pilzen pro Sekunde aus einem Masthähnchenstall emittiert werden [6]. Somit sind nicht nur die Beschäftigten im Stall gegenüber luftgetragenen Mikroorganismen exponiert, auch die Bevölkerung in der Umgebung solcher Anlagen kann einer zusätzlichen Belastung durch Mikroorganismen ausgesetzt sein [8].
Molekularbiologische Charakterisierung luftgetragener Bakterien in Emissionsproben aus Hähnchenmastanlagen
Zusammenfassung An einem Masthähnchenstall wurden isokinetische Emissionsprobenahmen an einem Abluftkamin mittels Impingement über 2,5 Mastperioden durchgeführt. Die Proben wurden kultivierungs- unabhängig qualitativ und quantitativ hinsichtlich der vorliegenden Bak- teriengemeinschaft untersucht. Die Gesamtzellzahl-Bestimmung nach DAPI-Anfärbung ergab zu Beginn der Mastperiode eine Zellfracht von 1 · 108 Zellen/s und stieg am Ende der Mastperiode auf 5 · 1010 Zellen/s an. Über eine Mastperiode wurde aufgrund der ermittelten Frachten eine Gesamtemission von etwa 1016 Zellen extrapoliert. Die 16S-rRNA-Gen - sequenzanalysen der Emissionsproben zeigten, dass es im Verlauf der Mastperiode zu einer Veränderung der emittierten Bakterien- gemeinschaft kommt. Mit fortschreitender Mastdauer wurde eine Zunahme an Sequenzen von Fäkalbakterien festgestellt. Demgegenüber wurde eine Abnahme der dominierenden Gattung Staphylococcus beob- achtet. Die molekularen Analysen zeigten, dass 16S-rRNA-Gen - sequenzen von Bakterien vorlagen, die a) keiner der bislang kultivierten Bakterienarten zugeordnet werden können und b) bislang im Zusam- menhang mit Geflügelställen nicht erwartet wurden. So wurde beispiels- weise nachgewiesen, dass der Anteil der Zellen der Gattung Jeotgali - coccus (Jeot-Cluster-I) an der Gesamtzellzahl während der Mastperiode von 0,4 am Anfang auf 6,7 % am Ende der Mastperiode anstieg. Teil- weise wurden in den Emissionen auch Sequenzen detektiert, die am ähnlichsten zu Aerococcus viridans, Enterococcus hirae, E. faecium, Escherichia albertii und Staphylococcus saprophyticus waren und somit die Emission von Mikroorganismen der Risikogruppe 2 aufzeigen.
E. Martin, A. Gessner, A. Gärtner, U. Jäckel
Dr. Andrea Gärtner, Dipl.-Phys. Ing. Andreas Gessner, Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Dienstort Essen.
M. Sc. Elena Martin, Dr. Udo Jäckel,
Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin, Gruppe 4.7 Biologische Arbeitsstoffe, Berlin.
1 Einleitung
Obwohl die Anzahl der Mastbetriebe für Enten und Hähn- chen zwischen den Jahren 1992 und 2007 in Deutschland um rund 90 % abgenommen hat, ist die Anzahl der gehaltenen Tiere um 38 % angestiegen (Bild 1). Somit haben sich die Haltungsbedingungen, aber auch die damit verbundenen Arbeitsplätze in der industriellen Geflügelmast deutlich ver- ändert. Die Beschäftigten sind in diesen Anlagen häufig einer sehr hohen Tieranzahl auf engstem Raum und somit auch einer großen Anzahl an Mikroorganismen ausgesetzt [1 bis 3]. Geflügelmastanlagen werden daher auch als bedeutende Emissionsquelle von Mikroorganismen ange - sehen [4]. Standardisierte Messungen von Gärtner et al.
[5 bis 7] verdeutlichen dies. Sie zeigten, dass bis zu 1010 Mi- kroorganismenzellen bzw. 109 Kolonie bildende Einheiten (KBE) anBakterien pro Sekunde und 106 KBE an Schimmel-
Molecular characterization of airborne bacteria in emission samples of broiler houses
Abstract Stack emissions from a broiler house were sampled by isokinetic impingement over 2.5 fattening periods. For quantitative and qualita tive investigations cultivation independent methods were used to examine the bacterial community in these emissions. The total cell count was determined after DAPI staining and revealed at the beginning of a fatte- ning period a cell emission of 1 ·108 cells/s and at the end of a fattening period a cell emission of 5 · 1010 cells/s. A total emission of about 1016 cells was determined after extrapolation over an entire fatten - ing period. The 16S rRNA gene analysis revealed a changing in the emitted bacterial community. In the course of the fattening period an increase of sequences of fecal bacteria was observed. In contrast a decrease of the dominant genus Staphylococcus at the beginning of the fattening period was observed. The molecular analyses showed that 16S rRNA gene sequences were detected which could not be assigned to any genus and were classified as “uncultured bacteria”. Furthermore we recog nized bacteria which were not expected in the air of poultry houses. For example the percentage of cells of the genus Jeotgalicoccus (Jeot-Cluster-I) of the total cell count increased from 0.4 at the beginning of the fattening period to 6.7% at the end. We could show that in the emissions 16S rRNA gene sequences are present which were next related to bacteria of the risk group 2 (Aerococcus viridans, Enterococcus hirae, E. faecium, Escherichia albertii and Staphylococcus saprophyticus). This study shows that cultivation independent analysis could be used to quan- tify and identify bacteria in emission samples.
Bild 1. Anzahl von Masthähnchen und Masthähnchenbetrieben in Deutschland.
Quelle: Statistisches Bundesamt Deutschland
Über die Zusammensetzung der Mikroorganismengemein- schaften in Emissionen von Geflügelställen ist bisher nur wenig bekannt. Schulz et al. [9] zeigen in ihrer Studie mittels Kultivierung, dass vor allem Spezies der Gattung Staphylo- coccus in der Luft von Masthähnchenstallungen und dessen Emissionen dominieren. Allerdings kann die Luft von Geflü- gelställen auch pathogene Bakterien enthalten. So zeigten verschiedene Studien [10 bis 12] kultivierungsabhängig das Vorhandensein von Salmonella, Campylobacter, Aerococcus viridans, Acinetobacter johnsonii, Pantoea agglomerans, Cellulosimicrobium funkei, Corynebacterium falsenii, Coryne bacterium xerosis, Mycobacterium arupense und Staphylococcus epidermidis an Arbeitsplätzen in Geflügel - ställen. Um eine Bewertung der Bioaerosole hinsichtlich ge- sundheitlicher und umweltrelevanter Wirkungen ableiten zu können, sollten detaillierte Ergebnisse über deren Zu- sammensetzung vorhanden sein. Für eine Charakterisie- rung müssen neben den kürzlich standardisierten Probe - nahmemethoden entsprechende Detektionssysteme etab- liert werden.
Bisher werden luftgetragene Bakterien nach ihrer Samm- lung fast ausschließlich auf festen Nährmedien nach Richt- linie VDI 4253 Blatt 3 [13] kultiviert. Kultivierungsunabhän- gige Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse luftgetragener Bakterien finden bislang noch relativ selten Anwendung. Die kürzlich veröffentlichte Richtlinie VDI 4253 Blatt 4 „Erfassen luftgetragener Mikroorganismen und Viren in der Außenluft – Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels Fluoreszenzanalyse nach Anfärbung mit DAPI“ (4',6-Dia- midin-2-phenylindol) [14] beschreibt eine Methode, bei der die Anzahl der Zellen in Proben kultivierungsunabhängig quantitativ erfasst werden.
Zusätzlich bieten molekularbiologische Methoden eine Möglichkeit zur qualitativen Analyse. In Abhängigkeit von der Fragestellung stehen dafür unterschiedliche Ansätze zur Verfügung. Eine gute Grundlage zur molekularbiologischen Identifizierung von Bakterien stellt die 16S-rRNA-Gen - sequenz dar. Sie wird derzeit vor allem in der taxono- mischen Klassifikation von Prokaryoten eingesetzt [15; 16].
Dieses Gen ist in essenziellen Zellfunktionen (Proteinbio- synthese) involviert und aus diesem Grund in allen Pro- karyoten präsent. Es verfügt über hoch konservierte, aber auch über variable Nukleinsäureabschnitte, über die Pro- karyoten in Gattungen und in manchen Fällen auch in Spe- zies unterschieden werden können [15]. Über das Wissen adäquater Nukleinsäureabschnitte ist es möglich, gezielt die Summe der Mitglieder einer Gattung oder sogar einzelne Spezies in Umweltproben nachzuweisen und mithilfe der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (real-time PCR) sogar zu quantifizieren [17 bis 25]. Weiterhin können molekular- biologische Methoden auch genutzt werden, um die Zusam- mensetzung von unbekannten Mikroorganismengemischen zu untersuchen.
Ziel der hier vorgestellten Untersuchung war es, luftgetra- gene Bakterien in Emissionsproben aus einem Hähnchen- maststall quantitativ und qualitativ kultivierungsunabhän- gig zu untersuchen.
2 Material und Methoden
2.1 Bestimmung der Gesamtzellzahl (GZZ)
Emissionsproben wurden mittels Impingement an einem Abluftkamin eines Hähnchenmaststalls isokinetisch gesam-
melt. Nähere Details der Probenahme sind der Veröffent- lichung von Gärtner et al. [6] zu entnehmen. Die Emissions- proben wurden gekühlt in das Labor geliefert. Für die GZZ- Bestimmung wurden 10 ml der Emissionsproben mit 1 ml Formaldehyd (37%ig) fixiert ([26]; VDI 4253 Blatt 4 [14]). Für die anschließende Färbung wurde ein Aliquot der mit Form- aldehyd fixierten Mikroorganismensuspension mit einem Hundertstel des Volumens mit einer DAPI-Stammlösung (1 mg/ml zellfreiem, entsalztem H2O), gemischt und im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Färbezeit von 30 min inkubiert. Nach der Färbung wurden die DAPI-behandelten Proben auf die Oberfläche eines schwarzen Polycarbonatfil- ters (0,2 µm Porengröße, Durchmesser 25 mm, Whatman) gesaugt und unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung mithilfe eines Okular gitters auf mehreren Teilflächen des Polycarbonatfilters direkt gezählt.
Anhand der ebenfalls im Abluftkamin gemessenen Volu- menströme konnte die GZZ-Fracht (Zellen pro Sekunde) er- rechnet werden.
2.2 PCR und Klonierung
Die Zellen wurden aus je 10 ml der Emissionsproben in mehreren Schritten durch eine Zentrifugation bei 24100 x g in einem 1,5-ml-Reaktionsgefäß ankonzentriert. Im nächs- ten Schritt wurde die DNA mit einem kommerziell erhält - lichen DNA-Extraktionskit (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) nach Herstellerangaben extrahiert. Nachdem mittels PCR die 16S- rRNA-Gene unter Verwendung universeller Primer [27] vervielfältigt wurden, legte die Fa. Agowa (Berlin) Klon- bibliotheken an. Die PCR-Produkte werden bei der Klonie- rung jeweils über einen Vektor (hier ein Plasmid) in Escheri- chia coli-Zellen eingeführt. Im Labor werden die E. coli-Zel- len dann vereinzelt und kultiviert. Einhergehend mit seiner eigenen Vermehrung vervielfältigt E. coli dabei durch Zell- teilung das ihm eingefügte DNA-Fragment (Vektor und 16S- rRNA) und bildet auf entsprechendem Nährboden Kolonien.
Jede Kolonie enthält identische 16S-rRNA-Moleküle, die auf ein 16S-rRNA-Gen eines Bakterium aus der Umweltprobe zurückgeführt werden können. Grundsätzlich muss aller- dings berücksichtigt werden, dass es durch speziesselektive DNA-Extraktionen sowie speziesselektive PCR zu artifiziel- len Verteilungen kommen kann.
Im Rahmen dieser Studie wurden pro Klonbibliothek von 24 E. coli-Kolonien das eingefügte 16S-rRNA-Gensequenz- Fragment vollständig sequenziert. Die ca. 1 350 bp langen Sequenzen wurden ausgewertet. Die phylogenetische Zu- ordnung der 16S-rRNA-Gensequenzen auf Gattungsebene wurde mithilfe des Softwarepakets MEGA 4.0 [28] durch- geführt. Weiterhin wurde in jeder Emissionsprobe das Vor- kommen des „Jeot-Cluster-I“ mittels quantitativer real-time PCR bestimmt [29]. Zusammen bilden die vier Arten Jeotgalicoccus halotolerans, J. psychrophilus, J. coquinae und J. aerolatus das „Jeot-Cluster-I“, da nur diesen Jeotgalicoc- cus-Arten sowohl Bakterienisolate (J. coquinae, J. aerolatus) als auch 16S-rRNA-Gensequenzen aus Klonierungsanalysen aus Entenstall- und Putenstallluft [29] zugeordnet wurden.
3 Ergebnisse
Die Emissionsproben wurden im Zeitraum von Juni bis No- vember 2009 gesammelt. Aus diesem Probenpool wurden Proben zu Beginn, in der Mitte und am Ende der Mastperiode analysiert. Die GZZ-Fracht lag zu Beginn der Mastperiode
bei 1 x 108 Zellen/s und stieg kontinuierlich über den Verlauf der Mastperiode bis zu 5 x 1010 Zellen/s an.
Mittels quantitativer real-time PCR wurde in den Emissions- proben die Anzahl an Zellen des „Jeot-Cluster-I“ ermittelt.
Die Emission von Zellen dieses Clusters ist in Bild 2 dar- gestellt. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die Fracht die- ser Zellen in der Abluft vergleichbar zur GZZ-Fracht im Lau- fe einer Mastperiode ansteigt. Am Anfang der Mastperiode lag die Fracht von Zellen des Jeot-Cluster-I bei 5 x 105 Jeot- Cluster-I-Zellen/s und stieg im Verlauf der Mastperiode auf bis zu 1 x 109 Jeot-Cluster-I-Zellen/s am Ende der Mast - periode an. Der geschätzte prozentuale Anteil dieser Zellen an der GZZ stieg von 0,4 auf 6,7 % an.
In den in der Mitte der Mastperioden gesammelten Proben, waren die häufigsten Sequenzen (61 bis 78 %) in den Klon - bibliotheken am ähnlichsten zu Vertretern der Gattung Staphylococcus. Allerdings nahm der Anteil der Staphylo -
coccus-ähnlichen Sequenzen in den ermittelten Klonbiblio- theken mit zunehmender Mastdauer kontinuierlich auf 20 bis 55 % am 35sten Masttag ab (Bild 3). Demgegenüber stieg der Anteil an Sequenzen an, die am ähnlichsten zu bislang
„unkultivierten Bakterien“ waren. Nur an den Masttagen 35 und 37 wurden Sequenzen detektiert, die am ähnlichsten zu denen von Vertretern der Gattung Nosocomiicoccus waren.
Anhand des Dendrogramms (Bild 4) ist zu erkennen, dass sich die 16S-rRNA-Gensequenz-Klonbibliotheken, die von Emissionsproben am Ende der Mastperiode generiert wur- den, deutlich von denen unterscheiden, die von Emissions- proben vom Beginn der Mastperiode stammen.
4 Diskussion
Die mit der Abluft transportierte Fracht an Zellen stieg im Verlauf der Mast deutlich von 1 · 108 Zellen/s zu Beginn bis auf 5 · 1010 Zellen/s am Ende der Mast an. Somit konnten die Ergebnisse von Gärtner et al. [6] im Rahmen dieser Studie bestätigt werden. Einen Konzentrationsanstieg in der Stall- luft im Verlauf der Mastperiode stellten auch Vu‹emilo et al.
[30] in ihren kultivierungsabhängigen Untersuchungen in Geflügelställen fest. Baykov und Stoyanov [8] errechneten aufgrund der steigenden Konzentrationen luftgetragener Mikroorganismen in der Stallluft und des Abluftvolumens eine Zunahme der Zellfracht im Verlauf der Mast. So kann insgesamt davon ausgegangen werden, dass die Belastung der Stallluft mit Mikroorganismen mit dem Alter und dem Gewicht der Tiere steigt und somit auch im Verlauf der Mast mit steigenden Emissionsraten zu rechnen ist. Vor allem un- ter Berücksichtigung der Gesamtzellzahlkonzentration in der Kaminabluft wird deutlich, wie hoch die Emissionsraten tatsächlich sind. Im Vergleich zu GZZ-Konzentrationen in der Außenluft (zwischen 6 · 103 bis 2 · 105 Zellen pro m3 Luft, [31]) sind die hier ermittelten Emissionskonzentrationen von bis zu 9 · 108 Zellen/m3 (Daten nicht gezeigt) um nahe- zu 10 000fach höher. Extrapoliert man durch Integration der Fläche unter der Emissionskurve (Bild 2) die Anzahl emit- tierter Zellen über die gesamte Emissionssammelzeit, so er- rechnet sich eine Gesamtemission von rund 1016 Zellen pro Mastperiode. Legt man die von [32] angegebenen Zellzahlen zwischen 109 und 1010 Zellen pro Gramm Boden zugrunde,
Bild 2. GZZ- und Jeotgalicoccus-Cluster-I-Emission aus einem Hähnchenmast- stall in Abhängigkeit vom Masttag. Ein Datenpunkt der GZZ entspricht dem Mittelwert aus n = 12 Emissionsproben eines Messtags und für Jeotgalicoccus dem Mittelwert aus n = 12 Emissionsproben eines Messtags (à drei Mess - wiederholungen bei der real-time PCR).
Bild 3. Prozentuale Zusammensetzung der 16S-rRNA-Gensequenzen (Gattungs- ebene) der Klonbibliotheken in Abhängigkeit vom Masttag. Die 16S-rRNA- Gensequenzen waren ca. 1 350 bp lang. Ein Balken entspricht dem Mittelwert der Verteilung der Sequenzen von zwei Klonbibliotheken, die aus zwei Emis - sionsproben eines Messtags angelegt wurden (n = 2 x 24 Klone).
Bild 4. Dendrogramm basierend auf dem Bray-Curtis-Koeffizienten zwischen den 16S-rRNA-Gensequenz-Klonbibliotheken einzelner Masttage. Das Dendro- gramm wurde mit der Software „Multi-Variate Statistical Package“ (2009) erstellt.
entspricht dies in etwa der Anzahl von Zellen, die in 2 bis 30 t Boden enthalten sind.
Die Verteilung der detektierten 16S-rRNA-Gensequenzen in- nerhalb der erzeugten Klonbibliotheken zeigte, dass es im Verlauf der Mast zu deutlichen Veränderungen des emittier- ten Bakterienspektrums kommt. So wurde eine kontinuier - liche Abnahme des Anteils an Sequenzen der Bakterien - gattung Staphylococcus in den Klonbibliotheken beobachtet.
Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die parallel mit der Kultivierung auf Staphylokokken-selektiven Nähr- medien (Baird-Parker-Agarplatten) festgestellt wurden [6].
In diesem Zusammenhang muss berücksichtigt werden, dass beide Methoden unterschiedliche Detektionsziele ver- folgen. Während der kultivierungsabhängige Ansatz prinzi- piell nur koagulase-positiven Staphylokokken das Wachs- tum ermöglichen soll, erfasst der molekularbiologische An- satz koagulase-positive und -negative Staphylokken. Die Auswertungen der 16S-rRNA-Gensequenzen-Klon biblio - theken zeigten, dass der überwiegende Anteil der detektier- ten Staphylococcus-Sequenzen solchen am ähnlichsten waren, die als koagulase-negativ (S. nepalensis; S. cohnii;
S. arlettae; S. lentus) beschrieben sind.
Im Gegensatz zur Abnahme der Staphylokokken wurde eine kontinuierliche Zunahme des Anteils an 16S-rRNA-Gen - sequenzen festgestellt, die keiner derzeit beschriebenen Gattung (hier als „unkultivierte Bakterien“ bezeichnet) zu- geordnet werden konnten. Sequenzen der Gattungen Lacto- bacillus und Nosocomiicoccus wurden nur am Ende der Mast beobachtet. Die Unterscheidung des Bakterienspektrums zwischen Mitte und Ende der Mast wird vor allem durch die Clusteranalyse deutlich, die eine klare Differenzierung der Bakterienspektra der Tage 21 bis 26 von den Tagen 35 und 37 aufzeigt (Bild 4). Die beobachtete Veränderung der Bakte- riengemeinschaft lässt insgesamt darauf schließen, dass es zwischen Mitte und Ende der Mastperioden zu einer Ver- schiebung des Bakterienspektrums in den Emissionsproben hin zu Fäkalbakterien kommt. Dies wird vor allem durch den Anstieg der Sequenzen der „unkultivierten Bakterien“ in den Klonbibliotheken deutlich, da ein Großteil dieser Sequenzen den 16S-rRNA-Sequenzen zugeordnet werden konnte, die aus dem Verdauungstrakt verschiedener Geflügelarten ge- wonnen wurde [33 bis 35]. In diesem Zusammenhang kann auch die Zunahme an Sequenzen der Gattung Lactobacillus in den Klonbibliotheken gesehen werden, da diese Gattung auch in Hühnerfäzes nachgewiesen wurde [36].
Neben den bereits beschriebenen Sequenzen von bislang
„unkultivierten Bakterien“ konnte beispielsweise die Gattung Jeotgalicoccus in den 16S-rRNA-Gensequenz-Klon- bibliotheken mit einer Häufigkeit zwischen 2 und 7% nach- gewiesen werden (Bild 3). Diese Gattung wurde erstmals von Yoon et al. [37] in einem fermentierten traditionellen koreanischen Fischgericht namens „Jeotgal“ detektiert. Im Zusammenhang mit Geflügelstall-Bioaerosolen wurde diese Gattung erstmals im Jahr 2010 erwähnt [11; 29]. Mit einer spezifisch entwickelten Analysenvorschrift für die quantita- tive real-time PCR [29] wurde in der hier vorliegenden Studie erstmals auch eine Quantifizierung von Zellen des Jeot- Cluster-I in den Emissionen des Masthähnchenstalls durch- geführt. Vergleichbar mit der Gesamtzellzahl wurde eine Zunahme der Fracht vom Jeot-Cluster-I aus den Hähnchen- maststall im Verlauf der Mastperiode beobachtet, wobei der Anteil an der Gesamtzellzahl von 0,4 auf 6,7% zunahm (Bild 2). Im Zusammenhang mit der „unbekannten Zusam-
mensetzung“ ist auch die Detektion von Sequenzen der Gat- tung Nosocomiicoccus zu nennen. Bis zum jetzigen Zeit- punkt ist diese Gattung nur durch die Art N. ampullae be- schrieben, die aus einer Flasche physiologischer Kochsalz- lösung aus einem Krankenhaus isoliert wurde [38].
Insgesamt bestätigen die molekularbiologischen Analysen die Dominanz von Vertretern der Gattung Staphylococcus in Geflügelstallluft [4; 9; 24; 30], sie lassen jedoch weiterhin er- kennen, dass über die grundsätzliche Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft bislang nur sehr wenig bekannt ist.
Betrachtet man den Teil der 16S-rRNA-Gensequenzen, die bisher isolierten Bakterienarten zugeordnet werden konn- ten, ist festzustellen, dass es sich überwiegend um Bakterien der Risikogruppe 1 handelt, also solche, „bei denen es un- wahrscheinlich ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen“ [39]. Jedoch wurden z. T. auch 16S-rRNA-Gen- sequenzen detektiert, die am ähnlichsten zu den Bakterien- arten Aerococcus viridans, Enterococcus hirae, E. faecium, Escherichia albertii und Staphylococcus saprophyticus waren. Diese gehören zu den biologischen Arbeitsstoffen der Risikogruppe 2, also solche, „die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftig- te darstellen können“ [39]. Somit sollten zumindest Beschäf- tigte bei Arbeiten innerhalb dieser Ställe sowie beim Arbei- ten an oder sogar in den Abluftkaminen, bei denen mit Expo- sitionen zu rechnen ist, adäquate Schutzmaßnahmen nach TRBA 230 [40] ergreifen.
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[39] Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätig- keiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung) vom 27. Januar 1999. BGBl. I Nr. 4, S. 50-60.
[40] Technische Regel für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA) 230:
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