.3.1 Heterotope Transplantation des Herzens

Die Transplantationstechnik von Ono und Lindsey (65) wurde an die physiologischen Bedingungen im MS zu Ratte Modell angepasst.

2.1.3.1.1 Organentnahme beim Meerschweinchen

Die Meerschweinchen des Stamms Dunkin Hartley dienten als Spender für die Herztransplantation. Die Anästhesie bei den Tieren wurde mit einer Ketamin-Rompun Narkose durchgeführt. Es wurden 80 mg/kg Körpergewicht Ketamin 10%

(Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen) und 2 mg/kg Körpergewicht Rompun 2% (BayerVital, Leverkusen) präoperativ intramuskulär injiziert.

Zunächst wurden bei den Spendertieren eine mediane Laparotomie durchgeführt und 500 IE Heparin (Liquemin N 25000) intravenös injiziert. Anschließend erfolgte die Thorakotomie und Eröffnung des Herzbeutels. Nach sorgfältiger Präparation der Gefäße wurden zunächst die Vena cava superior und inferior ligiert und durchtrennt. Der Truncus pulmonalis und die Aorta ascendens wurden freipräpariert und möglichst lang abgesetzt. Ohne das Herz im Bereich der Vorhöfe einzuengen, wurden die Venae pulmonales durch eine Massenligatur unterbunden und abgetrennt. Das Herz wurde zunächst durch zentralvenöse und arterielle Perfusion mit Ringer-Laktat-Lösung (20°C) mit einem Zusatz von 5 IE Heparin auf 20 ml Flüssigkeit blutleer gespült. Anschließend wurde das Organ mit kalter (5°C) Ringer-Laktat- Lösung nachperfundiert. Bis zur Transplantation wurde das Organ in Ringer-Laktat-Lösung bei 4°C gelagert. Die Zeit der kalten Ischämie betrug etwa 45 Minuten.

Methodik

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2.1.3.1.2 Abdominelle Herztransplantation

Die Ratten wurden durch Inhalationsnarkose mit Isofluran narkotisiert und mit 1 ml Ringer- Laktat-Lösung Volumen substituiert. Die Analgesie erfolgte mit Buprenorphin (Temgesic®, Essex Pharma, München)

Der Bauchraum wurde mittels medianer Laparotomie eröffnet. Für die Dauer der Operation wurde der Magen-Darm-Trakt nach kranial vorgelagert, in feuchte Kompressen gehüllt und mit warmer (37°C) Kochsalz-Lösung feuchtgehalten. Die Vena cava und die Aorta wurden infrarenal sorgfältig freipräpariert, dabei wurden kleine abgehende Gefäße koaguliert und durchtrennt. Aorta und Vena cava wurden jeweils kaudal des Abgangs der Nierengefäße sowie kranial der iliakalen Bifurkation mit mikrochirurgischen Gefäßklips abgeklemmt.

Zuerst wurde der kraniale Klip gesetzt. Vor dem Setzten des kaudalen Klips wurde das Blut in den Gefäße nach distal ausgestrichen. Die Vena cava und Aorta wurden durch Längsinzision eröffnet, wobei aus der Wand der Aorta zusätzlich ein kleines rechteckiges Stück herausgeschnitten wurde. Der Einschnitt an der Aorta blieb dabei kürzer als der Einschnitt an der Vena cava.

Die Anastomosen zum Transplantat wurden End-zu-Seit genäht. Dabei wurden zuerst Eckfäden an den Gefäßen der Empfänger gesetzt. In fortlaufender Naht wurden die End-zu- Seit Anastomosen mit 8-0 Ethilon geschlossen, wobei zunächst die Anastomose der Vena cava mit dem Truncus pulmonalis genäht wurde. Die Anastomose der Aorta wurde um etwa ein Drittel eingeengt, damit das Transplantat nicht dem im Vergleich zum Meerschweinchen höheren arteriellen Mitteldruck ausgesetzt ist. An die Anastomosennähte wurde ein lokales Hämostyptikum (Tabotamp ®, Johnson & Johnson Medical Ltd, Gargrave, United Kingdom) angelegt. Die Reperfusion des Transplantates erfolgte zunächst nur in kleinen Schritten, um die Dichtigkeit der Anastomose zu überprüfen. Zunächst wurde die kaudale Klemme kurz geöffnet. Der Bluteinstrom in den Bereich der Anastomose wurde dabei genau beobachtet.

Kleine Blutungen aus den Stichkanälen sistierten bereits nach kurzer Zeit von selbst. Nach Füllung der Ventrikel konnte die kaudale Klemme abgenommen. Als nächstes wurde die kraniale Klemme wiederholt kurz geöffnet. Nach Sistieren der Blutungen wurde auch die kraniale Klemme entfernt. Das zunächst einsetzende Kammerflimmern ging nach kurzer Zeit in rhythmische Kontraktionen über. Das lokale Hämostyptikum konnte wieder entfernt werden und das Transplantat wurde noch etwa 20 Minuten bei offenem Abdomen kontrolliert.

Methodik

____________________________________________________________________________

Anschließend wurde der Magen-Darm-Trakt vorsichtig reponiert und die Bauchdecke zweischichtig mit Dexon 3-0 verschlossen.

2.1.3.2 Überwachung der Transplantatfunktion

Zum täglichen Monitoring der Transplantatfunktion wurde die Ratte am Nackenfell in der linken Hand des Untersuchers angehoben. Zwischen Daumen und Zeigefinger der rechten Hand konnte das Herz nun in der Flanke des Tieres palpiert werden. Leichte Abstossung manifestierte sich in einer Verhärtung des Transplantats, finale Abstossung durch fehlende Herzaktion. Die Transplantatfunktion wurde zweimal täglich kontrolliert. Der Zeitpunkt, an dem die Kontraktionen nicht mehr palpabel waren, wurde als Abstossungszeitpunkt definiert.

Die Abstossung wurde durch Laparotomie verifiziert.

2.1.3.3 Organentnahme nach Abstossung

Zur Entnahme des abgestossenen Organs wurde die Ratte, wie beschrieben, mittels Isofluran narkotisiert und einer medianen Laparotomie unterzogen. Bei fehlender Kontraktion erfolgte in tiefer Narkose die Explantation des transplantierten Herzens und das Töten des Organempfängers. Grundsätzlich wurde jeder Abstossungszeitpunkt durch diagnostische Laparotomie gesichert. Vom abgestossenen Transplantat wurden Gewebestücke zur histologischen Untersuchung in Kryoröhrchen verpackt, eingefroren und bis zur histologischen Untersuchung bei -80°C aufbewahrt. Teilweise wurden auch Gewebeproben in 2 % Glutaraldehyd und 2 % Para-Formaldehyd für die Elektronenmikroskopie asserviert.

2.1.3.4 Intraportale Injektion von Meerschweinchen-Leberzellen

In Isoflurannarkose wurden die auf dem Rücken liegenden Tiere median laparotomiert und der Darm vorsichtig nach kranial vorgelagert. Die Vena portae wurde dargestellt. Ohne den

Methodik

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portalen Blutfluss zu unterbrechen, wurden 10⁷ Donor-Zellen über den Zeitraum von 2 Minuten langsam injiziert. Durch sanfte Kompression für 3 bis 10 Minuten im Bereich der Injektionsstelle wurde die Blutung gestillt. Der Darm wurde sanft zurück in die Bauchhöhle gelagert und die Wunde zweischichtig mit Dexon 3-0 vernäht.

2.1.3.4.1 Präparation der Meerscheinchen-Leberzellen für die intraportale Injektion

Unter aseptischen Bedingungen wurde eine Meerschweinchenleber entnommen und bis zur Präparation in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufbewahrt. Die Präparation wurde gleich nach der Entnahme bei 4° C durchgeführt. Dazu wurden die Organe mechanisch zerkleinert und durch ein steriles Metallsieb passiert. Nach Zentrifugation (200 G, 10 Minuten) wurden die Zellen zweimal gewaschen und dann in kalter PBS aufgenommen. Die Zellsuspension wurde anschließend zweimal in sterile Glasspritzen durch Kanülen mit abnehmendem Durchmesser aufgenommen. Die entstandene Suspension wurde auf 1 x 10⁷ Zellen/ml eingestellt.

2.1.3.5 Blutentnahme

Blutentnahmen bis ca. 1 ml erfolgten durch Punktion des retrobulbären Venenkomplexes der mit Isofluran narkotisierten Tiere. Falls erforderlich enthielten die Blutentnahmegefäße zur Inhibition der Gerinnung Zitronensäure-Dextrose (0,1 ml ACD für 1 ml Blut).

Methodik

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2.2 Immunsuppression

.

2.2.1 Inhibition des Komplementsystems

Das Komplementsystem wurde mit Cobra Venom Faktor (CVF) inhibiert. Durch Abbau von C3 führt CVF zur Ausschaltung der nachfolgenden Komplementkaskade. Der dafür benötigte Extrakt von lyophilisiertem Cobra Venom Faktor wurde nach der von Beukelman et al. (66) beschriebenen Methode mit Fast Protein Liquid Chromatography über einen Mono Q Anionenaustauscher aufgereinigt.

In Vorversuchen wurde im hämolytischen Test eine ausreichende Dosis an aufgereinigtem CVF ermittelt, um die Versuchstiere für mindestens drei Tage zu dekomplementieren. Auf Grund dieser Ergebnisse wurden die LEW-Ratten dann mit einer Einzeldosis von je 50 µg aufgereinigtem CVF behandelt. Der CVF wurde in die Penisvene injiziert. Präoperativ wurde den Tieren im Abstand von 12 Stunden 2 mal 50 µg verabreicht. Als Erhaltungsdosis bekamen die Ratten 50 µg alle 48 Stunden.

2.2.2 B-Zellsuppression

Zur B-Zellsuppression wurden 100 mg Filmtabletten des Präparates Arava® (Wirkstoff:

Leflunomid) in einer Porzellanreibschale mit Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben.

Anschließend wurde das Pulver mit 1% Carboxymethylcellulose und Wasser für Injektionszwecke zu einer homogenen Suspension mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml Leflunomid verarbeitet. Gleich nach der Verarbeitung wurde die Suspension in 2ml-Spritzen abgefüllt und bis zur Verabreichung nicht länger als 7 Tage bei 4°C aufbewahrt. Zur B- Zellsuppression wurde den Ratten täglich 10 oder 20 mg Leflunomid pro kg Körpergewicht mit einer Knopfkanüle intragastral verabreicht.

Methodik

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2.2.3 T-Zellsuppression

Um die Resorption des stark lipophilen Wirkstoffes Cyclosporin A (CsA) zu gewährleisten, wurde Sandimmun Optoral® (100 mg CsA/ml) mit Olivenöl im Verhältnis 1:19 gemischt.

Dies ermöglichte ebenfalls eine optimale Dosierungsmöglichkeit für die Ratten. Täglich wurde den Tieren 10 mg CsA pro kg Körpergewicht intragastral mit einer Knopfkanüle verabreicht.

2.2.4 Inhibition der NK-Zellen

NK-Zellen wurden mit dem Kaninchen anti-asialo GM1 Antikörper (Wako, Neuss) depletiert.

Hierzu wurden einer Ratte 100 µl des Antikörperserums zusammen mit 900 µl isotonischer Kochsalzlösung in die Penisvene injiziert. Um die Wirksamkeit des Antiserums auch in PVG/C6def -Ratten zu gewährleisten, wurde das Antiserum bei diesen Tieren, statt in isotonischer NaCl–Lösung, in MS-Serum bzw. in heparinisiertem MS-Vollblut aufgenommen.

2.2.5 Adsorption der präformierten xenoreaktiven Antikörper

In diesen Versuchen wurde eine portale Leberzellinfusion (LZI) durchgeführt, um die restlichen, noch vorhandenen xenoreaktiven Antikörper zu entfernen. Eine diskordante Bluttansfusion wäre mit einem geringeren Aufand verbunden. Bei der diskordanten Blutübertragung wurde allerdings oft eine respitatorische Insuffizienz und ein Kreislaufversagen beobachtet.

Methodik

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2.3 Tierversuchsgruppen

Als Spendertiere wurden Dunkin Hartley Meerschweinchen verwendet. Die Empfängertiere waren Ratten der Stämme Lewis (LEW) (Gruppen A bis E sowie BBB und DDD) und PVG/C6def-Ratten mit einem Defekt im Komplementsystem bei C6 (Gruppen BB, DD, EE und EEE).

2.3.1 Gruppe A (unbehandelte Empfänger)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

A 6 Kontrolltiere

+ + + + + +

Erläuterungen:

CVF Cobra Venom Faktor 50 g/Tier SPX Splenektomie

Lef Leflunomid (Lef10 = 10 mg/kg KG; Lef20 = 20 mg/kg KG) CsA Cyclosporin A 10 mg/kg KG

LZI intraportale Injektion von 1 x 10⁷ Donor-Leberzellen

Anti-NK anti-Asialo GM1 Serum zur Depletion der Natürlichen Killerzellen XNA Präformierte Xenoreaktive Antikörper

+ vorhanden

⊕

⊕

⊕

⊕ supprimiert

- defizient

Ө zusätzlich zur Defizienz supprimiert

Die Kontrolltiere der Gruppe A (Lewis-Ratten) mit voller Immunkompetenz wurden vor der Transplantation nicht immunsuppressiv behandelt.

Methodik

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2.3.2 Gruppe B (Komplementinhibierte Empfänger)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

B 15 CVF

+ ⊕ + + + +

In der Gruppe B wurden die LEW-Ratten zur Überprüfung des Komplementsystems am Tag vor der Herztansplantation und am Tag der Herztansplantation mit 50 g Cobra Venom Faktor (CVF) dekomplementiert.

2.3.3 Gruppe C (B-Zell-Suppression ohne Komplementinhibition)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

C 6 SPX, Lef10

⊕ + + ⊕ + +

Bei den Tieren der Gruppe C wurde zusätzlich die Milz entnommen und täglich 10mg/kg KG Leflunomid (Lef) zur B-Zell-Inhibierung verabreicht.

2.3.4 Gruppe D (B-Zell-Suppression mit Komplementhinhibition)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

D 20 SPX, Lef10, CVF

⊕ ⊕ + ⊕ + +

Die Gruppe D erhielt eine Kombinationstherapie der Gruppen B und C. Immunologisch wurden somit die B-Zellen inhibiert und die Tiere dekomplementiert.

Methodik

____________________________________________________________________________

2.3.5 Gruppe E (B-Zell-Suppression mit NK-Zell Depletion und Komplementinhibition)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

E 5 SPX, Lef10, CsA, CVF, LZI, Anti-NK

⊕ ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ +

Hier begann die Therapie mit einer Splenektomie (SPX) 21 Tage vor der Herztransplantation, von da an wurden täglich 10 mg/kg KG Lef verabreicht. Ab dem 15. Tag vor der Herztransplantation wurde zusätzlich 10 mg/kg KG Cyclosporin A täglich gegeben. Am 15.

und 14. Tag vor der Herztransplantation wurde CVF gegeben und die Tiere bekamen eine Leberzellinfusion (LZI) von 1x10⁷ Donor-Leberzellen zur präoperativen Immunstimulierung.

Am Tag nach der LZI wurde den Tieren anti-Asialo GM1 Serum zur Depletion der natürlichen Killerzellen (NK) verabreicht. Einen Tag vor, sowie am Tag der Herztransplantation wurde zusätzlich CVF gegeben. Die Dekomplementierung wurde an jedem zweiten postoperativen Tag fortgesetzt. Die Tiere hatten eine nahezu komplette Immunsuppression mit Ausnahme der Makrophagenaktivität. 15 Tage, einen Tag vor Transplantation und nach Abstossung, wurden Blutproben asserviert.

2.3.6 Gruppe BB (Komplementdefiziente Empfänger)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

BB 6 Kontrollgruppe

+ - + + + +

Die PVG/C6def Ratten haben einen Defekt im Komplementsystem, der die Bildung von C6 blockiert. Sie ähneln somit der behandelten Gruppe B und dienen als Kontrolle für die noch vorhandenen Bestandteile des Komplementsystems.

Methodik

____________________________________________________________________________

2.3.7 Gruppe DD (B-Zell-Suppression bei Komplementdefekt)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

DD 6 SPX, Lef10

⊕ - + ⊕ + +

Diese Tiere erhielten zusätzlich zu ihrem Komplementdefekt eine B-Zell suppressive Therapie mit SPX und 10 mg/kg KG Lef . Der Immunstatus der Tiere entspricht denen der Gruppe D.

2.3.8 Gruppe EE (Verstärkte B-Zell-Suppression mit T-Zell-Suppression, NK- Zell Depletion und Komplementdefekt)

Gruppe

n Therapie

XNA Kom

plem ent

T-Zellen B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

EE 4 SPX, Lef20, CsA, LZI, Anti-NK ⊕ - ⊕ ⊕ ⊕ +

Die Behandlung entspricht weitgehend der Gruppe E mit dem Unterschied, dass 20 mg/kg KG Lef verabreicht wurden und die Tiere nicht mit CVF behandelt wurden.

Die Tiere haben somit eine stärkere B-Zell- und eine schlechtere Komplement-Inhibierung als die Tiere der Gruppe E. Wie bei Gruppe E wurden Blutproben jeweils 15, 13 und einen Tag vor der Transplantation, sowie nach Abstossung des Transplantates für serologische Untersuchungen gewonnen.

Methodik

____________________________________________________________________________

2.3.9 Gruppe EEE (B-Zell-Suppression mit T-Zell-Suppression, NK-Zell Depletion, Komplementdefekt und Komplementinhibition)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

EEE 5 SPX, Lef20, CsA, CVF, LZI, Anti-NK ⊕ Ө ⊕ ⊕ ⊕ +

Hier erfolgte eine B-Zell suppressive Therapie mit 10 mg/kg KG Lef täglich ab dem 21. Tag vor Transplantation und Splenektomie. Ab dem 15. Tag vor der Transplantation wurden 10 mg/kg KG CsA verabreicht. Am 14. Tag vor der Transplantation erfolgte die LZI mit 1x10⁷ Donor-Leberzellen und am 13. Tag vor der OP wurde der NK-Zell Antikörper (Anti-Asialo GM1) verabreicht. Die Tiere bekamen am Tag vor, am Tag der und jeden zweiten Tag nach der Transplantation 50 g CVF.

Der Immunstatus dieser Gruppe entspricht somit in etwa dem der Tiere aus den Gruppe E und EE, wobei diese Tiere eine Inhibierung des Komplementsystems an zwei Stellen hatten. Bei diesen Tieren wurden Blutproben 15, 13 und einen Tag vor der Transplantation und nach Abstossung abgenommen.

2.3.10 Gruppe BBB (Komplementinhibiert, keine Transplantation)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

BBB 10 CVF

+ ⊕ + + + +

Die Lewis-Ratten dieser Gruppe sind analog zu den Tieren der Gruppe B nur mit 50 g CVF dekomplementiert. Diese Tiere erhielten anstatt einer Herztransplantation eine LZI zur Immunstimulation. Anschließend wurden Blutproben zur Serologie von IgM und IgG abgenommen.

Methodik

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2.3.11 Gruppe DDD (B-Zell-Suppression mit Komplementinhibition, keine Transplantation)

Gruppe

n Therapie

XNA

Kom plem

ent

T-Zellen

B-Zellen

NK-Zellen

Makrophagen

DDD 4 SPX, Lef10, CVF

⊕ ⊕ + ⊕ + +

Eine Behandlung, vergleichbar mit der bei Gruppe D, wurde hier angewendet. Die Tiere vom 10. Tag vor dem Antigenkontakt durch die LZI an tägliche Gaben von 10 mg/kg KG Lef und eine Splenektomie. Am Tag vor und auch am Tag der LZI wurden 50 g CVF i.v.

verabreicht. Analog zu der Gruppe BBB erfolgten nach der Leberzellinfusion Blutabnahmen zur Serologie.

Tabelle 1: Tierversuchsgruppen und Behandlungsschemata Erläuterungen: CVF Cobra Venom Faktor 50 g/Tier

SPX Splenektomie

Lef Leflunomid (Lef10 = 10 mg/kg KG; Lef20 = 20 mg/kg KG) CsA Cyclosporin A 10 mg/kg KG

LZI intraportale Injektion von 1 x 10⁷ Donor-Leberzellen

Anti-NK anti-Asialo GM1 Serum zur Depletion der Natürlichen Killerzellen + vorhanden; _⊕⊕⊕⊕ supprimiert; - defizient; ^Ө zusätzlich zur Defizienz supprimiert

Immunstatus Präformierte

Antikörper Komplement T-

Zellen B-

Zellen NK-

Zellen Makro- phagen I Stamm 1 Lewis Ratten n = 52

Herztransplantation + + + + + +

Gruppe n Behandlung

A 6 Kontrollgruppe + + + + + +

B 15 CVF + ⊕⊕ ⊕⊕ + + + +

C 6 SPX, Lef10 ⊕ + + ⊕⊕⊕⊕ + +

D 20 SPX, Lef10, CVF ⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ + ⊕⊕⊕⊕ + +

E 5 SPX, Lef10, CsA, CVF, LZI, Anti-NK ⊕⊕⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ +

II Stamm 2 PVG/C6def. Ratten n = 21 Herztransplantation

BB 6 Kontrollgruppe + - + + + +

DD 6 SPX, Lef10 ⊕ - + ⊕⊕⊕⊕ + +

EE 4 SPX, Lef20, CsA, LZI, Anti-NK ⊕⊕⊕⊕ - ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ + EEE 5 SPX, Lef10, CsA, CVF, LZI, Anti-NK ⊕⊕⊕⊕ Ө ⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ ⊕⊕⊕⊕ +

III Stamm 1 Lewis-Ratten n 14 Serologie nach LZI

BBB 10 CVF + ⊕⊕ ⊕⊕ + + + +

DDD 4 SPX, Lef10, CVF ⊕⊕⊕⊕ ⊕⊕ ⊕⊕ + ⊕⊕⊕⊕ + +

2.4 Serologische Nachweismethoden

2.4.1 Nachweis von natürlichen, xenoreaktiven Antikörpern

Zum Nachweis von natürlichen, xenoreaktiven, gegen MS gerichteten Antikörper (XNA) aus den Rattenseren wurden Membranextrakte aus Leberzellen von Meerschweinchen präpariert und als Antigene im Immunadsorptionstest (ELISA) eingesetzt. Die Bestimmung der XNA erfolgte in Anlehnung an einen von Leventhal (67) beschriebenen ELISA gegen MS- Thrombozytenmembranen. Als Negativkontrolle wurde Meerschweinchenserum an Stelle von Rattenserum genutzt und dieser gemessene Wert von den in Doppelmessungen bestimmten Werten der Rattenseren abgezogen.

Zur Ermittlung der Reduktion oder des Anstiegs von XNA bei einzelnen Individuen wurden die Werte der optischen Dichte der 1:2-Serumverdünnungen ausgewertet. Die ermittelten Signale wurden prozentual auf den vor jeglicher Behandlung erzielten Wert dieser Individuen bezogen.

2.5 Histologische Analysen

Die histologischen Untersuchungen wurden an 5 µm dicken Gefrierschnitten der transplantierten Organe durchgeführt. Dazu wurden vom Organ unmittelbar nach Explantation 4 x 4 x 4 mm kleine Blöcke auf schmale Aluminiumstreifen aufgebracht und bei -160°C in Isopentan (2-Methylbutan, Sigma Aldrich, Steinheim), das durch flüssigen Stickstoff gekühlt wurde, schockgefroren. Die so gewonnenen Gefrierblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung in Kryoröhrchen bei -80°C aufbewahrt. Zur Anfertigung der Schnitte wurden die gefrorenen Blöcke bei einer Kammertemperatur von -23°C im Kryostat (2800 Frigocut E, Reichert-Jung) auf dem Schneidetisch fixiert und 5 µm dicke Schnitte für HE- Färbung und Immunhistologie angefertigt. Diese Schnitte wurden auf Objektträger aufgebracht und bis zur Färbung bei -20°C gelagert.