dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Analyse und Therapie der Xenotransplantatabstoßung im diskordanten Kleintiermodell
-Bedeutung von Komplement, Xenoantikörpern, Makrophagen und NK-Zellen-
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Ursula Raschke
aus Münster / Westfalen
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. Dr. phil. E. Nagel Dr. med. A. Meyer zu Vilsendorf
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich 2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. I. Greiser de Wilke
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2001
Moppel und
meinen drei Jungs
Es kommt nicht darauf an, was andere aus uns gemacht haben,
sondern darauf,
was wir aus dem machen, was andere aus uns gemacht
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis VIII
Tabellenverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis IX
1 Einleitung 13
2 Schrifttum 15
2.1 Xenotransplantation 15
2.2 Hyperakute Abstoßung (HAR) in der diskordanten Xenotransplantation 17 2.2.1 Die Bedeutung des Komplementsystemes für die HAR 17
2.2.2 Inhibition des Komplementsystems 21
2.2.3 Xenoreaktive Antikörper (XNA) bei der HAR 25
2.2.4 XNA-Depletion 27
2.3 Verzögerte Abstoßung eines Xenotransplantates (DXR) 29 2.3.1 Aktivierung der Endothelzellen bei der DXR 29
2.3.2 Natürliche Killerzellen bei der DXR 31
2.3.3 Makrophagen bei der DXR 32
2.4 Abstoßungsreaktionen, die durch T-Zellen vermittelt wurden 33
2.5 Toleranz 34
2.6 Physiologische Barrieren 35
3 Experimenteller Teil 37
Tiere, Geräte und Verbrauchsmaterialien 37
3.1 Tiere und Tierhaltung 37
3.2 Geräte 38
3.3 Verbrauchsmaterial 40
3.3.1 Einmalmaterial 40
3.3.2 Chemikalien 43
3.3.3 Antikörper 44
3.3.3.1 Antikörper für die Immunhistochemie 44
3.3.3.2 Antikörper für die Durchflußzytometrie 45
3.3.3.3 Antikörper zur NK-Zell-Depletion 46
3.3.4 Lösungen und Puffer 46
3.3.5 Medien 49
3.3.6 Zelllinie 49
Methoden 51
3.4 Operative Eingriffe bei Meerschweinchen und Ratten 51
3.4.1 Narkotisierung und Tötung der Tiere 51
3.4.2 Blutentnahme 51
3.4.3 Präparation von MS-Leberzellen für die präoperative Immunisierung 51 3.4.4 Intraportale Injektion von MS-Leberzellen zur präoperativen Immunisierung 52
3.4.5 Splenektomie 53
3.4.6 Heterotope Herztransplantation von MS auf Ratte 54
3.4.6.1 Organentnahme beim Meerschweinchen 54
3.4.6.2 Transplantation eines MS-Herzens 55
3.5 Immunsuppression 56
3.5.1 B-Zellsuppression mit Leflunomid 56
3.5.2 T-Zellsuppression mit Ciclosporin A (CsA) 57
3.5.3 Depletion der Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) mit dem Antikörper
anti-asialo GM1 im Empfänger 57
3.5.4 Inhibition des Komplementsystems mit Cobra Venom Faktor (CVF) 57 3.6 Analyse von xenoreaktiven natürlichen Antikörpern (XNA) 58 3.6.1 Herstellung von Membranextrakten als Antigen für den Nachweis von XNA 59
3.6.2 XNA-Nachweis im ELISA (XNA-ELISA) 59
3.7 Analyse von B- und NK-Zellen 60
3.7.1 Aufreinigung des Maus-anti-Ratte NK-Zell-Antikörpers (mAk 3.2.3) 60 3.7.2 Durchflußzytometrische Bestimmung von NK- und B-Zellen 61
3.8 Tierversuchsgruppen 62
3.8.1 Versuchsgruppen und Behandlungsschemata bei heterotoper Herztransplantation 62
3.8.2 Versuchsgruppen zur Analyse der XNA 65
3.8.3 Versuchsgruppen zur Analyse der B- und NK-Zellen 66
3.9 Histochemische Analyse der Transplantate 67
3.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) 68
3.9.2 Immunhistochemische Analyse 68
3.9.2.1 Detektion der Ablagerungen von IgM oder Komplementfaktoren 69 3.9.2.2 Detektion der Infiltration mit Makrophagen oder NK-Zellen der Ratte 69 3.9.3 Morphometrische Auswertung der Infiltration mit Makrophagen mit
Makrophagen und NK-Zellen 70
3.10 Zytotoxizitätsassay 70
3.11 Statistik 72
4 Ergebnisse 73
4.1 Anpassung der operativen Techniken bei der X-HTX 73 4.1.1 Optimierung der Entnahme und Perfusion des Spenderherzens 73
4.1.2 Anpassung der Transplatationstechnik 76
4.2 Verschiedene Methoden zur Apllikation xenogener Antigene 78 4.3 Überlebenszeiten und Immunhistochemie nach heterotoper Herztransplantation 78
4.3.1 Unbehandelte LEW-Empfänger 80
4.3.2 Verhinderung der hyperakuten Komplement-abhängigen Abstoßungsreaktion
durch Vorbehandlung der Organempfänger mit CVF (Gruppe B) 81 4.3.3 Verhinderung der hyperakuten Komplement-abhängigen Abstoßungsreaktion
unter Verwendung von PVG/Lei-C6m Organempfängern (Gruppe F) 82 4.3.4 B-Zell-Suppression mit Leflunomid ohne gleichzeitige Komplementinhibition
(Gruppe C) 83
4.3.5 B-Zell-Suppression kombiniert mit Komplementinhibition (Gruppe D und G) 84 4.3.6 Versuch zur Erzeugung einer NK-Zell-Toleranz (Gruppen H und I) 86 4.3.7 Makrophagen-Infiltration der Xenotransplantate 87
4.4 NK-Zell-Immunsuppression 90
4.4.1 NK-Zellen im zirkulierenden Blut 90
4.4.2 Analyse der Zytotoxizität der regenerierenden NK-Zellen 93 4.4.3 Immunhistologische Analyse der infiltrierenden NK-Zellen in den
verschiedenen Behandlungsgruppen 94
4.5 Analyse der B-Zellen mittels Durchflußzytometrie 97
4.6 T-Zell-Inhibition 100
5 Diskussion 101 5.1 Anpassung der Transplantationstechnik bei der heterotopen
Herztransplanation von MS auf Ratte 101
5.2 Überleben nach heterotoper Herztransplantation von MS auf Ratte 101 5.2.1 Inhibition des Komplementsystems zur Überwindung der HAR 102
5.2.1.1 Komplementinhibition durch CVF 102
5.2.1.2 Komplementinhibition durch Einsatz komplementdefizienter Empfänger 103 5.2.2 Einfluß von XNA auf die Abstoßungsreaktion 104 5.3 Induktion von B-Zell und NK-Zell-Toleranz durch Einsatz verschiedener
Behandlungsschemata 106
5.3.1 Applikation xenogener Antigene 107
5.3.2 Transplantationsüberleben nach Behandlungsschema zur Induktion von Toleranz108 5.3.3 Analyse der XNA und der zirkulierenden B-Zellen unter dem zur Induktion
von Toleranz eingesetzten Behandlungsschema 110 5.3.4 Analyse der NK-Zellen unter dem zur Induktion von Toleranz eingesetzten
Behandlungsschema 112
5.4 Ausblick 113
6 Zusammenfassung 115
7 Summary 117
8 Literatur 119
9 Anhang 153
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Die Abstoßungsphasen eines diskordanten Xenotransplantates und die beteiligten
Mediatoren 16 Abb. 2 Schematische Darstellung der Komplementkaskade 21
Abb. 3 Schematische Darstellung der Typ 2 Endothelzell-Aktivierung und der
verzögerten Abstoßung (DXR) 31
Abb. 4 Intraportale Injektion von MS-Leberzellen 53
Abb. 5 Splenektomie 54
Abb. 6 Vergleich der Perfusionstechnik bei der Organentnahme zur Xenotransplantation 75 Abb. 7 Vergleich der Reperfusion nach Xenotransplantation 77 Abb. 8 Diskordantes Herztransplantat in unbehandelten LEW-Ratten 80 Abb. 9 Herztransplantat nach Vorbehandlung mit CVF zur Dekomplementierung 81 Abb. 10 Immunhistologische Anfärbung von IgM mit MARM4 und Hämatoxylin 82 Abb. 11 Herztransplantat in einem PVG/Lei-C6m Empfänger der Gruppe F 83 Abb. 12 Immunhistologische Anfärbung von IgM mit MARM-4 84 Abb. 13 Immunhistologische Anfärbung von Makrophagen mit ED1 85 Abb. 14 Immunhistologische Detektion auf Makrophagen mit dem ED1-Marker 87 Abb. 15 Auswertung der infiltrierenden Makrophagen 89 Abb. 16 Durchflußzytometrische Untersuchungen der NK-Zellen aus dem
peripheren Blut 92
Abb. 17 Immunhistochemische Anfärbung von NK-Zellen in Transplatatbiopsien 95 Abb. 18 Quantifizierung der immunhistologischen Untersuchungen der
Xenotransplantate auf infiltrierende NK-Zellen 96 Abb. 19 Beurteilung der CD45 positiven B-Zellen (in Prozent) in der durchfluß-
zytometrischen Analyse im Verlauf der immunsuppressiven Behandlung 99
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 primäre Antikörper für die Immunhistochemie 44
Tab. 2 Antikörper für die Durchflußzytometrie 45
Tab. 3 Versuchsgruppen und Schemata zur Suppression der humoralen und zellulären Effektorsysteme bei diskordanter Herztransplantation (X-HTX) 64
Tab. 4 Versuchsgruppen zur Analyse der XNA 66
Tab. 5 Versuchsgruppen zur Analyse der B- und NK-Zellen 66 Tab. 6 Transplantatfunktion und immunhistologische Untersuchungen nach
verschiedenen Behandlungsschemata bei der diskordanten Xenotransplantation 79
Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
ACD Zitronensäure-Dextrose (Acid-Citrat-Dextrose)
ADCC antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (Antibody Dependant Cell mediated Cytotoxicity)
Ag Antigen Ak Antikörper Aq. dest. Aqua destilata
AVR akuten vaskuläre Abstoßung (AVR: Acute Vascluar Rejection) BCA Bicinchoninsäure
BSA Rinderserumalbumin BSE Bovine Spongioforme Encephalitis ca. zirka
Ci Curie Con A Concanavalin A
CMC Carboxymethylcellulose CVF Cobra Venom Faktor
d Tag (day)
DAF decay accelerating factor DEA Diethanolamin
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DSG 15-Desoxyspergualin
DXR verzögerte Abstoßung (Delayed Xenograft Rejection)
ELISA Immunadsorbtionstest (enzyme-linked immunosorbent assay) FACS Durchflußzytometer (Flourescence activated cell sorter) FCS Serum aus fötalen Kälbern (fetal calf serum)
FITC Fluoesceinisothiocyanat
FL1 Fluoreszenz 1
FL 2 Fluoreszenz 2
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
FSC Durchlichtmessung im Durchflußzytometer, Maß für die Zellgröße (forward scatter)
g Gewicht in Gramm
g Erdbeschleunigung (9,81 m·s-2) ggf. gegebenenfalls
HAR hyperakute Abstoßung (hyperacute xenograft rejection)
h Stunde (hour)
h-DAF humaner- decay accelerating factor H.E.-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung
HEPES N`-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N`-2-ethansulfonsäure HHTX heterotope Herztransplantation
Ig Immunglobulin i.m. intramuskulär i.p. intraperitoneal
IU international Einheit (international unit) Lef Leflunomid
LPS Lipopolysaccharide LZI Leberzellinfusion
MAC Membran-Angriffs-Komplex (membrane attack complex) MAk monoklonaler Antikörper
MASP Mannan Binding Lectin Associated Serin Protease MCP membrane cofactor protein
min Minute
MS Meerschweinchen NaCl-Lösung Kochsalzlösung
NHS normales humanes Serum NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen
OD optische Dichte
PAF Plättchen aktivierender Faktor (platelet activating factor) PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PE Phycoerythrin PERV Porcines Endogenes RetroVirus
PMBC mononukleäre Zellen aus dem peripheen Blut (peripheral blood mononuclear cells)
PMN polymorphkernigen Zellen (PMN) PNPP p-Nitrophenylphosphat
sCR1 lösliche Form des Komplementrezeptor 1 (soluble Complement Receptor 1) SPF spezifisch pathogenfrei
SPX Splenektomie
SRBC Schafserythrozyten (sheep red blood cells) TBS Tris gepufferte Saline (Tris buffered saline) tgl. täglich
TI Thymus-unabhängig (thymus independant)
U Einheit (unit) V. Vena
VBS veronal gepufferte Saline Vit. Vitamin
XNA xenoreaktive natürliche Antikörper
1 Einleitung
Die Übertragung von Organen zwischen verschiedenen Spezies, d.h. die Xenotransplantation, könnte eine Lösung darstellen, um im humanen Bereich das Problem der Diskrepanz zwischen dem Bedarf und den tatsächlich für die Transplantation zur Verfügung stehenden Organen zu entschärfen. Bei der Xenotransplantation steht dem aber das Problem der Überwindung von physiologischen und immunologischen Barrieren entgegen. Die xenogenen Abstoßungsreaktionen müssen durch geeignete immunsuppressive Regime überwunden werden.
Sowohl aus tier-, artenschutzrechtlichen und ethischen Gründen wird zur Zeit eine Organtransplantation von Schwein auf Mensch favorisiert. Für diese Spezies-Kombination spricht außerdem eine hohe Reproduktion bzw. Fertilität sowie die Möglichkeit, Schweine unter SPF-Bedingungen (SPF: Spezifisch Pathogen Frei) aufzuziehen und zu halten, trotz der Übertragungsmöglichkeit von porcinen endogenen Retroviren (PERV). Umfangreiche Studien mit statistisch verlässlichen Zahlenwerten lassen sich in Großtiermodellen, wie z. B.
Schwein/Affe zur Zeit kaum realisieren. Um die Mechanismen der xenogenen Abstoßung und mögliche speziesspezifischen Barrieren zu untersuchen, wurde daher das Meerschweinchen (MS)/Ratte-Modell gewählt, da es sich bei dieser Spezies-Kombination ebenso wie bei der Schwein-Mensch-Situation um eine diskordante Spezies-Kombination handelt.
Wie bei der Situation Schwein – Mensch– liegen auch bei der MS/Ratte-Kombination präformierte xenoreaktive IgM Antikörper (XNA: Xenoreactive Natural Antibodies) vor und die Aktivierung des Komplementsystems führt auch hier zu einer hyperakuten Abstoßung (HAR: HyperAcute Rejection) eines vaskularisierten Organs innerhalb weniger Minuten.
Diese HAR kann durch Inhibition des Komplementsystems und der XNA überwunden werden. In der Folge unterliegt das Organ einer verzögerten Abstoßungsreaktion (DXR:
Delayed Xenograft Rejection). Die Mechanismen, die zu dieser Form der Abstoßung führen, sind bis jetzt nicht vollständig erforscht.
In dieser Arbeit sollten die immunologischen und zellulären Abstoßungsmechanismen bei der HAR und DXR sowie deren Überwindung im diskordanten Tiermodell
Meerschweinchen/Ratte bei der xenogenen Herztransplantation (X-HTX) analysiert werden.
Hierzu wurden insbesondere die Rolle von Komplement, der Einfluß von XNA, B- und T- Zellen sowie NK-Zellen analysiert. Daneben wurde ein besonderes Augenmerk auf die Transplantationstechnik gerichtet.
Die Dissertation wurde im Rahmen des Teilprojektes B16 „Untersuchung der funktionellen Kompatibilität von Serumproteinen nach orthotoper Lebertransplantation im xenogenen Tiermodell: Auswirkungen der Komplementkonversion auf Transplantat und Empfänger“ im SFB 265 „Immunreaktionen und Pathomechanismen bei Organtransplantationen“ angefertigt.
Das Forschungsprojekt wird seit 1997 von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt und wird ab 2001 aufgrund einer erneuten positiven Begutachtung als Folgeprojekt bis 2003 weiter gefördert.
2 Schrifttum
2.1 Xenotransplantation
Die Diskrepanz zwischen dem Bedarf und der Verfügbarkeit menschlicher Organe stellt ein zunehmendes Problem in der Transplantationsmedizin dar. Eine mögliche Lösung dieser Diskrepanz zwischen Bedarf und Angebot bei der Organtransplantation könnte die Xenotransplantation, d.h. die Transplantationen zwischen verschiedenen Spezies (Übersicht:
AUCHINCLOSS u. SACHS, 1998; SAADI u. PLATT, 1998; WHITE u. NICHOLSON, 1999; SOIN et al., 2000), aufzeigen. Durch die Verwendung tierischer Organe könnte diese Situation entschärft und möglicherweise durch gezielte spezifisch-pathogen-freie Zucht eine permanente Verfügbarkeit hochwertiger Transplantate erreicht werden.
Zur Zeit wird das Schwein als Spender parenchymatöser Organe wie Niere, Herz, Lunge oder ggf. Pankreas für eine mögliche klinische Xenotransplantation favorisiert. Schweine stehen in hoher Anzahl zur Verfügung, weisen günstige Zuchtcharakteristika und eine gewisse Ähnlichkeit vieler ihrer Organe zu denen der Menschen auf (SACHS, 1994). Die Problematik, die durch Erreger wie PERV (Porcines –Endogenes RetroVirus) (MARTIN et al., 2000) oder durch BSE (Bovine spongioforme Enzephalitis) besteht, lässt jedoch vorläufig keine klinischen Studien in der Schwein – Mensch - Situation zu.
Im Rahmen der Transplantationsmedizin unterscheidet man primär vaskularisierte und sekundär vaskularisierte Organe: Zu den ersteren zählt man Herz, Leber, Niere und Lunge, d.h. die transplantierten Organe müssen - auch bei der Xenotransplantation - direkt an die Blutgefäße des Empfängers angeschlossen werden, um ihre Funktion aufnehmen zu können.
Im Gegensatz dazu stehen sekundär vaskularisierte Transplantate, wie die Haut, die revaskularisiert werden muss und so Anschluss an die Blutbahn des Empfängers findet.
Je nach Verwandtschaftsgrad und immunologischen Unterschieden zwischen Spender und Empfänger kommt es zu verschiedenen Abstoßungsreaktionen von vaskularisierten Transplantaten. Nach Transplantation von Organen zwischen phylogenetisch weit entfernten
Spezies kommt es zu hyperakuten Abstoßungsreaktionen (HAR: HyperAcute Rejection). Die HAR erfolgt innerhalb weniger Minuten oder Stunden, ohne daß das Organ seine Funktion aufnehmen konnte. Diese Situation, die gerade auch in der Kombination Schwein-Mensch vorliegt, wird als diskordant bezeichnet (CALNE, 1970) (Abb. 1). Im Gegensatz dazu wird ein konkordantes Transplantat, wie z. B. in der Situation Affe/Mensch, weniger schnell im Rahmen einer sogenannten verzögerten Abstoßung (DXR: Delayed Xenograft Rejection) abgestoßen.
Zur Untersuchung der Abstoßungsmechanismen in der diskordanten Situation wird das Tiermodell MS/Ratte eingesetzt (JAMIESON, 1974; CANDINAS et al., 1996c; HANCOCK et al., 1997b; MIKI et al., 1998).
Abb. 1: Die Abstoßungsphasen eines diskordanten Xenotransplantates und die beteiligten Mediatoren
Nach Überwindung der hyperakuten Abstoßung (HAR) unterliegt das Transplantat einer verzögerten Abstoßung (DXR).
2.2 Hyperakute Abstoßung (HAR) in der diskordanten Xenotransplantation
In der diskordanten Situation führt eine Xenotransplantation zu einer hyperakuten Abstoßung des Transplantates, die durch interstitielle Blutungen, Ödeme, sowie Thrombosierung von Gefäßen und einer Zerstörung des Endothels charakterisiert ist (MOLLNES u. FIANE, 1999).
Kurz nach der Reperfusion des Transplantates mit dem Empfänger-Blut treten diese Veränderungen auf. Sie haben entweder keine Aufnahme oder den Verlust der normalen Organfunktion zur Folge. Beteiligte Komponenten sind das Komplementsystem, präformierte natürliche xenoreaktive Antikörper (XNA) und die Aktivierung von Endothelzellen.
2.2.1 Die Bedeutung des Komplementsystems für die HAR
Ein Jahrhundert nach der erstmaligen Beschreibung als ein hitzelabiler Faktor, der die bakterientötende Wirkung von Antikörpern „komplementiert“ (BUCHNER, 1889), ist die Bedeutung des Komplementsystems für die Immunabwehr allgemein anerkannt.
Das Komplementsystem ist ein konstanter Teil des Immunsystems und übernimmt Abwehrleistungen im Sinne einer unspezifischen humoralen Immunabwehr in der Präimmunphase einer Infektion durch die Zerstörung von Zellen durch Bildung eines lytischen Membranangriff-Komplexes (MAC: Membrane Attack Complex). Eine weitere wichtige Funktion des Komplementsystems besteht in der Entfernung von Antigen- Antikörperkomplexen durch Opsonierung mit folgender Phagozytose. Zudem ist das Komplementsystem ein Bindeglied zwischen humoraler und zellulärer Immunantwort, da aktivierte Spaltprodukte, die sog. Anaphylatoxine, Signalfunktionen für Zellen des Immunsystems besitzen. Das Komplementsystem besteht aus über 20 Plasmaproteinen [Übersicht: VOLANAKIS u. FRANK, 1998] und mindestens 10 weiteren, membranständigen Proteinen und Rezeptoren, die physiologischerweise im Serum bzw. im Gewebe vorhanden sind (BITTER-SUERMANN u. KÖHL, 1997, Abb. 2). Dabei handelt es sich um Proteine, die vor allem durch Hepatozyten (Serumproteine), sowie von Makrophagen und Fibroblasten (lokale Synthese im Gewebe) gebildet werden. Ähnlich dem Gerinnungssystem stellt das
Komplementsystem eine Enzymkaskade dar, in deren Verlauf inaktive Vorstufen durch limitierte Proteolyse oder katalytische Konformationsumwandlungen in enzymatisch aktive Komponenten umgesetzt werden. Der Aufbau als Enzymkaskade ermöglicht eine schnelle und starke Antwort. Diese erfolgt auch bei schwachen Aktivierungssignalen, da die inaktiven Vorstufen immer im Plasma vorhanden sind. Jeder Schritt im Verlauf der Enzymkaskade hat eine Signalverstärkung zur Folge.
Die Aktivierung des Komplementsystems kann über drei unterschiedliche Wege erfolgen:
1. Der „klassische“ Weg wird durch Antigen-gebundene IgM- und IgG-Antikörper aktiviert. Historisch gesehen wurde dieser Weg zuerst entdeckt. In diesem Fall ist das
Komplementsystem Teil der adaptiven Immunantwort. Aber auch durch Zellwandproteine (z.
B. Protein A), das Lipid A der Lipopolysaccharide gramnegativer Bakterien, das C-reaktive Protein und Retroviren kann der klassische Weg ausgelöst werden. Über die Bindung von C1, C4 und C2 führt der klassische Weg zur Aktivierung von C3.
2. Der „alternative“ Weg, dessen Initiierung durch Oberflächenstrukturen von
pathogenen Bakterien, Parasiten, Viren, virusinfizierten Zellen und Pilzen ausgelöst wird, ist der phylogenetisch älteste Teil des Komplementsystems. Hier gilt das Komplementsystem als Teil der angeborenen, unspezifischen Immunabwehr. C3b, das u. a. durch spontane Spaltung von C3 im Serum entsteht, lagert sich an die Oberflächen von Pathogenen an und unter Mitwirkung der Faktoren B und D kommt es zur Ausbildung der C3-Konvertase.
Zusätzlich bildet der alternative Weg eine Verstärkungsschleife des klassischen Weges.
3. Bei dem historisch gesehen zuletzt entdeckten und beschriebenen Mannose-
bindenden-Lektin-(MBL) Weg findet eine Antikörper- und C1- unabhängige Ausbildung der C3-Konvertase statt. Dieser Aktivierungsweg wird durch die Interaktion von Mannose- bindendem Lektin mit Polysaccharid-Resten, insbesondere Mannose- und
N-Acetylglukosamin-Resten auf der Oberfläche von Mikroorganismen ausgelöst.
Alle 3 Aktivierungswege münden in einen gemeinsamen terminalen Weg, der von den Komponenten C5, C6, C7, C8 und C9 gebildet wird. Am Ende der Komplementkaskade steht die Bildung eines C5b-C9-Membran-Angriff-Komplexes (MAC). Die Bildung des MAC wird durch Assoziation der Komplementproteine C5b, C6, C7 und C8 (C5b-C8) initiiert. Lagert sich der C5b-C8 Komplex an Membranen an, wird er zum Kondensationszentrum für hydrophile C9-Moleküle, von denen sich 6 bis 12 zu einem Hohlzylinder vereinigen und den eigentlichen MAC C5b-9 bilden. Dieser Komplex durchdringt die Zellmembran und zerstört damit die selektive Permeabilität und leitet die Lyse der Zelle ein. Aber auch die Ablagerung des C5b-C8 Komplexes führt über eine Aktivierung der Makrophagen zur Zerstörung der Zielzelle.
Während der Komplementaktivierung werden die Anaphylatoxine C3a und C5a durch proteolytische Spaltung am N-Terminus der α-Kette ihrer Muttermoleküle C3 und C5 sowie sein C-terminales Abbauprodukt C5adesArg gebildet. Die Anaphylatoxine sind potente Entzündungsmediatoren, da sie neben spasmogenen, vasopermeabilitätssteigernden, chemotaktischen und aggregierenden Eigenschaften nach Bindung an entsprechende Rezeptoren auch die Freisetzung vasoaktiver Peptide, z.B. Histamin und Serotonin aus Mastzellen und basophilen Leukozyten, sowie die Freisetzung von lysosomalen Enzymen, toxischen Sauerstoffmetaboliten und von Arachidonsäurederivaten (Prostaglandine, Thromboxane, Leukotriene) aus Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, verursachen (EMBER et al., 1998).
Das Komplementsystem spielt auch während der HAR bei der Xenotransplantation eine essentielle Rolle (Übersicht: SAADI u. PLATT, 1999). So kommt es nach der Reperfusion eines diskordanten Xenotransplantates zur rapiden Abnahme des Serumspiegels an Komplementkomponenten (BUSCH et al., 1975, GEWURZ et al., 1967) und gleichzeitig zur Akkumulation im Transplantat (PLATT et al., 1991).
Im Modell Schwein/Primat konnte die Aktivierung des Komplements über den klassischen Weg durch Bindung von XNA an Gal(α1,3)Gal-Epitope auf dem Endothel des Schweines
gezeigt werden (SAADI u. PLATT, 1999). In anderen Tiermodellen wurde die Aktivierung sowohl des klassischen als auch des alternativen Weges beschrieben: Im MS/Ratte-Modell konnten MIYAGAWA et al. (1988) zeigen, dass bei den Ratten während der hyperakuten Abstoßung eines MS-Herzens nach der Xenotransplantation eine signifikante Reduktion der hämolytischen Komplementkomponenten im Rattenserum auftrat, während es zu keinem Verbrauch der Faktoren C2 und C4 kam. Zudem beobachteten MIYAGAWA et al. (1988) keine anti-MS-Antikörper, so dass er den alternativen Weg als alleinige Aktivierung des Komplementsystems postulierte. Unabhängig von der Kinetik einer Antikörper-Antigen- Interaktion führt die Aktivierung des Komplementsystems über den alternativen Weg zu einer fulminanten Abstoßung innerhalb weniger Minuten aufgrund der schnellen und vor allem uniformen Aktivierung an der Fremdoberfläche. LEVENTHAL et al. (1992b) hingegen konnten anti-MS-Antikörper nachweisen, so dass eine Aktivierung des Komplementsystems über den klassischen Weg nicht ausgeschlossen werden kann.
Abb. 2. Schematische Darstellung der Komplementkaskade Quelle: SAHUL u. LAMBRIS, 2000.
2.2.2 Inhibition des Komplementsystems
Komplementregulierende Proteine schützen die körpereigenen Zellen vor einer Schädigung durch aktivierte Komplementkomponenten. Zu diesen Regulatoren gehören u.a. die membranständigen Glykoproteine DAF (Decay Accelerating Factor, CD55), MCP
(Membrane Cofactor Protein, CD46) und Protektin (CD59). C2b wird aus dem Komplex C4b—C2b, der die C3/C5-Konvertase des klassischen Weges darstellt, vom DAF verdrängt.
MCP unterstützt die C3b- und C4b-Inaktivierung durch den Faktor I, so dass ebenfalls die C3/C5 Konvertase gestört wird. Die Aktivität der terminalen Komplementkomponenten und die Inhibition der Bildung des MAC auf homologen Zellen werden von CD59 reguliert.
Allerdings wurden nur eingeschränkte Kontrolleigenschaften durch diese Proteine auf heterologe Komplementkomponenten gezeigt (ATKINSON et al., 1991). Für eine komplementvermittelte Beschädigung sind Xenotransplantate daher sehr empfänglich (MIYAGAWA et al., 1988; PLATT et al., 1990b; DALMASSO et al., 1991).
Als Ansatz zur Verhinderung einer HAR durch Komplementaktivierung kann also die verstärkte Expression der Komplementregulatoren des Empfängers auf dem Transplantat gesehen werden. Gerade bei der Spezieskombination Schwein/Mensch wurden enorme Anstrengungen unternommen, transgene Schweine zu züchten, die zusätzlich humane Komplementregulatorproteine exprimieren (PLATT et al., 1990b; LOGAN u. SHARMA, 1999; WOLF et al., 1999). Verschiedene Arbeitsgruppen haben humane Komplementregulatoren in transgenen Schweinen exprimieren können (CARY et al., 1993;
COZZI u. WHITE., 1995; McCURRY et al., 1995). Mit Primatenarten als Empfänger solch genetisch veränderter Organe wurden verschiedene Experimente durchgeführt und sie haben bereits ein verlängertes Transplantatüberleben von maximal 60 Tagen gezeigt (McCURRY et al., 1995; SCHMOECKEL et al., 1997; SCHMOECKEL et al., 1998; WHITE et al., 1996;
WINKLER u. SCHLITT, 1999; LOSS et al., 2000a; LOSS et al., 2000b). Für eine deutliche Erhöhung der Überlebenszeit musste zusätzlich ein starkes immunsuppressives Regime eingesetzt werden.
Die allgemeine Schlussfolgerung, dass transgene Schweine, die humane Komplementregulatoren exprimieren, eine HAR aufgrund der spezifischen Komplementregulation überwinden können, ist nicht unumstritten. Inzwischen wurden porcine Moleküle identifiziert, die als Homologe zu humanem CD59 und MCP die Wirkung von sowohl humanem als auch porcinem Komplement in vitro inhibieren können (VAN DEN BERG u. MORGAN, 1994; VAN DEN BERG et al., 1997; HANNA et al, 1998; PEREZ DE
LA LASTRA et al., 1999). Zudem wurde beobachtet, dass sich bei Nierentransplantationen der Kombination Schwein/Primat bzw. Schwein/Cynomolgus zum Teil keine HAR ereignet (McCURRY et al., 1995; LAMBRIGTS et al., 1998; LOSS et al., 2000c).
Um eine Komplementaktivierung und in Folge eine HAR bei der Xenotransplantation zu vermeiden, werden neben den membranständigen Komplementregulatoren auf Zellen von transgenen Tieren auch eine lösliche Form des Komplementrezeptors 1 (sCR1) eingesetzt.
Dieses Molekül bindet zum einen an C3b und C4b, wodurch die Wirkung der C3- Konvertasen C3bBb3b und C4b2a3b inhibiert wird. Zum anderen ist der sCR1 Kofaktor von Faktor I und katalysiert die proteolytische Spaltung von C3b und C4b. Der sCR1 stellt also einen potenten Inhibitor sowohl des klassischen als auch des alternativen Weges dar. Somit wird sowohl die Bildung der Anaphylatoxine C3a und C5a als auch die Bildung des MACs verhindert. Der rekombinante humane Komplementinhibitor sCR1 wurde bereits erfolgreich im Xenotransplantationsmodell MS/Ratte eingesetzt. Dieser Einsatz führte zu einer deutlichen Verlängerung der Überlebenszeit eines diskordanten Herztransplantates von wenigen Minuten bis auf 30 Stunden (CANDINAS et al., 1996e; PRUITT et al., 1991; XIA et al., 1992). Der humane Inhibitor ist in Ratten jedoch weniger potent und musste deswegen in relativ hohen Dosen verabreicht werden.
Der Cobra Venom Faktor (CVF) findet häufig bei Xenotransplantationen von MS auf Ratte Anwendung, um das Komplementsystem zu inhibieren. Die antikomplementäre Wirkung von CVF, ein Bestandteil des Schlangengiftes der Königskobra (Naja naja kouthia), wurde bereits 1903 von FLEXNER u. NOGUCHI beschrieben. Der inaktivierende Effekt auf die 3.
Komponente des Komplementsystems wurde von RITZ (1912) gezeigt. Das etwa 140 kD schwere Glykoprotein CVF ahmt funktionell C3b, die aktivierte Form der 3.
Komplementkomponente nach (VOGEL et al., 1984). In Folge dessen entstehen sogenannte CVF-abhängige C3/C5-Konvertasen, die als Serinproteasen die α-Kette von C3 an der Peptidbindung 77 (Arg-Ser) und die α-Kette von C5 an der Peptidbindung 74 (Arg-Leu) spalten, so dass C3b und C5b gebildet und die Anaphylatoxine C3a und C5a freigesetzt werden. Die gravierenden Unterschiede der CVF-abhängigen Konvertase zu dem C3b- abhängigen Enzym sind:
1.) der wesentlich langsamere Abbau (VOGEL u. MÜLLER-EBERHARD, 1982),
2.) die Resistenz gegenüber der Inaktivierung durch die Regulatorproteine Faktor H und Faktor I (LACHMANN u. HALBWACHS, 1975; NAGAKI et al., 1978)
3.) die Unabhängigkeit von C3b für die C5-Spaltung (MIYAMA et al., 1975; VON ZABERN et al., 1980).
Allerdings ist der Einsatz von CVF zur Komplementdepletion bei der Xenotransplantation nicht problemlos. CVF muß ausreichend hoch dosiert werden, da auch geringe Komplementkonzentrationen im Serum ausreichend sind, um eine hyperakute Abstoßung zu induzieren (IHRCKE et al., 1993). Zudem ist nicht aufgereinigtes CVF als Schlangengift hochtoxisch. Es enthält u.a. die Phospholipase A2, die bei Verwendung von unaufgereinigtem CVF zu einer Erythrozytenlyse führt (SCHIRMER et al., 1988; LACHMANN et al., 1976).
Außerdem kommt es durch die ständige Aktivierung des Komplementsystems zu einer vermehrten Bildung der Anaphylatoxine C3a und C5a (WARD et al., 1985). Diese können Veränderungen in Organen, wie z.B. der Lunge, hervorrufen oder sie können an den morphologischen Veränderungen der Transplantate durch Erhöhung der Zellinfiltrate beteiligt sein (CANDINAS et al., 1996e). Es konnte aber gezeigt werden, dass die Anaphylatoxine nicht die einzigen Mediatoren der HAR sind (PRUITT et al., 1996). CVF gilt als starkes Immunogen und kann somit eine humorale Antwort hervorrufen, die im Gegenzug die Effektivität der Komplementdepletion reduziert (CANDINAS et al., 1996e).
Eine weitere Möglichkeit zur Vermeidung der HAR durch Aktivierung des Komplementsystems ist die Verwendung einer komplementdefizienten Empfängerspezies. Im MS/Ratte Modell kann der C6-defiziente Rattenstamm PVG/Lei-C6m als Empfänger eingesetzt werden. Dieser Rattenstamm mit autosomal-rezessivem Erbgang, dem die Fähigkeit zur Aktivierung des C5b-9-Membranangriff-Komplexes fehlt, wurde 1994 beschrieben (LEENAERTS et al., 1994). Es gibt keinen Hinweis für eine Deletion innerhalb des C6-Gens, denn die für C6 kodierende mRNA wurde bei PVG/Lei-C6m -Ratten in der gleichen Größe wie bei den komplementkompetenten PVG-Ratten in der Leber nachgewiesen, wenn auch in etwa 100mal niedrigeren Konzentrationen (VAN DIXHORN et al., 1997). Die C6-Defizienz beruht möglicherweise auf einer instabilen mRNA, einer Punktmutation im C6-Gen und damit einer aberranten Transkription oder auf einer Mutation
in einem Gen, das für ein in die C6-Biosynthese involviertes Produkt kodiert. Die PVG/Lei-C6m Ratten zeigen trotz C6-Defizienz und nur 10% des Serumspiegels an C2 gegenüber komplement-kompetenten Tieren (PVG) keine Krankheitsanzeichen. Werden die PVG-Ratten mit Defekt in der terminalen Endstrecke des Komplementsystems als Empfänger eines heterotop transplantierten Meerschweinchen-Herzens eingesetzt, so verlängert sich das Transplantatüberleben von 26 Minuten (komplementkompetenter PVG-Stamm) auf 24 bis 48 Stunden (BRAUER et al., 1993).
2.2.3 Xenoreaktive natürliche Antikörper (XNA) bei der HAR
Bei einer Xenotransplantation im diskordanten Tiermodell ist das Vorhandensein präformierter, gegen Zelloberflächenantigene des Spenders gerichtete Antikörper im Empfänger eine entscheidende Komponente während der HAR. Die präformierten xenoreaktiven Antikörper werden ohne bekannte Sensibilisierung synthetisiert (BOYDEN, 1964; HAMMER, 1989), darunter auch solche, die an die Oberfläche von Zellen völlig unverwandter Spezies ohne vorherige Immunisierung binden (PLATT et al., 1990a; WHITE u. NICHOLSON, 1999). Daneben gibt es induzierte xenoreaktive Antikörper, die ebenfalls das Xenotransplantat schädigen.
Bei der Immunpathogenese der HAR wurde der Einfluß der XNA durch folgende Beobachtungen bestätigt:
1. XNA lagern sich schnell in einem Xenotransplantat ab (GILES et al., 1970; PLATT et al., 1991).
2. Eine Depletion der XNA verhindert die HAR eines nachfolgend xenotransplantierten Organs (PERPER u. NAJARIAN, 1966; ROSE et al., 1991).
3. In einigen Spezieskombinationen tritt keine HAR auf, wenn ein neugeborener Empfänger verwendet wird, der noch keine XNA besitzt (KAPLON et al., 1995)
4. Die HAR kann durch die Gabe von XNA im Xenotransplantat-Empfänger induziert werden (PERPER u. NAJARIAN, 1967).
Bei der Schwein/Primat-Kombination spielen die XNA eine Schlüsselrolle durch die Aktivierung der klassischen Komplementkaskade bei der HAR während der Xenotransplantation. Das Hauptepitop humaner präformierter XNA auf Schweineorganen ist das Zuckerepitop Galaktosyl α1-3-Galaktose (Galα1-3Gal) (GALILI et al., 1984; GALILI, 1993, ORIOL et al., 1993; COLLINS et al., 1995). Die Synthese dieses Zuckerepitops wird durch das Enzym α1,3-Galaktosyltransferase katalysiert, das in den Zellen aller niedrigeren Säugetiere und der Neuen-Welt-Affen vorhanden ist. Dieses Enzym wird jedoch nicht von Menschen, Menschenaffen und Alte-Welt-Affen exprimiert. Sie besitzen damit auch keine entsprechenden Zuckerepitope (GALILI et al., 1988). Zirkulierende XNA bilden eine humorale Abwehr gegen Bakterien der Darmflora, welche ebenfalls Galα1-3Gal Epitope besitzen und so einen initialen Abwehrmechanismus gegen invasive Mikroorganismen bilden (CASALI u. NOTKINS, 1989).
Bei der HAR im MS/Ratte Modell scheinen präformierte XNA vom IgM-Isotyp wie bei der Kombination Schwein/Primat eine Rolle zu spielen, da sie als Ablagerungen im abgestoßenen Transplantat gefunden werden. Nach Depletion der XNA mit einem anti-µ-Antikörper wurde ein verlängertes Transplantatüberleben erzielt (SOARES et al., 1994). Welche Zielepitope von den XNA der Ratten an MS-Zelloberflächen erkannt werden, ist im Gegensatz zur Situation Schwein/Primat noch nicht eindeutig geklärt. CALMUS et al. (1993) berichteten, dass anti-MS-IgM- und -IgG-Antikörper der Ratte mehrere Proteine unterschiedlicher Molekulargröße aus Homogenaten von MS-Lunge, -Niere, -Leber oder -Herz erkannten.
Die B-Zellen, die XNA produzieren, haben eine Anzahl einzigartiger Eigenschaften (AVRAMEAS u. TERNYNCK, 1993). Sie gehören wahrscheinlich zu den B1-B-Zellen im Gegensatz zu den herkömmlichen B2-B-Zellen, die für die erworbene Antikörperantwort verantwortlich sind (HERZENBERG et al., 1992). Die B1-B-Zellen, die das Antigen LY-1 exprimieren, werden noch einmal unterteilt in die B1a (CD5+) und B1b (CD5-) Zellen (KANTOR u. HERZENBERG, 1993). Den CD5+ Zellen wird die Immunantwort gegen Thymus-unabhängige (TI: Thymus Independant) Antigene zugesprochen, d.h. die Stimulation der B-Zellen erfolgt ohne Hilfe der T-Zellen (KASAIAN et al., 1992). Zu diesen Antigenen
zählen auch solche mit repetitiven Epitopen, wie z.B. Polysaccharide (TEUTSCH et al., 1995), die von einigen XNAs erkannt werden (SANDRIN u. McKENZIE, 1994).
2.2.4 XNA-Depletion
Vielfältige Methoden werden angewendet, um XNA bzw. deren Aktivität zu reduzieren.
Aufgrund der guten Kenntnisse der von XNA erkannten Epitope wurde im Modell Schwein/Primat durch Gabe von löslichen Sacchariden versucht, die Bindung Antikörper-Antigen zu blockieren (YE et al., 1994). Damit war man nicht sehr erfolgreich, da nur ca. 70% der XNA geblockt werden konnten und die einzusetzende Menge an Zucker toxisch war. Eine weitere Möglichkeit ist die Züchtung von Schweinen, die die Zuckerepitope Galα1-3Gal nur in geringem Maße exprimieren (OSMAN et al., 1997; SHARMA et al., 1996;
SANDRIN et al., 1995).
Daneben können auch verschiedene Immunsuppressiva zur Reduktion der XNA eingesetzt werden. Verwendung finden Cyclophosphamid (WATERWORTH et al., 1997), Tacrolismus, 15-Desoxyspergualin (DSG) und Leflunomid.
Um in Ratten anti-MS-Antikörper zu reduzieren oder zu depletieren, wurden verschiedene B- Zell-supprimierende Medikamente eingesetzt. SOARES et al. (1994) verlängerten das Überleben eines heterotop auf Ratte transplantierten MS-Herzens durch den Einsatz eines monoklonalen anti-µ-Antikörpers mit totaler Reduktion der IgM-XNA von 18 auf 62 Minuten. Eine Ganzkörperbestrahlung mit anschließender syngener Knochenmarkstransplantation kombiniert mit Splenektomie reduzierte die XNA in Ratten praktisch völlig, führte aber im Vergleich zu unbehandelten Tieren zu keiner Steigerung des Transplantatüberlebens (19 Minuten). Ein deutlich verlängertes Transplantatüberleben von 6 Tagen wurde erst durch die Kombination mit Depletion des Komplementsystems durch CVF erzielt (SCHERINGA et al., 1995a; SCHERINGA et al., 1995b). Im MS/Ratte-Modell kam auch DSG zum Einsatz, welches die terminale Differenzierung von T- und B-Zellen blockiert (CHIKARAISHI et al., 1995) und die XNA-Produktion reduziert (FLORES et al., 1992).
Splenektomie und Plasmapherese zusammen mit DSG erhöhte das Überleben eines in eine Ratte transplantierten MS-Herzens nur geringfügig von 20 Minuten auf 35 Minuten (LEVENTHAL et al. 1992a). Wiederum in Kombination mit der Komplement-Inhibition durch CVF ergab die Applikation von DSG in splenektomierten Ratten ein erhöhtes Transplantatüberleben eines MS-Herzens von 108 Stunden (HANCOCK et al., 1997a).
Ein weiteres B-Zell-Suppressivum, das tierexperimentell bei der Xenotransplantation verwendet wird, ist Leflunomid. Diese Substanz ist bereits als Medikament für die klinische Behandlung der rheumatoiden Arthritis beim Menschen zugelassen.
Von BARTLETT u. SCHLEYERBACH wurde in den frühen 80er Jahren die immunsuppressive Wirkung des Isoxazol-Derivates Leflunomid (N-(4’- trifluoromethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid) entdeckt (BARTLETT et al., 1994).
Leflunomid wird in vivo schnell in den aktiven Metaboliten A77 1726 konvertiert. A77 1726 werden 2 biochemische Aktivitäten zugeschrieben. Es handelt sich dabei zum einen um die Inhibition der Protein-Tyrosin-Kinasen und zum anderen um die Inhibition der Dihydroorotat- Dehydrogenase, die als Schlüsselenzym bei der de novo-Synthese von Pyrimidin-Nukleotiden beteiligt ist (XU et al., 1996; CHERWINSKI et al., 1995; GREENE et al., 1995). Pyrimidin- Nukleotide wiederum werden für einige lebensnotwendige Zellfunktionen benötigt, wie der Synthese von RNA, DNA, Glykoproteinen und Phospholipiden.
Die Behandlung mit Leflunomid führt unter anderem zur Inhibition von vielfältigen Funktionen von T-Zellen und Makrophagen (MORRIS, 1995) sowie zur direkten Inhibition der B-Zell-Proliferation und Antikörper-Synthese (SIEMASKO et al., 1996). Das Medikament wurde erfolgreich in der Xenotransplantation zur Verlängerung des Transplantatüberlebens und auch in der Allotransplantation eingesetzt (BARTLETT et al., 1991). Leflunomid blockiert sowohl durch Reduktion der CD5+B-Lymphozyten die Hemmung der T-Zell-unabhängigen Bildung von XNA des IgM-Isotyps (LIN et al., 1998a), als auch die Induktion solcher Antikörper durch Inhibition der Expression induzierbarer Xenoantigene wie E- und P-Selektin (LIN et al., 1998b). Durch Leflunomid in Kombination mit dem Komplementinhibitor CVF wurde eine Erhöhung eines heterotop in Ratte transplantierten MS-Herzens auf 129 Stunden erzielt, wohingegen die alleinige Gabe von
CVF ein Überleben von 62 Stunden bewirkte (HANCOCK et al., 1997a; MEYER ZU VILSENDORF et al., 2001).
2.3 Verzögerte Abstoßung eines Xenotransplantates (DXR)
Wenn die HAR eines Xenotransplantates durch therapeutische Maßnahmen, wie z.B.
Modulation der Komplementaktivierung und/oder Entfernung der XNA, verhindert wird, kommt es nach einigen Tagen zu einer T-Zell-unabhängigen Abstoßung (CANDINAS et al., 1996a), der verzögerten Transplantatabstoßung (DXR). Dieser Prozess wird gleichbedeutend auch als akute vaskuläre Abstoßung (AVR: Acute Vascular Rejection) bezeichnet. Bei der DXR kommt es zu einer Aktivierung von Endothelzellen des Transplantates, zur Aggregation von Blutplättchen mit Fibrinablagerungen sowie zu einer Aktivierung mononukleärer Zellen des Empfängers. Dieses führte zu einer fortschreitenden Infiltration des Transplantates durch Monozyten, Makrophagen und Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) (BACH et al., 1996;
HANCOCK, 1997b). Von der pathologischen Seite her ist dieser Prozess durch Endothelzellschädigung und Schwellung, Ischämie und Thrombose gekennzeichnet. Die Pathomechanismen dieser Form der Abstoßungsreaktion sind zur Zeit noch unvollständig verstanden, wenngleich eine Reihe wesentlicher Erkenntnisse aus in vivo-Versuchen in konkordanten und diskordanten Kleintiermodellen (Hamster bzw. Meerschweinchen / Ratte) und bei Primaten (Schwein/Pavian) erzielt wurden (CANDINAS et al., 1996b; KOBAYASHI et al., 1997).
2.3.1 Aktivierung der Endothelzellen bei der DXR
Als Folge einer kontinuierlichen Interaktion mit XNA, Monozyten und NK-Zellen wird die Endothelzelle aktiviert und in einen prokoagulatorischen Zustand versetzt (BACH et al., 1995; BACH et al., 1997b; CANDINAS et al., 1996a; LIN et al., 1998c). Die Rolle des Komplementsystems bei der Pathogenese der DXR wird noch nicht vollständig verstanden,
denn die DXR wurde bisher nur in Komplement-inhibierten Empfängern beobachtet.
Histologische Untersuchungen der durch DXR abgestoßenen Transplantate zeigen neben Ablagerungen von XNA auch Komplementablagerungen.
Während der DXR werden Endothelzellen aktiviert. Hierbei spricht man vom Typ II der Endothelzellaktivierung, da sie mit der Induktion der Transkription von Genen und Synthese von Proteinen einhergeht (POBER u. COTRAN, 1991) (Abb. 3). Durch die Induktion der für die Adhesionsmoleküle E-Selektin, P-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 u. a. kodierenden Gene wird der Kontakt zwischen Leukozyten und Endothel vermittelt (SCARPATI u.
SADLER, 1989). Proinflammatorische Gene werden über NF-κB hochreguliert, wodurch im Folgenden Zytokine und Chemokine, wie IL1, IL6, IL8 und Monozyten Chemoattraktant Protein (MCP-1), freigesetzt werden (SOARES et al., 1998a). Des weiteren werden die Gene für den Gewebefaktor (TF: Tissue Factor) und PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) hochreguliert, die als Regulatoren der Gerinnungsaktivierung eine wichtige Rolle spielen (MACKMAN et al., 1991; MACKMAN et al., 1990). Der Endothelzelloberfläche stehen Thrombomodulin und andere Moleküle mit antikoagulatorischer Funktion nicht mehr zur Verfügung (GERRITSON u. BLOOR, 1993; BACH et al., 1993). Bei der Aktivierung der Endothelzellen während der DXR spielen auch Inkompatibilitäten xenogener Rezeptor- Ligand-Interaktionen eine wesentliche Rolle. Genannt sei die gestörte Funktion von porcinem Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) oder von porcinem von-Willebrand-Faktor (ROBSON et al., 1999).
Abb. 3: Schematische Darstellung der Typ II Endothelzell-Aktivierung und der verzögerten Abstoßung (DXR).
Quelle: Bach et al., 1995.
2.3.2 Natürliche Killerzellen bei der DXR
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) repräsentieren eine dritte, getrennte, lymphoide Zellpopulation. Sie sind Bestandteil des angeborenen Immunsystems (JANEWAY et al., 1999). Die peripheren Blutlymphozyten bestehen zu mehr als 20% aus NK-Zellen, welche phänotypisch durch die Oberflächenexpression von CD 16 (der low-affinity Rezeptor des Fc- Anteils von Immunglobulin G [IgG]) und CD 56, welches homolog zu dem Neural-Zell- Adhäsionsmolekül (NCAM) ist, charakterisiert sind. Im Gegensatz zu den übrigen B- und T- Lymphozyten sind die NK-Zellen relativ groß und durch typische zytoplasmatische, azurophile Granula charakterisiert. Aufgrund dieser morphologischen Merkmale werden sie auch „große granulierte Lymphozyten“ genannt (TRINCHIERI, 1989).
NK-Zellen werden hauptsächlich auf funktioneller Basis identifiziert, d.h. als Hintergrund zytolytischer Aktivität bei Studien, die auf die Identifizierung bei Antitumor-Antworten abzielen. Lymphozyten von nicht-immunisierten Tieren wurden gefunden, welche bestimmte Tumoren lysieren können. Bei den Effektorzellen, die für diese Funktion verantwortlich sind,
wurde angenommen, dass sie einen anderen Zelltyp als die T-Lymphozyten repräsentieren, weil ihre Aktivität sowohl in athymischen, als auch in SCID-Mäusen (Severe Combined Immunodeficiency = streng kombinierte Immundefizienz) detektiert wurde.
NK-Zellen stellen eine erste Linie der Verteidigung gegen Tumoren und virale Infektionen bereit (TRINCHIERI, 1989). Die Aktivierung von NK-Zellen resultiert nicht nur in der Induktion ihrer zytolytischen Aktivität, sondern auch in der Produktion von Zytokinen, welche eine regulatorische Rolle bei der Immunantwort, Entzündungsreaktion und Hämatopoese ausüben können (TRINCHIERI,1995; BELLONE et al., 1993). Die Fähigkeit der NK-Zellen, Tumorzellen, aber keine normalen Zellen zu detektieren und zu lysieren, wurde interpretiert als Reflektion der Existenz von multiplen Rezeptoren für ein verändertes Muster der Ligandenmoleküle auf Tumorzellen. Fortschritte wurden vor kurzem bei dem Verständnis der funktionellen Möglichkeiten der NK-Zellen gemacht, besonders bei den Mechanismen, durch welche die NK-Zellen gegebene Zielzellen lysieren (MORETTA et al, 1992; MORETTA et al., 1994; MORETTA et al., 1996). Eine Zahl vermeintlicher Rezeptoren, welche möglicherweise bei der NK-Zell-Aktivierung involviert sind, wurden identifiziert. Wichtig scheint, dass eine inverse Korrelation zwischen der Expression von Oberflächen MHC-Klasse-I-Molekülen auf den Zielzellen und ihrer Empfänglichkeit für NK- Zell-vermittelte Lyse nachgewiesen wurde (LJUNGGREN u. KÄRRE, 1985; STORKUS et al., 1987).
2.3.3 Makrophagen bei der DXR
Makrophagen sind große, einkernige, phagozytierende Zellen, die der unspezifischen Abwehr dienen. Sie tragen, wie NK-Zellen, auf ihrer Zelloberfläche zum einen Rezeptoren für den Fc- Teil von Immunglobulinen, durch deren Bindung die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC: Antibody Dependant Cell mediated Cytotoxicity) der durch Immunglobulin markierten Zelle vermittelt wird. Auf der Oberfläche der Makrophagen finden sich auch Komplementrezeptoren für C3b und C4b, deren Bindung zur Stimulation der
Phagozytose führt. Daneben besitzen sie auch Rezeptoren für verschiedene Bestandteile von Mikroorganismen, wie Mannoserezeptoren, Scavenger Rezeptoren und Rezeptoren für Lipopolysaccharide. Der aktivierte Makrophage nimmt nach der Bindung Zellen in ein Phagosom auf, das dann mit Lysosomen verschmilzt. In den Lysosomen sind Substanzen enthalten, die zur Schädigung der „Fremdzellen“ durch Ansäuerung, toxische Sauerstoff- und Stickstoffderivate, aber auch durch antimikrobielle Peptide oder Enzyme führen.
Fremdpeptide werden auf den MHC-II-Molekülen des Makrophagen präsentiert und bei gleichzeitiger Expression von Kostimulatoren, wie B7, kommt es zur Proliferation und Differenzierung von T-Zellen. Daneben setzen aktivierte Makrophagen auch proinflammatorische Zytokine, wie TNF α und IL12 frei (WESTERFELDER et al., 1993).
Mononukleäre Zellen des Empfängers können bei der Xenotransplantation über Interaktion ihrer Fc-Rezeptoren mit endothelständigen XNA sowie über induzierte Adhäsionsmoleküle oder Lektin-abhängige Interaktion mit dem Endothel im Transplantat in Kontakt treten. In dem diskordanten Xenotransplantationsmodell MS/Ratte scheint für die Rekrutierung der Monozyten die Expression von Lektin auf der Makrophagenoberfläche für die Bindung an Kohlenhydrat-Strukturen auf den Endothelzellen des Empfängers verantwortlich zu sein (HANCOCK et al., 1997a). Dieses Lektin ist Makrophagen-spezifisch und gehört wie der Rezeptor NKR-P1 von NK-Zellen zu den TYP II-Transmembranproteinen. Diese Reaktionen mononukleärer Zellen können auch durch thrombininduziertes Fibrin und durch chemotaktische Zytokine gefördert werden (COLOTTA et al., 1994).
2.4 Abstoßungsreaktionen, die durch T-Zellen vermittelt werden
Lange Zeit wurde die Erkennung von xenogenen Antigenen und Zellen durch T- Lymphozyten kontrovers diskutiert. Die Interaktionen der beteiligten Erkennungsmoleküle auf T-Zellen (T-Zell-Rezeptor, CD4, CD8, Kostimulationsmoleküle) mit den korrespondierenden Molekülen auf den Antigen-präsentierenden Zellen (APC) sind hochgradig abhängig von der jeweiligen Spezieskombination. Jedoch scheint in der potentiell klinisch relevanten Kombination Schwein/Primat die xenogene T-Zell-Erkennung der
allogenen in Stärke und Dynamik in etwa gleichwertig zu sein. SACHS u. SABLINSKI (1995) zeigten sogar, daß die zelluläre Antwort gegen ein Xenotransplantat noch stärker ausfällt als bei einer Allotransplantation, so dass eine adäquate Immunsuppression nur sehr schwer aufrecht erhalten werden kann.
Die limitierten Überlebenszeiten von experimentellen Nieren- und Herztransplantationen von Schwein auf Primaten, sowie der Einsatz einer massiven Immunsuppression lassen die Rolle der T-Zell-vermittelten Abstoßung in vivo nur schwer klären. In vitro-Studien hingegen belegen, dass porcine Antigene sowohl direkt (Antigen-Präsentation durch xenogene MHC- Moleküle auf xenogenen Zellen), als auch indirekt (Antigen-Präsentation durch eigene MHC- Moleküle auf eigenen Antigen-präsentierenden Zellen) von menschlichen T-Lymphozyten erkannt werden, und so zu Proliferation und Zytotoxizität führen (MOSES et al., 1990;
MURPHY et al., 1996; YAMADA et al., 1995).
2.5 Toleranz
Eine erfolgreiche Xenotransplantation beim Menschen scheint eine Spender-spezifische Toleranz zu erfordern. Ein toleranter Status, bei dem das Immunsystem des Empfängers die Antigene des Spenders als „selbst“ wahrnimmt, würde zudem eine chronische, immunsuppressive Therapie überflüssig machen. Somit wären auch die Nebenwirkungen, wie Infektionsgefahr, Toxizität und Entstehen von malignen Tumoren, einer solchen Dauertherapie vermieden und gleichzeitig wäre die Gefahr einer Abstoßung eliminiert. Durch den Einsatz von xenogenen Spendern ist die Möglichkeit gegeben, Toleranz-induzierende Zellen (z. B. Knochenmark) vom Spender vor der Transplantation eines Organs von demselben Tier zu gewinnen. Zur Erzeugung von B- und T-Zell-Toleranz werden zur Zeit sowohl die xenogene Thymustransplantation, als auch der Zustand des gemischten Blutstammzellen-Chimerismus nach Knochenmarkstransplantation untersucht (SYKES et al., 1997; YANG et al., 1998; KOZLOWSKI et al., 1999).
Im konkordanten Tiermodell Hamster/Ratte konnte durch Infusion mit Donorantigen, transienter NK-Zell-Depletion und einer 4-wöchigen Gabe des B-Zellsuppressivums Leflunomid eine NK- und B-Zell-Toleranz mit Langzeitüberleben des Transplantats in T-Zell-defizienten Nacktratten, auch nach Absetzen der Immunosuppression, beobachtet werden (LIN et al., 1998c). Es wurden keine anti-Hamster-Antikörper generiert (B-Zell- Toleranz) und ein zweites Transplantat von Spender-Spezifität (Hamster) wurde spezies- spezifisch toleriert, wohingegen ein Transplantat einer dritten Spezies (Maus) abgestoßen wurde.
2.6 Physiologische Barrieren
Sollte die Xenotransplantation gelingen, ist die Frage nach physiologischen Kompatibilitäten zu klären. Zum einen ist wichtig, ob das Xenotransplantat die Funktion des geschädigten Organs vollkommen übernehmen kann, z. B. ob ein Schweineherz den normalen Blutdruck und die normale Organdurchblutung im Menschen aufrecht halten kann. Wenn Schweine mit einem Gewicht ähnlich wie erwachsene Menschen untersucht werden, zeigen ihre Organe ein vergleichbares Gewicht und Volumen (GROTH, 1998). Erste Untersuchungen scheinen die Ähnlichkeit von kardiovaskulären Parametern, wie Blutdruck und Herzausstromvolumen, zwischen Schweinen entsprechender Größe und erwachsenen Menschen zu belegen (SOIN et al., 2000)
Zum anderen ist aber auch noch die Frage der molekularen Kompatibilität offen (für eine Zusammenfassung s. SCHRAA et al., 1999). Moleküle, die in einer bestimmten Art interagieren, funktionieren eventuell nicht, wenn ein Teil vom Spender kommt und der andere vom Empfänger. Wie bereits oben erwähnt, zeigen beispielsweise die Komplementregulatoren zwischen verschiedenen Spezies keine oder nur unzureichende Wirkung. Aber auch andere Systeme können nach Xenotransplantationen gestört sein. So zeigten LAWSON et al. (1997), dass porcines Thrombomodulin nicht mit menschlichem
Thrombin interagieren kann, so dass es zu einem Defekt bei der Aktivierung des Protein C und dadurch zu einem prokoagulanten Status kommt.
Die aus dem Tiermodell abgeleiteten Ergebnisse hinsichtlich der physiologischen Kompatibilitäten können nicht ohne weiteres auf die relevante Spezieskombination Schwein/Mensch übertragen werden, liefern aber wichtige Hinweise auf die zu beachtenden Komponenten.
3 Experimenteller Teil
Tiere, Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.1 Tiere und Tierhaltung
Verwendet wurden männliche Ratten des Stammes LEW/Ztm bzw. LEW/Crl (in Folge mit LEW bezeichnet) aus der Zucht des Zentralen Tierlabors der MHH bzw. von Charles River Laboratories (Sulzfeld). Als Rattenstamm mit C6-Defizienz wurden männliche PVG/Lei-C6m –Ratten (in Folge mit PVG/Lei-C6m bezeichnet) eingesetzt. Die ersten Zuchtpaare des PVG/Lei-C6m Rattenstammes wurden von M. Daha, Universität Leiden, zur Verfügung gestellt und in der Folge im Zentralen Tierlabor der MHH gezüchtet. Die Ratten wurden in Gruppen bis zu vier Tieren in Makrolonkäfigen Typ III auf staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Die Raumtemperatur lag für alle Tiergruppen bei 22 ± 2 °C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 ± 5%, die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt. Die Ratten wurden mit einem pelletierten, autoklavierten Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage, D) [Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,00%, Rohfett 4,00%, Rohfaser 6,00%, Rohasche 7,00%, Rohwasser 10,00% und 54,00% N-freie Extraktstoffe;
Zusatzstoffe (je kg): Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg] gefüttert.
Für die Transplantation wurden Dunkin Hartley Meerschweinchen (Crl:HA) von Charles River Laboratories (Sulzfeld) als Organspender verwendet. Für die Präparation von Membranextrakten zum Nachweis von XNA, von Zielzellen für den Zytotoxizitätstest und als Antigen-Donor wurden C2BB/R+ MS aus Zucht des Zentralen Tierlabors der MHH eingesetzt. Bei diesem Tieren handelt es sich um im Komplementfaktor C2 defiziente MS (BITTER-SUERMANN u. BURGER, 1986). Die Meerschweinchen wurden in Gruppen mit bis zu 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ IV gehalten. Diese Tiere wurden mit einem pelletierten, autoklavierten V-Alleinfutter für Meerschweinchen-Zucht MS-Z, 4 mm der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH (Soest) [Energiequelle: Rohprotein 19,00%, Rohfett 3,30%, Rohfaser 12,00%, Rohasche 7,70%, Rohwasser 12,00% und somit 46,00% N-freie
Extraktstoffe; Zusatzstoffe: Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 1.000 IE, Vit. C. 1.500 IE , Vit. E 100 mg] gefüttert. Als Nahrungsergänzung bekamen sie autoklaviertes Heu.
Zur Wasserversorgung wurde steriles Leitungswasser für die Ratten aus Tränkeflaschen und für die Meerschweinchen aus Nippeltränken ad libitum bereitgestellt. Die Tiere wurden regelmäßig jedes Quartal auf das Vorkommen von Erregern entsprechend der Liste GV- SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1992) untersucht.
Das Gewicht richtete sich nach dem Verwendungszweck und lag bei den Ratten zwischen 250 und 350 g und bei den Meerschweinchen zwischen 300 und 500 g.
Genehmigung
Das Tierversuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Hannover unter der Nummer TS 97/970 genehmigt.
3.2 Geräte
Anionenaustauscher
- Mono Q (Pharmacia, Uppsala, S) Bipolar
- Minicutter 80 (Hüttinger Medizintechnik GmbH & Co KG, Umkirch)
Brutschränke
− Modell B5090E (Heraeus, Osterode)
− Modell B5060E (Heraeus, Osterode)
Durchflußzytometer
- FACScanTM (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg)
ELISA-Reader
- Titertek Multiskan® MCC/340 (Flow Laboratories, Meckenheim)
Glucometer
- Elite (Bayer Diagnostics, München)
Heizblock
- Blockthermostat BT 100 (Kleinefeld Labortechnik)
Kryostat
- 2800 Frigocut E (Reichert-Jung)
Mikroskope
− ID03 (Zeiss, Oberkochem)
− Photomikroskop II (Zeiss, Oberkochem) mit Sony Videokamera CCD DXC-151 AP
− Photomikroskop III (Zeiss, Oberkochem) mit Mikroskopkamera MC 80 DX (Zeiss, Oberkochem)
- Operationsmikroskop OPMI 1- DFC (Zeiss, Oberkochem)
- Axioskop (Zeiss, Oberkochem) und Mikroskopkamera (Zeiss, Oberkochem)
Photosystem
− Leuchttisch, UV-Kontaktlampe Chroma 43, 302nm (Vetter)
− Kamera, E.A.S.Y. 429K (Herolab)
− Videodokumentation E.A.S.Y. RH-3 (Herolab) mit Video Copy Processor p68E (Mitsubishi)
pH-Meter
- Calimatik 761 (Jürgens)
Zentrifugen
- Kühlzentrifuge, Modell J2-21 (Beckmann) - OptimaTLX Ultrazentrifuge (Beckmann) - Minifuge RF (Heraeus, Osterode)
Waagen
- Sartorius 2002 MP1 (Sartorius, Göttingen) - Sartorius 1364 MP (Sartorius, Göttingen)
- Soehnle domino, Elektronische Küchenwaage 8036.02.900 (Soehnle)
3.3 Verbrauchsmaterial
3.3.1 Einmalmaterial
Desinfektion
- Softasept N (Braun, Melsungen)
Einbettmedium
- Jung EINBETTMEDIUM (Leica Instruments GmbH, Nussloch)
Filme
− Elite chrome 200, ISO 200/21°, 36 Exp. (Kodak)
− Ektachrome Elite 100, ISO 100/ 21°, 36 Exp. (Kodak)
− Ektachrome Elite 400, ISO 400/ 27°, 36 Exp. (Kodak)
Haemostyptikum
- TABOTAMP®, 5cm x 35cm (Johnson & Johnson Medical Ltd, UK-Gargrave)
Kanülen
- Sterican® Luer-Lock, 0,40 x 12 mm2, 27 G x 0,5“, BL/LB (Braun, Melsungen) - Sterican® Luer-Lock, 0,55x25mm2, 24 G x 1“, Gr.17, BL/LB (Braun, Melsungen) - Sterican® Luer-Lock, 0,6x30mm2, 23 G x 1,25“, Gr.14, BL/LB (Braun, Melsungen) - Sterican® Luer-Lock, 0,80 x 40 mm2, 21 G x 1,5“, Gr.2, BL/LB (Braun, Melsungen) - Sterican® Luer-Lock, 0,9x40mm2, 20 G x 1,5“, Gr.1, BL/LB (Braun, Melsungen) - Introcan® Luer-Lock, 1,3 x 45 mm2, 18 G x 1,75“ (Braun, Melsungen)
OP-Unterlagen
- Molinea E, 59 930/1 (Paul Hartmann AG, Heldenheim)
Medikamente
- Ampicillin-ratiopharm0,5 Injektionslösung (ratiopharm) - Arava100 Filmtabletten (Hoechst Marion Roussel) - Refobacin 10 mg Ampullen (Merck)
- SandimmunOptoral -Lösung zum Einnehmen (Novartis, Nürnberg)
Mikrotiterplatten
- Polystyrol-Microplatten 96 K , U-Form (Greiner) - Nunclon Mikrowell Platten Flach- und Rundboden - 96 well mit Deckel (Nunc, London, UK)
- Polyethylenterephthalat-Mikroplatten 96 well für 1450 MicroBeta (Wallac)
Nahtmaterial
- Dexon® 3/0 (2 metric), HR 22 (B. Braun-Dexon GmbH) - Ethilon® 8/0 (0,4 metric) BV-2 (Ethicon, Norderstedt) - Prolene® blau 6/0 (0,7 metric) C-1 (Ethicon, Norderstedt) - Vicryl® 3/0 (2 metric), UCLX (Ethicon, Norderstedt)
Narkotika
- Diethylether, wasserfrei, 99,8% (Sigma-Aldrich®, Steinheim) - Ketamin® 10% (WDT, Garbsen)
- Rompun® 2% (BayerVital, Leverkusen)
Pharmazeutika
- Liquemin® N 25000 (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen)
Spritzen
− Injekt® 10ml Luer (Braun, Melsungen)
− Injekt® 20ml Luer (Braun, Melsungen)
− Micro-Fine+, 1 ml, U-40 Insulin, 0,33 x 13 mm2, 29 G x 0,5 (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg)
− Omnifix® -F, 1ml Luer (Braun, Melsungen)
− Omnifix® 40, 1ml, U-40 Insulin (Braun, Melsungen)
− Omnifix® 5ml Luer (Braun, Melsungen)
Sonstiges:
- Combitips plus (Eppendorf, Hamburg)
- Wattestäbchen mit zwei Watteköpfen (NOBA Verbandmittel; Danz GmbH+ Co KG,
Wetter-Wengern) - Zellstofftupfer
3.3.2 Chemikalien
Ampuwa (Fresenius, Graz, A)
Diethanolamin (DEA) (Sigma; St. Louis, USA)
Eosin Y (Sigma, St. Louis, USA)
Formalin, z.A. (Merck, Darmstadt)
Hämatoxylin (Merck, Darmstadt)
KAISERS Glyceringelantine (Merck, Darmstadt)
Luccese Natives Olivenöl (Lidl Stiftung + Co KG,
D-Neckarsulm)
Natriumchlorid Isotone Kochsalzlösung 0,9% (Braun, Melsungen)
4-Nitrophenylphosphat (Böhringer, Ingelheim)
Triton X-100 (Sigma, St. Louis, USA)
Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt)
3.3.3 Antikörper
3.3.3.1 Antikörper für die Immunhistochemie
Primäre Antikörper
Tabelle 1 zeigt Antikörper (Spalte 2), die in der vorliegenden Arbeit für die Immunhistologie eingesetzt wurden. In Spalte 3 wird die eingesetzte Verdünnung angegeben.
Antigen Klon Verdünnung Spezifität Hersteller NKR-P1 mAk 3.2.3 1:100 Maus-Antikörper gegen
Ratten-NK-Zellen
Serotec,
Kidlington, UK CD 161 MCA-1427 1:100 Maus-Antikörper gegen
Ratten-NK-Zellen
Serotec,
Kidlington, UK TCR R73,
MCA4536
1:500 Maus-Antikörper gegen Ratten- α/β T-Zellen
Serotec,
Kidlington, UK ED1 ED1
MCA341R
1:500 Maus-Antikörper gegen Ratten-Makrophagen
Serotec,
Kidlington, UK Ratten-
IgM
MARM-4, MCA189
1:500 Maus-Antikörper gegen Ratten-IgM
Serotec,
Kidlington, UK Ratten-C3 ED 11,
MCA733
1:500 Maus-Antikörper gegen Ratten- Komplementfaktor C3
Serotec,
Kidlington, UK Ratten-C6 Kat.-Nr.
55141
1:100 Ziege-Antikörper gegen humanen Komplementfaktor C6, kreuzreaktiv mit Ratten C6
ICN,
Aurora, USA
Ratten-C9 Kat.-Nr.
55121
1:100 Ziege-Antikörper gegen humanen Komplementfaktor C9,
kreuzreaktiv mit Ratten C9
ICN,
Aurora, USA
Tab. 1: Primäre Antikörper für die Immunhistochemie
Sekundärantikörper
- Kaninchen-anti-Maus Immunglobulin-Biotin (Dako, Hamburg) Verdünnung: 1:100
- Kaninchen-anti-Ziege Immunglobulin-Biotin (Dako, Hamburg) Verdünnung: 1:100
- Ziege anti-Maus Ig-FITC (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) Verdünnung: 1:100
3.3.3.2 Antikörper für die Durchflußzytometrie
Primäre Antikörper
Tabelle 2 zeigt Antikörper (Spalte 2), die in der vorliegenden Arbeit für die Durchfluß- zytometrie eingesetzt wurde. In Spalte 3 wird die eingesetzte Verdünnung angegeben.
Antigen Klon Verdünnung Spezifität Hersteller
B-Zellen OX-33 unverdünnt Maus-Antikörper gegen Ratten- B-Zellen CD45RA-RPE
Serotec,
Kidlington, UK CD5+B-
Zellen
MRC OX- 19
unverdünnt Maus-Antikörper gegen CD5-FITC
Serotec,
Kidlington, UK NKR-P1 mAk 3.2.3 1:1000 Maus-Antikörper gegen
Ratten-NK-Zellen
Serotec,
Kidlington, UK
Tab. 2: Antikörper für die Durchflußzytometrie
Sekundärantikörper
- Ziege anti-Maus Ig-FITC (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) Verdünnung: 1:100
3.3.3.3 Antikörper zur NK-Zell-Depletion
- Kaninchen anti-asialo GM1 (Wako, Neuss) Verdünnung: unverdünnt
3.3.4 Lösungen und Puffer
Acid-Citrat-Dextrose (ACD) 35 mM Zitronensäure 75 mM Natriumzitrat 121 mM D-Glukose
Diaminobenzidin-Substratlösung für Immunhistochemie 20 mg DAB in 100 ml PBS
kurz vor Gebrauch Zugabe von 12 µl H2O2 30%
Elutionspuffer für HiTrap 20 mM Phosphat 0,5 M NaCl 300 mM Imidazol
vor Gebrauch steril filtrieren (0,8µm)
Erythrozytenlysereagenz 0,83% NH4Cl
10 mM EDTA 12 mM NaHCO3
Extraktionspuffer für Membranextrakte 0,5% Triton X-100
0,05 M NaCl 0,05 M Tris/HCl 0,36 mM Pepstatin A 1 mM PMSF
10 mM N-Ethylmaleimid
pH 7,4
Lagerung bei 4°C
PBS (Phosphat gepufferte Saline) 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 2,7 mM KCl
15 mS mit NaCl einstellen (ca. 137 mM NaCl)
PBS 160 mM
137 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4
10 mM KH2PO4
pH 7,4
vor Gebrauch steril filtrieren (0,8 µm) und entgasen
Percoll, d= 1,086, 320 mOs/kg H2O 10 ml 1,5 M NaCl
61,7 ml Percoll, d= 1,13 g/ml ad 100 ml destilliertes Wasser
Puffer F (Aufreinigung CVF) 20 mM Tris/HCl pH 7,4
vor Gebrauch steril filtrieren (0,8 µm) und entgasen
Puffer G (Aufreinigung CVF)
20 mM Tris HCl, 350 mM NaCl pH 7,4
vor Gebrauch steril filtrieren (0,8 µm) und entgasen
Startpuffer für HiTrap 20 mM Phosphat 0,5 M NaCl 15 mM Imidazol
vor Gebrauch steril filtrieren (0,8 µm)
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex Streptavidin (AV) 1:100 mit PBS ansetzen Biotin (BP) 1:1000 mit PBS ansetzen
! dann 1:1 mischen
! 1 h vor Gebrauch ansetzen
TBS (Tris gepufferte Saline) 50 mM Tris/HCl 200 mM NaCl
pH 7,4
TBS Waschpuffer für XNA-ELISA TBS
0,3% Tween-20
0,02% NaN3
3.3.5 Medien
Concanavalin A (Con A) (Sigma, St. Louis, USA) DMEM high Glucose (1x) (PAA)
Fetales Kälberserum, bei 56°C hitzeinaktiviert (FCS) (Sigma, St. Louis, USA) HybridMed Seromed (Biochrom)
L-Glutamin (Gibco BRL)
Methyl-α-D-Mannopyranosid (Sigma, St. Louis, USA)
Penicillin (10000 IU/ml) / Streptomycin (10mg/ml) (Sigma, St. Louis, USA) TC199 mit Hank’s Salzen (Applichem)
Trypanblau 0,4% (Sigma, St. Louis, USA)
3.3.6 Zelllinien
3.2.3: Hydridomzelllinie, von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. K. Wonigeit, Abteilung für Viszeral- und Transplantationschirurgie der MHH, zur Verfügung gestellt
JH 4: Fibroblastenartige Meerschweinchen-Zelllinie isoliert aus der Lunge eines Jungtiers vom Stamm, adhärent. ATCC CCL-158
YAC-1: Lymphomzelllinie, die durch Inokulation des Moloney Leukämie Virus (MLV) in neugeborene A/Sn Mäusen induziert wurde.
Von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Kurt Wonigeit, Abteilung Viszeral- und Transplantationschirurgie der MHH, zur Verfügung gestellt.
